JPH0412119B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、NH3またはATPの測定法に関する。
さらに詳しくは、本発明は被検液中のNH3また
はATPを測定するに当り、NH3およびATPのい
ずれか一成分を含有する被検液、被検しない
NH3およびATPのいずれか他の一方と水溶性炭
酸塩にMgの存在下カルバメートキナーゼを作
用させ、生成したADPとキナーゼ基質用リン化
合物にMgの存在下キナーゼを作用させてATP
とキナーゼ反応生成物に変換させ、生成したキナ
ーゼ反応生成物を定量することを特徴とする
NH3およびATPのいずれか一成分を含有する被
検液中の成分の測定法である。 従来、NH3の酵素的測定法としては、グルタ
メートデヒドロゲナーゼを用いる方法〔Anal.
Bio−chem.，16，132〜138（1966）〕が知られて
いるが、消費されたNADHの比色定量法であり、
１分子のNH3よりNADH1分子しか減少しないた
めに感度が低かつた。またATPの酵素的測定法
としては、定量すべきATPとグルコースにヘキ
ソキナーゼを作用させてATPの量に応じたADP
とグルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグ
ルコース−６−リン酸とNADPにグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成し
たNADPHを340nｍにおける吸光度により定量
する方法（Methodsin Enzymatic Analysis，
２，789）が知られているが、１分子のATPより
NADPH1分子しか生成しないために感度が低か
つた。さらにまたルシフエラーゼを用いる生物発
光によるATPの高感度測定法も知られているが、
この方法はコストが高く、特殊な測定機を必要と
するために簡単な方法とは言えず、さらに血清成
分などによりクエンチングがあるなどの問題があ
つた。 そこで、本発明者は臨床検査への応用を可能に
するためには、NH3またはATPの定量を可視部
での比色定量が可能であること、サイクリング反
応を利用して非常に高感度な測定が可能であるこ
と、臨床検査に応用した場合、簡便な方法である
ことに着目し、種々研究を続けた結果、本発明を
完成させたものである。 本発明の被検液としては、少なくともNH3ま
たはATPのいずれか一成分を含有するものであ
ればよく、NH3またはATPを予め含有してなる
被検液やNH3またはATPを生成してなるNH3ま
たはATP含有被検液が挙げられる。NH3を生成
してなるNH3含有被検液としては、ペプチド結
合以外のＣ−Ｎ結合に加水分解酵素を作用させて
NH3を生成する酵素反応系のものが挙げられる。
例えば、次の酵素反応系が例示されるが、酵素活
性測定、基質またはその生成物の定量を行うこと
ができる。 アスパラギナーゼ（E.C.3.5.1.1） Ｌ−アスパラギン＋H2O→Ｌ−アスパラギン
酸＋NH3 グルタミナーゼ（E.C.3.5.1.2） Ｌ−グルタミン＋H2O→Ｌ−グルタミン酸＋
NH3 ウレアーゼ（E.C.3.5.1.5） 尿素＋H2O→2NH3＋CO2 ウレイドスクシナーゼ（E.C.3.5.1.7） Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパラギン酸＋
H2O→Ｌ−アスパラギン酸＋CO2＋NH3 ニコチンアミダーゼ（E.C.3.5.1.19） ニコチンアミド＋H2O→ニコチン酸＋NH3 シトルリナーゼ（E.C.3.5.1.20） Ｌ−シトルリン＋H2O→Ｌ−オルニチン＋CO2
＋NH3 ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（E.
C.3.5.1.42） NMN＋H2O→ニコチン酸MN＋NH3 アルギニンデイミナーゼ（E.C.3.5.3.6） Ｌ−アルギニン＋H2O→シトルリン＋NH3 シトシンアミナーゼ（E.C.3.5.4.1） シトシン＋H2O→ウラシル＋NH3 アデニンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.2） アデニン＋H2O→ヒポキサンチン＋NH3 グアニンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.3） グアニン＋H2O→キサンチン＋NH3 アデノシンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.4） アデノシン＋H2O→イノシン＋NH3 シチジンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.5） シチジン＋H2O→ウリジン＋NH3 AMPデアミナーゼ（E.C.3.5.4.6） AMP＋H2O→IMP＋NH3 dCMPデアミナーゼ（E.C.3.5.4.12） dCMP＋H2O→dUMP＋NH3 dCTPデアミナーゼ（E.C.3.5.4.13） dCTP＋H2O→dUTP＋NH3 グアノシンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.15） グアノシン＋H2O→キサントシン＋NH3 クレアチニンデイミナーゼ（E.C.3.5.4.21） グレアチニン＋H2O→Ｎ−メチルヒダントイ
ン ＋NH3 ATPを生成してなるATP含有被検液として
は、ATPAMP＋ppi変換反応する酵素反応系
のものが挙げられる。例えば、 ピルベート、オルソホスフエート ジキナーゼ
（E.C.2.7.9.1） ATP＋ピルビン酸＋piAMP＋ホスホエノール
ピルビン酸＋ppi の酵素反応系が例示されるが、その酵素活性測定
または生成物の定量のための被検液としても用い
ることができる。 本発明においては、少なくともNH3、HCO3 -
とATPにMgの存在下カルバメートキナーゼを
作用させてADPとカルバモイルホスフエートに
変換させる酵素反応系および生成したADPとキ
ナーゼ基質用リン化合物にMgの存在下キナー
ゼを作用させてATPとキナーゼ反応生成物に変
換させる酵素反応系との組合せによりATPサイ
クリング主反応させ、この主反応系により生成し
たキナーゼ反応生成物を、H2O2を生成するH2O2
生成酵素反応系、デヒドロゲナーゼの作用により
NADHからNADに変換させるNADH補酵素反
応系あるいはH2O2生成酵素反応系とNADH補酵
素反応系を組合せた酵素反応系を利用することに
よりNH3およびATPのいずれか一成分を含有す
る被検液中のNH3またはATPを定量するもので
ある。 本発明の主反応系に用いられるカルバメートキ
ナーゼはNH3、ATPおよびCO2を基質とし、Mg
の存在下ADPとカルバモイルホスフエートを
生成する反応を触媒する酵素（E.C.2.7.2.2）であ
り、マメまたは微生物のいずれに由来するもので
もよいが、例えばSerratia marcescens、
Streptococcus faecalis、Streptococcus lactis、
Escherichia coli由来のものが挙げられる
〔Methods in Enzymology，Vol.V，903，
Academic Ｐ−ress（1962）、Australian J.Biol.
