JPS6047698A - Νｈ↓３またはａｔｐの測定法 - Google Patents
Νｈ↓３またはａｔｐの測定法Info
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- JPS6047698A JPS6047698A JP15702683A JP15702683A JPS6047698A JP S6047698 A JPS6047698 A JP S6047698A JP 15702683 A JP15702683 A JP 15702683A JP 15702683 A JP15702683 A JP 15702683A JP S6047698 A JPS6047698 A JP S6047698A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＮＨ３またはＡ Ｔ Ｐの測定法に関する。
さらに詳しくは、本発明は被検液中のＮＨ３またはＡＴ
Ｐを測定するに当シ、ＮＨ３およびＡＴＰのいずれか一
成分を含有する被検液、被検しないＮＨ３およびＡＴＰ
のいずれか他の一方と水溶性炭酸塩にＭｇ＋およびアセ
チルグルタミン酸の存在下刃ルバモイルリン酸合成酵素
を作用させ、生成したＡＤＰとキナーゼ基質用リン化合
物にＭｇ の存在下キナーゼを作用させてＡＴＰとキナ
ーゼ反応生成物に変換させ、生成したキナーゼ反応生成
物を定量することを特徴とするＮＨ３およびＡＴＰのい
ずれか一成分を含有する被恢液中の成分の測定法である
。
Ｐを測定するに当シ、ＮＨ３およびＡＴＰのいずれか一
成分を含有する被検液、被検しないＮＨ３およびＡＴＰ
のいずれか他の一方と水溶性炭酸塩にＭｇ＋およびアセ
チルグルタミン酸の存在下刃ルバモイルリン酸合成酵素
を作用させ、生成したＡＤＰとキナーゼ基質用リン化合
物にＭｇ の存在下キナーゼを作用させてＡＴＰとキナ
ーゼ反応生成物に変換させ、生成したキナーゼ反応生成
物を定量することを特徴とするＮＨ３およびＡＴＰのい
ずれか一成分を含有する被恢液中の成分の測定法である
。
従来、’Ｎ１（３の酵素的測定法としては、グルタメー
トデヒドロゲナーゼを用いる方法ＣＡｎａｌ、Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍ、、 １６．１３２−１３８ （１９６６）
：） ７５：知られているが、消費されたＮＡＤＨの比
色定量法であり、１分子のＮＨ３よりＮＡＤＨＩ分子し
か減少しないために感度が低かった。またＡＴＰの酵素
内街Ｉ］定法としては、定量すべきＡＴＰとグルコース
にヘキソキナーゼを作用させてＡＴＰの址に１６じたＡ
ＤＰとグルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグル
コース−６一リンｍとＮＡＤＰにグ／レコースー６−リ
ン１酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成１． ｆｃ
Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｒを３４０ ｎｍにおける吸光度Ｖこ
より定量する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ、 ２．７８９） が知られて
いるカニ、１分子のＡＴＰよりＮＡＤＰＨＩ分子しか生
成しないために感度が低かった。さらにまたルシフェラ
ーゼを用いる生物発光によるＡ Ｔ Ｐの高感度測定法
も知られているが、この方法はコストが高く、特殊な測
定機を必要とするために間車な方法とは言えず、さらに
血清成分などによりクエンチングカ鳴るなどの問題があ
った。
トデヒドロゲナーゼを用いる方法ＣＡｎａｌ、Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍ、、 １６．１３２−１３８ （１９６６）
：） ７５：知られているが、消費されたＮＡＤＨの比
色定量法であり、１分子のＮＨ３よりＮＡＤＨＩ分子し
か減少しないために感度が低かった。またＡＴＰの酵素
内街Ｉ］定法としては、定量すべきＡＴＰとグルコース
にヘキソキナーゼを作用させてＡＴＰの址に１６じたＡ
ＤＰとグルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグル
コース−６一リンｍとＮＡＤＰにグ／レコースー６−リ
ン１酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成１． ｆｃ
Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｒを３４０ ｎｍにおける吸光度Ｖこ
より定量する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ、 ２．７８９） が知られて
いるカニ、１分子のＡＴＰよりＮＡＤＰＨＩ分子しか生
成しないために感度が低かった。さらにまたルシフェラ
ーゼを用いる生物発光によるＡ Ｔ Ｐの高感度測定法
も知られているが、この方法はコストが高く、特殊な測
定機を必要とするために間車な方法とは言えず、さらに
血清成分などによりクエンチングカ鳴るなどの問題があ
った。
そこで、本発明者は臨床検査への応用を可能にするため
には、ＮＨ３またはＡＴＰの定量を可視部での比色定量
が可能であること、サイクリング反応を利用して非常に
高感度な測定が可能であること、臨床検査に応用した場
合、簡便な方法であることに着目し、種々研究を続けた
結果、本発明を完成させたものである。
には、ＮＨ３またはＡＴＰの定量を可視部での比色定量
が可能であること、サイクリング反応を利用して非常に
高感度な測定が可能であること、臨床検査に応用した場
合、簡便な方法であることに着目し、種々研究を続けた
結果、本発明を完成させたものである。
本発明の被検液としては、少なくともＮＨ３またはＡＴ
Ｐのいずれか一成分を含有するものであればよく、ＮＨ
３またはＡＴＰを予め含有してなる被検液やＮｆ（３ま
たばＡＴＰを生成してなるＮｆ（３またＩ′１ＡＴＰ含
有被検液が挙げられる。１＜Ｈ３を生成し。
Ｐのいずれか一成分を含有するものであればよく、ＮＨ
３またはＡＴＰを予め含有してなる被検液やＮｆ（３ま
たばＡＴＰを生成してなるＮｆ（３またＩ′１ＡＴＰ含
有被検液が挙げられる。１＜Ｈ３を生成し。
てなるＮＨ３含有被検液としては、ペプチド結合以外の
Ｃ−Ｎ結合に加水分解酵素を作用させてＮＨ３を生成す
る酵素反応系のものが挙げられる。例えば、次の酵素反
応系が例示されるが、酵素活性測定、基質またはその生
成物の定量を行うことができる。
Ｃ−Ｎ結合に加水分解酵素を作用させてＮＨ３を生成す
る酵素反応系のものが挙げられる。例えば、次の酵素反
応系が例示されるが、酵素活性測定、基質またはその生
成物の定量を行うことができる。
■アスパラギナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，１）Ｌ−ア
スパラギン＋１（２０→Ｌ−アスパラギン酸十十ＮＨ３ ■グルタミナーゼ（ＬＣ，３，５，１，２）Ｌ−グルタ
ミン＋Ｈ，、Ｏ−＋Ｌ−グルクミン酸十Ｈ３ ■ウレアーゼ（Ｅ、Ｃ，，３，５，１，５）尿素−ｉ−
Ｈ２０＝−）２ＮＨ３＋ ＣＯ２■ウレイドスクシナー
ゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，７）Ｎ−カルバモイル−Ｌ−
