JPH0218075B2 - - Google Patents
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- JPH0218075B2 JPH0218075B2 JP14050082A JP14050082A JPH0218075B2 JP H0218075 B2 JPH0218075 B2 JP H0218075B2 JP 14050082 A JP14050082 A JP 14050082A JP 14050082 A JP14050082 A JP 14050082A JP H0218075 B2 JPH0218075 B2 JP H0218075B2
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は検体の前処理方法に関するものであ
る。更に詳細には、本発明は尿、血液等の検体中
に存在する目的物質をアンモニア生成系で定量す
るにあたり、予め、検体中に存在するアンモニア
を消去せしめる方法に関するものである。
る。更に詳細には、本発明は尿、血液等の検体中
に存在する目的物質をアンモニア生成系で定量す
るにあたり、予め、検体中に存在するアンモニア
を消去せしめる方法に関するものである。
従来、生体に由来する尿、血液等の検体に存在
する反応生成物として、アンモニアを生ずる物
質、例えばクレアチニン、尿素等の定量はクレア
チニンあるいは尿素と特異的に反応する試薬例え
ばアルカリピロリン酸（クレアチニンの場合：
Taffe法）やジアセチルモノオキシム（尿素の場
合：Fearon反応）を添加し、化学反応により生
じた物質の吸収極大をもつて測定する方法があつ
た。
する反応生成物として、アンモニアを生ずる物
質、例えばクレアチニン、尿素等の定量はクレア
チニンあるいは尿素と特異的に反応する試薬例え
ばアルカリピロリン酸（クレアチニンの場合：
Taffe法）やジアセチルモノオキシム（尿素の場
合：Fearon反応）を添加し、化学反応により生
じた物質の吸収極大をもつて測定する方法があつ
た。
しかしながらこの化学的呈色法は検体中に目的
物質と同様の呈色を示す物質が多数存在するとい
う欠点があつて好ましくない。
物質と同様の呈色を示す物質が多数存在するとい
う欠点があつて好ましくない。
他の方法として、検体中のクレアチニンあるい
は尿素をアンモニアに変換せしめる酵素を用いて
クレアチニンあるいは尿素をアンモニアに変換せ
しめ、生成したアンモニアを定量することにより
クレアチニンあるいは尿素の量を知る方法があつ
た。しかしこの方法も検体中にすでに多量のアン
モニアが混在するため、簡単な方法ながら正確に
定量できないという欠点があつた。
は尿素をアンモニアに変換せしめる酵素を用いて
クレアチニンあるいは尿素をアンモニアに変換せ
しめ、生成したアンモニアを定量することにより
クレアチニンあるいは尿素の量を知る方法があつ
た。しかしこの方法も検体中にすでに多量のアン
モニアが混在するため、簡単な方法ながら正確に
定量できないという欠点があつた。
本発明者等は、上記アンモニアの混在する検体
でしかもアンモニアを反応生成物として生じる物
質の定量を研究の結果、本発明を見い出した。即
ち、本発明は検体中の目的物質を定量するにあた
り、検体にグルタミン酸脱水素酵素（以下GlDH
という）、２−オキソグルタール酸（以下α−
KGという）、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（以下NADHという）そしてニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD+
という）を還元する酵素及び基質を添加混合し、
検体中にすでに存在するアンモニアを消去せし
め、その際生成されたNAD＋をNAD＋を還元せ
しめる酵素を用いて再度NADHに変換せしめる
ことを特徴とする検体の前処理方法であり、更に
はウレアーゼを添加混合することを特徴とする検
体の前処理方法を提供する。
でしかもアンモニアを反応生成物として生じる物
質の定量を研究の結果、本発明を見い出した。即
ち、本発明は検体中の目的物質を定量するにあた
り、検体にグルタミン酸脱水素酵素（以下GlDH
という）、２−オキソグルタール酸（以下α−
KGという）、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（以下NADHという）そしてニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD+
という）を還元する酵素及び基質を添加混合し、
検体中にすでに存在するアンモニアを消去せし
め、その際生成されたNAD＋をNAD＋を還元せ
しめる酵素を用いて再度NADHに変換せしめる
ことを特徴とする検体の前処理方法であり、更に
はウレアーゼを添加混合することを特徴とする検
体の前処理方法を提供する。
本発明の特色とするところは、検体中にすでに
存在するアンモニアを、GlDH、α−KG、
NADHによつてグルタミン酸と水に変化せしめ
るに、その際生成されたNAD＋をNAD＋を還元
せしめる酵素を用いて再度NADHに変換せしめ
る点にあり更にはウレアーゼによつて尿素をアン
モニアに変質しグルタミン酸と水に変化せしめ、
その際生成されたNAD＋を再度NADHに変換せ
しめる点にある。
存在するアンモニアを、GlDH、α−KG、
NADHによつてグルタミン酸と水に変化せしめ
るに、その際生成されたNAD＋をNAD＋を還元
せしめる酵素を用いて再度NADHに変換せしめ
る点にあり更にはウレアーゼによつて尿素をアン
モニアに変質しグルタミン酸と水に変化せしめ、
その際生成されたNAD＋を再度NADHに変換せ
しめる点にある。
ここに本発明のアンモニア消去の反応系の一例
を式(1)で表わすと下記の通りとなる。
を式(1)で表わすと下記の通りとなる。
本発明において検体中存在するアンモニアをあ
らかじめ消去させるには、第一に、既存のアンモ
ニアとα−KGより水とグルタミン酸を生成する
GlDHが必須となる。
らかじめ消去させるには、第一に、既存のアンモ
ニアとα−KGより水とグルタミン酸を生成する
GlDHが必須となる。
この反応系には助酵素としてNADHの存在が
必須である。
必須である。
しかし、このGlDH及びNADHは後に定量す
る際の反応生成物であるアンモニアにも影響する
ため、すでに検体中に存在するアンモニアを予め
消去するために必要な充分量を添加することはで
きない。
る際の反応生成物であるアンモニアにも影響する
ため、すでに検体中に存在するアンモニアを予め
消去するために必要な充分量を添加することはで
