BR112021014997A2 - Kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, método para fornecer um kit de ensaio, uso de um kit de ensaio, kit de ensaio, mistura e dispositivo - Google Patents
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Abstract
kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, método para fornecer um kit de ensaio, uso de um kit de ensaio, kit de ensaio, mistura e dispositivo. a presente divulgação trata da bioquímica de reagentes úteis na detecção de amônia em amostras líquidas. especificamente, a presente divulgação é direcionada a um aprimoramento técnico de um teste baseado em enzimas para amônia que pode ser usado para análise de amostras de plasma retiradas de pacientes em ambientes clínicos, entre outros usos. a este respeito, a estabilidade de um reagente contendo nad(p)h é melhorada, aumentando a vida útil e resultando na detecção de amônia. em um reagente exemplar, a amônia liberada, como um resultado do decaimento de nad(p)h, é eliminada usando uma reação enzimática para converter a amônia usando gldh, nad(p)h e 2-oxoglutarato, formando assim l-glutamato, nad(p)+ e h2o no reagente contendo nad(p)h.
Description
[0001] A presente divulgação trata da bioquímica de reagentes úteis na detecção de amônia em amostras líquidas. Especificamente, a presente divulgação é direcionada a um aprimoramento técnico de um teste baseado em enzimas para amônia que pode ser usado para análise de amostras de plasma retiradas de pacientes em ambientes clínicos, entre outros usos. A este respeito, a estabilidade de um reagente contendo NAD(P)H é melhorada, aumentando a vida útil e resultando na detecção de amônia. Em um reagente exemplar, a amônia liberada como resultado do decaimento de NAD(P)H é eliminada usando uma reação enzimática para converter a amônia usando GLDH (glutamato desidrogenase), NAD(P)H e 2-oxoglutarato, formando assim L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no reagente contendo NAD(P)H
[0002] Em animais superiores e particularmente em humanos, a amônia é gerada principalmente no trato gastrointestinal pelo metabolismo de compostos nitrogenados. Um excesso de amônia pode ser tóxico para o sistema nervoso central. O ciclo da ureia de Krebs-Henseleit fornece um meio de eliminação da amônia ao metabolizar a amônia em ureia no fígado. A hiperamonemia em bebês humanos pode ser causada por deficiências hereditárias das enzimas do ciclo da ureia ou adquirida por doença hepática aguda (como na síndrome de Reye) ou crônica (como na cirrose). Em humanos adultos, os níveis elevados de amônia podem ajudar no diagnóstico de insuficiência hepática ou encefalopatia hepática por doenças hepáticas avançadas, tais como hepatite viral ou cirrose. Assim, a amônia é um parâmetro clínico significativo, e ensaios in vitro para amônia são tecnicamente desejados.
[0003] Em 1963, Kirsten et al. introduziram um método enzimático para determinação de amônia baseado na ação da glutamato desidrogenase (Kirsten E, et al. Biochem Z 337 (1963) 312-319). Embora o método enzimático tenha se mostrado altamente específico e usado avaliação direta com base na absortividade molar da NADH, vários problemas foram encontrados, incluindo dificuldades em estabilizar a reação final.
[0004] Uma melhoria desta abordagem técnica é a modificação de Da Fonseca-Wollheim da reação de Kirsten. O método enzimático original é melhorado pela adição de ADP à mistura de reação, pelo uso de NADPH no lugar de NADH para eliminar a interferência da reação de LDH endógena com piruvato endógeno, e pela substituição de plasma por sobrenadante desproteinizado (Da Fonseca-Wollheim F. Z Klin Chem Klin Biochem 11 (1973) 421-425).
[0005] JP03614967B2 divulga a remoção de amônio de uma amostra efetuada usando uma combinação compreendendo 2-oxoglutarato, GLDH, glicose-6-fosfato, glicose-6-fosfato desidrogenase e NADPH.
[0006] Chenault KH & Whitesides GM Appl Biochem Biotechnol.
