JPS5931696A - クレアチニンの定量方法 - Google Patents
クレアチニンの定量方法Info
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- JPS5931696A JPS5931696A JP14050382A JP14050382A JPS5931696A JP S5931696 A JPS5931696 A JP S5931696A JP 14050382 A JP14050382 A JP 14050382A JP 14050382 A JP14050382 A JP 14050382A JP S5931696 A JPS5931696 A JP S5931696A
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- phosphate
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はクレアチニンの定量方法tこ関するものである
。
。
更に詳細には、本発明はアンモニアを含有する検体中(
存在するクレアチニンをそのまま直接定員する方法に関
するものである。
存在するクレアチニンをそのまま直接定員する方法に関
するものである。
従来、生体に由来する血液、尿等の検体に存在するクレ
アチニンを定量するには、検体中にすでに存在している
アルカリピクリン酸反応(Jaffe法)を妨書する物
質を、透析処理や樹脂によゐ吸着、処理等をして除去し
た後、Jaffe法にて定量するか、又は検体中のクレ
アチニンをクレアチンに変換せしめる酵素を用いてクレ
アチンに変換せしめ、生成したクレアチンを種々の方法
により定量することによりクレアチニンを定量していた
。
アチニンを定量するには、検体中にすでに存在している
アルカリピクリン酸反応(Jaffe法)を妨書する物
質を、透析処理や樹脂によゐ吸着、処理等をして除去し
た後、Jaffe法にて定量するか、又は検体中のクレ
アチニンをクレアチンに変換せしめる酵素を用いてクレ
アチンに変換せしめ、生成したクレアチンを種々の方法
により定量することによりクレアチニンを定量していた
。
しかしながら、検体の透析処理は煩雑な上に検体が希釈
される欠点があり、樹脂による吸着処理を操作が煩雑で
あるという欠点もあって、いずれも好ましくない。また
クレアチニンなクレアチニンに変換せしめ、生成したク
レアチニンを定量する方法は、クレアチンの定量にすで
に3段階以上もの反応をカップリングさせた多段階の反
応系であり、また検体中のクレアチンをあらかじめ消去
せしめるか、5あらかじめ検体の盲検を行なわなければ
ならず二度手間がかかる上に、検体量が少ない場合は測
定できないことをこなって好ましいものではなかった。
される欠点があり、樹脂による吸着処理を操作が煩雑で
あるという欠点もあって、いずれも好ましくない。また
クレアチニンなクレアチニンに変換せしめ、生成したク
レアチニンを定量する方法は、クレアチンの定量にすで
に3段階以上もの反応をカップリングさせた多段階の反
応系であり、また検体中のクレアチンをあらかじめ消去
せしめるか、5あらかじめ検体の盲検を行なわなければ
ならず二度手間がかかる上に、検体量が少ない場合は測
定できないことをこなって好ましいものではなかった。
本発明はこのようなりレアチニンの定量における従来の
欠点を改善するためになされたものである。
欠点を改善するためになされたものである。
本発明はアンモニアを含有する検体にグルタミン酸脱水
素酵素(以下GzDHという)α−オキソゲルタール酸
(以下α−OGという)還元型ニコチンアミド7デニン
ジヌクレオチドホス7エート(以下NADPHという)
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート(
以下NADP+ という)を還元する酵素、及びNAD
P+を還元する酵素の基質を添加し、検体中にすでに存
在するアンモニアを水とグルタミン酸に変化せしめ、そ
の際生成されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフェートをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフェートを還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートに変
換せしめ、しかる後、検体に過剰量のクレアチニンディ
ミナーゼと還元型ニコチンアミドアデニン(以下NAD
Hという)を添加して反応せしめ、NADHの減少量を
340nm の吸光度の減少によってクレアチニンを
定量する方法である。
素酵素(以下GzDHという)α−オキソゲルタール酸
(以下α−OGという)還元型ニコチンアミド7デニン
ジヌクレオチドホス7エート(以下NADPHという)
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート(