Sci.，９，253（1956）、Biochim.Biophys.Acta.，
37，442（1960）〕。この酵素の作用により、被検液
中のNH3は用いるATPおよびCO2と共にADPと
カルバモイルホスフエートを生成し、また被検液
中のATPは用いるNH3およびCO2と共にADPと
カルバモイルホスフエートを生成する反応を行わ
せる。 上記酵素反応によつて生成したADPはキナー
ゼ基質と共にMgの存在下キナーゼを作用させ
てATPとキナーゼ反応生成物を生成させること
によりATPサイクリング反応が行われ、ATPが
増幅される。 上記のキナーゼ反応系の好適な例としては、次
の酵素反応系が例示される。 ピルベートキナーゼ（E.C.2.7.1.40） ATP＋ピルビン酸Mg ――→ ←―― ADP ＋ホスホエノールピルビン酸 クレアチンホスホキナーゼ（E.C.2.7.3.2） ATP＋クレアチン酸Mg ――→ ←―― ADP ＋クレアチンホスフエート 前記カルバメートキナーゼ反応系とキナーゼ反
応系との組合せによる主反応系においては、その
反応液量は、通常１テスト当り10μから３mlの
範囲の容量で反応し得る。反応温度は通常37℃で
１分間以上行えばよい。カルバメートキナーゼは
反応時間または待時間により異なるが、通常１テ
スト当り0.5〜100単位、好ましくは５単位以上で
作用し得る。キナーゼ、例えばピルベートキナー
ゼ、クレアチンキナーゼは反応時間または待時間
により異なるが、１テスト当り0.5〜100単位、好
ましくは２単位以上で作用し得る。用いられる
ATP、NH3またはCO2およびキナーゼ基質用リ
ン化合物、例えばピルビン酸ホスフエート、クレ
アチンホスフエートは、少なくとも被検液中の
NH3またはATPのモル量以上に用いればよい。 次に、上記主反応により生成したキナーゼ反応
生成物、例えばピルビン酸は ピルビン酸とチアミンピロホスフエート
（TPP）にFADとO2の存在下ピルビートオキ
シダーゼを作用させてアセチルリン酸、CO2お
よびH2O2に変換させる酵素反応系、 ピルビン酸にNADHの存在下ラクテートデ
ヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とNAD
に変換させる酵素反応、または ピルビン酸にNADHの存在下ラクテートデ
ヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とNAD
に変換させる酵素反応系、生成した乳酸にO2
の存在下ラクテートオキシダーゼを作用させて
ピルビン酸とH2O2に変換させる酵素反応系お
よび生成したH2O2にカタラーゼを作用させて
O2とH2Oに変換させる酵素反応系の組合せに
よるサイクリング反応系、 などを用いて生成したH2O2消費されたO2または
消費されたNADHを定量することにより被検液
中のNH3またはATPを測定することができる。 またキナーゼ反応生成物、例えばクレアチンは クレアチンにクレアチナーゼを作用させてザ
ルコシン、尿素およびH2Oに変換させ、生成
したザルコシンにO2の存在下ザルコシンオキ
シダーゼを作用させてグリシンとH2O2に変換
させる酵素反応系、または 前記酵素反応系、尿素にウレアーゼを作用
させてNH3とCO2に変換させる酵素反応系およ
びキナーゼがクレアチンホスホキナーゼであ
り、キナーゼ基質用リン化合物がクレアチンホ
スフエートである前記主反応系の組合にによる
サイクリング反応系、 などを用いて生成したH2O2または消費されたO2
を定量することにより被検液中のNH3または
ATPを測定することができる。 上記の各酵素反応系〜においては、各酵素
は反応時間または待期間により異なるが、通常１
テスト当り0.5〜100単位、好ましくは２単位以上
で作用し得る。これらの各酵素はすべて「酵素ハ
ンドブツク」（朝倉書店、1982年12月１日発行）
に記載されていて、公知の酵素であり、いずれの
由来のものでもよいが、安定な酵素が有利であ
る。これらの酵素反応系の反応は、前記主反応系
と同時に行われるが、反応媒体としては、各酵素
活性の安定PH域の媒体であればよく、通常PH6.5
〜8.5の範囲の緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ト
リス−塩酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、
ジメチルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペス
−NaOH緩衝液などが用いられる。反応時間は
長時間にする方がより高感度に変化が生じるもの
であるが、通常20秒以上であればよく、好ましく
は30秒〜10分間程度の範囲で適宜選択し得る。 このようにして反応させて検出できる変化を測
定するのであるが、この検出できる変化とは、１
回のサイクルにて少なくとも１分子の成分を消費
するか、または生成する成分の変化である。簡便
には、生成したH2O2、消費されたO2または消費
されたNADHを定量すればよい。 生成したH2O2の定量に当つては、H2O2電極を
用いる電気化学的変化の量として定量するか、ま
たはH2O2と反応して検出できる生成物に変化す
る指示薬組成物を用いて定量してもよい。この指
示薬組成物としては、例えば生成したH2O2と反
応して安定した赤色を形成する４価のチタン化合
物とキシレノールオレンジによつて生成した色素
を比色定量するか、または生成したH2O2とフエ
ノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはホモバ
ニリン酸と４−アミノアンチピリンにパーオキシ
ダーゼを作用させて、生成した色素を比色定量す
ることにより生成したH2O2を測定することがで
きる。上記の４−アミノアンチピリンの代りに４
−アミノフエナゾーンを用いてもよく、また２，
６−ジクロロフエノールインドフエノールとパー
オキシダーゼとの組合せ、グアヤク脂とパーオキ
シダーゼとの組合せなどによるパーオキシダーゼ
を用いる方法も用いることができる。 消費されるO2の定量に当つては、通常O2電極
を用いる電気化学的変化の量として定量すればよ
い。上記各酵素反応系において使用されるO2は
通常溶存O2が使用されるので、その変化の量を
定量することにより、キナーゼ反応生成物の量を
測定することができる。 消費されたNADHの定量に当つては、予め用
いたNADH量から酵素反応後に残存するNADH
