JPH0218074B2 - - Google Patents
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- JPH0218074B2 JPH0218074B2 JP12888382A JP12888382A JPH0218074B2 JP H0218074 B2 JPH0218074 B2 JP H0218074B2 JP 12888382 A JP12888382 A JP 12888382A JP 12888382 A JP12888382 A JP 12888382A JP H0218074 B2 JPH0218074 B2 JP H0218074B2
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアンモニアを反応生成物とする生体物
質の定量法に関するものである。更に詳細には、
本発明はアンモニアを含有する検体において、ア
ンモニアを反応生成物とする生体物質をそのまま
直接定量する方法に関するものである。
質の定量法に関するものである。更に詳細には、
本発明はアンモニアを含有する検体において、ア
ンモニアを反応生成物とする生体物質をそのまま
直接定量する方法に関するものである。
従来、アンモニアを含有する検体において、ア
ンモニアを反応生成物とする物質をアンモニアの
生成量で定量する際に、検体中に存在するアンモ
ニアも含めた形で測定され正確な定量値を得るこ
とができなかつた。
ンモニアを反応生成物とする物質をアンモニアの
生成量で定量する際に、検体中に存在するアンモ
ニアも含めた形で測定され正確な定量値を得るこ
とができなかつた。
本発明はこのようなアンモニアを反応生成物と
する物質の定量における従来の欠点を改善するた
めになされたものである。
する物質の定量における従来の欠点を改善するた
めになされたものである。
即ち、本発明はアンモニアを含有する検体にグ
ルタミン酸脱水素酵素（以下GlDHという）、α
−ケトグルタール酸（以下α−KGという）、還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート（以下NADPHという）、そしてニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート
（以下NADP+という）を還元する酵素及び
NADP+を還元する酵素の基質を添加し、検体中
にすでに存在するアンモニアを水とグルタミン酸
に変化せしめ、その際生成されたNADP+を
NADP+を還元せしめる酵素を用いて再度
NADPHに変換せしめしかる後検体に過剰量の
反応生成物としてアンモニアを生成する酵素とニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NADHという）を添加して反応せしめ、NADH
の減少量を340nmの吸光度の減少によつてアンモ
ニアを反応生成物とする物質を定量する方法であ
る。
ルタミン酸脱水素酵素（以下GlDHという）、α
−ケトグルタール酸（以下α−KGという）、還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート（以下NADPHという）、そしてニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート
（以下NADP+という）を還元する酵素及び
NADP+を還元する酵素の基質を添加し、検体中
にすでに存在するアンモニアを水とグルタミン酸
に変化せしめ、その際生成されたNADP+を
NADP+を還元せしめる酵素を用いて再度
NADPHに変換せしめしかる後検体に過剰量の
反応生成物としてアンモニアを生成する酵素とニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NADHという）を添加して反応せしめ、NADH
の減少量を340nmの吸光度の減少によつてアンモ
ニアを反応生成物とする物質を定量する方法であ
る。
本発明の特色とするところは検体中にすでに存
在するアンモニアをGlDH、α−KG、NADPH
によつてグルタミン酸に変化させ、しかる後にア
ンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素の
反応によりアンモニアを反応生成物とする物質か
ら生ずるアンモニアを同じGlDHとNADHによ
つて反応せしめグルタミン酸と水に変化せしめる
点にある。
在するアンモニアをGlDH、α−KG、NADPH
によつてグルタミン酸に変化させ、しかる後にア
ンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素の
反応によりアンモニアを反応生成物とする物質か