きない。
そこで本発明は、目的物質の定量に影響を及ぼ
さない程度のGlDH及びNADH添加量とするた
めNAD+を還元する酵素と基質を反応系に共存さ
せることによつてNAD+をNADHに変化せしめ
GlDH及びNADHの添加量を極力おさえること
によつて上記問題を解決せしめた。
さない程度のGlDH及びNADH添加量とするた
めNAD+を還元する酵素と基質を反応系に共存さ
せることによつてNAD+をNADHに変化せしめ
GlDH及びNADHの添加量を極力おさえること
によつて上記問題を解決せしめた。
すなわちGlDH、NADHの添加量を少なくす
るために反応で生成するNAD+を還元するイソク
エン酸脱水素酵素（以下iCDHという）等の
NAD+を還元する酵素を過剰のイソクエン酸等の
NAD+を還元する酵素反応基質と一緒に添加して
おいて２−オキソグルタール酸（以下α−KGと
いう）を生成させると同時にアンモニアをα−
KGによつて完全に水とグルタミン酸に変化させ
てしまうのである。
るために反応で生成するNAD+を還元するイソク
エン酸脱水素酵素（以下iCDHという）等の
NAD+を還元する酵素を過剰のイソクエン酸等の
NAD+を還元する酵素反応基質と一緒に添加して
おいて２−オキソグルタール酸（以下α−KGと
いう）を生成させると同時にアンモニアをα−
KGによつて完全に水とグルタミン酸に変化させ
てしまうのである。
式(1)の反応においてα−KGからグルタミン酸
の変化によつてNADHがNAD+になると340nm
による吸光度が一旦は減少するが、iCDHによつ
て再びNADHに変化するために340nmによる吸
光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつたらアン
モニアが全部消費されたことになる。
の変化によつてNADHがNAD+になると340nm
による吸光度が一旦は減少するが、iCDHによつ
て再びNADHに変化するために340nmによる吸
光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつたらアン
モニアが全部消費されたことになる。
本発明のアンモニア消費群のうち、GlDHは必
須であるが助酵素のNAD＋を還元する酵素は
iCDHに限らずNAD＋を助酵素として還元する
酵素であれば任意に選択することができる。
須であるが助酵素のNAD＋を還元する酵素は
iCDHに限らずNAD＋を助酵素として還元する
酵素であれば任意に選択することができる。
例えばNAD＋の場合はiCDH〔ECI.I.I.41〕６ホ
スホグルコン酸脱水素酵素（以下６−PGDHと
いう）〔ECI.I.I.43〕などがあり、これらを用いる
場合は、それぞれ過剰の基質としてイソクエン酸
6PGをそれぞれ選択して添加すればよい。更には
検体中に多量存在するアンモニアを反応生成物と
して生ずる尿素をも、検体の前処理としてウレア
ーゼを添加することにより尿素を消去せしめるこ
とが出来る。これによつて目的物質を定量するに
用いる酵素がウレアーゼを混在する粗酵素の時に
効果的である。
スホグルコン酸脱水素酵素（以下６−PGDHと
いう）〔ECI.I.I.43〕などがあり、これらを用いる
場合は、それぞれ過剰の基質としてイソクエン酸
6PGをそれぞれ選択して添加すればよい。更には
検体中に多量存在するアンモニアを反応生成物と
して生ずる尿素をも、検体の前処理としてウレア
ーゼを添加することにより尿素を消去せしめるこ
とが出来る。これによつて目的物質を定量するに
用いる酵素がウレアーゼを混在する粗酵素の時に
効果的である。
このようにして、検体中にすでに存在していた
アンモニアは消去され、目的物質よりアンモニア
を生成せしめる酵素の作用によつて生成するアン
モニアは直接測定できる状態となつたわけであ
る。
アンモニアは消去され、目的物質よりアンモニア
を生成せしめる酵素の作用によつて生成するアン
モニアは直接測定できる状態となつたわけであ
る。
このように本発明はアンモニア混存検体中のア
ンモニアを生成せしめる物質の定量において、予
じめ検体中に存在するアンモニアを消去せしめた
ために引続き同一反応系で直接アンモニアを生成
せしめる物質の定量を可能としたもので、アンモ
ニアを生成せしめる物質の自動分析にきわめて適
した方法である。
ンモニアを生成せしめる物質の定量において、予
じめ検体中に存在するアンモニアを消去せしめた
ために引続き同一反応系で直接アンモニアを生成
せしめる物質の定量を可能としたもので、アンモ
ニアを生成せしめる物質の自動分析にきわめて適
した方法である。
次に本発明の実施例を示す
実施例
クレアチニンの定量の場合
α−KG 3.9mM
NADH 0.06mM
イソクエン酸 4.5mM
塩化マグネシウム 4.5mM
iCDH 2.2u／ml
GlDH（牛肝臓由来） 18u／ml
GlDH（酵母） 30u／ml
以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃
度に調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12
mg／ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝
0.96mg／ml）20μを添加した。
（PH7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃
度に調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12
mg／ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝
0.96mg／ml）20μを添加した。
それぞれ25℃で５分間保温した後340nmの吸光
度を測定し、吸光度の変化が停止したところで
5mM NADPH40μを添加し、340nmの吸光度
の増加を約２分間追跡した後、20u／mlクレアチ
ニンデイミナーゼ50μを添加し、340nmの吸光
度の減少を測定した。
度を測定し、吸光度の変化が停止したところで
5mM NADPH40μを添加し、340nmの吸光度
の増加を約２分間追跡した後、20u／mlクレアチ
ニンデイミナーゼ50μを添加し、340nmの吸光
度の減少を測定した。
ΔE Ａ＝0.042 Ｂ＝0.085 Ｃ＝0.169 Ｄ＝0.339
であつた。
これを次式により計算した結果、検体中にすで
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく、検体中のクレアチニン含量が定量され
た。