アスノＺ−ｙギン酸＋Ｈ７〇−→Ｌ−アスパラギン酸＋
ＣＯ２＋ＮＨ３■ニコチンアミダーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５
，１，１９）ニコチンアミド＋Ｈ２０−−→ニコチン酸
十ＮＨ３■／トルリナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，２０
）Ｌ−シトルリン＋Ｈ２Ｏ−→Ｌ−オルニチン＋ＣＯ２
＋ＮＨ３ ■ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（Ｅ。
スパラギン＋１（２０→Ｌ−アスパラギン酸十十ＮＨ３ ■グルタミナーゼ（ＬＣ，３，５，１，２）Ｌ−グルタ
ミン＋Ｈ，、Ｏ−＋Ｌ−グルクミン酸十Ｈ３ ■ウレアーゼ（Ｅ、Ｃ，，３，５，１，５）尿素−ｉ−
Ｈ２０＝−）２ＮＨ３＋ ＣＯ２■ウレイドスクシナー
ゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，７）Ｎ−カルバモイル−Ｌ−
アスノＺ−ｙギン酸＋Ｈ７〇−→Ｌ−アスパラギン酸＋
ＣＯ２＋ＮＨ３■ニコチンアミダーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５
，１，１９）ニコチンアミド＋Ｈ２０−−→ニコチン酸
十ＮＨ３■／トルリナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，２０
）Ｌ−シトルリン＋Ｈ２Ｏ−→Ｌ−オルニチン＋ＣＯ２
＋ＮＨ３ ■ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ（Ｅ。
Ｃ，３，５，１，４２’）
ＮＭＮ＋Ｈ２Ｏ−→ニコチン酸Ｍ Ｎ ＋Ｎ１−１３■
アルギニンデイミナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，３，６）Ｌ
−アルギニン＋Ｈ２〇−ンシトルリン十Ｎ１１３■ント
シンデアミナ〜ゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，１）シトモノ
十Ｈ２Ｏ−→ウラシル十ＮＦＩ３［Ｆ］アデニンデアミ
ナーセ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，２）アデニン＋Ｈ２Ｏ−
一→ヒポキサンチン十ＮＨ３＠グアニンデアミナーゼ（
Ｅ、Ｃ，３，５，４，３）グアニン＋Ｈ２Ｏ−→キサン
チン＋ＮＨ３０アデノシンデアミナ−セ（Ｅ、Ｃ，３，
５，４，４）アデノシン＋Ｈ２０→イノシン十ＮＨ３＠
ンチジンデアミナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，５）シチ
ジン＋Ｈ２０−−→ウリジン十ＮＨ３ＱＡＭＰデーｙ
ミナーセ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，６）Ａ Ｍ Ｐ ＋Ｈ
２Ｏ−→ＩＭＰ十ＮＨ３■ｄＣＭＰデフ ミナーセ（Ｅ
、Ｃ，３，５，４，１２）ｄＣＭＰ＋Ｈ２０−−→ｄＵ
ＭＰ十Ｎｆ（３■ｄ ＣＴＰデフ ミナーセ（Ｅ、Ｃ，
３，５，４，１３）ｄＣＴＰ＋Ｈ２０−−→ｄＵＴＰ＋
Ｎ）Ｉ３■グアノシンデーｙ ミーｔ−セ（Ｅ、Ｃ，３
，５，４，１５）グアノシン＋Ｉ（２０−キサントシン
＋Ｎｆ（３［相］クレアチニンディミナーゼ（Ｅ、Ｃ，
３、５，４，２１）クレアチニン＋Ｈ２ｏ−→Ｎ−メチ
ルヒダントイン＋ＮＨ３ ＡＴＰを生成してなるＡＴＰ含有被検液としては、ＡＴ
ＰミＡＭＰ＋ｐｐｊ変換反応する酵素反応系のものが挙
げられる。例えば、 ピルベート、オルソホスフェート ジキナーゼ（Ｅ、Ｃ
，２，７，９，１） ＡＴＰ＋ピルビン酸十ｐｌ＃ＡＭＰ＋ホスホエノールピ
ルビン酸＋ｐｐｉ の酵素反応系が例示されるが、その酵素活性測定または
生成物の定量のための被検液としても用いることができ
る。
アルギニンデイミナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，３，６）Ｌ
−アルギニン＋Ｈ２〇−ンシトルリン十Ｎ１１３■ント
シンデアミナ〜ゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，１）シトモノ
十Ｈ２Ｏ−→ウラシル十ＮＦＩ３［Ｆ］アデニンデアミ
ナーセ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，２）アデニン＋Ｈ２Ｏ−
一→ヒポキサンチン十ＮＨ３＠グアニンデアミナーゼ（
Ｅ、Ｃ，３，５，４，３）グアニン＋Ｈ２Ｏ−→キサン
チン＋ＮＨ３０アデノシンデアミナ−セ（Ｅ、Ｃ，３，
５，４，４）アデノシン＋Ｈ２０→イノシン十ＮＨ３＠
ンチジンデアミナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，５）シチ
ジン＋Ｈ２０−−→ウリジン十ＮＨ３ＱＡＭＰデーｙ
ミナーセ（Ｅ、Ｃ，３，５，４，６）Ａ Ｍ Ｐ ＋Ｈ
２Ｏ−→ＩＭＰ十ＮＨ３■ｄＣＭＰデフ ミナーセ（Ｅ
、Ｃ，３，５，４，１２）ｄＣＭＰ＋Ｈ２０−−→ｄＵ
ＭＰ十Ｎｆ（３■ｄ ＣＴＰデフ ミナーセ（Ｅ、Ｃ，
３，５，４，１３）ｄＣＴＰ＋Ｈ２０−−→ｄＵＴＰ＋
Ｎ）Ｉ３■グアノシンデーｙ ミーｔ−セ（Ｅ、Ｃ，３
，５，４，１５）グアノシン＋Ｉ（２０−キサントシン
＋Ｎｆ（３［相］クレアチニンディミナーゼ（Ｅ、Ｃ，
３、５，４，２１）クレアチニン＋Ｈ２ｏ−→Ｎ−メチ
ルヒダントイン＋ＮＨ３ ＡＴＰを生成してなるＡＴＰ含有被検液としては、ＡＴ
ＰミＡＭＰ＋ｐｐｊ変換反応する酵素反応系のものが挙
げられる。例えば、 ピルベート、オルソホスフェート ジキナーゼ（Ｅ、Ｃ
，２，７，９，１） ＡＴＰ＋ピルビン酸十ｐｌ＃ＡＭＰ＋ホスホエノールピ
ルビン酸＋ｐｐｉ の酵素反応系が例示されるが、その酵素活性測定または
生成物の定量のための被検液としても用いることができ
る。
本発明におりては、少なくともＮ１−Ｉ３、ＨＣＯ３−
とＡＴＰＫＭｇ”およびアセチルグルタミン酸の存在下
刃ルバモイルリン酸合成酵素を作用させてＡＤＰとカル
バモイルホスフェートに変換させる１膨素反応系および
生成したＡＤＰとキナーゼ基質用リン化合物にＭｇ ＋
の存在下キナーゼを作用させてＡＴＰとキナーゼ反応生
成物に変換させる酵素反応系との組合せによ５ＡＴＰサ
イクリング主反応させ、この主反応系により生成したキ
ナーゼ反応生成物を、Ｈ２０□を生成するＨ２０□生成
酵素反応系、デヒドロゲナーゼの作用によＪＮＡＤＨか
らＮＡＤに変換させるＮＡＤＨ補酵素反応系あるいはＨ
２０□生成酵素反応系とＮＡＤｆ（補酵素反応系を組合
せた酵素反応系を利用することによ、Ｄ ＮＨ３および
ＡＴＰのいずれか一成分を含有する被検液中のＮＥ（３
またはＡＴＰを定量するものである。
とＡＴＰＫＭｇ”およびアセチルグルタミン酸の存在下
刃ルバモイルリン酸合成酵素を作用させてＡＤＰとカル
バモイルホスフェートに変換させる１膨素反応系および
生成したＡＤＰとキナーゼ基質用リン化合物にＭｇ ＋
の存在下キナーゼを作用させてＡＴＰとキナーゼ反応生
成物に変換させる酵素反応系との組合せによ５ＡＴＰサ
イクリング主反応させ、この主反応系により生成したキ
ナーゼ反応生成物を、Ｈ２０□を生成するＨ２０□生成