量の差を求めることによつて行われる。この
NADHの定量は、公知の種々のNADHの定量法
が用いられる。例えば、共存するNADに特異的
吸収波長でなく、NADHの特異的吸収波長であ
る波長に基いて吸光度測定すればよい。NADは
260nｍ付近に特異的極大吸収波長を有するのに
対し、NADHは260nｍおよび340nｍ付近に特異
的極大吸収波長を有することから、NADHの定
量のための吸収波長域としては320〜360nｍ付
近、好ましくは340nｍ付近である。この波長を
吸光度値として測定することによりNADHを定
量できる。 別のNADHの定量法としては、NADHの水素
原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の発
色による方法が挙げられる。例えばテトラゾリウ
ム塩や２，６−ジクロロフエノールインドフエノ
ールなどが用いられ、好ましくは水溶性テトラゾ
リウム塩とジアホラーゼまたはフエナジンメトサ
ルフエートを組合せたものを用いればよい。この
水素伝達系色原体はNADHの水素原子を受けて
呈色するホルマザン色素を形成するので、この色
素をその吸収波長域、例えば500〜550nｍ付近に
おける極大吸収に基いて比色定量することにより
消費されたNADHを定量することができる。 次に、本発明における反応の原理について例示
すると、次式の通りである。 (1) 主反応系 H2O2生成反応系 (2) 主反応系 (1)に同じ NADH補酵素反応系 (3) 主反応系 (1)に同じ ピルビン酸サイクリング反応系 (4) 主反応系 H2O2生成反応系 色原性化合物；４−アミノアンチピリンとフエ
ノールまたはＮ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン このように、本発明によれば、簡便かつ高感度
でNH3またはATPの測定が可能であり、さらに
NH3を遊離させる種々の被検液中の成分の測定
のために利用できるだけでなく、エンド・ポイン
ト法だけでなく、レイト法も可能な方法であり、
しかも特殊な反応容器を必要とせず、一般の恒温
槽で反応が可能な方法である。 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、これにより本発明を限定とするものではな
い。 実施例 １ ピルビートオキシダーゼ反応系を用いて生成し
たH2O2をパーオキシダーゼ法により形成した
色素の比色定量法によるNH3の測定 0.2M トリス−塩酸緩衝液（PH7.5） 0.75ml 0.1M MgCl2 0.3ml 0.5ｍＭ ATP 0.3ml 50ｍＭ NaHCO3 0.3ml 15ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.3ml 15ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン
0.3ml パーオキシダーゼ（5U／テスト、シグマ社製） カルバメートキナーゼ（ストレプトコツカス・フ
エカリス産生、8U／テスト、シグマ社製） 50ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.3ml 50ｍＭ リン酸緩衝液（PH7.5） 0.3ml １ｍＭ FAD 0.01ml 10ｍＭ チアミンピロホスフエート 0.05ml ピルベートキナーゼ（ウサギ筋肉由来5U／テス
ト、シグマ社製） ピルベートオキシダーゼ（5U／テスト、東洋醸
造社製） 水 0.09ml 上記混合溶液3.0mlに０、0.5、1.0、2.0、4.0、
6.0、8.0および10.0ｍＭ硫安溶液20μを各々加
え、37℃で10分間反応した後、545nｍで比色定
量した。その結果は第１図の通りであつて、
NH3の量と吸光度に良好な直線関係が得られた。 実施例 ２ ピルベートオキシダーゼ反応系を用いて生成し
たH2O2をパーオキシダーゼ法により形成した
色素の比色定量法による尿素の測定 実施例１の混合溶液にウレアーゼ（12U／テス
ト、東洋紡社製）を添加した混合溶液3.0mlに０、
0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0および10.0ｍＭ尿素
溶液20μを各々加え、37℃で10分間反応した
後、545nｍで比色定量した。その結果は第２図
の通りであつて、尿素の量と吸光度に良好な直線
関係が得られた。 また、上記反応において、尿素溶液の代りに人
血清を1/8、1/4、1/2、3/4に希釈した希釈血清
20μを各々使用した結果は、第３図の通りであ
つて、血清中の尿素量と吸光度に良好な直線関係
が得られた。 実施例 ３ 消費NADHの定量法によるNH3の測定 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5ml） 0.75ml 0.1M MgCl2 0.3ml 50ｍＭ ATP 0.3ml 50ｍＭ NaHCO3 0.3ml カルバメートキナーゼ（8U／テスト） 50ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.3ml 7.5ｍＭ NADH 0.1ml ラクテートデヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉由来、
4U／テスト、シグマ社製） ピルベートキナーゼ（5U／テスト） 水 0.95ml 上記混合溶液3.0mlに０、0.5、1.0、2.0、4.0、
6.0、8.0および10.0ｍＭ硫安溶液20μを各々加
え、37℃で10分間反応させた後、340nｍの吸光
度を測定した。その結果は第４図の通りであつ
て、NH3の量と吸光度に良好な直線関係が得ら
れた。 実施例 ４ ザルコシンオキシダーゼ反応系を用いて生成し
たH2O2をパーオキシダーゼ法により形成した
色素の比色定量法によるNH3の測定 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5） 0.75ml 0.1M MgCl2 0.3ml 50ｍＭ ATP 0.3ml 50ｍＭ NaHCO3 0.3ml カルバメートキナーゼ（8U／１テスト） クレアメンホスホキナーゼ（ウサギ筋肉由来、
5U／１テスト） 0.1M クレアチンホスフエート クレアチナーゼ（20U／１テスト、東洋醸造社
製） ザルコシンオキシダーゼ（10U／１テスト、東洋