以下NADP+ という)を還元する酵素、及びNAD
P+を還元する酵素の基質を添加し、検体中にすでに存
在するアンモニアを水とグルタミン酸に変化せしめ、そ
の際生成されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフェートをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフェートを還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートに変
換せしめ、しかる後、検体に過剰量のクレアチニンディ
ミナーゼと還元型ニコチンアミドアデニン(以下NAD
Hという)を添加して反応せしめ、NADHの減少量を
340nm の吸光度の減少によってクレアチニンを
定量する方法である。
本発明の特色とするところは検体中にすでに存在−r
ルア ンソ= 7 ’x GtDHla −OG トN
ADPHによってグルタミン酸に変化させ、後にタレア
チンディ鷹ナーゼの反応によりクレアチニンから生ずる
アンそニアを同じGzDHとNADHによって反応させ
゛Cグルタミン酸と水に変化せしめる点にある。
ルア ンソ= 7 ’x GtDHla −OG トN
ADPHによってグルタミン酸に変化させ、後にタレア
チンディ鷹ナーゼの反応によりクレアチニンから生ずる
アンそニアを同じGzDHとNADHによって反応させ
゛Cグルタミン酸と水に変化せしめる点にある。
本発明のクレアチニンの定量方法によれば検体中にすで
に存在するアンモニアを前もって消費させてしまってい
るので、同一検体でそのまま添加したクレアチニンディ
ミナーゼにより検体中のクレアチニンからアンモニアを
生成させ直接生成するアンモニア全量をクレアチンデイ
ミナーゼによって分解されたアンモニアとして測定する
ことができるのでクレアチニン含量は正確に測定するこ
とができる。
に存在するアンモニアを前もって消費させてしまってい
るので、同一検体でそのまま添加したクレアチニンディ
ミナーゼにより検体中のクレアチニンからアンモニアを
生成させ直接生成するアンモニア全量をクレアチンデイ
ミナーゼによって分解されたアンモニアとして測定する
ことができるのでクレアチニン含量は正確に測定するこ
とができる。
ここに示した本発明のアンモニア消費系の反応の一例を
式(1)で表せば次の通りである。
式(1)で表せば次の通りである。
本発明のクレアチニンの定量方法はアンそエアを含有す
る検体中、例えば血清・尿中のクレアチニンの定量に用
いられる。これらの検体にはすでに多量のアンモニアが
絶えず存在しているために直接グルタミン酸生成反応に
よって測定するとクレアチニン量に、相当量のアンモニ
ア量を付加して測定されてしまうので正確な定量値が得
られなかったものである。
る検体中、例えば血清・尿中のクレアチニンの定量に用
いられる。これらの検体にはすでに多量のアンモニアが
絶えず存在しているために直接グルタミン酸生成反応に
よって測定するとクレアチニン量に、相当量のアンモニ
ア量を付加して測定されてしまうので正確な定量値が得
られなかったものである。
本発明ではあらかじめ検体中のアンモニアなNADPH
K、より消費させてしまった後にクレアチニンディ1ナ
ーゼな検体中のクレアチニンに作用させるので、そこに
生成するNAD の量は正確にクレアチニンの量とし
て測定されるものである。
K、より消費させてしまった後にクレアチニンディ1ナ
ーゼな検体中のクレアチニンに作用させるので、そこに
生成するNAD の量は正確にクレアチニンの量とし
て測定されるものである。
本発明のクレアチンの定量法は、単にエンドポイント法
によってもアンモニアを含有する検体中のクレアチニン
を定量できるし、また適量なタレアチンディミナーゼの
量を選択することによってRate As5ay にて
クレアチニンを定量できる。
によってもアンモニアを含有する検体中のクレアチニン
を定量できるし、また適量なタレアチンディミナーゼの
量を選択することによってRate As5ay にて
クレアチニンを定量できる。
本発明においてあらかじめ存在するアンモニアを消費さ
せるtこは第一にアンモニアとα−ケトゲルタール酸よ
り水とグルタミン酸を生成する1、ルタ電ン酸脱水素酵
素CGtDH) (EC1,4,1,3)が必要となる
。
せるtこは第一にアンモニアとα−ケトゲルタール酸よ
り水とグルタミン酸を生成する1、ルタ電ン酸脱水素酵
素CGtDH) (EC1,4,1,3)が必要となる
。
この反応には助酵素とし′t″NADPHの存在が必要
tあるが、 NADPHの添加量を少なくするために反
応で生成するNADPHを還元するグルエース−6−リ
ン酸脱水素酵素(G−6−PD)−1)(EC1,1,
1,49)などのNADPHを還元する酵素を過剰のグ
ルコース−6−リン酸(G−6−P)などのNADPH
を還元する酵素反応基質と一緒に添加しておいて6−ホ