酵素反応系、デヒドロゲナーゼの作用によＪＮＡＤＨか
らＮＡＤに変換させるＮＡＤＨ補酵素反応系あるいはＨ
２０□生成酵素反応系とＮＡＤｆ（補酵素反応系を組合
せた酵素反応系を利用することによ、Ｄ ＮＨ３および
ＡＴＰのいずれか一成分を含有する被検液中のＮＥ（３
またはＡＴＰを定量するものである。
本発明の主反応系に用いられるカルバモイルリン酸合成
酵素は、ＮＨ３，２ＡＴＰおよびＣＯ２を基質とし、Ｍ
ｇおよびアセチルグルタミン酸の存在下２ＡＩ）Ｐ、カ
ルバモイルホスフェ−トドリン酸を生成する反応を触媒
する酵素（Ｅ、Ｃ，６，３，４゜１６）であり、各種動
物の肝臓にその存在が知られており、いずれの由来する
ものでもよいが、例えば生肝由来のもの〔Ｅｌｌｉｏｔ
、に、Ｒ，Ｆ、 （１９７６）Ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙ
ｃｌｅ（Ｇｒｉｓｏｌｉａ＋Ｓ、＋Ｂａｇｕｅｎａ。
酵素は、ＮＨ３，２ＡＴＰおよびＣＯ２を基質とし、Ｍ
ｇおよびアセチルグルタミン酸の存在下２ＡＩ）Ｐ、カ
ルバモイルホスフェ−トドリン酸を生成する反応を触媒
する酵素（Ｅ、Ｃ，６，３，４゜１６）であり、各種動
物の肝臓にその存在が知られており、いずれの由来する
ものでもよいが、例えば生肝由来のもの〔Ｅｌｌｉｏｔ
、に、Ｒ，Ｆ、 （１９７６）Ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙ
ｃｌｅ（Ｇｒｉｓｏｌｉａ＋Ｓ、＋Ｂａｇｕｅｎａ。
Ｒ，＆ Ｍａｙｏｒ、Ｆ、ｅｄ、） （３３−１４２，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）。
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）。
ラット肝由来のものＣ，Ｌｕ５ｔｙ、Ｃ，Ｊ、；Ｅｕｒ
、Ｊ。
、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、８５，３７３−３８３ （１９７８）
）が挙げられる。この酵素の作用により、被検液中の
Ｎ１（３は周込るＡＴＰとＣＯ□と共にＡＤＰ、カルバ
モイルホスフェートとリン酸を生成し、また被検液中の
ＡＴＰは用いるＮＨ２とＣＯ２と共にＡＤＰ、カルバモ
イルホスフェートとリン酸を生成する反応を行わせる。
）が挙げられる。この酵素の作用により、被検液中の
Ｎ１（３は周込るＡＴＰとＣＯ□と共にＡＤＰ、カルバ
モイルホスフェートとリン酸を生成し、また被検液中の
ＡＴＰは用いるＮＨ２とＣＯ２と共にＡＤＰ、カルバモ
イルホスフェートとリン酸を生成する反応を行わせる。
上記酵素反応によって生成したＡＩ）Ｐはキナーゼ基゛
質と共にＭｇ＋およびアセチルグルタミン酸の存在下キ
ナーゼを作用させてＡＴＰとキナーゼ反応生成物を生成
させることによりＡＴＰサイクリング反応が行われ、Ａ
ＴＰが増幅される。
質と共にＭｇ＋およびアセチルグルタミン酸の存在下キ
ナーゼを作用させてＡＴＰとキナーゼ反応生成物を生成
させることによりＡＴＰサイクリング反応が行われ、Ａ
ＴＰが増幅される。
上記のキナーゼ反応系の好適な例としては、次の酵素反
応系が例示される。
応系が例示される。
ルビルピン酸
スフエート
前記カルバモイルリン酸合成酵素反応糸とキナーゼ反応
系との組合せによる主反応系におりでは、その反応液量
は、通常ｌテスト当、０１０μｌから３ｍｌの範囲の容
量で反応し得る。反応温度は通常３７℃で１分間以上行
えばよい。カルバモイルリン酸合成酵素は反応時間また
は待時間により異なるが、通常１テスト当り０５〜１ｏ
ｏ単位、好寸しく ｕ ５単位以上で作用し得る。キナ
ーゼ、例えばピルベートキナーゼ、クレアチンキナーゼ
は反応時間または待時間により異なるが、■テスト当り
０５〜１００単位、好ましくは２単位以上で作用し得る
。用ＡられるＡＴＰ、Ｎ）Ｉ３またはｃｏ２およびキナ
ーゼ基質用リン化合物、例えばホスホエノールビルビン
酸、クレアチンポスフェートは、少なくとも被検液中の
ＮＨ３まｆＣばＡ Ｔ Ｐのモル量以上に用いればよ−
。
系との組合せによる主反応系におりでは、その反応液量
は、通常ｌテスト当、０１０μｌから３ｍｌの範囲の容
量で反応し得る。反応温度は通常３７℃で１分間以上行
えばよい。カルバモイルリン酸合成酵素は反応時間また
は待時間により異なるが、通常１テスト当り０５〜１ｏ
ｏ単位、好寸しく ｕ ５単位以上で作用し得る。キナ
ーゼ、例えばピルベートキナーゼ、クレアチンキナーゼ
は反応時間または待時間により異なるが、■テスト当り
０５〜１００単位、好ましくは２単位以上で作用し得る
。用ＡられるＡＴＰ、Ｎ）Ｉ３またはｃｏ２およびキナ
ーゼ基質用リン化合物、例えばホスホエノールビルビン
酸、クレアチンポスフェートは、少なくとも被検液中の
ＮＨ３まｆＣばＡ Ｔ Ｐのモル量以上に用いればよ−
。
次に、上記主反応により生成したキナーゼ反応生成物、
例えばピルビン酸ハ ■ピルビン酸とチアミンピロポスフェート（ＴＰＰ）に
Ｆ’ＡＤと０２ の存在下ピルビートオキシダーゼを作
用させてアセチルリン酸、ｃｏ２およびＨ２０□に変換
させる酵素反応系、 フ ■ピルビン酸にＮＡＤＨの存在下！クテート・デヒドロ
ゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とＮＡＤに変換させる酵
素反応、または ■ピルビン酸にＮＡＤＨの存在下ラクテートデヒドロゲ
ナーゼを作用させてＬ−乳酸とＮＡ Ｉ）に変換させる
酵素反応系、生成Ｌ７た乳酸に０２の存在下ラクテート
オキシダーゼを作用させてピルビン酸とＨ２Ｏ２に変換
させる酵素反応系および生成し７たＦＩ２０２にカタラ
ーゼを作用させてｏ２とＨ２Ｏに変換させる酵素反応系
の組合せによるサイクリング反応系、 などを用いて生成したＨ２Ｏ２消費さ７′１．たｏ２ま
たは消費されたＮ Ａ Ｄ Ｈを定量することにより被
検液中のＮＨ３またはＡ ’Ｉ” Ｐを測定することが
できる。
例えばピルビン酸ハ ■ピルビン酸とチアミンピロポスフェート（ＴＰＰ）に
Ｆ’ＡＤと０２ の存在下ピルビートオキシダーゼを作
用させてアセチルリン酸、ｃｏ２およびＨ２０□に変換
させる酵素反応系、 フ ■ピルビン酸にＮＡＤＨの存在下！クテート・デヒドロ
ゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とＮＡＤに変換させる酵
素反応、または ■ピルビン酸にＮＡＤＨの存在下ラクテートデヒドロゲ
ナーゼを作用させてＬ−乳酸とＮＡ Ｉ）に変換させる
酵素反応系、生成Ｌ７た乳酸に０２の存在下ラクテート
オキシダーゼを作用させてピルビン酸とＨ２Ｏ２に変換
させる酵素反応系および生成し７たＦＩ２０２にカタラ
ーゼを作用させてｏ２とＨ２Ｏに変換させる酵素反応系
の組合せによるサイクリング反応系、 などを用いて生成したＨ２Ｏ２消費さ７′１．たｏ２ま
たは消費されたＮ Ａ Ｄ Ｈを定量することにより被
検液中のＮＨ３またはＡ ’Ｉ” Ｐを測定することが
できる。
またキナーゼ反応生成物、例えばクレアチンは■クレア
チンにクレアチナーゼを作用きぜてツルコソン、尿素お
よびｔ（２０に変換さぜ、生成したザルコシンに０２の
存在下ザルコンンオキシグーゼを作用させてグリ７ンと
１−Ｉ２Ｏ３に変換させる酵素反応系、または ■前記酵素反応系■、尿素にウレアーゼを作用させてＮ