紡醸造社製） 15ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.3ml 15ｍＭ フエノール 0.3ml パーオキシダーゼ（5U／１テスト） 水 0.45ml 上記混合溶液3.0mlに０、0.5、1.0、2.0、4.0、
6.0、8.0および10.0ｍＭ硫安溶液20μを各々加
え、37℃で10分間反応させた後、500nｍの吸光
度を測定する比色定量を行つた結果、第５図の通
り、NH3の量と吸光度に良好な直線関係が得ら
れた。 実施例 ５ ピルビン酸サイクリング反応系により消費され
たNADHの比色定量法によるNH3の測定 50ｍＭ ジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液
（PH7.0） 10ｍＭ MgCl2 50ｍＭ NaHCO3 カルバメートキナーゼ（8U／ml） ５ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.25ｍＭ NADH ラクテートデヒドロゲナーゼ（10U／ml） ピルベートキナーゼ（5U／ml） ラクテートオキシダーゼ（10U／ml、東洋醸造社
製） カタラーゼ（60U／ml） 上記混合溶液1.0mlに０、10、20、40、60、80
および100μM硫安溶液20μを各々加え、37℃で
反応させた。硫安添加後３分と５分の340nｍに
おける吸光度の差を測定した。その結果は第６図
の通りであつて、NH3が非常に高感度で測定さ
れた。 実施例 ６ ピルビン酸サイクリング反応により消費された
NADHの比色定量法および消費されたO2の電
気化学的定量法によるATPの測定 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5ml） 10ｍMMgCl2 0.3ml ５ｍＭ硫安 0.3ml ラクテート デヒドロゲナーゼ（10U／ml） カルバメートキナーゼ（8U／ml） ピルベートキナーゼ（5U／ml） ５ｍＭホスホエノールピルビン酸 0.3ml 3μMFAD 0.01ml 0.2ｍＭチアミンピロホスフエート 0.05ml ラクテートオキシダーゼ（5U／ml） 上記混合溶液1.0mlを37℃で予備加温した後、
これに０、20、40、60、80および100μMATP溶
液10μを各々加え、正確に５分間反応させ、0.5
％SDC溶液（PH6.0）2.0mlを加えて反応を停止さ
せた。次いでこれら反応処理液を545nｍの吸光
度を測定した結果は第７図の通りATP量と吸光
度に良好の相関関係が得られた。 また上記混合溶液1.0mlを溶存酸素計（石川製
作所）付反応容器に入れ、37℃で加温した後、上
記と同じATP溶液10μを添加し、経時的に酸素
消費量を測定した。その結果は第８図の通りであ
つて、ATP量と酵素消費量との間に直線関係が
得られた。
さらに詳しくは、本発明は被検液中のNH3また
はATPを測定するに当り、NH3およびATPのい
ずれか一成分を含有する被検液、被検しない
NH3およびATPのいずれか他の一方と水溶性炭
酸塩にMgの存在下カルバメートキナーゼを作
用させ、生成したADPとキナーゼ基質用リン化
合物にMgの存在下キナーゼを作用させてATP
とキナーゼ反応生成物に変換させ、生成したキナ
ーゼ反応生成物を定量することを特徴とする
NH3およびATPのいずれか一成分を含有する被
検液中の成分の測定法である。 従来、NH3の酵素的測定法としては、グルタ
メートデヒドロゲナーゼを用いる方法〔Anal.
Bio−chem.，16，132〜138（1966）〕が知られて
いるが、消費されたNADHの比色定量法であり、
１分子のNH3よりNADH1分子しか減少しないた
めに感度が低かつた。またATPの酵素的測定法
としては、定量すべきATPとグルコースにヘキ
ソキナーゼを作用させてATPの量に応じたADP
とグルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグ
ルコース−６−リン酸とNADPにグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成し
たNADPHを340nｍにおける吸光度により定量
する方法（Methodsin Enzymatic Analysis，
２，789）が知られているが、１分子のATPより
NADPH1分子しか生成しないために感度が低か
つた。さらにまたルシフエラーゼを用いる生物発
光によるATPの高感度測定法も知られているが、
この方法はコストが高く、特殊な測定機を必要と
するために簡単な方法とは言えず、さらに血清成
分などによりクエンチングがあるなどの問題があ
つた。 そこで、本発明者は臨床検査への応用を可能に
するためには、NH3またはATPの定量を可視部
での比色定量が可能であること、サイクリング反
応を利用して非常に高感度な測定が可能であるこ
と、臨床検査に応用した場合、簡便な方法である
ことに着目し、種々研究を続けた結果、本発明を
完成させたものである。 本発明の被検液としては、少なくともNH3ま
たはATPのいずれか一成分を含有するものであ
ればよく、NH3またはATPを予め含有してなる
被検液やNH3またはATPを生成してなるNH3ま
たはATP含有被検液が挙げられる。NH3を生成
してなるNH3含有被検液としては、ペプチド結
合以外のＣ−Ｎ結合に加水分解酵素を作用させて
NH3を生成する酵素反応系のものが挙げられる。
例えば、次の酵素反応系が例示されるが、酵素活
性測定、基質またはその生成物の定量を行うこと
ができる。 アスパラギナーゼ（E.C.3.5.1.1） Ｌ−アスパラギン＋H2O→Ｌ−アスパラギン
酸＋NH3 グルタミナーゼ（E.C.3.5.1.2） Ｌ−グルタミン＋H2O→Ｌ−グルタミン酸＋
NH3 ウレアーゼ（E.C.3.5.1.5） 尿素＋H2O→2NH3＋CO2 ウレイドスクシナーゼ（E.C.3.5.1.7） Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパラギン酸＋
H2O→Ｌ−アスパラギン酸＋CO2＋NH3 ニコチンアミダーゼ（E.C.3.5.1.19） ニコチンアミド＋H2O→ニコチン酸＋NH3 シトルリナーゼ（E.C.3.5.1.20） Ｌ−シトルリン＋H2O→Ｌ−オルニチン＋CO2
＋NH3 ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（E.