スホグルコンWl (6−PG)を生成させると同時に
アンモニアなα−ケトゲルタール酸によって完全に水と
グルタミン酸に変化させてしまうのである。
tあるが、 NADPHの添加量を少なくするために反
応で生成するNADPHを還元するグルエース−6−リ
ン酸脱水素酵素(G−6−PD)−1)(EC1,1,
1,49)などのNADPHを還元する酵素を過剰のグ
ルコース−6−リン酸(G−6−P)などのNADPH
を還元する酵素反応基質と一緒に添加しておいて6−ホ
スホグルコンWl (6−PG)を生成させると同時に
アンモニアなα−ケトゲルタール酸によって完全に水と
グルタミン酸に変化させてしまうのである。
式(1)の反応tこおいてα−OG → グルタミン
酸の変化によってNADPHがNADPHになると34
0nm r−よる吸光度が一且は減少するがG−6−
PDHEよって再び NADPHr−変化するためtこ
340nm #こよる吸光度は上昇し、吸光度の変化
がなくなったらアンモニアが全部消費されたことになる
。
酸の変化によってNADPHがNADPHになると34
0nm r−よる吸光度が一且は減少するがG−6−
PDHEよって再び NADPHr−変化するためtこ
340nm #こよる吸光度は上昇し、吸光度の変化
がなくなったらアンモニアが全部消費されたことになる
。
本発明のアンモニア消費群のうちGzDHは必須である
が助酵素のNADPHを還元する酵素はG−6−PDH
に限らずNADPHを助酵素として還元する酵素であれ
ば任意に選択することができる。例えば G−6−PD)−1(EC11,1,49)(グルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素)6−P−GDH(EC1,
1,1,44)(6ホスホグルコン酸脱水素酵素)lc
−DI−1(EC1,1,1,42)(イソクエン酸脱
水素酵素)などがあり、これらを用いる場合は、それぞ
れ過剰の基質としてG−6−P、 6−PG、イソクエ
ン酸をそれでれ選択して添加すれば良い。このように検
体中のすでに存在していたアンモニアは消費されクレア
チンディ1ナーゼの作用によって生成するアンモニアは
直接測定できる状態となったわけである。
が助酵素のNADPHを還元する酵素はG−6−PDH
に限らずNADPHを助酵素として還元する酵素であれ
ば任意に選択することができる。例えば G−6−PD)−1(EC11,1,49)(グルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素)6−P−GDH(EC1,
1,1,44)(6ホスホグルコン酸脱水素酵素)lc
−DI−1(EC1,1,1,42)(イソクエン酸脱
水素酵素)などがあり、これらを用いる場合は、それぞ
れ過剰の基質としてG−6−P、 6−PG、イソクエ
ン酸をそれでれ選択して添加すれば良い。このように検
体中のすでに存在していたアンモニアは消費されクレア
チンディ1ナーゼの作用によって生成するアンモニアは
直接測定できる状態となったわけである。
次に本発明におけるクレアチニンを定量する場合の反応
系を式(2)で表わせば次の通りである。
系を式(2)で表わせば次の通りである。
なお、太線はアンモニア消費系の反応に関する係で、細
線はクレアチニンディミナーゼの反応(関する系である
。) 即ち、検体に定1するクレアチニンlrこ応じた基質・
酵素及び過剰のNADHを添加して反応せしめることに
よってタレアチニン畦なN A D +−1の減少量と
して340nm による測定で定量することがで鎗る
。
線はクレアチニンディミナーゼの反応(関する系である
。) 即ち、検体に定1するクレアチニンlrこ応じた基質・
酵素及び過剰のNADHを添加して反応せしめることに
よってタレアチニン畦なN A D +−1の減少量と
して340nm による測定で定量することがで鎗る
。
ここで添す口tこ必須のものとしてはα−OG並びに牛
肝臓GtDHであるが最初のアンモニア消費反応系に添
加されていたものを使用することもで鎗る。最初の添加
量が少ないときは、ここ雫追加して添加することもでき
る。またクレアチニンディミナーゼの添加も必須である
。
肝臓GtDHであるが最初のアンモニア消費反応系に添
加されていたものを使用することもで鎗る。最初の添加
量が少ないときは、ここ雫追加して添加することもでき
る。またクレアチニンディミナーゼの添加も必須である
。
またNADHの添加は必須であってNADHのNADH
への変化によって生じる3 40nmの減少によってク
レアチニン含量が測定できることになる。
への変化によって生じる3 40nmの減少によってク
レアチニン含量が測定できることになる。
反応はPH7,5の緩衝液中で25℃で行なわれ′る。
式(2)の反応tこおいてクレアチニンがクレアチニン
ディミナーゼによって分解されアンモニアからα−〇〇
ととも1=GtDHによってグルタミン酸になるときに
NADHかNADHになって蓄積する。
ディミナーゼによって分解されアンモニアからα−〇〇