Ｈ３とＣＯ□に変換させる。酵素反応系およびキナーゼ
がクレアチンホスホキナーゼであり、キナーゼ基質用リ
ン化合物がクレアチンホスフェートである前記主反応系
の組合せによるサイクリング反応系、 などを用Ａて生成したＨ２０□または消費された０２を
定量することにより被検液中のＮＨ３またはＡＴＰを測
定することができる。
チンにクレアチナーゼを作用きぜてツルコソン、尿素お
よびｔ（２０に変換さぜ、生成したザルコシンに０２の
存在下ザルコンンオキシグーゼを作用させてグリ７ンと
１−Ｉ２Ｏ３に変換させる酵素反応系、または ■前記酵素反応系■、尿素にウレアーゼを作用させてＮ
Ｈ３とＣＯ□に変換させる。酵素反応系およびキナーゼ
がクレアチンホスホキナーゼであり、キナーゼ基質用リ
ン化合物がクレアチンホスフェートである前記主反応系
の組合せによるサイクリング反応系、 などを用Ａて生成したＨ２０□または消費された０２を
定量することにより被検液中のＮＨ３またはＡＴＰを測
定することができる。
上記の各酵素反応系■〜■においては、各酵素は反応時
間または待期間により異なるが、通常ｌテスト当り０．
５〜１００単位、好ましくは２単位以上で作用し得る。
間または待期間により異なるが、通常ｌテスト当り０．
５〜１００単位、好ましくは２単位以上で作用し得る。
これらの各酵素はすべてｒ酵素ハンドブック」 （朝食
書店、１９８２年１２月１日発行）に記載されていて、
公知の酵素であり、いずれの由来のものでもよりが、安
定な酵素が有利である。これらの酵素反応系の反応は、
前記主反応系と同時に行われるが、反応媒体としては、
各酵素活性の安定ｐＨ域の媒体であればよく、通常ｐＨ
６，５〜８５の範囲の緩衝液、例えばリン岐緩衝液、ト
リス−塩酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ジメチ
ルゲルタール酸−ＮａＯＨ緩衝液、Ｐ Ｉ Ｐ Ｅｓ
−ＮａＯＨ緩衝液などが用いられる。反応時間は長時間
にする方がより高感度に変化が生じるものであるが、通
常２０秒以上であればよく、好捷しくは３０秒〜１０分
間程度の範囲で適宜選択し、得る。
書店、１９８２年１２月１日発行）に記載されていて、
公知の酵素であり、いずれの由来のものでもよりが、安
定な酵素が有利である。これらの酵素反応系の反応は、
前記主反応系と同時に行われるが、反応媒体としては、
各酵素活性の安定ｐＨ域の媒体であればよく、通常ｐＨ
６，５〜８５の範囲の緩衝液、例えばリン岐緩衝液、ト
リス−塩酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ジメチ
ルゲルタール酸−ＮａＯＨ緩衝液、Ｐ Ｉ Ｐ Ｅｓ
−ＮａＯＨ緩衝液などが用いられる。反応時間は長時間
にする方がより高感度に変化が生じるものであるが、通
常２０秒以上であればよく、好捷しくは３０秒〜１０分
間程度の範囲で適宜選択し、得る。
このようにして反応させて検出できる変化ｔ ６１１ｊ
定するのであるが、この検出できる変化とけ、１回のサ
イクルにて少なくとも１分子の成分を消費するか、また
は生成する成分の変化である。簡便には、生−成したＨ
２Ｏ２、消費された０２または消費されたＮ Ａ Ｄ
Ｈを定量すればよい。
定するのであるが、この検出できる変化とけ、１回のサ
イクルにて少なくとも１分子の成分を消費するか、また
は生成する成分の変化である。簡便には、生−成したＨ
２Ｏ２、消費された０２または消費されたＮ Ａ Ｄ
Ｈを定量すればよい。
生成したＨ２０□の定量に当っては、１１□０゜電極を
用いる電気化学的変化の量として定量するか、またはＨ
２Ｏ２と反応して検出できる生成物に変化する指示薬組
成物を用すて定量し７てもよい。この指示薬組成物とし
ては、例えば生成したＨ ２０□と反応して安定した赤
色を形成する４価のチタン化合物とキシレノールオレン
ジによって生成した色素を比色定量するか、捷たは生成
したｌＩ２０□とフエノール、、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニ
リンまたはホモバニリン酸と４−アミノアンチビリ／に
ノ（−オキシダーゼを作用させて、生成した色素を比色
定量または螢光定量することにより生成したＨ２Ｏ２を
測定することができる。上記の４−アミノアンチピリン
の代りに４−アミノツェナゾーンを用いてもよく、また
２、６−シクロロフエノールイ／ドフェノールとパーオ
キシダーゼと、の組合せ、グアヤク脂とパーオキシダー
ゼとの組合せなどによるパーオキシダーゼを用いる方法
も周込ることができる。
用いる電気化学的変化の量として定量するか、またはＨ
２Ｏ２と反応して検出できる生成物に変化する指示薬組
成物を用すて定量し７てもよい。この指示薬組成物とし
ては、例えば生成したＨ ２０□と反応して安定した赤
色を形成する４価のチタン化合物とキシレノールオレン
ジによって生成した色素を比色定量するか、捷たは生成
したｌＩ２０□とフエノール、、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニ
リンまたはホモバニリン酸と４−アミノアンチビリ／に
ノ（−オキシダーゼを作用させて、生成した色素を比色
定量または螢光定量することにより生成したＨ２Ｏ２を
測定することができる。上記の４−アミノアンチピリン
の代りに４−アミノツェナゾーンを用いてもよく、また
２、６−シクロロフエノールイ／ドフェノールとパーオ
キシダーゼと、の組合せ、グアヤク脂とパーオキシダー
ゼとの組合せなどによるパーオキシダーゼを用いる方法
も周込ることができる。
消費烙れる０２の定量に当っては、通常０゜電極を用い
る電気化学的変化の童として定量すればよい。
る電気化学的変化の童として定量すればよい。
上記各酵素反応系において使用される０２は通常溶存０
２が使用されるので、その変化の量を定量することによ
り、キナーゼ反応生成物の量を測定することができる。
２が使用されるので、その変化の量を定量することによ
り、キナーゼ反応生成物の量を測定することができる。
消費されたＮＡＤＨの定量に当っては、予め用いたＮ
Ａ Ｄ Ｈ量から酵素反応後に残存するＮＡＤＨ量の差
をめることによって行われる。このＮＡＤＨの定量は、
公知の種々のＮ Ａ Ｄ ）（の定量法が用いられる。
Ａ Ｄ Ｈ量から酵素反応後に残存するＮＡＤＨ量の差
をめることによって行われる。このＮＡＤＨの定量は、
公知の種々のＮ Ａ Ｄ ）（の定量法が用いられる。
例えば、共存するＮＡＤＫ特異的吸収波長でなく、ＮＡ
ＤＨの特異的吸収波長である波長に基いて吸光度測定す
ればよい。Ｎ Ａ Ｄけ２６０ ｎ ｍ付近に特異的極
大吸収波長を肩するのに対し、Ｎ Ａ Ｉ） Ｈば２６
０ｎｍおよび３４０ｎｍ付近に特異的極大吸収波長を有
することから、１”Ｊ Ａ Ｉ） Ｉ−１の定量のため
の吸収波長域としては３２０〜３６０ｎｍ付近、好まし
くけ３４０ｎｍ付近である。この波長を吸光度値として
測定することによりＮＡＬＩＩ−Ｉを定量できる。
ＤＨの特異的吸収波長である波長に基いて吸光度測定す
ればよい。Ｎ Ａ Ｄけ２６０ ｎ ｍ付近に特異的極
大吸収波長を肩するのに対し、Ｎ Ａ Ｉ） Ｈば２６
０ｎｍおよび３４０ｎｍ付近に特異的極大吸収波長を有
することから、１”Ｊ Ａ Ｉ） Ｉ−１の定量のため
の吸収波長域としては３２０〜３６０ｎｍ付近、好まし
くけ３４０ｎｍ付近である。この波長を吸光度値として