ら生ずるアンモニアを同じGlDHとNADHによ
つて反応せしめグルタミン酸と水に変化せしめる
点にある。
本発明のアンモニアを反応生成物とする物質の
定量法によれば、検体中にすでに存在するアンモ
ニアを前もつて消去させてしまうので、同一検体
でそのまま添加したアンモニアを反応生成物とし
て生じせしめる酵素により、アンモニアを反応生
成物とする物質からアンモニアを生成させ、直接
生成するアンモニア全量をアンモニアを反応生成
物として生じせしめる酵素によつて分解されたア
ンモニアとして測定することができるのでアンモ
ニアを反応生成物とする物質含量は正確に測定す
ることができる。
定量法によれば、検体中にすでに存在するアンモ
ニアを前もつて消去させてしまうので、同一検体
でそのまま添加したアンモニアを反応生成物とし
て生じせしめる酵素により、アンモニアを反応生
成物とする物質からアンモニアを生成させ、直接
生成するアンモニア全量をアンモニアを反応生成
物として生じせしめる酵素によつて分解されたア
ンモニアとして測定することができるのでアンモ
ニアを反応生成物とする物質含量は正確に測定す
ることができる。
ここに示した本発明のアンモニア消費系の反応
の一例を式(1)で表わせば次の通りである。
の一例を式(1)で表わせば次の通りである。
本発明のアンモニアを反応生成物とする物質の
定量法は、アンモニアを含有する検体中（例えば
血清・尿中）のアンモニアを反応生成物とする物
質の定量に用いられる。これらの検体にはすでに
多量のアンモニアが絶えず存在しているために直
接グルタミン酸生成反応によつて測定するとアン
モニアを反応生成物とする物質量に相当量のアン
モニア量を付加して測定されてしまうので正確な
定量値が得られない。
定量法は、アンモニアを含有する検体中（例えば
血清・尿中）のアンモニアを反応生成物とする物
質の定量に用いられる。これらの検体にはすでに
多量のアンモニアが絶えず存在しているために直
接グルタミン酸生成反応によつて測定するとアン
モニアを反応生成物とする物質量に相当量のアン
モニア量を付加して測定されてしまうので正確な
定量値が得られない。
本発明ではあらかじめ検体中に存在するアンモ
ニアをNADPHにより消費させてしまつた後、
アンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素
を検体中のアンモニアを反応生成物とする物質に
作用させるので、そこに生成するNADの量は正
確にアンモニアを反応生成物とする物質の量とし
て測定されるものである。
ニアをNADPHにより消費させてしまつた後、
アンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素
を検体中のアンモニアを反応生成物とする物質に
作用させるので、そこに生成するNADの量は正
確にアンモニアを反応生成物とする物質の量とし
て測定されるものである。
本発明のアンモニアを反応生成物とする物質の
定量法は、単にエンドポイント法によつてもアン
モニアを含有する検体中のアンモニアを反応生成
物とする物質を定量できるし、また適量なアンモ
ニアを反応生成物として生じせしめる酵素の量を
選択することによつて、レイトアセイ（rate
assay）にてアンモニアを反応生成物とする物質
を定量できる。
定量法は、単にエンドポイント法によつてもアン
モニアを含有する検体中のアンモニアを反応生成
物とする物質を定量できるし、また適量なアンモ
ニアを反応生成物として生じせしめる酵素の量を
選択することによつて、レイトアセイ（rate
assay）にてアンモニアを反応生成物とする物質
を定量できる。
本発明においてあらかじめ存在するアンモニア
を消去させるには第一にアンモニアとα−KGよ
り水とグルタミン酸を生成するGlDH（EC1，４，
１，３）が必要となる。この反応には助酵素とし
てNADPHの存在が必要であるがNADPHの添
加量を少なくするために反応で生成するNADP+
を還元するグルコース６リン酸脱水素酵素Ｇ−６
−PDH（EC1，１，1.49）などのNADP+を還元
する酵素を過剰のグルコース６リン酸（Ｇ−６−
Ｐ）などのNADP+を還元する酵素反応基質と一
縮に添加しておいて６ホスホグルコン酸（６−
PG）を生成させると同時にアンモニアをα−
KGによつて完全に水とグルタミン酸に変化させ
てしまうのである。
を消去させるには第一にアンモニアとα−KGよ
り水とグルタミン酸を生成するGlDH（EC1，４，
１，３）が必要となる。この反応には助酵素とし
てNADPHの存在が必要であるがNADPHの添
加量を少なくするために反応で生成するNADP+
を還元するグルコース６リン酸脱水素酵素Ｇ−６
−PDH（EC1，１，1.49）などのNADP+を還元
する酵素を過剰のグルコース６リン酸（Ｇ−６−