C.3.5.1.42） NMN＋H2O→ニコチン酸MN＋NH3 アルギニンデイミナーゼ（E.C.3.5.3.6） Ｌ−アルギニン＋H2O→シトルリン＋NH3 シトシンアミナーゼ（E.C.3.5.4.1） シトシン＋H2O→ウラシル＋NH3 アデニンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.2） アデニン＋H2O→ヒポキサンチン＋NH3 グアニンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.3） グアニン＋H2O→キサンチン＋NH3 アデノシンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.4） アデノシン＋H2O→イノシン＋NH3 シチジンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.5） シチジン＋H2O→ウリジン＋NH3 AMPデアミナーゼ（E.C.3.5.4.6） AMP＋H2O→IMP＋NH3 dCMPデアミナーゼ（E.C.3.5.4.12） dCMP＋H2O→dUMP＋NH3 dCTPデアミナーゼ（E.C.3.5.4.13） dCTP＋H2O→dUTP＋NH3 グアノシンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.15） グアノシン＋H2O→キサントシン＋NH3 クレアチニンデイミナーゼ（E.C.3.5.4.21） グレアチニン＋H2O→Ｎ−メチルヒダントイ
ン ＋NH3 ATPを生成してなるATP含有被検液として
は、ATPAMP＋ppi変換反応する酵素反応系
のものが挙げられる。例えば、 ピルベート、オルソホスフエート ジキナーゼ
（E.C.2.7.9.1） ATP＋ピルビン酸＋piAMP＋ホスホエノール
ピルビン酸＋ppi の酵素反応系が例示されるが、その酵素活性測定
または生成物の定量のための被検液としても用い
ることができる。 本発明においては、少なくともNH3、HCO3 -
とATPにMgの存在下カルバメートキナーゼを
作用させてADPとカルバモイルホスフエートに
変換させる酵素反応系および生成したADPとキ
ナーゼ基質用リン化合物にMgの存在下キナー
ゼを作用させてATPとキナーゼ反応生成物に変
換させる酵素反応系との組合せによりATPサイ
クリング主反応させ、この主反応系により生成し
たキナーゼ反応生成物を、H2O2を生成するH2O2
生成酵素反応系、デヒドロゲナーゼの作用により
NADHからNADに変換させるNADH補酵素反
応系あるいはH2O2生成酵素反応系とNADH補酵
素反応系を組合せた酵素反応系を利用することに
よりNH3およびATPのいずれか一成分を含有す
る被検液中のNH3またはATPを定量するもので
ある。 本発明の主反応系に用いられるカルバメートキ
ナーゼはNH3、ATPおよびCO2を基質とし、Mg
の存在下ADPとカルバモイルホスフエートを
生成する反応を触媒する酵素（E.C.2.7.2.2）であ
り、マメまたは微生物のいずれに由来するもので
もよいが、例えばSerratia marcescens、
Streptococcus faecalis、Streptococcus lactis、
Escherichia coli由来のものが挙げられる
〔Methods in Enzymology，Vol.V，903，
Academic Ｐ−ress（1962）、Australian J.Biol.
Sci.，９，253（1956）、Biochim.Biophys.Acta.，
37，442（1960）〕。この酵素の作用により、被検液
中のNH3は用いるATPおよびCO2と共にADPと
カルバモイルホスフエートを生成し、また被検液
中のATPは用いるNH3およびCO2と共にADPと
カルバモイルホスフエートを生成する反応を行わ
せる。 上記酵素反応によつて生成したADPはキナー
ゼ基質と共にMgの存在下キナーゼを作用させ
てATPとキナーゼ反応生成物を生成させること
によりATPサイクリング反応が行われ、ATPが
増幅される。 上記のキナーゼ反応系の好適な例としては、次
の酵素反応系が例示される。 ピルベートキナーゼ（E.C.2.7.1.40） ATP＋ピルビン酸Mg ――→ ←―― ADP ＋ホスホエノールピルビン酸 クレアチンホスホキナーゼ（E.C.2.7.3.2） ATP＋クレアチン酸Mg ――→ ←―― ADP ＋クレアチンホスフエート 前記カルバメートキナーゼ反応系とキナーゼ反
応系との組合せによる主反応系においては、その
反応液量は、通常１テスト当り10μから３mlの
範囲の容量で反応し得る。反応温度は通常37℃で
１分間以上行えばよい。カルバメートキナーゼは
反応時間または待時間により異なるが、通常１テ
スト当り0.5〜100単位、好ましくは５単位以上で
作用し得る。キナーゼ、例えばピルベートキナー
ゼ、クレアチンキナーゼは反応時間または待時間
により異なるが、１テスト当り0.5〜100単位、好
ましくは２単位以上で作用し得る。用いられる
ATP、NH3またはCO2およびキナーゼ基質用リ
ン化合物、例えばピルビン酸ホスフエート、クレ
アチンホスフエートは、少なくとも被検液中の
NH3またはATPのモル量以上に用いればよい。 次に、上記主反応により生成したキナーゼ反応
生成物、例えばピルビン酸は ピルビン酸とチアミンピロホスフエート
（TPP）にFADとO2の存在下ピルビートオキ
シダーゼを作用させてアセチルリン酸、CO2お
よびH2O2に変換させる酵素反応系、 ピルビン酸にNADHの存在下ラクテートデ
ヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とNAD
に変換させる酵素反応、または ピルビン酸にNADHの存在下ラクテートデ
ヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とNAD
に変換させる酵素反応系、生成した乳酸にO2
の存在下ラクテートオキシダーゼを作用させて
ピルビン酸とH2O2に変換させる酵素反応系お
よび生成したH2O2にカタラーゼを作用させて
O2とH2Oに変換させる酵素反応系の組合せに
よるサイクリング反応系、 などを用いて生成したH2O2消費されたO2または
消費されたNADHを定量することにより被検液
中のNH3またはATPを測定することができる。 またキナーゼ反応生成物、例えばクレアチンは クレアチンにクレアチナーゼを作用させてザ
ルコシン、尿素およびH2Oに変換させ、生成
したザルコシンにO2の存在下ザルコシンオキ
シダーゼを作用させてグリシンとH2O2に変換
させる酵素反応系、または 前記酵素反応系、尿素にウレアーゼを作用
させてNH3とCO2に変換させる酵素反応系およ
びキナーゼがクレアチンホスホキナーゼであ
り、キナーゼ基質用リン化合物がクレアチンホ
スフエートである前記主反応系の組合にによる
サイクリング反応系、 などを用いて生成したH2O2または消費されたO2
を定量することにより被検液中のNH3または
ATPを測定することができる。 上記の各酵素反応系〜においては、各酵素
は反応時間または待期間により異なるが、通常１
テスト当り0.5〜100単位、好ましくは２単位以上
で作用し得る。これらの各酵素はすべて「酵素ハ
ンドブツク」（朝倉書店、1982年12月１日発行）