測定することによりＮＡＬＩＩ−Ｉを定量できる。
次に、本発明における反応の原理について例示すると、
次式の通りである。
次式の通りである。
＋＋）
■主反応系
■Ｈ２０□生成反応系
（２）
■主反応系
（１）■に同じ
■ＮＡＤＨ補醇素反応系
（３）
■主反応系
（１）■に同じ
■ピルピノ酸すイクリング反応系
（４）
■主反応系
■■（２０゜生成反応系
色原性化合物；４−アミノアンチピリンとフェノールま
たはＮ、Ｎ−ジメ チル−ｍ−トルイジン このように、本発明によ几ば、簡便かつ高感度でｐＪＨ
ｚまたはＡ ’ｒ Ｐの測定が可能であシ、さらにＮＨ
３を遊離させる種々の被検液中の成分の測定のために利
用できるだけでなく、エンド・ポイント法タケでなく、
レイト法も可能な方法であり、しかも特殊な反応容器を
必要とせず、一般の恒温槽で反応が可能な方法である。
たはＮ、Ｎ−ジメ チル−ｍ−トルイジン このように、本発明によ几ば、簡便かつ高感度でｐＪＨ
ｚまたはＡ ’ｒ Ｐの測定が可能であシ、さらにＮＨ
３を遊離させる種々の被検液中の成分の測定のために利
用できるだけでなく、エンド・ポイント法タケでなく、
レイト法も可能な方法であり、しかも特殊な反応容器を
必要とせず、一般の恒温槽で反応が可能な方法である。
次に、実施例を楯げて本発明を液内的Ｖこ説明するが、
これにより本発明を限定するものでけない３゜実施例
１ ビルビートオキシダーゼ反応系を用いて生成したＨ２Ｏ
２をパーオキシダーゼ法Ｖこより形成した色素の比色定
着法によるＮＨ３の」１１定０．２Ｍ ）リス−塩酸緩
衝液（ｐ）１７．５ ）Ｑ、７５ｍｅ Ｏ，Ｉ Ｍ ｉＶｉｇｃ ６２ ０．３ ｍｅｌ ００
ｍＭ ＡＴＰ ０．３ ｍ１５０ｍＭ Ｎａ１−ＩＣ
０３０，３ｍｅ１５ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．
３ｍｔ１５ｍＭ Ｎ、Ｎ−ンメチ／１ｚ−１７１−トル
イジ：ｙ０．３ｍｌｍｌパーンダーゼ（５Ｕ／テスト１
／グマ社製）カルバモイルリン酸合成酵素（ラット肝製
、６Ｕ／テスト） １０ｍＭ アセチルグルタミン酸 ０．３ｍ１５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸 （１，３ｍ１５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ Ｅ（７，５） ０．３ ｍ１１ｍＭ
ＦＡＤ ｏ、ｏｔｍｌ ｌｏｌＴＩＭ チアミンピロホスフェート ０．０５＋
ｎｌピルベートキナーゼ（ウサギ筋肉由来 ５Ｕ／テス
ト、シグマ社製） ピルベートオキシダーゼ（５Ｕ／テスト、東洋醸造社製
） 水 ０．０９ｍ／＋ 上記混合溶液３．０ ｍｌ ＶＣＯ、０，２５，０，５
，１，０，２，０，３，０，４，０およびＩＯ，ＯｍＭ
硫安俗液２０μｌ！を各々加え、３７℃で１０分間反応
した後、５４５ｎｍで比色定量した。その結果は第１図
の通シであって、ＮＨ３の量と吸光度に良好な直線関係
が得られた。
これにより本発明を限定するものでけない３゜実施例
１ ビルビートオキシダーゼ反応系を用いて生成したＨ２Ｏ
２をパーオキシダーゼ法Ｖこより形成した色素の比色定
着法によるＮＨ３の」１１定０．２Ｍ ）リス−塩酸緩
衝液（ｐ）１７．５ ）Ｑ、７５ｍｅ Ｏ，Ｉ Ｍ ｉＶｉｇｃ ６２ ０．３ ｍｅｌ ００
ｍＭ ＡＴＰ ０．３ ｍ１５０ｍＭ Ｎａ１−ＩＣ
０３０，３ｍｅ１５ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．
３ｍｔ１５ｍＭ Ｎ、Ｎ−ンメチ／１ｚ−１７１−トル
イジ：ｙ０．３ｍｌｍｌパーンダーゼ（５Ｕ／テスト１
／グマ社製）カルバモイルリン酸合成酵素（ラット肝製
、６Ｕ／テスト） １０ｍＭ アセチルグルタミン酸 ０．３ｍ１５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸 （１，３ｍ１５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ Ｅ（７，５） ０．３ ｍ１１ｍＭ
ＦＡＤ ｏ、ｏｔｍｌ ｌｏｌＴＩＭ チアミンピロホスフェート ０．０５＋
ｎｌピルベートキナーゼ（ウサギ筋肉由来 ５Ｕ／テス
ト、シグマ社製） ピルベートオキシダーゼ（５Ｕ／テスト、東洋醸造社製
） 水 ０．０９ｍ／＋ 上記混合溶液３．０ ｍｌ ＶＣＯ、０，２５，０，５
，１，０，２，０，３，０，４，０およびＩＯ，ＯｍＭ
硫安俗液２０μｌ！を各々加え、３７℃で１０分間反応
した後、５４５ｎｍで比色定量した。その結果は第１図
の通シであって、ＮＨ３の量と吸光度に良好な直線関係
が得られた。
実施例 ２
ピルベートオキシダーゼ反応禾を用いて生成したＨ２Ｏ
２をパーオキシダーゼ法により形成した色素の比色定量
法による尿素の測定実施例１の混合溶液にウレアーゼ（
１２Ｕ／テスト、東洋紡社製）を添加した混合浴ｔＬ３
．０ ｍ／！に０．０．２５．０．５．１．０． ２．
０．３．０．４．０ およびｌＯ，０ｍＭ尿素溶液２０
μｌを各々加え、３７℃で１０分間反応した後、５４５
ｎｍで比色定量した。
２をパーオキシダーゼ法により形成した色素の比色定量
法による尿素の測定実施例１の混合溶液にウレアーゼ（
１２Ｕ／テスト、東洋紡社製）を添加した混合浴ｔＬ３
．０ ｍ／！に０．０．２５．０．５．１．０． ２．
０．３．０．４．０ およびｌＯ，０ｍＭ尿素溶液２０
μｌを各々加え、３７℃で１０分間反応した後、５４５
ｎｍで比色定量した。
その結果は第２図の通りであって、尿素の量と吸光度に
良好な直線関係が得られた。
良好な直線関係が得られた。
また、上記反応において、尿素溶液の代りに人血（Ｉｆ
ｋ ｌ ／ ８、ｌ／４．１／２．３／１１に希釈し
た希釈血清２０μｌを各々使用した結果は、第３図の通
りであって、血清中の尿素量と吸光Ｉｆに艮好な直線関
係がイｌられだ。
ｋ ｌ ／ ８、ｌ／４．１／２．３／１１に希釈し
た希釈血清２０μｌを各々使用した結果は、第３図の通
りであって、血清中の尿素量と吸光Ｉｆに艮好な直線関
係がイｌられだ。
実施例 ３
消費ＮＡ １）ｉ−［の定量法に」：るＮＨ３の測定０
．２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ１４７ 、５ｍ１）
０．７５ｍ１ Ｏ，Ｉ Ｍ Ｍｇｃ１２ｏ、３ｍ１ ５０ｍＭＡＴＰｏ、３ｍｔ ５ ０ ｍ Ｍ ＮａＨＣＯ０，３ｍｌカルバモイルリ
ン酸合成酵素（ラッｌｌ］ｆＭ、６Ｕ／テスト） １０ｍＭ アセチルグルタミン酸 Ｑ、３ｍ１５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸 Ｑ、３ｍ１７．５ｍＭ
ＮＡＤＨ０，１ｍｌ。
．２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ１４７ 、５ｍ１）
０．７５ｍ１ Ｏ，Ｉ Ｍ Ｍｇｃ１２ｏ、３ｍ１ ５０ｍＭＡＴＰｏ、３ｍｔ ５ ０ ｍ Ｍ ＮａＨＣＯ０，３ｍｌカルバモイルリ
ン酸合成酵素（ラッｌｌ］ｆＭ、６Ｕ／テスト） １０ｍＭ アセチルグルタミン酸 Ｑ、３ｍ１５０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸 Ｑ、３ｍ１７．５ｍＭ
ＮＡＤＨ０，１ｍｌ。
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉由来。