Ｐ）などのNADP+を還元する酵素反応基質と一
縮に添加しておいて６ホスホグルコン酸（６−
PG）を生成させると同時にアンモニアをα−
KGによつて完全に水とグルタミン酸に変化させ
てしまうのである。
式(1)の反応においてα−KG→グルタミン酸の
変化によつてNADPHがNADP+になると340nm
による吸光度が一旦は減少するがＧ−６−PDH
によつて再びNADPHに変化するために340nmに
よる吸光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつた
らアンモニアが全部消費されたことになる。
変化によつてNADPHがNADP+になると340nm
による吸光度が一旦は減少するがＧ−６−PDH
によつて再びNADPHに変化するために340nmに
よる吸光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつた
らアンモニアが全部消費されたことになる。
本発明のアンモニア消費群のうちGlDHは必須
であるが助酵素のNADP+を還元する酵素はＧ−
６−PDHに限らずNADP+を助酵素として還元す
る酵素であれば任意に選択することができる。
であるが助酵素のNADP+を還元する酵素はＧ−
６−PDHに限らずNADP+を助酵素として還元す
る酵素であれば任意に選択することができる。
例えばＧ−６−PDH（EC1，１，１，49）
（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）
６−Ｐ−GDH（EC1，１，１，44）
（６ホスホグルコン酸脱水素酵素）
ic−DH（EC1，１，１，42）
（イソクエン酸脱水素酵素）
などがあり、これらを用いる場合はそれぞれ過剰
の基質としてＧ−６−Ｐ、６−PG、イソクエン
酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。
の基質としてＧ−６−Ｐ、６−PG、イソクエン
酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。
このように検体中のすでに存在していたアンモ
ニアは消費されアンモニアを反応生成物として生
じせしめる酵素の作用によつて生成するアンモニ
アは直接測定できる状態となつたわけである。
ニアは消費されアンモニアを反応生成物として生
じせしめる酵素の作用によつて生成するアンモニ
アは直接測定できる状態となつたわけである。
次に本発明におけるアンモニアを反応生成物と
する物質例えば尿素を定量する場合の反応系を式
(2)で表わせば次の通りである。
する物質例えば尿素を定量する場合の反応系を式
(2)で表わせば次の通りである。
なお太線はアンモニア消費系の反応に関する系
で、細線はウレアーゼの反応に関する系である。
即ち、検体に定量する尿素に応じた基質、酵素及
び過剰のNADHを添加して反応せしめることに
よつて尿素をNADHの減少量として340nmによ
る測定で定量することができる。ここで添加に必
須のものとしてはα−KG並びにGlDHであるが、
最初のアンモニア消費反応系に添加されていたも
のを使用することもできる。最初の添加量が少な
いときにはここで追加して添加することもでき
る。またウレアーゼの添加も必須である。また
NADHの添加は必須であつてNADHのNAD+へ
の変化によつて生じる340nmの減少によつて尿素
含量が測定できることになる。
で、細線はウレアーゼの反応に関する系である。
即ち、検体に定量する尿素に応じた基質、酵素及
び過剰のNADHを添加して反応せしめることに
よつて尿素をNADHの減少量として340nmによ
る測定で定量することができる。ここで添加に必
須のものとしてはα−KG並びにGlDHであるが、
最初のアンモニア消費反応系に添加されていたも
のを使用することもできる。最初の添加量が少な
いときにはここで追加して添加することもでき
る。またウレアーゼの添加も必須である。また
NADHの添加は必須であつてNADHのNAD+へ
の変化によつて生じる340nmの減少によつて尿素
含量が測定できることになる。
反応はPH7.5の緩衝液中で25℃で行なわれる。
式(2)の反応において尿素がウレアーゼによつて分
解されアンモニアからα−KGとともにGlDHに
よつてグルタミン酸になるときにNADHが
NAD+になつて蓄積する。この時検体中のアンモ
ニアを消費するために添加されていたNADPH
がNADHと同様に酸化されて、さらにＧ−６−
PDHによつてNADHにもどると危惧される。し
かし、NADPHはNADHに比較してごく微量、
例えば10分の１以下しか存在しないため、Ｇ−６
−PDHサイクルが回る事は無視できるものであ
る。
式(2)の反応において尿素がウレアーゼによつて分
解されアンモニアからα−KGとともにGlDHに
