JP2548438B2 - 分析対象濃度の酵素的測定方法 - Google Patents
分析対象濃度の酵素的測定方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生成される還元された補酵素の再酸化によ
る吸光度変化の測定を改良点として含む試料体液中の分
析対象濃度の改良された酵素的測定方法を提供するもの
である。該吸光度変化は、試料中の分析対象濃度に比例
する。また、本発明は、本発明の方法を使用する全CO2
およびアンモニアの測定方法、ならびにこれらの方法に
使用する新規試薬、および試料体液中の全CO2およびア
ンモニアの測定のために有用な診断用試験キットを提供
するものである。
る吸光度変化の測定を改良点として含む試料体液中の分
析対象濃度の改良された酵素的測定方法を提供するもの
である。該吸光度変化は、試料中の分析対象濃度に比例
する。また、本発明は、本発明の方法を使用する全CO2
およびアンモニアの測定方法、ならびにこれらの方法に
使用する新規試薬、および試料体液中の全CO2およびア
ンモニアの測定のために有用な診断用試験キットを提供
するものである。
酵素的方法による試料体液中の分析対象の定量は、全
く最近の事柄である。該基本的処理は、分析対象を含む
試料と、この特定の分析対象の定量に使用されることが
知られている酵素基質との混合による試料“ブランク”
の測定に関連する。次いで、基質特異的酵素が、該反応
混合物い添加される。該基質および分析対象の酵素的変
換は、反応組成物の変化を生じ、これは該基質に対する
基質特異的酵素の作用による吸光度の変化を測定する種
々の方法によって定量され得る。次いで、この吸光度変
化は、試料中の分析対象濃度と関連付けられる。
く最近の事柄である。該基本的処理は、分析対象を含む
試料と、この特定の分析対象の定量に使用されることが
知られている酵素基質との混合による試料“ブランク”
の測定に関連する。次いで、基質特異的酵素が、該反応
混合物い添加される。該基質および分析対象の酵素的変
換は、反応組成物の変化を生じ、これは該基質に対する
基質特異的酵素の作用による吸光度の変化を測定する種
々の方法によって定量され得る。次いで、この吸光度変
化は、試料中の分析対象濃度と関連付けられる。
例えば、血清または血漿中の全CO2の酵素的定量は、C
O2を含む試料と基質ホスホエノールピルベート（PEP）
との混合を含む。ブランク読取りの後、基質特異的酵素
ホスホエノールプルベードカルボキシラーゼ（PEPG）が
添加され、以下の反応に従ってPEPのオキサロアセテー
ト（OAA）およびホスフォートへの変換を起こす： 次いで生成したOAAは、種々の方法により試料中のCO2
濃度と関連付けられる。例えば、ここに参考として加え
られるWilsonらのClinical Chemistry 19:640（1973）
およびMunsonらのClinical Chemistry 20:872（1974）
において、OAAは、還元ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NADH）およびマレエートデヒドロゲナーゼ
（MDH）と同時に結合し、酸化されるNADHの量が、試料
中のOO2に直接比例する。やはり参考として加えられるM
orrisらのClinical Chemistry 21:8,1093（1975）にお
いては、OAAは、ファーストバイオレットＢ（Fast Viol
at B）のジアゾニウム塩との反応により定量される。
O2を含む試料と基質ホスホエノールピルベート（PEP）
との混合を含む。ブランク読取りの後、基質特異的酵素
ホスホエノールプルベードカルボキシラーゼ（PEPG）が
添加され、以下の反応に従ってPEPのオキサロアセテー
ト（OAA）およびホスフォートへの変換を起こす： 次いで生成したOAAは、種々の方法により試料中のCO2
濃度と関連付けられる。例えば、ここに参考として加え
られるWilsonらのClinical Chemistry 19:640（1973）
およびMunsonらのClinical Chemistry 20:872（1974）
において、OAAは、還元ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NADH）およびマレエートデヒドロゲナーゼ
（MDH）と同時に結合し、酸化されるNADHの量が、試料
中のOO2に直接比例する。やはり参考として加えられるM
orrisらのClinical Chemistry 21:8,1093（1975）にお
いては、OAAは、ファーストバイオレットＢ（Fast Viol
at B）のジアゾニウム塩との反応により定量される。
CO2についての酵素的方法の原理的に不利な点は、反
応の最適化およびNADHの安定性のために必要とされるア
ルカリ性pHにおいて特に雰囲気CO2の妨害に対して極め
て鋭敏であることである。
応の最適化およびNADHの安定性のために必要とされるア
ルカリ性pHにおいて特に雰囲気CO2の妨害に対して極め
て鋭敏であることである。
血漿アンモニアもまた、参考として加えるVan Anken
らのClinical Chemica Acta 56:151（1974）の方法に従
って、酵素的に測定されうる。この方法は、次の反応に
基づく： 生成されるNADPは、試料中のアンモニア濃度に比例
し、補酵素NADPHのNADP+への酸化による吸光度変化の測
定により定量されうる。
らのClinical Chemica Acta 56:151（1974）の方法に従
って、酵素的に測定されうる。この方法は、次の反応に
基づく： 生成されるNADPは、試料中のアンモニア濃度に比例
し、補酵素NADPHのNADP+への酸化による吸光度変化の測
定により定量されうる。
この方法における酵素的試薬、特に補酵素NADPHもま
た、極めて不安定である。
た、極めて不安定である。
本発明は、試料体液中の分析対象の濃度を、試料−基
質反応混合物に対する基質特異的酵素の作用による吸光
度変化の測定によって測定する酵素的方法の改良を含
み、該改良は、補酵素が添加されている試料−基質反応
混合物に基質特異的酵素を添加後、そこに生成する還元
された補酵素の再酸化による吸光度変化を測定すること
を含む。
質反応混合物に対する基質特異的酵素の作用による吸光
度変化の測定によって測定する酵素的方法の改良を含
み、該改良は、補酵素が添加されている試料−基質反応
混合物に基質特異的酵素を添加後、そこに生成する還元
された補酵素の再酸化による吸光度変化を測定すること
を含む。
更に、特定的には、本発明は、試料と基質との混合物
に対する基質特異的酵素の作用による吸光度変化の測定
によって試料体液中の分析対象濃度を測定する酵素的方
法において、補酵素が添加された試料と基質との混合物
への基質特異的酵素の添加後に、その場に生成する還元
された補酵素の再酸化による吸光度変化の測定により試