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく、検体中のクレアチニン含量が定量され
た。
クレアチニン量
mg／ml＝△Ｅ／6.2×3.11／0.02×113／1000
△Ｅ＝NADHの減少による吸光度の減少
6.2＝NADHの1mMの吸光度
3.14＝全反応液量 0.02＝検体量
113＝クレアチニンの分子量
実施例 ２
クレアチニンデイミナーゼの粗酵素液を用いて
のクレアチニンの定量の場合 α−KG 3.9mM NADH 0.06mM イソクエン酸 4.5mM 塩化マグネシウム 4.5mM iCDH 2.2u／ml GlDH（牛肝臓由来） 18u／ml GlDH（酵母） 30u／ml 以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニア並びに2mM尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体（0.48
mg／ml）20μを添加した。これを25℃で５分間
保温した後340nmの吸光度を測定し吸光度の変化
が停止したところで、5mM NADPH40μを添
加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡した
後、20u／mlクレアチニンデイミナーゼの粗酵素
液50μを添加し340nmの吸光度の減少を測定し
た。
のクレアチニンの定量の場合 α−KG 3.9mM NADH 0.06mM イソクエン酸 4.5mM 塩化マグネシウム 4.5mM iCDH 2.2u／ml GlDH（牛肝臓由来） 18u／ml GlDH（酵母） 30u／ml 以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニア並びに2mM尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体（0.48
mg／ml）20μを添加した。これを25℃で５分間
保温した後340nmの吸光度を測定し吸光度の変化
が停止したところで、5mM NADPH40μを添
加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡した
後、20u／mlクレアチニンデイミナーゼの粗酵素
液50μを添加し340nmの吸光度の減少を測定し
た。
このときの吸光度の変化は0.327であつた。こ
の吸光度変化は、クレアチニン含量の２倍近い値
を示した。
の吸光度変化は、クレアチニン含量の２倍近い値
を示した。
一方クレアチニン含有検体を添加した際にウレ
テーゼを検体当り10u添加した場合についても、
同様の操作を行ない340nmの吸光度の減少を測定
したところ0.169であつた。
テーゼを検体当り10u添加した場合についても、
同様の操作を行ない340nmの吸光度の減少を測定
したところ0.169であつた。
この吸光度変化は、クレアチニン含量に一致し
た。
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検体中の目的物質を定量するにあたり、検体
にグルタミン酸脱水素酵素、２−オキソグルター
ル酸、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドそしてニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドを還元する酵素及び基質を添加混合し、検体中
にすでに存在するアンモニアを消去せしめ、その
際生成されたニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドをニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを
還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドに変換せしめること
を特徴とする検体の前処理方法。 ２ 更にウレアーゼを添加混合することを特徴と
する特許請求範囲第１項記載の検体の前処理方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050082A JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050082A JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5931697A JPS5931697A (ja) | 1984-02-20 |
| JPH0218075B2 true JPH0218075B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15270074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14050082A Granted JPS5931697A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | 検体の前処理法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5931697A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0675515B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1994-09-28 | オリエンタル酵母工業株式会社 | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPH0673475B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1994-09-21 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
| JPS6234060A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | 尿素の定量方法 |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP14050082A patent/JPS5931697A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5931697A (ja) | 1984-02-20 |
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