14 (1987) 147-197 relatam diferentes abordagens para regeneração de cofatores de nicotinamida.
[0007] Uma modalidade exemplar da modificação de Da Fonseca- Wollheim no campo da química clínica e diagnóstico in vitro é o kit de ensaio cobas® NH3 (Amônia) para analisadores Roche/Hitachi (incluindo o MODULAR P, plataformas cobas c; por exemplo, Roche Cat. nº 11877984216 com Cat. nº 20751995190, 20752401190, 20753009190 como calibradores), para determinação quantitativa de amônia no plasma sanguíneo. O kit em uso compreende um recipiente de reagente com uma primeira e uma segunda solução aquosa de trabalho, também conhecida como R1 e R2.
[0008] O princípio do ensaio faz uso de uma reação que é catalisada pela glutamato desidrogenase (GLDH), EC 1.4.1.3. Em solução aquosa, a GLDH catalisa a aminação redutiva de 2-oxoglutarato com NH4+ e o cossubstrato NADPH, formando glutamato e NADP+. No decurso do fluxo de trabalho do ensaio de diagnóstico, a amostra de plasma é misturada com alíquotas de R1 e R2 e incubada. Após a incubação, a quantidade de cossubstrato oxidado NADP+ é determinada fotometricamente medindo a diferença de absorbância para NADPH antes e depois de adicionar a amostra, e a quantidade correspondente de amônia na amostra é determinada usando dados de calibração que são coletados em medições separadas.
[0009] A fim de assegurar a estabilidade e o prazo de validade dos compostos reativos envolvidos, as soluções aquosas dos mesmos precisam ser mantidas sob condições adequadas. Especificamente, a GLDH se torna cada vez mais instável com o aumento do pH. Para o propósito de um ensaio de diagnóstico, a GLDH é impraticável do ponto de vista técnico se armazenada sob condições alcalinas acima de pH 10. No entanto, um pH inferior a 9 permite estabilidade, vida útil e usabilidade suficientes da GLDH. Assim, no kit de ensaio cobas® NH3 (Amônia) exemplar, a solução de trabalho R1 é uma solução aquosa tamponada a pH 8,3 (ou seja, inferior a pH 9) que é fornecida pelo fabricante como um reagente líquido pronto para uso no kit de ensaio disponível comercialmente.
[00010] Em contraste, a NADPH (e similarmente a NADH) é suficientemente estável em solução a um pH acima de 10. No entanto, com o tempo, a NAD(P)H exibe o decaimento em solução aquosa, mesmo em um pH acima de 10. Para lidar com essa instabilidade, o kit de ensaio cobas® NH 3 (Amônia) é enviado com ingredientes secos de R2, incluindo NADPH. Quando mantida como matéria seca, a NADPH permanece estável. Antes do uso, a solução de trabalho R2 é preparada pela dissolução da NADPH seca em um tampão aquoso, formando-se assim a solução aquosa (R2), que está pronta para o subsequente (e preferivelmente imediato) consumo no ensaio de diagnóstico de fluxo de trabalho para determinar NH3 na amostra. Como isso requer trabalho manual extra, um reagente estabilizado pronto para uso com NADPH é desejado.
[00011] Como resultado do decaimento da NADPH, a amônia é formada como um produto. Por esse motivo específico, há uma necessidade técnica de neutralizar o decaimento da NADPH em reagentes para uso em um ensaio para determinar e quantificar a amônia em uma amostra. Assim, ao longo do tempo, a NH3 se acumula em uma solução de trabalho R2 devido ao decaimento da NADPH, com o risco de causar valores de medição falsamente elevados
[00012] As composições, métodos de kits e usos descritos na presente divulgação são projetados para fornecer melhorias em vista das necessidades técnicas mencionadas acima. Com base nos ensinamentos detalhados neste documento, os ensaios para a determinação de amônia em amostras líquidas podem ser melhorados de forma vantajosa.
Surpreendentemente, a vida útil de um reagente aquoso contendo NAD(P)H pode ser prolongada, mesmo sob condições adversas.