料体液中の分析対象濃度を測定することからなる方法で
あって、第１の吸光度測定を、試料を補酵素、酵素基質
および基質特異的酵素と混合した後行い、第２の吸光度
測定を、第１の吸光度測定後適当な時間に行うか、また
は 第１の吸光度測定を、試料を補酵素および酵素基質と
混合した後行い、第２の吸光度測定を基質特異的酵素を
加えた後適当な時間に行うか、または 第１の吸光度測定を、試料を基質特異的酵素と混合し
た後行い、第２の吸光度測定を補酵素および酵素基質を
加えた後適当な時間に行うことからなる酵素的測定方法
に関するものである。
に対する基質特異的酵素の作用による吸光度変化の測定
によって試料体液中の分析対象濃度を測定する酵素的方
法において、補酵素が添加された試料と基質との混合物
への基質特異的酵素の添加後に、その場に生成する還元
された補酵素の再酸化による吸光度変化の測定により試
料体液中の分析対象濃度を測定することからなる方法で
あって、第１の吸光度測定を、試料を補酵素、酵素基質
および基質特異的酵素と混合した後行い、第２の吸光度
測定を、第１の吸光度測定後適当な時間に行うか、また
は 第１の吸光度測定を、試料を補酵素および酵素基質と
混合した後行い、第２の吸光度測定を基質特異的酵素を
加えた後適当な時間に行うか、または 第１の吸光度測定を、試料を基質特異的酵素と混合し
た後行い、第２の吸光度測定を補酵素および酵素基質を
加えた後適当な時間に行うことからなる酵素的測定方法
に関するものである。
この発明は、CO2、アンモニア、アスパルテートトラ
ンスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ
（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH、ピルベートをラ
クテートに）、トリグリセリド、サリチレート、および
尿素等の種々の分析対象の測定に適用され得る。
ンスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ
（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH、ピルベートをラ
クテートに）、トリグリセリド、サリチレート、および
尿素等の種々の分析対象の測定に適用され得る。
また、本発明は、この改良された方法による試料体液
中の全CO2の測定方法も含み、使用される新規試薬組成
物ならびに試薬中の全CO2の測定に有用な診断用試薬キ
ットを包含している。
中の全CO2の測定方法も含み、使用される新規試薬組成
物ならびに試薬中の全CO2の測定に有用な診断用試薬キ
ットを包含している。
また、本発明は、この改良された方法による試薬体液
中のアンモニア濃度の測定方法も含み、使用される新規
試薬組成物ならびに試料中のアンモニアの測定に有用な
診断用試験キットを包含している。
中のアンモニア濃度の測定方法も含み、使用される新規
試薬組成物ならびに試料中のアンモニアの測定に有用な
診断用試験キットを包含している。
本発明の方法において好適に使用される補酵素類は、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）および
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（NADP）であるが、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドまたはチオ−NAD等の補酵素類似体もまた好
適であろう。還元された補酵素を生成するための好まし
い基質／酵素系は、グルコース−６−ホスフェート（G6
P）／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
（G6PD）系であり、またグルコース／グルコースデヒド
ロゲナーセおよびフォルメート／フォルメートデヒドロ
ゲナーゼなどの他の多くの基質／酵素系も使用され得
る。G6Pは、興味ある特定の分析対象の定量に使用され
る補酵素および酵素基質と共に試料−基質反応混合物に
添加される。試料ブランクを含む第１の吸光度読取りが
行なわれる。次いで、基質特異的酵素が加えられる。別
法は、基質特異的酵素および適切な基質と補酵素の混合
の結果であるその場での還元補酵素の生成に続いて、試
料の添加を含み、ここで最初の吸光度読取りは、試料の
添加の直前あるいは直後のいずれかにおいてなされる。
２種類の試薬の混合は、手により単一の操作用試薬を形
成するか、あるいは自動分析装置によりその場において
行なわれ得る。G6PDは、G6Pの６−ホスホーグルコン酸
（6PGA）への変換において触媒作用をし、還元された補
酵素を生成する。その場において生成された還元補酵素
の再酸化による吸光度の変化は、試料中の分析対象の濃
度に比例する。本発明の固有の特徴は、同時または引続
く分析対象、基質および特異的酵素による補酵素の再酸
化を伴った、その場での還元された補酵素の生成であ
る。このその場での還元された補酵素の生成は、試薬類
の安定性を高度に改善する。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）および
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（NADP）であるが、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドまたはチオ−NAD等の補酵素類似体もまた好
適であろう。還元された補酵素を生成するための好まし
い基質／酵素系は、グルコース−６−ホスフェート（G6
P）／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
（G6PD）系であり、またグルコース／グルコースデヒド
ロゲナーセおよびフォルメート／フォルメートデヒドロ
ゲナーゼなどの他の多くの基質／酵素系も使用され得
る。G6Pは、興味ある特定の分析対象の定量に使用され
る補酵素および酵素基質と共に試料−基質反応混合物に
添加される。試料ブランクを含む第１の吸光度読取りが
行なわれる。次いで、基質特異的酵素が加えられる。別
法は、基質特異的酵素および適切な基質と補酵素の混合
の結果であるその場での還元補酵素の生成に続いて、試
料の添加を含み、ここで最初の吸光度読取りは、試料の
添加の直前あるいは直後のいずれかにおいてなされる。
２種類の試薬の混合は、手により単一の操作用試薬を形
成するか、あるいは自動分析装置によりその場において
行なわれ得る。G6PDは、G6Pの６−ホスホーグルコン酸
（6PGA）への変換において触媒作用をし、還元された補
酵素を生成する。その場において生成された還元補酵素
の再酸化による吸光度の変化は、試料中の分析対象の濃
度に比例する。本発明の固有の特徴は、同時または引続
く分析対象、基質および特異的酵素による補酵素の再酸