４Ｕ／テスト、ングマ社製）
ピルベートキナーゼ（５Ｕ／テスト）
水 ０．９５１１１１
上記混合浴液３．Ｑｍｌに０．０．２５．０．５、■、
０．２．０．３．０．４．０および５．０ｍＭ硫安溶液
２０ ｔｔｌＪを各々加え、３７℃で１０分間反応させ
た後、３４０ｎｍの吸光度を測定し、た。その結果は第
４図の通りであって、ＮＨ３の量と吸光度に良好な直線
関係が得られた。
０．２．０．３．０．４．０および５．０ｍＭ硫安溶液
２０ ｔｔｌＪを各々加え、３７℃で１０分間反応させ
た後、３４０ｎｍの吸光度を測定し、た。その結果は第
４図の通りであって、ＮＨ３の量と吸光度に良好な直線
関係が得られた。
実施例 ４
ザルコシンオキシダーゼ反応系を用いて生成したｆ（２
０２をパーオキシダーゼ法により形成した色累の比色定
を法によるＮ１（３の測定０．２Ｍ＋−リス−塩酸緩衝
液（ｌ（７，５）０．７５ｍ１ ０、１１ＶｉＭｇＣＩｌ ２０．３ ｒＭ５０ｍｌ■
ＡＴＰ ０．３ｍ１ ５ ０ ｍ Ｍ Ｎａ）（Ｃｏ Ｏ，３ｌｎｌカルバモ
イルリン酸合成酵素（ラット肝臓）６Ｕ／テスト １０ｍＭ アセチルグルタミン酸 ０．３ｍｌクレアメ
／ホスホキナーゼ（ウサギ筋肉由来。
０２をパーオキシダーゼ法により形成した色累の比色定
を法によるＮ１（３の測定０．２Ｍ＋−リス−塩酸緩衝
液（ｌ（７，５）０．７５ｍ１ ０、１１ＶｉＭｇＣＩｌ ２０．３ ｒＭ５０ｍｌ■
ＡＴＰ ０．３ｍ１ ５ ０ ｍ Ｍ Ｎａ）（Ｃｏ Ｏ，３ｌｎｌカルバモ
イルリン酸合成酵素（ラット肝臓）６Ｕ／テスト １０ｍＭ アセチルグルタミン酸 ０．３ｍｌクレアメ
／ホスホキナーゼ（ウサギ筋肉由来。
５Ｕ／１テスト）
０．１Ｍ タレアチンホスフエート
クレアチナーゼ（２０Ｕ／テスト、東洋１糎造社製）
ザルコ７ンオキ／ダーゼ（ＩＯＵ／デスｉ・１東洋醸造
社製） １５ｍＭ４−アミノアンチピリ７ ０．３ｍｌ：１５ｍ
Ｍ フェノール０．３ ｉｎｌ パーオキシダーゼ（５Ｕ／テスト） 水 ０．４５１１’ｌｔ 上記混合溶液３．Ｑｍｌに０．０．２５．０．５．１．
０．２．０．３．０．４，０および５．０ｍＭ硫安溶液
２０〜を各々加え、３７℃で１０分間反応させた後、５
００ｎｍの吸光度を測定する比色定量を行った結果、第
５図の通り、ＮＨ３の量と吸光度に良好な直線関係が得
られた。
社製） １５ｍＭ４−アミノアンチピリ７ ０．３ｍｌ：１５ｍ
Ｍ フェノール０．３ ｉｎｌ パーオキシダーゼ（５Ｕ／テスト） 水 ０．４５１１’ｌｔ 上記混合溶液３．Ｑｍｌに０．０．２５．０．５．１．
０．２．０．３．０．４，０および５．０ｍＭ硫安溶液
２０〜を各々加え、３７℃で１０分間反応させた後、５
００ｎｍの吸光度を測定する比色定量を行った結果、第
５図の通り、ＮＨ３の量と吸光度に良好な直線関係が得
られた。
実施例 ５
ピルビン酸サイクリング反応系により消費されたＮＡＤ
Ｈの比色定量法によるＮＨ３の測定５０ｍＭ ジメチル
グルタル酸−Ｎａ ＯＨ緩衝液（ｐＨ７，０） １０ ｍ Ｍ ＭｇＣ１１２ １ｍＭ アセチルグルタミン酸 ５ ｍ Ｍ ＮａＨＣＯ３ カルバモイルリン酸合成ｔｉｌ素（８Ｕ ／’ １１１
１１’）５ｍＭ ホスホエノールピルビン歌 ０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ ラクテートデヒドロゲナーゼ（１０Ｕ ／ｍｌ）ピルベ
ートキナーゼ（５Ｕ／＋１１１）ラクテートオキシダー
ゼ（ＩＯＵ／ｍｌ、東洋醸造社製） カタラーゼ（６０Ｕ／ｍｌ） 上記混合溶液１．□ｍｌに０．５．１０，２０．３０．
４０および５０μＭ硫安溶液２０μｌ全谷々加え、３７
℃で反応させた。硫安添加後３分と５分の３４０ｎｍに
おける吸光度の差を測定した。その結果は第６図の通り
であって、Ｎ■１３が非常Ｖこ尚感度で測定された。
Ｈの比色定量法によるＮＨ３の測定５０ｍＭ ジメチル
グルタル酸−Ｎａ ＯＨ緩衝液（ｐＨ７，０） １０ ｍ Ｍ ＭｇＣ１１２ １ｍＭ アセチルグルタミン酸 ５ ｍ Ｍ ＮａＨＣＯ３ カルバモイルリン酸合成ｔｉｌ素（８Ｕ ／’ １１１
１１’）５ｍＭ ホスホエノールピルビン歌 ０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ ラクテートデヒドロゲナーゼ（１０Ｕ ／ｍｌ）ピルベ
ートキナーゼ（５Ｕ／＋１１１）ラクテートオキシダー
ゼ（ＩＯＵ／ｍｌ、東洋醸造社製） カタラーゼ（６０Ｕ／ｍｌ） 上記混合溶液１．□ｍｌに０．５．１０，２０．３０．
４０および５０μＭ硫安溶液２０μｌ全谷々加え、３７
℃で反応させた。硫安添加後３分と５分の３４０ｎｍに
おける吸光度の差を測定した。その結果は第６図の通り
であって、Ｎ■１３が非常Ｖこ尚感度で測定された。
実施例 ６
ビルビンはサイクリング反応により消費された１マＡ
Ｄ Ｈの比色定量法および消費きれ／ζ０゜の電気化学
的定量法によるＡ Ｔ Ｐの測定０．１Ｍ＋・リスー塩
酸緩ｔｉ液（ｐＨ７，５ｍｌ ）１０ ｍ Ｍ ＭｇＣ
＃ ２ ０．：３ｍ１５ ｎｉ ＩＶＩ硫安 ＩＪ、３
ｍｌ ラクテート デヒドロゲナーゼ（１０Ｕ ／ｎｒｅ）カ
ルバモイルリン酸合成酵素（８Ｕ／ｍｅ）１ｍＭ アセ
チルグルタミン酸 ピルベートキナーゼ（５Ｕ／ＩＩＩ／’）５ｍＭホスホ
エノールピルビン酸０．３ｒｎ１３８Ｍ Ｆ Ａ Ｄ
Ｏ，０１ｒｎｅ ０．２ｍＭチアミンピロホスフェート ０．０５ｍ１ラ
クテートオキシダーゼ（５Ｕ／）ｎｌ）上記混合溶液１
．９ｍｌを３７℃で予備加温した後、これに０１２０．
４０．６０．８０および１００／ＪＭＡＴＰ溶液１０μ
ｌを各々加え、正確に５分間反応させ、０．５ ％ Ｓ
Ｄ Ｓ溶ｔｉ、（ｐＨ６，０） ２．Ｏｒｎｌを加え
て反応を停止させた。次−でこれら反応処理液を５４５
ｎｍの吸光度を測定した結果は４７図の通シＡＴ、ｐ倉
と吸光度に良好な相関関係が得られた。
Ｄ Ｈの比色定量法および消費きれ／ζ０゜の電気化学
的定量法によるＡ Ｔ Ｐの測定０．１Ｍ＋・リスー塩
酸緩ｔｉ液（ｐＨ７，５ｍｌ ）１０ ｍ Ｍ ＭｇＣ
＃ ２ ０．：３ｍ１５ ｎｉ ＩＶＩ硫安 ＩＪ、３
ｍｌ ラクテート デヒドロゲナーゼ（１０Ｕ ／ｎｒｅ）カ
ルバモイルリン酸合成酵素（８Ｕ／ｍｅ）１ｍＭ アセ
チルグルタミン酸 ピルベートキナーゼ（５Ｕ／ＩＩＩ／’）５ｍＭホスホ
エノールピルビン酸０．３ｒｎ１３８Ｍ Ｆ Ａ Ｄ
Ｏ，０１ｒｎｅ ０．２ｍＭチアミンピロホスフェート ０．０５ｍ１ラ
クテートオキシダーゼ（５Ｕ／）ｎｌ）上記混合溶液１
．９ｍｌを３７℃で予備加温した後、これに０１２０．
４０．６０．８０および１００／ＪＭＡＴＰ溶液１０μ
ｌを各々加え、正確に５分間反応させ、０．５ ％ Ｓ
Ｄ Ｓ溶ｔｉ、（ｐＨ６，０） ２．Ｏｒｎｌを加え
て反応を停止させた。次−でこれら反応処理液を５４５
ｎｍの吸光度を測定した結果は４７図の通シＡＴ、ｐ倉
と吸光度に良好な相関関係が得られた。
また上記混合法＄１．Ｑｍｌを溶存版累計（石川製作所
）付反応答器に入瓦、３７℃で加温した後、上記と同じ
ＡＴＰ溶液１０μｌｆ：添加し１、経時的に酸素消費量
を測定した。その結果は第８図の通りであって、ＡＴＰ
量と酵素消費量との間に直線関係が得られた。
）付反応答器に入瓦、３７℃で加温した後、上記と同じ
ＡＴＰ溶液１０μｌｆ：添加し１、経時的に酸素消費量
を測定した。その結果は第８図の通りであって、ＡＴＰ
量と酵素消費量との間に直線関係が得られた。
３Ｈ図はピルベートオキシダーゼ反尾、系を用いて生成