ととも1=GtDHによってグルタミン酸になるときに
NADHかNADHになって蓄積する。
この時検体中のアンモニアを消費するために添加されて
いた、NADPHがNADHと同様に酸化されて、さら
にG−6−PDHによってNADHにもどると危惧され
る。しかしNADPHはNADHに比較してごく微量、
例えば10分の1以下しか存在しないため、 G−6−
PGHサイクルが回る事は無視で−るものである。
いた、NADPHがNADHと同様に酸化されて、さら
にG−6−PDHによってNADHにもどると危惧され
る。しかしNADPHはNADHに比較してごく微量、
例えば10分の1以下しか存在しないため、 G−6−
PGHサイクルが回る事は無視で−るものである。
また検体中のアンモニアを消費するために含有されてい
るG−6−PDHがNADHを還元すると危惧されるが
、ここで含有される酵素は助酵素rこ高い特異性を持つ
ものが選ばれているため、その心配は必要としない。生
成したNADHはそのまま340 amの吸光度の減少
によってクレアチニン含量を測定することができる。ま
た尿素の定量もクレアチニンの定量と同様に行なうこと
がで診る。そして他のアンモニア生成反応系ではクレア
チニンの定量と全く同様にアンモエアを生成する物質を
定量することかできるものである〇 このようtこ本発明はクレアチニンの定量tこおいて前
もって検体中のアンモニアを消費せしめたために引続き
同一検体で直接クレアチニンの定量を可能としたもので
、クレアチニンのl[I分析に極めて適した方法である
。
るG−6−PDHがNADHを還元すると危惧されるが
、ここで含有される酵素は助酵素rこ高い特異性を持つ
ものが選ばれているため、その心配は必要としない。生
成したNADHはそのまま340 amの吸光度の減少
によってクレアチニン含量を測定することができる。ま
た尿素の定量もクレアチニンの定量と同様に行なうこと
がで診る。そして他のアンモニア生成反応系ではクレア
チニンの定量と全く同様にアンモエアを生成する物質を
定量することかできるものである〇 このようtこ本発明はクレアチニンの定量tこおいて前
もって検体中のアンモニアを消費せしめたために引続き
同一検体で直接クレアチニンの定量を可能としたもので
、クレアチニンのl[I分析に極めて適した方法である
。
次(本発明の実施例を示す。
実施例 クレアチニンの定量の場合
a −OG 4.2mM
NADP8 0.013mMG−6−P
3.2y*M G−6−PDH(酵母由来) 3.2uAtGffi
H(牛肝臓由来) 38uAt以上を含有する0、
1M)リス塩酸緩衝液(PH74)311/Iこ2 m
M アンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチ
ニン含有検体(A = 0.12 my/nl。
3.2y*M G−6−PDH(酵母由来) 3.2uAtGffi
H(牛肝臓由来) 38uAt以上を含有する0、
1M)リス塩酸緩衝液(PH74)311/Iこ2 m
M アンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチ
ニン含有検体(A = 0.12 my/nl。
B=624mg/me、C−0,4819/N、D=O
,D6tR9/ml )201+j!。
,D6tR9/ml )201+j!。
を添加した。それぞれ25℃で5分間保温した後:(4
0n+rl の吸光度を測定し、吸光度の変化が停し
たとコロで5mM NADH72ptを添加し、340
nmの吸光度の増加を約2分間追跡した後クレアチンデ
ィ1ナーゼ50μtを添加し、340 am の吸光
度の減少を測定した。
0n+rl の吸光度を測定し、吸光度の変化が停し
たとコロで5mM NADH72ptを添加し、340
nmの吸光度の増加を約2分間追跡した後クレアチンデ
ィ1ナーゼ50μtを添加し、340 am の吸光
度の減少を測定した。
ΔE; A=0.042 B−0,084C=0.16
8 D=0.335であった。
8 D=0.335であった。
これを次式により計算した結果、検体中にすで會こ存在
していたアンモニア2mM は完全に消去され、引ぎ
続き測定されるクレアチニンの定量に影響なく、検体中
のクレアチニン含量が定量された。
していたアンモニア2mM は完全に消去され、引ぎ
続き測定されるクレアチニンの定量に影響なく、検体中
のクレアチニン含量が定量された。
クレアチニン量
ΔE、−NAD)(の減少による吸光度の減少a、z−
=NAD)−1の1mMの吸光度3.11=全反応液量 0.02−検、体倉 113Wgタレナチニンの分子量
=NAD)−1の1mMの吸光度3.11=全反応液量 0.02−検、体倉 113Wgタレナチニンの分子量
Claims (1)
- 検体にグルタミン酸脱水素酵素、a−オキソクルタール
酸、還元型ニコチンアミド7デニンジヌクレオチドホス
フエート及びニコチンアセトアデニンジヌクレオチドホ