化を伴った、その場での還元された補酵素の生成であ
る。このその場での還元された補酵素の生成は、試薬類
の安定性を高度に改善する。
本発明の方法は、次の工程を含んで全CO2の測定に容
易に適用される： （ａ） 試料を、補酵素および酵素基質、ならびに基質
特異的酵素と混合し、 （ｂ） 溶液の吸光度を320−380nmにて測定し、 （ｃ） 工程（ｂ）に続く適当な時間に溶液の吸光度を
約320−380nmにて測定し、 ここにおいて試料中に全CO2は、その場に生成された
還元された補酵素の再酸化による吸光度変化に比例す
る。
易に適用される： （ａ） 試料を、補酵素および酵素基質、ならびに基質
特異的酵素と混合し、 （ｂ） 溶液の吸光度を320−380nmにて測定し、 （ｃ） 工程（ｂ）に続く適当な時間に溶液の吸光度を
約320−380nmにて測定し、 ここにおいて試料中に全CO2は、その場に生成された
還元された補酵素の再酸化による吸光度変化に比例す
る。
前述したように、補酵素および酵素基質は、試料添加
前に基質特異的酵素と混合されてもよく、あるいは該補
酵素および酵素基質は、基質特異的酵素添加後に試料と
混合されてもよい。上記工程（ａ）は、両別法を包含す
ることを意味し、第１の方法が好ましい。
前に基質特異的酵素と混合されてもよく、あるいは該補
酵素および酵素基質は、基質特異的酵素添加後に試料と
混合されてもよい。上記工程（ａ）は、両別法を包含す
ることを意味し、第１の方法が好ましい。
例えば、本発明の方法による全CO2の測定は、次の反
応工程に従って行なわれる。
応工程に従って行なわれる。
血清または血漿等の体液試料は、補酵素NADならびに
全CO2の定量に使用されることが知られている酵素基質G
6PおよびPEPと混合される。該混合物の吸光度は、320−
380nmの波長範囲において測定される。次いで、この反
応混合物に酵素が添加され、第２の吸光度測定が行なわ
れる。
全CO2の定量に使用されることが知られている酵素基質G
6PおよびPEPと混合される。該混合物の吸光度は、320−
380nmの波長範囲において測定される。次いで、この反
応混合物に酵素が添加され、第２の吸光度測定が行なわ
れる。
この反応工程において、NADは、G6PDによるG6Pの6PGA
への変換によってNADHに還元される。分析対象およびPE
Pは、PEPCの触媒作用によってOAAおよびホスフェートに
変換される。次いで、生成された該OAAは、MDHの触媒作
用によってマレエートに還元される。試料中のCO2濃度
は、340nm付近または320−380nmの範囲内に強い吸収を
有するNADHの再酸化による吸光度変化に比例する。
への変換によってNADHに還元される。分析対象およびPE
Pは、PEPCの触媒作用によってOAAおよびホスフェートに
変換される。次いで、生成された該OAAは、MDHの触媒作
用によってマレエートに還元される。試料中のCO2濃度
は、340nm付近または320−380nmの範囲内に強い吸収を
有するNADHの再酸化による吸光度変化に比例する。
第２の吸光度測定のために適切な時間は、好ましくは
３分であるが、２−６分等のより広範囲も適している。
３分であるが、２−６分等のより広範囲も適している。
また、本発明は、上記方法において使用される２種類
の新規試薬組成物を提供するものである。第１の試薬組
成物は、基本的に補酵素および酵素基質からなる。この
試薬［試薬１］は、PEP、G6P、およびNADを含んでい
る。
の新規試薬組成物を提供するものである。第１の試薬組
成物は、基本的に補酵素および酵素基質からなる。この
試薬［試薬１］は、PEP、G6P、およびNADを含んでい
る。
第２の試薬組成物は、基質の変換において触媒作用を
し、補酵素NADHを生成する酵素を基本的に含んでなる。
この試薬［試薬２］は、PEPのOAAへの変換において触媒
作用をするために充分な量のPEPC、G6Pの6PGAへの変換
において触媒作用をするために充分な量のG6PD、OAAの
マレエートへの変換において触媒作用をするために充分
な量のMDHを含んでなる。
し、補酵素NADHを生成する酵素を基本的に含んでなる。
この試薬［試薬２］は、PEPのOAAへの変換において触媒
作用をするために充分な量のPEPC、G6Pの6PGAへの変換
において触媒作用をするために充分な量のG6PD、OAAの
マレエートへの変換において触媒作用をするために充分
な量のMDHを含んでなる。
試薬１および２は、付加的に緩衝剤、保存剤、キレー
ト剤、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、LDH阻害剤、
抗生物質、および安定性増強作用を有し、本発明の特徴
に実質的な影響をおよぼさないその他の成分を含有して
もよい。好適な緩衝剤は、リ酸カリウム、リン酸アンモ
ニウム、HEPES、４−モルフォリンプロパンスルホン酸
（MOPS）、または２−［トラス（ヒドロキシメチル）メ
チルアミノ］−１−エタンスルホン酸（TES）である。
試験される試料は、所望により、脱イオン水または食塩
水等の適当な希釈剤により希釈されてもよい。
ト剤、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、LDH阻害剤、
抗生物質、および安定性増強作用を有し、本発明の特徴
に実質的な影響をおよぼさないその他の成分を含有して
もよい。好適な緩衝剤は、リ酸カリウム、リン酸アンモ
ニウム、HEPES、４−モルフォリンプロパンスルホン酸
（MOPS）、または２−［トラス（ヒドロキシメチル）メ
チルアミノ］−１−エタンスルホン酸（TES）である。
試験される試料は、所望により、脱イオン水または食塩
水等の適当な希釈剤により希釈されてもよい。
ナトリウムアジド（NaN3）、ヒドロキシ安息香酸また
はゲンタマイシン等の保存剤が好適である。オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノールまたはポリオキシエチ
レン脂肪族アルコールエーテル等の非イオン性界面活性
剤が好適である。PMSFまたはアプロチニンは、公知のプ
ロテアーゼ阻害剤であり、またナトリウムオキサメー
ト、修酸またはゴシポール（gossypol）は、乳酸デヒド
ロゲナーゼによる干渉を効果的に阻害するであろう。ED
TA、EGTA、ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジア
ミン三酢酸（HEDTA）等の種々のキレート剤もまた好適
である。所望により適当な消泡剤を加えることもでき
る。ジチオスレイトール（DTT）、ウシガンマグロブリ
ン（BGG）、Mg2+、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）およ
びグリセロール等の酵素安定剤および活性化剤も好適で
ある。