[00013] Neste documento, é relatado, como um primeiro aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, o kit contendo 2-oxoglutarato, glutamato desidrogenase capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato (= GLDH) e NAD(P)H, em que o kit compreende um primeiro e um segundo recipiente, em que o primeiro recipiente contém um primeiro reagente aquoso com uma primeira quantidade de GLDH, o primeiro reagente tendo um pH capaz de manter a atividade enzimática de GLDH, em que o segundo recipiente contém um segundo reagente aquoso com NAD(P)H, 2-oxoglutarato e uma segunda quantidade de GLDH, em que a atividade enzimática de GLDH por mL do primeiro reagente é superior à atividade enzimática de GLDH por mLde reagente no segundo reagente, e em que o pH do segundo reagente é capaz de manter a atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H e 2-oxoglutarato, sendo assim capaz de formar L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no segundo reagente.
[00014] Neste documento, é relatado, como um segundo aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, um método para fornecer um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, o kit compreendendo dois reagentes aquosos diferentes, os reagentes contendo em solução aquosa 2-oxoglutarato, glutamato desidrogenase capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato (= GLDH) e NAD(P)H, o método compreendendo as etapas de preparar um primeiro reagente por dissolução de GLDH em um uma solução aquosa com um pH capaz de manter a atividade enzimática de GLDH, preparar um segundo reagente pela dissolução, em uma solução aquosa, de 2-oxoglutarato, GLDH e NAD(P)H, e ajustar o pH do segundo reagente para ser permissivo para manter atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H e 2-oxoglutarato, permitindo assim a formação de L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no segundo reagente, fornecer o primeiro e o segundo reagentes em recipientes separados e combinar os recipientes em um kit de peças, fornecendo portanto um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa.
[00015] Neste documento, é relatado, como um terceiro aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, o uso de um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto, para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa.
[00016] Neste documento, é relatado, como um quarto aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto, em que a concentração de amônia no segundo reagente é de cerca de 1,5 µM ou menos, mais especificamente de cerca de 0,01 µM a cerca de 1,5 µM.
[00017] Neste documento, é relatado, como um quinto aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, uma mistura compreendendo (i) uma amostra líquida aquosa suspeita de conter amônia e (ii) o segundo reagente do kit de ensaio, incluindo um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto.
[00018] Neste documento, é relatado, como um sexto aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, um dispositivo automatizado capaz de formar uma mistura de acordo com o quinto aspecto, em que o dispositivo é combinado com (i) uma amostra líquida aquosa em um recipiente de amostra e (ii) um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto.
[00019] A terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares somente e não se destina a ser uma limitação da invenção.
[00020] Nesta descrição detalhada, as referências a "uma modalidade", "uma modalidade" ou "em modalidades" significam que a característica a ser referida está incluída em pelo menos uma modalidade da tecnologia no que diz respeito a todos os seus aspectos de acordo com a presente divulgação. Além disso, referências separadas a "uma modalidade", "uma modalidade" ou "modalidades" não se referem necessariamente à mesma modalidade; no entanto, nenhuma dessas modalidades são mutuamente exclusivas, a menos que assim declarado, e exceto como será prontamente aparente para aqueles técnicos no assunto. Assim, a tecnologia em todos os seus aspectos de acordo com a presente divulgação pode incluir qualquer variedade de combinações e/ou integrações das modalidades descritas neste documento.
[00021] Os termos “um”, “uma” e “o/a” geralmente incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
Conforme usado neste documento, "pluralidade" é entendida como significando mais de um. Por exemplo, uma pluralidade refere-se a pelo menos dois, três, quatro, cinco ou mais. A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado neste documento, o termo "ou" é entendido como inclusivo.