したｔ（２０２’ｒパーオキシダーゼ法によす形成した
色素の比色定量法により測定したＮＨ３の検量線、第２
図は同法により測定した尿素の検量線、第３図は同法に
よシ測定した血清中の尿素の倹覇線、第４図は／ｌ！１
費ＮＡＤＨの比色定量法により測定したＮＨ３の検量線
第５図はザルコシンオキ／ダーゼ反応系を用いて生成し
たＨ２０□をパーオキ／ダーゼ法により形成した色素の
比色定量法により測定したＮＨ３の検量線により測定し
たＮｆ（３サイクリング反応系による、第６図はピルビ
ン１浚サイクリング反応系により消費さ７１．たＮ Ａ
Ｉ） ｆ（の比色定量法により測定したＮＨ３の検量
線、第７図はピルビン酸サイクリング反応系Ｖこまり消
費されたＬ’Ｊ Ａ１つｌ（の比色定紋法により測定し
たＡ ’ｒ Ｉ）の倹酸緋、第８図はピルビン１丈サイ
クリング反応系により消費さｈた０２の電気化学的定量
法により測定したＡＴＰの倹に線を示す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者高田哲男 第 １ 図 ０ １ ２３ ４ ５ ４魚ｇ 滅（（虻（り＾・Ｈン 第２図 ０１ ２ ３ ４５ １簾肘（杭Ｈ） 第 ３ 図 ｍｌ−希釈４ 第 ４ 図 ４鼠守ηＭ（、＋（ン ２．．５図 １シフ １２３４５ 独１シ１菰Ｈ） 第６図 ０ １０ ２０ ３０ ４０ Ｓ。 鉄１１１；’１ ｔｐＨ） 第 ７ 図 ０１０２０３０４０．５０ ７’ｌＴＦ’潅ＣＰ＋’（） 第８図 ０ ２０ ４０ ６０ ８０１００ ΔＴＰ（、ｕｌ″Ｉ）
したｔ（２０２’ｒパーオキシダーゼ法によす形成した
色素の比色定量法により測定したＮＨ３の検量線、第２
図は同法により測定した尿素の検量線、第３図は同法に
よシ測定した血清中の尿素の倹覇線、第４図は／ｌ！１
費ＮＡＤＨの比色定量法により測定したＮＨ３の検量線
第５図はザルコシンオキ／ダーゼ反応系を用いて生成し
たＨ２０□をパーオキ／ダーゼ法により形成した色素の
比色定量法により測定したＮＨ３の検量線により測定し
たＮｆ（３サイクリング反応系による、第６図はピルビ
ン１浚サイクリング反応系により消費さ７１．たＮ Ａ
Ｉ） ｆ（の比色定量法により測定したＮＨ３の検量
線、第７図はピルビン酸サイクリング反応系Ｖこまり消
費されたＬ’Ｊ Ａ１つｌ（の比色定紋法により測定し
たＡ ’ｒ Ｉ）の倹酸緋、第８図はピルビン１丈サイ
クリング反応系により消費さｈた０２の電気化学的定量
法により測定したＡＴＰの倹に線を示す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者高田哲男 第 １ 図 ０ １ ２３ ４ ５ ４魚ｇ 滅（（虻（り＾・Ｈン 第２図 ０１ ２ ３ ４５ １簾肘（杭Ｈ） 第 ３ 図 ｍｌ−希釈４ 第 ４ 図 ４鼠守ηＭ（、＋（ン ２．．５図 １シフ １２３４５ 独１シ１菰Ｈ） 第６図 ０ １０ ２０ ３０ ４０ Ｓ。 鉄１１１；’１ ｔｐＨ） 第 ７ 図 ０１０２０３０４０．５０ ７’ｌＴＦ’潅ＣＰ＋’（） 第８図 ０ ２０ ４０ ６０ ８０１００ ΔＴＰ（、ｕｌ″Ｉ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）被検液中のＮＨ３またはＡＴＰを測定するに当り
、ＮＨ３およびＡＴＰへ鴎實紅寿〜成匁を含有する被検
液、被検しないＮＨ３およびＡＴＰのいずれか他の一方
と水溶性炭酸塩にＭｇ およびアセチルグルタミン酸の
存在下刃ルバモイルリン酸合成酵素を作用させ、生成し
たＡＤＰとキナーゼ基質用リン化合物にＭｇの存在下キ
ナーゼを作用させてＡＴＰとキナーゼ反応生成物に変換
させ、生成したキナーゼ反応・生成物を定量することを
％徴とするＮＨ３およびＡＴｐＨｐべ黴九熟〜数分を含
有する被検液中の成分の測定法。 （２１ＮＨ３およびＡＴＰ〜Ｎ黒鋲を繋＼叉を含有する
被検液、被検しな？ＮＨ３およびＡＴＰのいずれか他の
一方と水溶性炭酸塩にＭｇ およびアセチルグルタミン
酸の存在下刃ルバモイルリン酸合成酵素を作用させ、生
成したＡＤＰとホスホエノールピルビン酸にＭｇ の存
在下ピルベートキナーゼを作用させてＡＴＰとピルビン
酸に変換させ、生成したピルビン酸を定量する特許請求
の範囲第１項記載の測定法。 （３） 生成したピルビン酸、チアミンピロホスフェー
ド（ＦＡＤを添加しても食込）およびリン酸に０２の存
在下ピルベートオキシダーゼを作用させ、消費された０
２または生成したＨ２Ｏ２を定量する特許請求の範囲第
２項記載の測定法。 （４） 消費された０２を０２電極を用いる電気化学的
定量手段により定量する特許請求の範囲第３項記載の測
定法。 （５）生成したＨ２Ｏ２をＨ２０□電極を用いる電気化
学的定量手段により定量する特許請求の範囲第３項記載
の測定法。 （６）生成したＨ２０□と色原性化合物にパーオキシダ
ーゼを作用させ、生成した色素を特徴とする特許請求の
範囲第３項記載の測定法。 （力 生成したピルビン酸とＮＡＩ）Ｈにラクテートデ
ヒドロゲナーゼを作用させ、消費されたＮＡＤＩを特徴
とする特許請求の範囲第２項記載の測定法。 （８）比色定量を３４０ ｎｍにおける吸光度の測定に
より行う特許請求の範囲第７項記載の測定法。 （９） 生成したピルビン酸とＮＡＤＨに７ クチ−）
デヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸とＮＡＤに変換
させる酵素反応系および生成したし−ｆｉｌを０２の存
在下ラクテートオキシダーゼｋ 作用させてピルビン酸
とＮ２０゜に変換きせる酵素反応系との組合せによるピ
ルビン酸サイクリング反応を行わせ、消費されたＮＡＤ
ｆ（、消費された０２または生成したＨ２Ｏ２を定量す
る特許請求の範囲第２項記載の測定法。 （ｌＯ）消費されたＮＡＤＨを３４０ ｎｍにおける吸
光度の測定により比色定量する特許請求の範囲第９項記
載の測定法。 ０１） 消費さｉ″した０２を０２電極を用する電気化
学的定量手段により定量する特許請求の範１２ｆ１第９
項記載の測定法。 （Ｉ２）生成したピルビン酸とＮＡＤＨに２クデートデ
ヒドロゲナーゼを作用させてＬ−乳酸上ＮＡＤに変換さ
せる酵素反応系、生成したし一乳酸を０２の存在下ラク
テートオキシダーゼを作用させてピルビン酸とＨ２Ｏ２
に変換させる酵素反応系および生成したＨ２Ｏ２にカタ
ラーゼ又はＮ Ａ Ｄ １１−ペルオキシダーゼを作用
させてｏ２に変換させる酵素反応系との組合せによるピ
ルビン成用１□０□サイクリング反応を行わせ、消費さ
り、たＮＡＤＨを定量する特許請求の範囲第２項記載の
測定法。 （１３） （消費されたＮＡＩ）Ｈを３４０ ｎｍ Ｋ
おける吸光度の測定により比色定量する特♂［請求の靴
囲る被検液、被検しな？ＮＨ３およびＡ ’ｆ’ Ｐの
いずれか他の一方と水溶性炭酸塩にＩＶＩｇ ｎおよび
アセチルグルタミン暇の存在下刃ルバモイルリノ酸合成
酵素を作用させ、生成したＡ Ｏｌ）とクレアチンホス
フェートに１ｖｉｇ１１の存在下クレアチンキナーゼを
作用させてＡ ’Ｉ” Ｐとフレアニンに変換させ、生
成したクレアチンを定量する特許請求の範囲第１項記載
の測定法。 ａ！ｉ）生成したりＶアチンにクレアチナーゼを作用さ
せ、生成したザルコシンｖｃＯ２の存在下ザルコシンオ
キシダーゼを作用させ、消費された０□または生成した
Ｈ２Ｏ２を定量する特許請求の範囲第１４項記載の測定
法。 （１６） 消費された０２を０２電極を用いる電気化学