はゲンタマイシン等の保存剤が好適である。オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノールまたはポリオキシエチ
レン脂肪族アルコールエーテル等の非イオン性界面活性
剤が好適である。PMSFまたはアプロチニンは、公知のプ
ロテアーゼ阻害剤であり、またナトリウムオキサメー
ト、修酸またはゴシポール（gossypol）は、乳酸デヒド
ロゲナーゼによる干渉を効果的に阻害するであろう。ED
TA、EGTA、ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジア
ミン三酢酸（HEDTA）等の種々のキレート剤もまた好適
である。所望により適当な消泡剤を加えることもでき
る。ジチオスレイトール（DTT）、ウシガンマグロブリ
ン（BGG）、Mg2+、Ｎ−アセチルシステイン（NAC）およ
びグリセロール等の酵素安定剤および活性化剤も好適で
ある。
本発明は、また、 （ａ） 試薬１の容器、 （ｂ） 試薬２の容器 を含む試料体液中の全CO2測定用の診断試験キットを含
んでなる。
んでなる。
好ましい実施態様において、１〜５マイクロリットル
の血清または血漿が、約100〜300マイクロリットルの試
薬１と混合される。吸光度が、約340nmにて測定され
る。次いで、該反応混合物が、約20〜94マイクロリット
ルの試薬２および１−75μの希釈剤と混合される。第
２の吸光度測定が、約340nmにて行なわれ、吸光度の差
が試料中の全CO2濃度に比例する。
の血清または血漿が、約100〜300マイクロリットルの試
薬１と混合される。吸光度が、約340nmにて測定され
る。次いで、該反応混合物が、約20〜94マイクロリット
ルの試薬２および１−75μの希釈剤と混合される。第
２の吸光度測定が、約340nmにて行なわれ、吸光度の差
が試料中の全CO2濃度に比例する。
約２マイクロリットルの試料、約20マイクロリットル
の脱イオン水または食塩水等の希釈剤、および約150マ
イクロリットルの試薬１を混合し、該溶液の吸光度を約
340nmにて測定することにより最良の結果が得られる。
次いで、約50マイクロリットルの試薬２および約30マイ
クロリットルの希釈剤をこの反応混合物に加え、第２の
吸収光度測定を行なう。
の脱イオン水または食塩水等の希釈剤、および約150マ
イクロリットルの試薬１を混合し、該溶液の吸光度を約
340nmにて測定することにより最良の結果が得られる。
次いで、約50マイクロリットルの試薬２および約30マイ
クロリットルの希釈剤をこの反応混合物に加え、第２の
吸収光度測定を行なう。
試料に対して試薬１および試薬２を加える順序は、交
換可能であることにも注意すべきである。すなわち、試
料を最初に試薬２と混合して吸光度測定を行ない、その
後、該反応混合物に試薬１を加えて第２の吸光度測定を
行なってもよい。別法として、試薬１および２を共に加
え、吸光度測定を行ない、試料添加後に第２の吸光度測
定を行なってもよい。
換可能であることにも注意すべきである。すなわち、試
料を最初に試薬２と混合して吸光度測定を行ない、その
後、該反応混合物に試薬１を加えて第２の吸光度測定を
行なってもよい。別法として、試薬１および２を共に加
え、吸光度測定を行ない、試料添加後に第２の吸光度測
定を行なってもよい。
試薬１の基本構成成分は、PEP、G6PおよびNADであ
る。試薬１は、更にリン酸カリウム、塩化または硫酸マ
グネシウム等の緩衝剤、および保存剤を含んでもよい。
塩化マグネシウムは、MgCl2・6H2Oの形態において良好
に使用でき、また、ナトリウムアジド（NaN3）等の保存
剤が好適である。試薬１は、キレート剤、非イオン性界
面活性剤、LDH阻害剤およびシリコン系消泡剤を含有し
てもよい。種々の成分の濃度範囲は、約２〜50ミリモル
のPEP、1.0〜2.0ミリモルのG6P、２〜10ミリモルのNA
D、２〜25ミリモルのMgCl2、および0.1〜１％のNaN3、1
0−100mMのリン酸カリウム、0.1−0.5mMのEGTA、0.01−
0.1％の非イオン性界面活性剤、および0.1−10mMのナト
リウムオキサメート、および0.01−0.1％のシリコン系
消泡剤である。好ましい実施態様において、試薬１は、
約50ミリモルのリン酸カリウムをpH6.9において、約6.7
ミリモルのMgCl2、0.1％のNaN3、1.2ミリモルのG6P、8.
0ミリモルのNAD、8.0ミリモルのPEP、3.3ミリモルのオ
キサメート、0.2ミリモルのEGTA、および0.01％のオク
チルフェノキシポリエトキシエタノール等の非イオン性
界面活性剤、および0.05％のシリコン系消泡剤を含有す
る。
る。試薬１は、更にリン酸カリウム、塩化または硫酸マ
グネシウム等の緩衝剤、および保存剤を含んでもよい。
塩化マグネシウムは、MgCl2・6H2Oの形態において良好
に使用でき、また、ナトリウムアジド（NaN3）等の保存
剤が好適である。試薬１は、キレート剤、非イオン性界
面活性剤、LDH阻害剤およびシリコン系消泡剤を含有し
てもよい。種々の成分の濃度範囲は、約２〜50ミリモル
のPEP、1.0〜2.0ミリモルのG6P、２〜10ミリモルのNA
D、２〜25ミリモルのMgCl2、および0.1〜１％のNaN3、1
0−100mMのリン酸カリウム、0.1−0.5mMのEGTA、0.01−
0.1％の非イオン性界面活性剤、および0.1−10mMのナト
リウムオキサメート、および0.01−0.1％のシリコン系
消泡剤である。好ましい実施態様において、試薬１は、
約50ミリモルのリン酸カリウムをpH6.9において、約6.7
ミリモルのMgCl2、0.1％のNaN3、1.2ミリモルのG6P、8.
0ミリモルのNAD、8.0ミリモルのPEP、3.3ミリモルのオ
キサメート、0.2ミリモルのEGTA、および0.01％のオク
チルフェノキシポリエトキシエタノール等の非イオン性
界面活性剤、および0.05％のシリコン系消泡剤を含有す
る。
試薬２は、基本的に、PEPのOAAへの変換において触媒
作用をするために充分な量のPEPC、G6Pの6PGAへの変換
において触媒作用をするために充分な量のG6PD、OAAの
マレエートへの変換において触媒作用をするために充分
な量のMDHを含んでなる。試薬２は、付加的に緩衝剤な
らびにキレート剤、界面活性剤、抗生物質、または保存
剤等の種々の他の成分、例えば、ウシガンマグロブリン
（BGG）、NaN3、EDTA、PMSF、EGTA、およびグリセロー
ル等を含んでもよい。試薬２は、好ましくは、1000〜22
00U/LのPEPC;5,000〜62,000U/LのG6PD;および2400〜11,
000U/LのMDHを含有する。試薬２は、更に、次の範囲の
成分:20〜200ミリモルのリン酸アンモニウム、0.1〜１
％BGG、１〜30ミリモルのDTT、１〜40％のグリセロー
ル、0.1−１％のNaN3、0.1−0.5mMのEDTAおよび0.1−0.