[00022] É ainda entendido que os termos raiz "incluem" e/ou "tem", quando usados neste relatório específico, especificam a presença de características, itens, números inteiros, etapas, operações, elementos e/ou componentes declarados, mas não excluem a presença ou adição de pelo menos uma outra característica, número inteiro, etapa, operação, elemento, componente e/ou grupos dos mesmos. De forma análoga, “com” também especifica a presença de características declaradas, etc.
[00023] Conforme usado neste documento, os termos "compreende", "compreendendo", "contém", "contendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo" ou qualquer outra variação do mesmos, destinam-se a cobrir uma inclusão não exclusiva, ou seja, indicar uma lista aberta de características. Por exemplo, um processo, método, artigo ou aparelho que compreende uma lista de características não está necessariamente limitado somente a essas características, mas pode incluir outras características não expressamente listadas ou inerentes a tal processo, método, artigo ou aparelho. Em contraste, “consiste em”, “consistindo em” ou qualquer outra variação dos mesmos especifica uma lista fechada de características. Notavelmente, a lista fechada de determinadas características é entendida como representando uma modalidade específica de uma lista aberta dessas características.
[00024] Conforme usado neste documento, e a menos que expressamente declarado ao contrário, "ou" refere-se a um inclusivo ou e não a um exclusivo ou. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e A e B são verdadeiros (ou presentes).
[00025] Conforme usado neste documento, "substancialmente", "relativamente", "geralmente", "normalmente", e "aproximadamente" são modificadores relativos destinados a indicar variação permissível da característica assim modificada. Eles não se destinam a serem limitados ao valor absoluto ou característica que ele modifica, mas sim aproximando-se ou aproximando-se de tal característica física ou funcional. A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado neste documento, o termo "cerca de" é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média.
"Cerca de" pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que de outra forma claro do contexto, todos os valores numéricos fornecidos neste documento podem ser modificados pelo termo "cerca de".
[00026] “Amônia” é um composto bem conhecido de nitrogênio e hidrogênio com a fórmula NH3. Pode ser dissolvida em água e sua solução aquosa é alcalina. A amônia é uma base com uma constante de base pK b de
4,76. Assim, em solução aquosa, uma quantidade das moléculas de amônia reage com as moléculas de água para produzir íons de amônio (= “amônio”) e íons de hidroxila. Entende-se que, na medida em que há amônia em uma solução aquosa, ela está em equilíbrio de reação com o amônio, a menos que explicitamente indicado de outra forma.
[00027] O ácido 2-oxoglutárico (= ácido α-cetoglutárico) é um dos dois derivados cetônicos do ácido glutárico. Seu ânion, 2-oxoglutarato (= α- cetoglutarato) é um importante composto biológico. O cetoácido produzido pela desaminação do glutamato é um intermediário no ciclo de Krebs.
[00028] A glutamato desidrogenase (= GLDH) é uma enzima presente na maioria dos micróbios e na mitocôndria de eucariotos. A atividade da GLDH é capaz de converter o L-glutamato em α-cetoglutarato e vice-versa.
Entende-se que todos os aspectos e modalidades do presente relatório referem- se a GLDH (EC 1.4.1.3) que é capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato.
[00029] A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) são cossubstratos de GLDH. Elas são compostas por uma molécula AMP (adenosina monofosfato) covalentemente ligada a uma nicotinamida mononucleotídeo, portanto, um dinucleotídeo. A NADP+ difere da NAD+ pela presença de um grupo fosfato adicional no carbono dois do anel ribose da AMP. Essas moléculas são cossubstratos difusíveis que participam das reações de oxidação/redução (= redox). NAD+ e NADP+ são as formas oxidadas do respectivo cossubstrato.
Quando reduzido, o carbono quatro do anel da nicotinamida aceita um íon hidreto (H–), um próton e dois elétrons. NAD+/NADP+ sempre sofre duas oxidações ou reduções de elétrons. NADH e NADPH são a abreviatura para as formas reduzidas. No que diz respeito à atividade enzimática de GLDH, não apenas NADH e NADPH podem servir como substratos, mas também seus análogos funcionais. Na Figura 4A-H, vários deles são ilustrados. Para os fins do presente relatório, afirma-se neste documento que os ensinamentos descritos em todos os aspectos e modalidades também podem ser, de forma vantajosa, praticados com qualquer um dos análogos funcionais, desde que a GLDH particular em uso seja capaz de reagir a forma reduzida do respectivo análogo funcional em uma reação redox com 2-oxoglutarato, produzindo assim a forma oxidada do análogo funcional.