に記載されていて、公知の酵素であり、いずれの
由来のものでもよいが、安定な酵素が有利であ
る。これらの酵素反応系の反応は、前記主反応系
と同時に行われるが、反応媒体としては、各酵素
活性の安定PH域の媒体であればよく、通常PH6.5
〜8.5の範囲の緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ト
リス−塩酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、
ジメチルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペス
−NaOH緩衝液などが用いられる。反応時間は
長時間にする方がより高感度に変化が生じるもの
であるが、通常20秒以上であればよく、好ましく
は30秒〜10分間程度の範囲で適宜選択し得る。 このようにして反応させて検出できる変化を測
定するのであるが、この検出できる変化とは、１
回のサイクルにて少なくとも１分子の成分を消費
するか、または生成する成分の変化である。簡便
には、生成したH2O2、消費されたO2または消費
されたNADHを定量すればよい。 生成したH2O2の定量に当つては、H2O2電極を
用いる電気化学的変化の量として定量するか、ま
たはH2O2と反応して検出できる生成物に変化す
る指示薬組成物を用いて定量してもよい。この指
示薬組成物としては、例えば生成したH2O2と反
応して安定した赤色を形成する４価のチタン化合
物とキシレノールオレンジによつて生成した色素
を比色定量するか、または生成したH2O2とフエ
ノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはホモバ
ニリン酸と４−アミノアンチピリンにパーオキシ
ダーゼを作用させて、生成した色素を比色定量す
ることにより生成したH2O2を測定することがで
きる。上記の４−アミノアンチピリンの代りに４
−アミノフエナゾーンを用いてもよく、また２，
６−ジクロロフエノールインドフエノールとパー
オキシダーゼとの組合せ、グアヤク脂とパーオキ
シダーゼとの組合せなどによるパーオキシダーゼ
を用いる方法も用いることができる。 消費されるO2の定量に当つては、通常O2電極
を用いる電気化学的変化の量として定量すればよ
い。上記各酵素反応系において使用されるO2は
通常溶存O2が使用されるので、その変化の量を
定量することにより、キナーゼ反応生成物の量を
測定することができる。 消費されたNADHの定量に当つては、予め用
いたNADH量から酵素反応後に残存するNADH
量の差を求めることによつて行われる。この
NADHの定量は、公知の種々のNADHの定量法
が用いられる。例えば、共存するNADに特異的
吸収波長でなく、NADHの特異的吸収波長であ
る波長に基いて吸光度測定すればよい。NADは
260nｍ付近に特異的極大吸収波長を有するのに
対し、NADHは260nｍおよび340nｍ付近に特異
的極大吸収波長を有することから、NADHの定
量のための吸収波長域としては320〜360nｍ付
近、好ましくは340nｍ付近である。この波長を
吸光度値として測定することによりNADHを定
量できる。 別のNADHの定量法としては、NADHの水素
原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の発
色による方法が挙げられる。例えばテトラゾリウ
ム塩や２，６−ジクロロフエノールインドフエノ
ールなどが用いられ、好ましくは水溶性テトラゾ
リウム塩とジアホラーゼまたはフエナジンメトサ
ルフエートを組合せたものを用いればよい。この
水素伝達系色原体はNADHの水素原子を受けて
呈色するホルマザン色素を形成するので、この色
素をその吸収波長域、例えば500〜550nｍ付近に
おける極大吸収に基いて比色定量することにより
消費されたNADHを定量することができる。 次に、本発明における反応の原理について例示
すると、次式の通りである。 (1) 主反応系 H2O2生成反応系 (2) 主反応系 (1)に同じ NADH補酵素反応系 (3) 主反応系 (1)に同じ ピルビン酸サイクリング反応系 (4) 主反応系 H2O2生成反応系 色原性化合物；４−アミノアンチピリンとフエ
ノールまたはＮ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン このように、本発明によれば、簡便かつ高感度
でNH3またはATPの測定が可能であり、さらに
NH3を遊離させる種々の被検液中の成分の測定
のために利用できるだけでなく、エンド・ポイン
ト法だけでなく、レイト法も可能な方法であり、
しかも特殊な反応容器を必要とせず、一般の恒温
槽で反応が可能な方法である。 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、これにより本発明を限定とするものではな
い。 実施例 １ ピルビートオキシダーゼ反応系を用いて生成し
たH2O2をパーオキシダーゼ法により形成した
色素の比色定量法によるNH3の測定 0.2M トリス−塩酸緩衝液（PH7.5） 0.75ml 0.1M MgCl2 0.3ml 0.5ｍＭ ATP 0.3ml 50ｍＭ NaHCO3 0.3ml 15ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.3ml 15ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン
0.3ml パーオキシダーゼ（5U／テスト、シグマ社製） カルバメートキナーゼ（ストレプトコツカス・フ
エカリス産生、8U／テスト、シグマ社製） 50ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.3ml 50ｍＭ リン酸緩衝液（PH7.5） 0.3ml １ｍＭ FAD 0.01ml 10ｍＭ チアミンピロホスフエート 0.05ml ピルベートキナーゼ（ウサギ筋肉由来5U／テス
ト、シグマ社製） ピルベートオキシダーゼ（5U／テスト、東洋醸
造社製） 水 0.09ml 上記混合溶液3.0mlに０、0.5、1.0、2.0、4.0、
6.0、8.0および10.0ｍＭ硫安溶液20μを各々加
え、37℃で10分間反応した後、545nｍで比色定
量した。その結果は第１図の通りであつて、
NH3の量と吸光度に良好な直線関係が得られた。 実施例 ２ ピルベートオキシダーゼ反応系を用いて生成し
たH2O2をパーオキシダーゼ法により形成した
色素の比色定量法による尿素の測定 実施例１の混合溶液にウレアーゼ（12U／テス
ト、東洋紡社製）を添加した混合溶液3.0mlに０、
0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0および10.0ｍＭ尿素
溶液20μを各々加え、37℃で10分間反応した
後、545nｍで比色定量した。その結果は第２図
の通りであつて、尿素の量と吸光度に良好な直線
関係が得られた。 また、上記反応において、尿素溶液の代りに人
血清を1/8、1/4、1/2、3/4に希釈した希釈血清
20μを各々使用した結果は、第３図の通りであ
つて、血清中の尿素量と吸光度に良好な直線関係