5mMのPMSFを含有してもよい。好ましい実施態様におい
て、試薬２は、約1400U/LのPEPC、50,000U/LのG6PD、70
00U/LのMDH、pH7.2における100ミリモルのリン酸アンモ
ニウム、20ミリモルのDTT、0.1％のNaN3、30％のグリセ
ロール、0.1％のBGG、0.2mM EDT、および0.01mMのPMSF
を含有する。
作用をするために充分な量のPEPC、G6Pの6PGAへの変換
において触媒作用をするために充分な量のG6PD、OAAの
マレエートへの変換において触媒作用をするために充分
な量のMDHを含んでなる。試薬２は、付加的に緩衝剤な
らびにキレート剤、界面活性剤、抗生物質、または保存
剤等の種々の他の成分、例えば、ウシガンマグロブリン
（BGG）、NaN3、EDTA、PMSF、EGTA、およびグリセロー
ル等を含んでもよい。試薬２は、好ましくは、1000〜22
00U/LのPEPC;5,000〜62,000U/LのG6PD;および2400〜11,
000U/LのMDHを含有する。試薬２は、更に、次の範囲の
成分:20〜200ミリモルのリン酸アンモニウム、0.1〜１
％BGG、１〜30ミリモルのDTT、１〜40％のグリセロー
ル、0.1−１％のNaN3、0.1−0.5mMのEDTAおよび0.1−0.
5mMのPMSFを含有してもよい。好ましい実施態様におい
て、試薬２は、約1400U/LのPEPC、50,000U/LのG6PD、70
00U/LのMDH、pH7.2における100ミリモルのリン酸アンモ
ニウム、20ミリモルのDTT、0.1％のNaN3、30％のグリセ
ロール、0.1％のBGG、0.2mM EDT、および0.01mMのPMSF
を含有する。
試薬１および２は、理想的には大気中CO2の吸収を最
小とするために、約pHにおいて調製されるべきである。
これらの試薬は、COBAS BIO 、COBAS FARA 、およびC
OBAS MIRATM（Hoffmann−La Roche Inc.,Mutley,New Je
rsey）等の自動化臨床用化学分析装置において特に良好
に使用される。
小とするために、約pHにおいて調製されるべきである。
これらの試薬は、COBAS BIO 、COBAS FARA 、およびC
OBAS MIRATM（Hoffmann−La Roche Inc.,Mutley,New Je
rsey）等の自動化臨床用化学分析装置において特に良好
に使用される。
BGG、DTT、およびグリセロール等の試薬２の成分は、
酵素安定剤および活性剤として作用する。ナトリウムオ
キサメートは、ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の阻害
剤であり、ヒト体液中に普通に見出される外来性ピルベ
ートによるアッセイにおける干渉を防止するために含有
させた。マグネシウムイオンは、PEPCによるPEPのOAAへ
の変換の補助をする。
酵素安定剤および活性剤として作用する。ナトリウムオ
キサメートは、ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の阻害
剤であり、ヒト体液中に普通に見出される外来性ピルベ
ートによるアッセイにおける干渉を防止するために含有
させた。マグネシウムイオンは、PEPCによるPEPのOAAへ
の変換の補助をする。
本発明の改良方法は、試料体液中のアンモニアの測定
に対しても容易に適用でき、従って本発明は、次の工
程： （ａ） 試料を基質特異的酵素と混合し、 （ｂ） 該溶液の吸光度を320−380nmにて測定し、 （ｃ） 工程（ａ）の反応混合物を、補酵素および酵素
基質と混合し、 （ｄ） 補酵素が安全に再酸化された後に最低吸光度を
320−380nmにて測定し、 ここにおいて試料中のアンモニア濃度は、その場に生
成された還元された補酵素の再酸化による吸光度変化に
比例する、を含んでなる試料体液中のアンモニアの測定
方法にも関するものである。
に対しても容易に適用でき、従って本発明は、次の工
程： （ａ） 試料を基質特異的酵素と混合し、 （ｂ） 該溶液の吸光度を320−380nmにて測定し、 （ｃ） 工程（ａ）の反応混合物を、補酵素および酵素
基質と混合し、 （ｄ） 補酵素が安全に再酸化された後に最低吸光度を
320−380nmにて測定し、 ここにおいて試料中のアンモニア濃度は、その場に生
成された還元された補酵素の再酸化による吸光度変化に
比例する、を含んでなる試料体液中のアンモニアの測定
方法にも関するものである。
本発明のアンモニアの測定において好ましい補酵素
は、NADP+である。アンモニア含有試料、好ましくは、
血清、血漿または尿は、α−ケトグルタレート、NADP+
およびG6Pと混合され、ブランク測定が行なわれる。次
いで、該反応混合物にG6PDおよびグルタメートデヒドロ
ゲナーゼ（GlDH）を加え、約340nm、または320−380nm
の範囲内にて強い吸収を有するNADPHの形成による吸光
度の急速な増加を起こす。次いで、以下のアンモニア反
応におけるNADPHの引続く酸化により吸光度が徐々に減
少する： 第２の吸光度測定は、NADPH酸化後の最低吸光度の点
にて行なわれる。第１および第２の測定についての吸光
度酸化は、試料中のアンモニア濃度に比例する。
は、NADP+である。アンモニア含有試料、好ましくは、
血清、血漿または尿は、α−ケトグルタレート、NADP+
およびG6Pと混合され、ブランク測定が行なわれる。次
いで、該反応混合物にG6PDおよびグルタメートデヒドロ
ゲナーゼ（GlDH）を加え、約340nm、または320−380nm
の範囲内にて強い吸収を有するNADPHの形成による吸光
度の急速な増加を起こす。次いで、以下のアンモニア反
応におけるNADPHの引続く酸化により吸光度が徐々に減
少する： 第２の吸光度測定は、NADPH酸化後の最低吸光度の点
にて行なわれる。第１および第２の測定についての吸光
度酸化は、試料中のアンモニア濃度に比例する。
別法として、試薬３および４を第１に混合してNADPH
を生成せしめてもよい。次いで試料が添加される。
を生成せしめてもよい。次いで試料が添加される。
本発明は、本発明の方法によるアンモニアの測定にお
いて使用される新規試薬組成物をも含んでなる。
いて使用される新規試薬組成物をも含んでなる。
該第１のアンモニア試薬［試薬３］は、基本的にNADP
+とG6Pとからなる。試薬３は、MES緩衝剤（２−［Ｎ−