スフェートを還元する酵素と基質を添加混合し、混合液
中にすでに存在するアンモニアを消費せしめ、その際生
成されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェ−)をニコチンアミド7デニンジヌクレオチドホスフ
エートを還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホス7エートに変換せし
め、しかる後還元をニコチンアミド7デニンジヌクレオ
チド及びクレアチニンディミナーゼを添加して反応せし
めることを特徴とするクレアチニンの定量方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14050382A JPS5931696A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14050382A JPS5931696A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5931696A true JPS5931696A (ja) | 1984-02-20 |
JPH0218078B2 JPH0218078B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15270150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14050382A Granted JPS5931696A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5931696A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS626700A (ja) * | 1985-07-02 | 1987-01-13 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 |
JPS626699A (ja) * | 1985-07-02 | 1987-01-13 | Oriental Yeast Co Ltd | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法 |
JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
US4767712A (en) * | 1983-04-25 | 1988-08-30 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Assay method using nad synthetase and a process for production of the enzyme |
US5206146A (en) * | 1983-04-25 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Assay method using NAD synthetase |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP14050382A patent/JPS5931696A/ja active Granted
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4767712A (en) * | 1983-04-25 | 1988-08-30 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Assay method using nad synthetase and a process for production of the enzyme |
US5206146A (en) * | 1983-04-25 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Assay method using NAD synthetase |
JPS626700A (ja) * | 1985-07-02 | 1987-01-13 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 |
JPS626699A (ja) * | 1985-07-02 | 1987-01-13 | Oriental Yeast Co Ltd | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法 |
JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0218078B2 (ja) | 1990-04-24 |
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