が得られた。 実施例 ３ 消費NADHの定量法によるNH3の測定 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5ml） 0.75ml 0.1M MgCl2 0.3ml 50ｍＭ ATP 0.3ml 50ｍＭ NaHCO3 0.3ml カルバメートキナーゼ（8U／テスト） 50ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.3ml 7.5ｍＭ NADH 0.1ml ラクテートデヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉由来、
4U／テスト、シグマ社製） ピルベートキナーゼ（5U／テスト） 水 0.95ml 上記混合溶液3.0mlに０、0.5、1.0、2.0、4.0、
6.0、8.0および10.0ｍＭ硫安溶液20μを各々加
え、37℃で10分間反応させた後、340nｍの吸光
度を測定した。その結果は第４図の通りであつ
て、NH3の量と吸光度に良好な直線関係が得ら
れた。 実施例 ４ ザルコシンオキシダーゼ反応系を用いて生成し
たH2O2をパーオキシダーゼ法により形成した
色素の比色定量法によるNH3の測定 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5） 0.75ml 0.1M MgCl2 0.3ml 50ｍＭ ATP 0.3ml 50ｍＭ NaHCO3 0.3ml カルバメートキナーゼ（8U／１テスト） クレアメンホスホキナーゼ（ウサギ筋肉由来、
5U／１テスト） 0.1M クレアチンホスフエート クレアチナーゼ（20U／１テスト、東洋醸造社
製） ザルコシンオキシダーゼ（10U／１テスト、東洋
紡醸造社製） 15ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.3ml 15ｍＭ フエノール 0.3ml パーオキシダーゼ（5U／１テスト） 水 0.45ml 上記混合溶液3.0mlに０、0.5、1.0、2.0、4.0、
6.0、8.0および10.0ｍＭ硫安溶液20μを各々加
え、37℃で10分間反応させた後、500nｍの吸光
度を測定する比色定量を行つた結果、第５図の通
り、NH3の量と吸光度に良好な直線関係が得ら
れた。 実施例 ５ ピルビン酸サイクリング反応系により消費され
たNADHの比色定量法によるNH3の測定 50ｍＭ ジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液
（PH7.0） 10ｍＭ MgCl2 50ｍＭ NaHCO3 カルバメートキナーゼ（8U／ml） ５ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.25ｍＭ NADH ラクテートデヒドロゲナーゼ（10U／ml） ピルベートキナーゼ（5U／ml） ラクテートオキシダーゼ（10U／ml、東洋醸造社
製） カタラーゼ（60U／ml） 上記混合溶液1.0mlに０、10、20、40、60、80
および100μM硫安溶液20μを各々加え、37℃で
反応させた。硫安添加後３分と５分の340nｍに
おける吸光度の差を測定した。その結果は第６図
の通りであつて、NH3が非常に高感度で測定さ
れた。 実施例 ６ ピルビン酸サイクリング反応により消費された
NADHの比色定量法および消費されたO2の電
気化学的定量法によるATPの測定 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.5ml） 10ｍMMgCl2 0.3ml ５ｍＭ硫安 0.3ml ラクテート デヒドロゲナーゼ（10U／ml） カルバメートキナーゼ（8U／ml） ピルベートキナーゼ（5U／ml） ５ｍＭホスホエノールピルビン酸 0.3ml 3μMFAD 0.01ml 0.2ｍＭチアミンピロホスフエート 0.05ml ラクテートオキシダーゼ（5U／ml） 上記混合溶液1.0mlを37℃で予備加温した後、
これに０、20、40、60、80および100μMATP溶
液10μを各々加え、正確に５分間反応させ、0.5
％SDC溶液（PH6.0）2.0mlを加えて反応を停止さ
せた。次いでこれら反応処理液を545nｍの吸光
度を測定した結果は第７図の通りATP量と吸光
度に良好の相関関係が得られた。 また上記混合溶液1.0mlを溶存酸素計（石川製
作所）付反応容器に入れ、37℃で加温した後、上
記と同じATP溶液10μを添加し、経時的に酸素
消費量を測定した。その結果は第８図の通りであ
つて、ATP量と酵素消費量との間に直線関係が
得られた。
第１図はピルベートオキシダーゼ反応系を用い
て生成したH2O2をパーオキシダーゼ法により形
成した色素の比色定量法により測定したNH3の
検量線、第２図は同法により測定した尿素の検量
線、第３図は同法により測定した血清中の尿素の
検量線、第４図は消費NADHの比色定量法によ
り測定したNH3の検量線第５図はザルコシンオ
キシダーゼ反応系を用いて生成したH2O2をパー
オキシダーゼ法により形成した色素の比色定量法
により測定したNH3の検量線により測定した
NH3サイクリング反応系による、第６図はピル
ビン酸サイクリング反応系により消費された
NADHの比色定量法により測定したNH3の検量
線、第７図はピルビン酸サイクリング反応系によ
り消費されたNADHの比色定量法により測定し
たATPの検量線、第８図はピルビン酸サイクリ
ング反応系により消費されたO2の電気化学的定
量法により測定したATPの検量線を示す。
て生成したH2O2をパーオキシダーゼ法により形
成した色素の比色定量法により測定したNH3の
検量線、第２図は同法により測定した尿素の検量
線、第３図は同法により測定した血清中の尿素の
検量線、第４図は消費NADHの比色定量法によ
り測定したNH3の検量線第５図はザルコシンオ
キシダーゼ反応系を用いて生成したH2O2をパー
オキシダーゼ法により形成した色素の比色定量法
により測定したNH3の検量線により測定した
NH3サイクリング反応系による、第６図はピル
ビン酸サイクリング反応系により消費された
NADHの比色定量法により測定したNH3の検量
線、第７図はピルビン酸サイクリング反応系によ
り消費されたNADHの比色定量法により測定し
たATPの検量線、第８図はピルビン酸サイクリ
ング反応系により消費されたO2の電気化学的定
量法により測定したATPの検量線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被検液中のNH3またはATPを測定するに当
り、NH3およびATPのいずれか一成分を含有す
る被検液、被検しないNH3およびATPのいずれ
か他の一方と水溶性炭酸塩にMg++の存在下カル
バメートキナーゼを作用させ、生成したADPと
キナーゼ基質用リン化合物にMg++の存在下キナ
ーゼを作用させてATPとキナーゼ反応生成物に
変換させ、生成したキナーゼ反応生成物を定量す
ることを特徴とするNH3およびATPのいずれか
一成分を含有する被検液中の成分の測定法。 ２ NH3およびATPのいずれか一成分を含有す
る被検液、被検しないNH3およびATPのいずれ
か他の一方と水溶性炭酸塩にMg++の存在下カル
バメートキナーゼを作用させ、生成したADPと
ホスホエノールピルビン酸にMg++の存在下ピル
ベートキナーゼを作用させてATPとピルビン酸
に変換させ、生成したピルビン酸を定量する特許