モルフォリノ］エタンスルホン酸）もしくは他の緩衝
剤、または安定剤を含んでもよい。例えば、試薬３は、
50−150mMのMES緩衝剤、pH6.0、10−50mMのNADP+、およ
び10−20mMのG6Pを含んでもよい。好ましい実施態様に
おいて、試薬３は概略、次を含む： 80mM MES緩衝剤 pH6.0 26,4mM NADP+ 7.9mM G6P 該第２のアンモニア試薬［試薬４］は、基本的にα−
ケトグルタレート、G6PDおよびGlDHを含んでなる。試薬
４は、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン）緩衝剤もしくは他の緩衝剤または安定剤を含んでも
よい。例えば、試薬４は、25−500mMのトリス緩衝剤、p
H8.0、２−15mMのα−ケトグルタレート、５−15,000U/
L G6PDおよび５−40,000U/LのGLDHを含んでもよい。好
ましい実意態様において、試薬４は概略、次を含む： 320mMのトリス、pH8.0 8,800U/LのG6PD 22,000U/LのGlDH 7.9mMのα−ケトグルタレート 試料中のアンモニアの測定は、COBAS MIRAにおいて２
種類の方法で行なえる。第１には、１容の試薬３と10容
の試薬４とを混合することにより単一の操作用試薬を調
製する。次いで25−75μの試料を、100−200μの操
作用試薬と同時に、第１サイクルにおいてピペットで取
る。340nmにおける吸光度測定を反応開始後4.5秒（T
1）、および反応完了時のサイクル10（４分）い行な
う。吸光度読取りの差が、試料中のアンモニア量と相関
関係にある。
+とG6Pとからなる。試薬３は、MES緩衝剤（２−［Ｎ−
モルフォリノ］エタンスルホン酸）もしくは他の緩衝
剤、または安定剤を含んでもよい。例えば、試薬３は、
50−150mMのMES緩衝剤、pH6.0、10−50mMのNADP+、およ
び10−20mMのG6Pを含んでもよい。好ましい実施態様に
おいて、試薬３は概略、次を含む： 80mM MES緩衝剤 pH6.0 26,4mM NADP+ 7.9mM G6P 該第２のアンモニア試薬［試薬４］は、基本的にα−
ケトグルタレート、G6PDおよびGlDHを含んでなる。試薬
４は、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン）緩衝剤もしくは他の緩衝剤または安定剤を含んでも
よい。例えば、試薬４は、25−500mMのトリス緩衝剤、p
H8.0、２−15mMのα−ケトグルタレート、５−15,000U/
L G6PDおよび５−40,000U/LのGLDHを含んでもよい。好
ましい実意態様において、試薬４は概略、次を含む： 320mMのトリス、pH8.0 8,800U/LのG6PD 22,000U/LのGlDH 7.9mMのα−ケトグルタレート 試料中のアンモニアの測定は、COBAS MIRAにおいて２
種類の方法で行なえる。第１には、１容の試薬３と10容
の試薬４とを混合することにより単一の操作用試薬を調
製する。次いで25−75μの試料を、100−200μの操
作用試薬と同時に、第１サイクルにおいてピペットで取
る。340nmにおける吸光度測定を反応開始後4.5秒（T
1）、および反応完了時のサイクル10（４分）い行な
う。吸光度読取りの差が、試料中のアンモニア量と相関
関係にある。
操作用試薬を調製せずに、更なる別法においては、CO
BAS MIRAに試薬３および４をそれぞれ1:10の比率で別々
にピペットにて取られる。例えば、第１サイクルにおい
ては10〜20μの試薬３と100−200μの試薬４とをピ
ペットで取り、サイクル３までに、完全にNADPHが生成
される（最大A340により証明される）。次いで、サイク
ル４において、25−75μの試料をピペットで取る。34
0nmにおける最終吸光度測定は、10サイクル後に行なわ
れ、サイクル14と３のA340の差がアンモニア濃度に比例
する。ピペット分取順序において同様に許容される変法
は、試料と試薬４とを共にサイクル１において加え、A
340の測定を行ない、次いでサイクル２にて試薬３を加
えることである。前述と同様に、最終A340は、約10サイ
クル後に測定される。この変法は、下記例３において使
用された。
BAS MIRAに試薬３および４をそれぞれ1:10の比率で別々
にピペットにて取られる。例えば、第１サイクルにおい
ては10〜20μの試薬３と100−200μの試薬４とをピ
ペットで取り、サイクル３までに、完全にNADPHが生成
される（最大A340により証明される）。次いで、サイク
ル４において、25−75μの試料をピペットで取る。34
0nmにおける最終吸光度測定は、10サイクル後に行なわ
れ、サイクル14と３のA340の差がアンモニア濃度に比例
する。ピペット分取順序において同様に許容される変法
は、試料と試薬４とを共にサイクル１において加え、A
340の測定を行ない、次いでサイクル２にて試薬３を加
えることである。前述と同様に、最終A340は、約10サイ
クル後に測定される。この変法は、下記例３において使
用された。
本発明は、 （ａ） 試薬３の容器 （ｂ） 試薬４の容器 を含む試料中のアンモニアの測定に使用するための診断
用試薬キットをも包含している。
用試薬キットをも包含している。
本発明は、例示の目的のみに与えられる以下の例との
関連において、更に記述されるであろう。
関連において、更に記述されるであろう。
例１ 試薬調製 試薬１（１リットル）:8.71gのリン酸カリウム（二塩基
性、無水）、1gのNaN3、0.076gのEGTA（酸型）、0.366g
のオキサメート（−ナトリウム塩）を、約950mlの脱イ
オン水に溶解させた。最終成分を該試薬溶液中に次の順
序で完全に溶解させた：第１に、2.8gのホスホエノール
プリベート（モノーシクロヘキシルアンモニウム塩）；
第２に5.86gのNAD・3H2O（酸型）；第３に、1.36gのMgC
l2・6H2O;第４に、0.34gのグルコース−６−ホスフェー
ト（モノナトリウム塩）。最後に0.1gのトライトンＸ−
100（還元されている）および0.5gのフォーマスター（F
oamoster）FLDを加え、KOHにてpHを6.9に調節し、脱イ
オン水を用いて体積を１リットルとした。試薬１の成分
の濃度は:50mMのリン酸カリウム、pH6.9、1.2mMのG6P、
8.0mMのNAD+、8.0のPEP、6.7mMのMgCl2、3.3mMのオキサ