[00030] Para o propósito da presente divulgação, um "kit de ensaio" é entendido como uma composição de peças que são combinadas com a finalidade de realizar um ensaio. Normalmente, o ensaio envolve a detecção e a determinação (quantificação) de um analito em uma amostra, tal como, por exemplo, mas não se limitando a, o analito amônia no plasma como o material da amostra. É importante ressaltar que o significado de "kit de ensaio" denota a composição de peças antes do uso que esgota uma ou mais peças incluídas no kit. Na modalidade específica de um recipiente que envolve (contém) um reagente líquido, entende-se que, antes do uso, o recipiente é fechado e opcionalmente selado. Antes do uso, o recipiente é aberto e o selo, se presente, está quebrado. Aspectos e modalidades relatados na presente divulgação são direcionados a um kit de ensaio como um kit de peças compreendendo pelo menos duas peças, peça A e peça B. Outras peças podem estar presentes em um kit de ensaio de acordo com a presente divulgação. Cada peça normalmente compreende um ou mais componentes. Ao fornecer o kit de peças deve - se possível - ser evitado combinar componentes dentro de uma peça, componentes que podem reagir quimicamente entre si formando um produto indesejado, especialmente durante o armazenamento do kit de peças. Assim, o kit de peças normalmente é fornecido de uma maneira, em que esses componentes reativos são separados uns dos outros, pelo menos durante o armazenamento, a fim de evitar uma reação indesejada. Embora o problema técnico apresentado por reações indesejadas de NAD(P)H seja tratado especificamente, entende-se que todos os outros componentes em peças de um kit de ensaio, conforme divulgado neste documento, estão em um ambiente apropriado, por exemplo, reagentes (não limitantes) incluídos em um invólucro (recipiente) que protege contra a evaporação de líquidos, enzimas e substratos são fornecidos em solventes compostos para serem permissivos para uso de acordo com o propósito do kit de ensaio e outras medidas aceitas na técnica. Um kit de ensaio também inclui material de embalagem e um documento com informações sobre o uso pretendido do kit de ensaio e as condições recomendadas ou exigidas de armazenamento antes do uso do kit. No que diz respeito ao material de embalagem, uma modalidade específica permite ao usuário reconhecer um kit que já foi aberto e, portanto, pode não estar na condição original após a fabricação, por exemplo, por um selo de originalidade.
[00031] As descobertas relatadas na presente divulgação, por um lado, estão relacionadas à modificação de Da Fonseca-Wollheim da reação de Kirsten. O método enzimático original é melhorado pela adição de ADP à mistura de reação, pelo uso de NADPH no lugar de NADH para eliminar a interferência da reação de LDH endógena com piruvato endógeno, e pela substituição de plasma por sobrenadante desproteinizado (Da Fonseca-Wollheim F. Z Klin Chem Klin Biochem 11 (1973) 421-425). Por outro lado, no entanto, as descobertas da presente divulgação referem-se mais geralmente à estabilização de soluções aquosas de NADPH e NADH, especificamente para o propósito da determinação de amônia, em que ensaios de detecção relevantes são baseados na atividade enzimática de glutamato desidrogenase.
[00032] Normalmente, os reagentes de detecção específicos para amônia são selecionados e projetados para serem capazes de simultaneamente i) reagirem quantitativamente o amônio (e, portanto, a amônia estando em um equilíbrio de reação com o amônio, em solução aquosa) que está presente na amostra, e ii) produzirem um produto de reação detectável em quantidades estequiométricas refletindo a quantidade de amônia reagida.
