JPH0218076B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアンモニアを反応生成物とする生体物
質の定量方法に関するものである。更に詳細には
本発明はアンモニアを含有する検体において、ア
ンモニアを反応生成物とする生体物質をそのまま
直接定量する方法に関するものである。

従来、アンモニアを含有する検体において、ア
ンモニアを反応生成物とする物質のアンモニアの
生成量で、定量する際に、検体中に存在するアン
モニアも含めた形で測定され正確な定量値を得る
ことができなかつた。

本発明は、このようなアンモニアを反応生成物
とする物質の定量における従来の欠点を改善する
ためになされたものである。即ち、本発明はアン
モニアを含有する検体にグルタミン酸脱水素酵素
（以下GlDHという）α−ケトグルタール酸（以
下α−KGという）、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下NADH⁺という）そし
てニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NAD⁺という）を還元する酵素及びNAD⁺を還元
する酵素の基質を添加混合し、検体中にすでに存
在するアンモニアを水とグルタミン酸に変化せし
め、その際生成されたNAD＋をNAD＋を還元せ
しめる酵素を用いて再度NADHに変換せしめ、
しかる後検体に過剰量の反応生成物としてアンモ
ニアを生成する酵素とニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフユート（以下NADPHとい
う）を添加して反応せしめ、NADPHの減少量
を340mmの吸光度の減少によつてアンモニアを反
応生成物とする物質を定量する方法である。

本発明の特色とするところは検体中にすでに存
在するアンモニアをGlDH、α−KG、NADHに
よつてグルタミン酸に変化させ、しかる後にアン
モニアを反応生成物として生じせしめる酵素の反
応によりアンモニアを反応生成物とする物質から
生ずるアンモニアを同じGlDH（イースト）と
NADPHによつて反応せしめグルタミン酸と水
に変化せしめる点にある。

本発明のアンモニアを反応生成物とする物質の
定量法によれば、検体中にすでに存在するアンモ
ニアを前もつて消去させてしまうので、同一検体
でそのまま添加したアンモニアを反応生成物とし
て生じせしめる酵素により、アンモニアを反応生
成物とする物質からアンモニアを生成させ、直接
生成するアンモニア全量をアンモニアを反応生成
物として生じせしめる酵素によつて分解されたア
ンモニアとして測定することができるのでアンモ
ニアを反応生成物とする物質含量は正確に測定す
ることができる。

ここに示した本発明のアンモニア消費系の反応
の一例を式(1)で表わせば次の通りである。

本発明のアンモニアを反応生成物とする物質の
定量法は、アンモニアを含有する検体中（例えば
血清、尿中）のアンモニアを反応生成物とする物
質の定量に用いられる。これらの検体には、すで
に多量のアンモニアが絶えず存在しているために
直接グルタミン酸生成反応によつて測定するとア
ンモニアを反応生成物とする物質量に相当量のア
ンモニア量を付加して測定されてしまうので正確
な定量値が得られない。

本発明ではあらかじめ検体中に存在するアンモ
ニアをNADHにより消費させてしまつた後、ア
ンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素を
検体中のアンモニアを反応生成物とする物質に作
用させるので、そこに生成するNADP＋の量は
正確にアンモニアを反応生成物とする物質の量と
して測定されるものである。

本発明のアンモニアを反応生成物とする物質の
定量法は、単にエンドポイント法によつてもアン
モニアを含有する検体中のアンモニアを反応生成
物とする物質を定量できるし、また適量なアンモ
ニアを反応生成物として生じせしめる酵素の量を
選択することによつてrate assayにてアンモニア
を反応生成物とする物質を定量できる。

本発明においてあらかじめ存在するアンモニア
を消去させるには第一にアンモニアとα−KGよ
り水とグルタミン酸を生成するGlDH（EC1.4.1.3）
が必要となる。この反応には助酵素として
NADHの存在が必要であるがNADHの添加量を
少なくするために反応で生成するNAD＋を還元
するイソクエン酸脱水素（ECII1.4）（以下iCDH
という）などのNAD＋を還元する酵素を過剰の
イソクエン酸などのNAD⁺を還元する酵素反応基
質と一緒に添加しておいてα−ケトグルタール酸
を生成させると同時にアンモニアをα−KGによ
つて完全に水とグルタミン酸に変化させてしまう
のである。

式(1)の反応においてα−KG→グルタミン酸の
変化によつてNADHがNAD⁺になると340nmに
よる吸光度が一旦は減少するがiCDHによつて再
びNADHに変化するために340nmによる吸光度
は上昇し、吸光度の変化がなくなつたらアンモニ
アが全部消費されたことになる。

本発明のアンモニア消費群のうちGlDHは必須
であるが助酵素のNAD⁺を還元する酵素はiCDH
に限らずNAD⁺を助酵素として還元する酵素であ
れば任意に選択することができる。

例えば ６−Ｄ−GDH（EC1.1.1.43）（６ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素） iC−DH（EC1.1.1.41）（イソクエン酸脱水素酵
素） などがあり、これらを用いる場合は、それぞれ過
剰の基質として６−PG、イソクエン酸をそれぞ
れ選択して添加すればよい。

このように検体中にすでに存在していたアンモ
ニアは消費されアンモニアを反応生成物として生
じせしめる酵素の作用によつて成生するアンモニ
アは直接測定できる状態となつたわけである。次
に本発明におけるアンモニアを反応生成物とする
物質、例えば尿素を定量する場合の反応系を式(2)
で表わせば次の通りである。