メート、0.2mMのEGTA、0.1％のNaN3、0.01％のトライト
ンＸ−100、および0.05％のフォーマスターFLDである。
性、無水）、1gのNaN3、0.076gのEGTA（酸型）、0.366g
のオキサメート（−ナトリウム塩）を、約950mlの脱イ
オン水に溶解させた。最終成分を該試薬溶液中に次の順
序で完全に溶解させた：第１に、2.8gのホスホエノール
プリベート（モノーシクロヘキシルアンモニウム塩）；
第２に5.86gのNAD・3H2O（酸型）；第３に、1.36gのMgC
l2・6H2O;第４に、0.34gのグルコース−６−ホスフェー
ト（モノナトリウム塩）。最後に0.1gのトライトンＸ−
100（還元されている）および0.5gのフォーマスター（F
oamoster）FLDを加え、KOHにてpHを6.9に調節し、脱イ
オン水を用いて体積を１リットルとした。試薬１の成分
の濃度は:50mMのリン酸カリウム、pH6.9、1.2mMのG6P、
8.0mMのNAD+、8.0のPEP、6.7mMのMgCl2、3.3mMのオキサ
メート、0.2mMのEGTA、0.1％のNaN3、0.01％のトライト
ンＸ−100、および0.05％のフォーマスターFLDである。
試薬２（１リットル）:3.91gの一塩基性リン酸アンモニ
ウム（無水）、および8.72gの二塩基性リン酸アンモニ
ウム（無水）を、1gのNaN3、および0.058gのEDTA（酸
型）と共に約650mlの脱イオン水に溶解させた。これを3
00mlのグリセロールと混合し、NH4OHによりpHを7.2に調
節し、続いて1gのウシガンマーグロブリン（BGG）およ
び3.09gのジチオスレイトール（DTT）を加え、溶解させ
た。次いで、50,000単位のG6PD（L.Mesenteroides）、1
400UのPEPC（トウモロコシの葉）および7000単位のMDH
（ブタ心臓細胞質）をゆるやかに撹拌しつつ添加し、続
いてイソプロパノール中のフェニルメチルスルフォニル
フルオライド（PMSF）の0.1M溶液1mlを撹拌しつつ添加
した。必要に応じてpHをNH4OHにより7.2に調節し、体積
を脱イオン水により１リットルに調節した。試薬２の成
分の最終濃度は:100mMのリン酸アンモニウム、pH7.2、2
0mMのDTT、0.2mMのEDTA、0.1mMのPMSF、0.1％のNaN3、3
0％のグリセロール、50,000U/LのG6PD、1400U/LのPEP
C、および7000U/LのMDHである。反応混合物中の臨界的
試薬の最終濃度は、0.72mMのG6P、4.8mMのPEP、4.8mMの
NAD+、4.0mMのMgCl2、10,000U/LのG6PD、280U/LのPEP
C、および1400U/LのMDHである。
ウム（無水）、および8.72gの二塩基性リン酸アンモニ
ウム（無水）を、1gのNaN3、および0.058gのEDTA（酸
型）と共に約650mlの脱イオン水に溶解させた。これを3
00mlのグリセロールと混合し、NH4OHによりpHを7.2に調
節し、続いて1gのウシガンマーグロブリン（BGG）およ
び3.09gのジチオスレイトール（DTT）を加え、溶解させ
た。次いで、50,000単位のG6PD（L.Mesenteroides）、1
400UのPEPC（トウモロコシの葉）および7000単位のMDH
（ブタ心臓細胞質）をゆるやかに撹拌しつつ添加し、続
いてイソプロパノール中のフェニルメチルスルフォニル
フルオライド（PMSF）の0.1M溶液1mlを撹拌しつつ添加
した。必要に応じてpHをNH4OHにより7.2に調節し、体積
を脱イオン水により１リットルに調節した。試薬２の成
分の最終濃度は:100mMのリン酸アンモニウム、pH7.2、2
0mMのDTT、0.2mMのEDTA、0.1mMのPMSF、0.1％のNaN3、3
0％のグリセロール、50,000U/LのG6PD、1400U/LのPEP
C、および7000U/LのMDHである。反応混合物中の臨界的
試薬の最終濃度は、0.72mMのG6P、4.8mMのPEP、4.8mMの
NAD+、4.0mMのMgCl2、10,000U/LのG6PD、280U/LのPEP
C、および1400U/LのMDHである。
例２ COBAS−MIRAによるCO2測定 アッセイを37℃にて行なった。150μの試薬１、50
μお試薬２、および30μの希釈剤を反応溶液中に混
合し、３分間インキュベートした。次いで、２μの試
料と18μの希釈剤とを加え、混合後直ちに340nmにお
ける吸光度を測定した。３分後に第２回目の吸光度測定
を340nmにて行なった。吸光度変化は、試料中のCO2濃度
に比例している。標準および対照を、未知試料と組合わ
せて走らせ、見知試料中のCO2濃度を常法により標準曲
線から計算した。
μお試薬２、および30μの希釈剤を反応溶液中に混
合し、３分間インキュベートした。次いで、２μの試
料と18μの希釈剤とを加え、混合後直ちに340nmにお
ける吸光度を測定した。３分後に第２回目の吸光度測定
を340nmにて行なった。吸光度変化は、試料中のCO2濃度
に比例している。標準および対照を、未知試料と組合わ
せて走らせ、見知試料中のCO2濃度を常法により標準曲
線から計算した。
例３ COBAS MIRAによるアンモニア測定 アッセイを370℃にて行ない、130μの試料４を第１
サイクルにおいて50μの試料と混合し、吸光度を340n
mにて測定した。次いで13μの試薬３を加え、４分間
後（サイクル11）に第２の吸光度測定を340nmにて行な
った。２回の測定についての吸光度差からアンモニア濃
度を決定した。下記表は、本発明によりアンモニアを測
定する場合の吸光度変化を例示している。
サイクルにおいて50μの試料と混合し、吸光度を340n
mにて測定した。次いで13μの試薬３を加え、４分間
後（サイクル11）に第２の吸光度測定を340nmにて行な
った。２回の測定についての吸光度差からアンモニア濃
度を決定した。下記表は、本発明によりアンモニアを測
定する場合の吸光度変化を例示している。
Ａ（サイクル１）は、試薬４および試料の吸光度であ
る。Ａ（サイクル11）は、試薬３添加後の吸光度であ
る。ΔＡ（サイクル11−サイクル１）は、アンモニア反
応による吸光度変化であり、試料中のアンモニア濃度の
計算に使用される。
る。Ａ（サイクル11）は、試薬３添加後の吸光度であ
る。ΔＡ（サイクル11−サイクル１）は、アンモニア反