よつてグルタミン酸になるときにNADHが
NAD+になつて蓄積する。この時検体中のアンモ
ニアを消費するために添加されていたNADPH
がNADHと同様に酸化されて、さらにＧ−６−
PDHによつてNADHにもどると危惧される。し
かし、NADPHはNADHに比較してごく微量、
例えば10分の１以下しか存在しないため、Ｇ−６
−PDHサイクルが回る事は無視できるものであ
る。
また検体中のアンモニアを消費するために含有
されているＧ−６−PDHがNAD+を還元すると
危惧されるがここで含有される酸素は助酵素に高
い特異性を持つものが選ばれているため、その心
配は必要としない。
されているＧ−６−PDHがNAD+を還元すると
危惧されるがここで含有される酸素は助酵素に高
い特異性を持つものが選ばれているため、その心
配は必要としない。
生成したNADはそのまま340nmの吸光度の減
少によつて尿素含量を測定することができる。
少によつて尿素含量を測定することができる。
また尿素以外にもアンモニアを反応生成物とす
る物質の定量も同様に行なうことができる。例え
ばクレアチニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタ
ミン、モノカルボキシリツク酸、Ｎ−カルバミル
βアラニン、Ｌ−ウレイトコハク酸、Ｎ−ホルム
イミノ−Ｌ−アスパラギン酸、シトシン、アデニ
ン、グアニン、アデノシン、シチジン、ADP、
４アミノイミダゾール、ペトリン、デオキシ−
CMP、ニトリル、尿素等の物質の定量にそれら
のアンモニアを反応生成物とする物質に作用し、
アンモニアを生成せしせめる酵素例えばクレアチ
ニンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ、グルタミ
ナーゼ、アミダーゼ、β−ウレイトプロピオナー
ゼ、ウレイトサクシナーゼ、ホルムイミノアスパ
ラギン酸−デイミナーゼ、シトシンデアミナー
ゼ、アデニンデアミナーゼ、グアニンデアミナー
ゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナ
ーゼ、ADPデアミナーゼ、アミノイミダゾラー
ゼ、ペトリンデアミナーゼ、デオキシCMPデア
ミナーゼ、ニトリラーゼ、ウレアーゼとともに用
いることによりアンモニアを反応生成物とする物
質を定量することができる。
る物質の定量も同様に行なうことができる。例え
ばクレアチニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタ
ミン、モノカルボキシリツク酸、Ｎ−カルバミル
βアラニン、Ｌ−ウレイトコハク酸、Ｎ−ホルム
イミノ−Ｌ−アスパラギン酸、シトシン、アデニ
ン、グアニン、アデノシン、シチジン、ADP、
４アミノイミダゾール、ペトリン、デオキシ−
CMP、ニトリル、尿素等の物質の定量にそれら
のアンモニアを反応生成物とする物質に作用し、
アンモニアを生成せしせめる酵素例えばクレアチ
ニンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ、グルタミ
ナーゼ、アミダーゼ、β−ウレイトプロピオナー
ゼ、ウレイトサクシナーゼ、ホルムイミノアスパ
ラギン酸−デイミナーゼ、シトシンデアミナー
ゼ、アデニンデアミナーゼ、グアニンデアミナー
ゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナ
ーゼ、ADPデアミナーゼ、アミノイミダゾラー
ゼ、ペトリンデアミナーゼ、デオキシCMPデア
ミナーゼ、ニトリラーゼ、ウレアーゼとともに用
いることによりアンモニアを反応生成物とする物
質を定量することができる。
また上記例以外のアンモニアを反応生成物とす
る物質をも本発明の範囲に含むものである。
る物質をも本発明の範囲に含むものである。
このように本発明はアンモニアを反応生成物と
する物質の定量において前もつて検体中のアンモ
ニアを消費せしめたために引続き同一検体で直接
アンモニアを反応生成物とする物質の定量を可能
としたものでアンモニアを反応生成物とする物質
の自動分析にきわめて適した方法である。
する物質の定量において前もつて検体中のアンモ
ニアを消費せしめたために引続き同一検体で直接
アンモニアを反応生成物とする物質の定量を可能
としたものでアンモニアを反応生成物とする物質
の自動分析にきわめて適した方法である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 （尿素の定量）
α−KG 4.2mM
NADPH 0.013mM
Ｇ−６−Ｐ 3.2mM
Ｇ−６−PDH（Yeast） 3.2u／ml
GlDH（Beef liver） 38u／ml
以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH＝