なお太線はアンモニア消費系の反応に関する系
で、細線はウレアーゼの反応に関する系である。
即ち、検体に定量する尿素に応じた基質酵素及び
過剰のNADPHを添加して反応せしめることに
よつて尿素をNADPHの減少量として340nmによ
る測定で定量することができる。

ここで添加に必須のものとしてはα−KG並び
にGlDHであるが、最初のアンモニア消費反応系
に添加されていたものを使用することもできる。
最初の添加量が少ないときにはここで追加して添
加することもできる。

またウレアーゼの添加も必須である。また
NADPHの添加は必須であつてNADPHの
NADP＋への変化によつて生じる340nmの減少
によつて尿素含量が測定できることになる。

反応はPH7.5の緩衝液中で25℃で行なわれる。
式(2)の反応において尿素がウレアーゼによつて分
解されアンモニアからα−KGとともにGlDHに
よつてグルタミン酸になるときにNADPHが
NADP＋になつて蓄積する。

この時検体中のアンモニアを消費するために添
加されていたNADHがNADPHと同様に酸化さ
れて、さらにiCDHによつてNADPHにもどると
危惧される。しかし、GlDH（牛肝臓）はGlDH
（イースト）に比較してアンモニアに対するKM
値が高いためiCDHサイクルが回る事は無視でき
るものである。

また検体中のアンモニアを消費するために含有
されているiCDHがNADP＋を還元すると危惧さ
れるが、ここで含有される酵素は助酵素に高い特
異性を持つものが選ばれているため、その心配は
必要としない。

生成したNADP＋はそのまま340nmの吸光度
の減少によつて尿素含量を測定することができ
る。また尿素以外にもアンモニアを反応生成物と
する物質の定量も同様に行なうことができる。例
えばクレアチン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタ
ミン、モノカルボキシリツク酸、Ｎ−カルバミル
βアラニン、Ｌ−ウレイトコハク酸、Ｎ−ホルム
イミノ−Ｌ−アスパラギン酸シトシン、アデニ
ン、アデノシン、シチジン、ADP、４アミノイ
ミダゾール、ペトリン、デオキシ−CMP、尿素
等の物質の定量にそれらのアンモニアを反応生成
物とする物質に作用しアンモニアを生成せしめる
酵素例えばクレアチンデイミナーゼ、アスパラギ
ナーゼ、グルタミナーゼ、アミダーゼ、β−ウレ
イトプロピオナーゼ、ウレイトサクシナーゼ、ホ
ルムイミノアスパラギン酸−デイミナーゼ、シト
シンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、グア
ニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シ
チジンデアミナーゼ、ADPデアミナーゼ、アミ
ノイミダゾラーゼ、ペトリンデアミナーゼ、デオ
キシCMPデアミナーゼ、ニトリラーゼ、ウレア
ーゼとともに用いることによりアンモニアを反応
生成物とする物質を定量することができる。また
上記例の以外のアンモニアを反応生成物とする物
質をもこの範中に含むものである。

このように本発明はアンモニアを反応生成物と
する物質の定量において前もつて検体中のアンモ
ニアを清費せしめるために引続き同一検体で直接
アンモニアを反応生成物とする物質の定量を可能
としたものでアンモニアを反応生成物とする物質
の自動分析にきわめて適した方法である。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 （尿素の定量） α−KG 3.9mM NADH 0.06mM イソクエン酸 4.5mM 塩化マグネシウム 4.5mM iCDH 2.2u／ml GlDH（Yeast） 30u／ml GlDH（Beef liver） 18u／ml 以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH＝
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整した尿素含有検体（Ａ：0.1mg／ml Ｂ：0.2
mg／ml Ｃ：0.4mg／ml Ｄ：0.8mg／ml）10μ
を添加した。

それぞれ25℃で５分間保温した後340nmの吸光
度を測定し吸光度の変化が停止したところで
5mM NADPH40μを添加し340nmの吸光度の
増加を約２分間追跡した後100u／mlウレアーゼ
50μを添加し、340nmの吸光度の減少を測定し
た。

△Ｅ：Ａ：0.067 Ｂ：0.133 Ｃ：0.266 Ｄ：
0.533 これを次式によつて計算した結果、検体中にす
でに存在していたアンモニア2mMは完全に消費
され、引つづき測定される尿素の定量に影響なく
検体中の尿素含量が定量された。

尿素量mg／ml ＝△Ｅ／6.2×3.1／0.01× 60.06÷２÷1000 △Ｅ＝NADPHの減少による吸光度の減少 6.2＝NADPHの1mMの吸光度 3.1＝全液量 0.01＝検体量 60.06＝尿素の分子量 ２＝尿素１分子よりアンモニア２分子生成

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 検体にグルタミン酸脱水素酵素、２−オキソ
   グルタール酸、還元型ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドそしてニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチドを還元する酵素と基質を添加混合し、
   混合液中にすでに存在するアンモニアを消費せし
   め、その際生成されたニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドをニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドを還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換せし
   め、しかる後、還元型ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドホスフエート及び反応生成物として
   アンモニアを生成せしめる酵素を添加して反応せ
   しめることを特徴とするアンモニアを反応生成物
   とする生体物質の定量方法。