的定量手段により定量する特許請求の範囲第１５項記載
の測定法。 ０７Ｉ 生成したＨ２Ｏ２をＮ２０□電極を用因る電気
化学的定量手段により定量する特許請求の範囲第１５項
記載の測定法。 Ｎ８１ 生成したＨ２Ｏ２と色原性化合物にパーオキシ
ダーゼを作用させ、生成した色素を特徴とする特許請求
の範囲第１５項記載の測定法。 ［９１ＮＨ３を含有する被検液、Ａ Ｔ Ｐと水溶性炭
酸塩にＭｇ１およびアセチルグルタミン暇の存在下刃ル
バメートキナーゼを作用させてＡＩ）Ｐとカルバモイル
ホスフェートに変換はせる酵素反応系、生成したＡＤＰ
とクレアチンホスフェートにＭｇ の存在下クレアチン
キナーゼを作用させてＡ Ｔ Ｐとクレアチンに変換さ
せる酵素反応系、生成したクレアチンにクレアチナーゼ
を作用させて尿素とザルコシンに変換させる酵素反応系
および生成した尿素にウレアーゼを作用させてＮ１−１
３とＣＯ２に変換させる酵素反応系との組合せによるＮ
Ｈ３−ＡＤＰサイクリング反応を行わぜ、生成したザル
コシンに０２の存在下ザルコ／ンオキシダーゼを作用さ
せ、／ｌｊｉ′Ｊ！ｃされた０２１／ζは生成したＮ２
０゜を定量することによりＮＦＩ３を定量する特許請求
の範囲第２項記載の測定法。 （２０） 消費された０２を０２′醒極を用いる眠気化
学的定量手段により定量する特許請求の範囲第１９項記
載の測定法。 シ１） 生成したＨ２Ｏ２をＮ２０゜電極を用いる一気
化学的定量手段により定量するｌ持♂Ｆ請求の範囲第１
９項記載の測定法。 Ｃ２１生成したＮ２０□と色原性化合物にパルオキ／ダ
ーゼを作用させ、生成した色素を比色定量する特許請求
の範囲第１９項記載の測定法。 （２３！ ＮＨ３が、尿素にウレアーゼを作用させてＮ
Ｈ３とＣＯ２を生成する酵素反応系によって生成するＮ
Ｈ３である特許請求の範囲第１項、第２項または第１４
項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15702683A JPS6047698A (ja) | 1983-08-26 | 1983-08-26 | Νｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15702683A JPS6047698A (ja) | 1983-08-26 | 1983-08-26 | Νｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6047698A true JPS6047698A (ja) | 1985-03-15 |
Family
ID=15640557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15702683A Pending JPS6047698A (ja) | 1983-08-26 | 1983-08-26 | Νｈ↓３またはａｔｐの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6047698A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5780256A (en) * | 1991-03-01 | 1998-07-14 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method and composition for quantitative determination of ammonia, α-amino acid, or α-keto acid |
| WO2002025262A1 (fr) * | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
| WO2007055331A1 (ja) * | 2005-11-14 | 2007-05-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | アデニンヌクレオチドの測定方法 |
| JP2007155713A (ja) * | 2005-11-14 | 2007-06-21 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | アデニンヌクレオチドの測定方法 |
| WO2016047580A1 (ja) * | 2014-09-26 | 2016-03-31 | 旭化成ファーマ株式会社 | キナーゼを用いた新規な測定方法及び組成物 |
-
1983
- 1983-08-26 JP JP15702683A patent/JPS6047698A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5780256A (en) * | 1991-03-01 | 1998-07-14 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method and composition for quantitative determination of ammonia, α-amino acid, or α-keto acid |
| WO2002025262A1 (fr) * | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
| JPWO2002025262A1 (ja) * | 2000-09-25 | 2004-01-29 | 旭化成株式会社 | 酵素電極 |
| US7169273B2 (en) | 2000-09-25 | 2007-01-30 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Enzyme electrode |
| JP4721618B2 (ja) * | 2000-09-25 | 2011-07-13 | 旭化成株式会社 | 酵素電極 |
| WO2007055331A1 (ja) * | 2005-11-14 | 2007-05-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | アデニンヌクレオチドの測定方法 |
| JP2007155713A (ja) * | 2005-11-14 | 2007-06-21 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | アデニンヌクレオチドの測定方法 |
| WO2016047580A1 (ja) * | 2014-09-26 | 2016-03-31 | 旭化成ファーマ株式会社 | キナーゼを用いた新規な測定方法及び組成物 |
| JPWO2016047580A1 (ja) * | 2014-09-26 | 2017-06-08 | 旭化成ファーマ株式会社 | キナーゼを用いた新規な測定方法及び組成物 |
| US10472665B2 (en) | 2014-09-26 | 2019-11-12 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Measuring method and composition using kinase |
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