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整した尿素含有検体（Ａ：0.1mg／ml Ｂ：0.2
mg／ml Ｃ：0.4mg／ml Ｄ：0.8mg／ml）10μ
を添加した。
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整した尿素含有検体（Ａ：0.1mg／ml Ｂ：0.2
mg／ml Ｃ：0.4mg／ml Ｄ：0.8mg／ml）10μ
を添加した。
それぞれ25℃で５分間保温した後340nmの吸光
度を測定し吸光度の変化が停止したところで
5mM NADH 72μを添加し340nmの吸光度の
増加を約２分間追跡した後100u／mlウレアーゼ
50μを添加し、340nmの吸光度の減少を測定し
た。
度を測定し吸光度の変化が停止したところで
5mM NADH 72μを添加し340nmの吸光度の
増加を約２分間追跡した後100u／mlウレアーゼ
50μを添加し、340nmの吸光度の減少を測定し
た。
ΔE：Ａ：0.066 Ｂ：0.132 Ｃ：0.264 Ｄ：0.527
これを次式によつて計算した結果、検体中にす
でに存在していたアンモニア2mMは完全に消費
され、引続き測定される尿素の定量に影響なく検
体中の尿素含量が定量された。
でに存在していたアンモニア2mMは完全に消費
され、引続き測定される尿素の定量に影響なく検
体中の尿素含量が定量された。
尿素量mg／ml＝ΔE／6.2×3.132／0.01
×60.06÷２÷1000
ΔE＝NADHの減少による吸光度の減少
6.2＝NADHの1mMの吸光度
3.132＝全液量
0.01＝検体量
60.06＝尿素の分子量
２＝尿素１分子よりアンモニア２分子生成。
Claims (1)
- １ 検体にグルタミン酸脱水素酵素、２−オキソ
グルタール酸、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフエートそしてニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエートを還元する
酵素と基質を添加混合し、混合液中にすでに存在
するアンモニアを消費せしめ、その際生成された
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ートをニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフエートを還元せしめる酵素を用いて再度還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
エートに変換せしめ、しかる後還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド及び反応生成物とし
てアンモニアを生成せしめる酵素を添加して反応
せしめることを特徴とするアンモニアを反応生成
物とする生体物質の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12888382A JPS5921399A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12888382A JPS5921399A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5921399A JPS5921399A (ja) | 1984-02-03 |
| JPH0218074B2 true JPH0218074B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=14995706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12888382A Granted JPS5921399A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5921399A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60152090U (ja) * | 1984-03-22 | 1985-10-09 | カルソニックカンセイ株式会社 | 電動フアン |
-
1982
- 1982-07-26 JP JP12888382A patent/JPS5921399A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5921399A (ja) | 1984-02-03 |
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