応による吸光度変化であり、試料中のアンモニア濃度の
計算に使用される。
本発明を好ましい実施態様との関連において記述した
が、本発明を示した特定の形態に限定することを意図す
るものではなく、逆に、別法、変法および同等物を特許
請求の範囲の精神および範囲に包含させることを意図す
るものである。
が、本発明を示した特定の形態に限定することを意図す
るものではなく、逆に、別法、変法および同等物を特許
請求の範囲の精神および範囲に包含させることを意図す
るものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘンリィ ジョセフ ローゼンフェルド アメリカ合衆国ニユー ジャージー州フ ローアハム パーク，アパートメント エイ４， リッジデール アベニュー 250 (72)発明者 ジャニー エリザベス サボ アメリカ合衆国ニユー ジャージー州ロ ディ，アイダ コート ９
Claims (9)
- 【請求項１】試料と基質との混合物に対する基質特異的
酵素の作用による吸光度変化の測定によって試料体液中
の分析対象濃度を測定する酵素的方法において、補酵素
が添加された試料と基質との混合物への基質特異的酵素
の添加後に、その場に生成する所定量の還元された補酵
素の再酸化による吸光度変化を測定し、この吸光度変化
を分析対象濃度に相関させることにより試料体液中の分
析対象濃度を測定することからなる方法であって、第１
の吸光度測定を、試料を補酵素、酵素基質および基質特
異的酵素と混合した後行い、第２の吸光度測定を、第１
の吸光度測定後適当な時間に行うか、または 第１の吸光度測定を、試料を補酵素および酵素基質と混
合した後行い、第２の吸光度測定を基質特異的酵素を加
えた後適当な時間に行うか、または 第１の吸光度測定を、試料を基質特異的酵素と混合した
後行い、第２の吸光度測定を補酵素および酵素基質を加
えた後適当な時間に行う ことからなり、この吸光度変化は第１の吸光度測定値と
第２の吸光度測定値との差である酵素的測定方法。 - 【請求項２】その場に生成する所定量の還元された補酵
素の、分析対象、基質および基質特異的酵素による再酸
化による吸光度変化を測定し、この吸光度変化を分析対
象濃度に相関させることからなる、酵素的方法による試
料体液中の全二酸化炭素の測定用試薬組成物であって、
ホスホエノールピルベート（PEP）、グルコース−６−
ホスフェート（G6P）およびニコチンアミドアデニンヌ
クレオチド（NAD）からなる、試薬組成物［試薬１］。 - 【請求項３】その場に生成する所定量の還元された補酵
素の、分析対象、基質および基質特異的酵素による再酸
化による吸光度変化を測定し、この吸光度変化を分析対
象濃度に相関させることからなる、酵素的方法による試
料体液中の全二酸化炭素の測定用試薬組成物であって、
PEPのオキサロ酢酸（OAA）への変換に触媒作用を及ぼす
ために充分な量のホスホエノールピルベートカルボキシ
ラーゼ（PEPC）、グルコース−６−ホスフェート（G6
P）の６−ホスホグルコネート（6PGA）への変換に触媒
作用を及ぼすために充分な量のグルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ（G6PD）、およびOAAのマレエ
ート（リンゴ酸）への変換に触媒作用を及ぼすために充
分な量のマレエートデヒドロゲナーゼ（MDH）からな
る、試薬組成物［試薬２］。 - 【請求項４】（ａ）試薬体液を、補酵素、酵素基質、基
質特異的酵素と混合し、 （ｂ）工程（ａ）に続いて溶液の吸光度を320〜380ナノ
メータ（nm）にて測定し、第１の吸光度測定値を得、 （ｃ）工程（ｂ）に続く適当な時間に溶液の吸光度を32
0〜380nmにて測定し、第２の吸光度測定値を得る工程か
らなり、 この場合試料体液中のCO2濃度はその場に生成する還元
された補酵素の再酸化による吸光度変化に比例する、試
料体液中の全CO2を測定するための請求項１の方法。 - 【請求項５】その場に生成する所定量の還元された補酵
素の、分析対象、基質および基質特異的酵素による再酸
化による吸光度変化を測定し、この吸光度変化を分析対
象濃度に相関させることからなる、酵素的方法による試
料体液中の全二酸化炭素の測定用キットであって、 （ａ）請求項２の試薬組成物［試薬１］を含む容器、お
よび （ｂ）請求項３の試薬組成物［試薬２］を含む容器 からなる、試料体液中の全CO2測定に用いる診断用試験
キット。 - 【請求項６】その場に生成する所定量の還元された補酵
素の、分析対象、基質および基質特異的酵素による再酸
化による吸光度変化を測定し、この吸光度変化を分析対
象濃度に相関させることからなる、酵素的方法による試
料体液中のアンモニア（NH3）の測定用試薬組成物であ
って、NADPおよびG6Pからなる試料体液中のアンモニア
の測定に用いる試薬組成物［試薬３］。 - 【請求項７】その場に生成する所定量の還元された補酵
素の、分析対象、基質および基質特異的酵素による再酸
化による吸光度変化を測定し、この吸光度変化を分析対
象濃度に相関させることからなる、酵素的方法による試
料体液中のアンモニア（NH3）の測定用試薬組成物であ
って、α−ケトグルタレート、G6PDおよびグルタメート
デヒドロゲナーゼ（GLDH）からなる試料体液中のアンモ
ニアの測定に用いる試薬組成物［試薬４］。 - 【請求項８】（ａ）試料体液を、基質特異的酵素と混合
し、 （ｂ）溶液の吸光度を320〜380nmにて測定し、第１の吸
光度測定値を得、 （ｃ）工程（ａ）の反応混合物を補酵素および酵素基質
と混合し、 （ｄ）補酵素の再酸化後、320〜380nmにて最低吸光度を
測定し、第２の吸光度測定値を得る工程からなり、 この場合（ｄ）および（ｂ）の吸光度差は試料体液中の
アンモニア濃度に比例する、試料体液中のアンモニアを
測定するための請求項１の方法。 - 【請求項９】その場に生成する所定量の還元された補酵
素の、分析対象、基質および基質特異的酵素による再酸
化による吸光度変化を測定し、この吸収度変化を分析対
象濃度と相関させることからなる、酵素的方法による試
料体液中のアンモニア（NH3）の測定用キットであっ
て、 （ａ）請求項６の試薬組成物［試薬３］を含む容器、お
よび （ｂ）請求項７の試薬組成物［試薬４］を含む容器 からなる、試料体液中のアンモニア測定用診断用試験キ
ット。
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