請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ 生成したピルビン酸、チアミンピロホスフエ
ート（FADを添加しても良い）にO2の存在下ピ
ルベートキナーゼを作用させ、消費されたO2ま
たは生成したH2O2を定量する特許請求の範囲第
２項記載の測定法。 ４ 消費されたO2をO2電極を用いる電気化学的
定量手段により定量する特許請求の範囲第３項記
載の測定法。 ５ 生成したH2O2をH2O2電極を用いる電気化学
的定量手段により定量する特許請求の範囲第３項
記載の測定法。 ６ 生成したH2O2と色原性化合物にパーオキシ
ダーゼを作用させ、生成した色素を比色定量する
特許請求の範囲第３項記載の測定法。 ７ 生成したピリビン酸とNADHにラクテート
デヒドルゲナーゼを作用させ、消費された
NADHを比色定量する特許請求の範囲第２項記
載の測定法。 ８ 比色定量を340nｍにおける吸光度の測定に
より行う特許請求の範囲第７項記載の測定法。 ９ 生成したピリビン酸とNADHにラクテート
デヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とNAD
に変換させる酵素反応系および生成したＬ−乳酸
をO2の存在下ラクテートオキシダーゼを作用さ
せてピルビン酸とH2O2に変換させる酵素反応系
との組合せによるピルビン酸サイクリング反応を
行わせ、消費されたNADH、消費されたO2また
は生成したH2O2を定量する特許請求の範囲第２
項記載の測定法。 １０ 消費されたNADHを340nｍにおける吸光
度の測定により比色定量する特許請求の範囲第９
項記載の測定法。 １１ 消費されたO2をO2電極を用いる電気化学
的定量手段により定量する特許請求の範囲第９項
記載の測定法。 １２ 生成したピルビン酸とNADHにラクテー
トデヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸と
NADに変換させる酵素反応系、生成したＬ−乳
酸をO2の存在下ラクテートオキシダーゼを作用
させてピルビン酸とH2O2に変換させる酵素反応
系および生成したH2O2にカタラーゼ又はNADH
−ペンオキシダーゼを作用させてO2に変換させ
る酵素反応系との組合せによるピルビン酸−
H2O2サイクリング反応を行わせ、消費された
NADHを定量する特許請求の範囲第２項記載の
測定法。 １３ 消費されたNADHを340nｍにおける吸光
度の測定により比色定量する特許請求の範囲第１
２項記載の測定法。 １４ NH3およびATPのいずれか一成分を含有
する被検液、被検しないNH3およびATPのいず
れか他の一方と水溶性炭酸塩にMg++の存在下カ
ルバメートキナーゼを作用させ、生成したADP
とクレアチンホスフエートにMg++の存在下クレ
アチンキナーゼを作用させてATPとクレアチン
に変換させ、生成したクレアチンを定量する特許
請求の範囲第１項記載の測定法。 １５ 生成したクレアチンにクレアチナーゼを作
用させ、生成したザルコシンにO2の存在下ザル
コシンオキシダーゼを作用させ、消費されたO2
または生成したH2O2を定量する特許請求の範囲
第１４項記載の測定法。 １６ 消費されたO2をO2電極を用いる電気化学
的定量手段により定量する特許請求の範囲第１５
項記載の測定法。 １７ 生成したH2O2をH2O2電極を用いる電気化
学的定量手段により定量する特許請求の範囲第１
５項記載の測定法。 １８ 生成したH2O2と色原性化合物にパーオキ
シダーゼを作用させ、生成した色素を比色定量す
る特許請求の範囲第１５項記載の測定法。 １９ NH3を含有する被検液、ATPと水溶性炭
酸塩にMg++の存在下カルバメートキナーゼを作
用させてADPとカルバモイルホスフエートに変
換させる酵素反応系、生成したADPとクレアチ
ンホスフエートにMg++の存在下クレアチンキナ
ーゼを作用させてATPとクレアチンに変換させ
る酵素反応系、生成したクレアチンにクレアチナ
ーゼを作用させて尿素とザルコシンに変換させつ
酵素反応系および生成した尿素にウレアーゼを作
用させてNH3とCO2に変換させる酵素反応系との
組合せによるNH3測定のための酵素サイクリン
グ反応を行わせ、生成したザルコシンにO2の存
在下ザルコシンオキシダーゼを作用させ、消費さ
れたO2または生成したH2O2を定量することによ
りNH3を定量する特許請求の範囲第１５項記載
の測定法。 ２０ 消費されたO2をO2電極を用いる電気化学
的定量手段により定量する特許請求の範囲第１９
項記載の測定法。 ２１ 生成したH2O2をH2O2電極を用いる電気化
学的定量手段により定量する特許請求の範囲第１
９項記載の測定法。 ２２ 生成したH2O2と色原性化合物にパーオキ
シダーゼを作用させ、生成した色素を比色定量す
る特許請求の範囲第１９項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8723483A JPS59213399A (ja) | 1983-05-18 | 1983-05-18 | Ｎｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8723483A JPS59213399A (ja) | 1983-05-18 | 1983-05-18 | Ｎｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59213399A JPS59213399A (ja) | 1984-12-03 |
| JPH0412119B2 true JPH0412119B2 (ja) | 1992-03-03 |
Family
ID=13909148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8723483A Granted JPS59213399A (ja) | 1983-05-18 | 1983-05-18 | Ｎｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59213399A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8407736D0 (en) * | 1984-03-26 | 1984-05-02 | Univ London | Detecting specific polynucleotide sequences |
| JPS63160600A (ja) * | 1986-12-24 | 1988-07-04 | Fujirebio Inc | ピルビン酸定量用試薬 |
| JP3034969B2 (ja) * | 1991-03-01 | 2000-04-17 | 旭化成工業株式会社 | アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物 |
-
1983
- 1983-05-18 JP JP8723483A patent/JPS59213399A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59213399A (ja) | 1984-12-03 |
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