[00033] Um princípio de ensaio estabelecido há muito faz uso da seguinte reação [Reação 1] que é catalisada pela glutamato desidrogenase (GLDH). Em solução aquosa, a GLDH catalisa a aminação redutiva de 2-oxoglutarato com NH4+ e NADPH, formando glutamato e NADP+.
[Reação 1]
GLDH NH4+ + 2-oxoglutarato + NADPH → L-glutamato + NADP+ + H2O
[00034] O cossubstrato na [Reação 1] é NADPH sendo a forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (CAS nº 53-59-8); a forma oxidada correspondente é NADP+. Alternativamente, o cossubstrato pode ser NADH sendo a forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo (CAS nº 58-68-4); a forma oxidada correspondente é NAD+. A reação enzimática alternativa é análoga à seguinte [Reação 2].
[Reação 2]
GLDH NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH → L-glutamato + NAD+ + H2O
[00035] Conforme já mencionado acima, na medida em que há amônia em uma solução aquosa, ela está em equilíbrio de reação com o amônio, a menos que explicitamente indicado de outra forma. Para o propósito da presente divulgação, qualquer uma das [Reação 1] e [Reação 2], tanto sozinhas ou combinadas, também é referida como "reação de detecção". Além disso, qualquer um dos NADPH e NADH c também são referidos como "cossubstrato reduzido". Além disso, qualquer um dos NADP+ e NAD+ também são referidos como "cossubstrato oxidado".
[00036] É importante ressaltar que ambas as reações de detecção produzem o respectivo cossubstrato oxidado em quantidades estequiométricas, refletindo assim a quantidade de amônio reagido. Os cossubstratos absorvem fortemente a luz ultravioleta, e a diferença entre um cossubstrato reduzido e um oxidado pode ser detectada fotometricamente. Assim, a diferença nos espectros de absorção entre as formas oxidada e reduzida do cossubstrato torna simples medir essa conversão em ensaios enzimáticos de [Reação 1] ou [Reação 2].
[00037] Portanto, com grande vantagem, a NADH e a NADPH são usadas como cossubstratos em uma variedade de ensaios quantitativos que são baseados em reações redox catalisadas por enzimas e, especificamente, tais ensaios são para avaliar as concentrações de amônia em amostras aquosas líquidas. Existe uma relação estequiométrica em que, para cada reação redox catalisada por enzima envolvendo um íon amônio, há uma molécula NAD(P)H convertida em NAD(P)+. A medição espectrofotométrica permite detectar quantitativamente quaisquer alterações da quantidade inicial de NADH ou NADPH inicialmente presente na reação. Com relação à [Reação 1] e [Reação 2], por meio de formar de maneira detectável a respectiva forma oxidada como produto da reação em quantidades estequiométricas, a medição espectrofotométrica da respectiva forma oxidada reflete a quantidade de amônio (e amônia) reagida. O cossubstrato e o composto aceitador 2-oxoglutarato estão presentes em excesso molar, e o equilíbrio químico é deslocado para o lado do produto (L-glutamato + NAD(P)+ + H2O). Como resultado, toda a amônia disponível é eventualmente convertida, ou seja, reagiu quantitativamente, dando origem a uma quantidade molar equivalente de NAD+ ou NADP+, respectivamente.
[00038] As moléculas de NAD(P)H em solução aquosa são instáveis, ou seja, apresentam tendência a decaimento, liberando amônia. O Exemplo 3 lista na Tabela 1 os experimentos ## 1, 3, 4 e 5 que ilustram que a liberação de amônia com o tempo é de fato o caso para soluções aquosas de NAD(P)H. O problema técnico que surge com tal decaimento da liberação de amônia do cossubstrato é especificamente evidente nos casos em que uma solução aquosa de NAD(P)H deve ser usada como um reagente na detecção de amônia em uma amostra. Quanto mais baixa a concentração de amônia na amostra, mais grave é o risco representado pelo reagente aquoso contendo NAD(P)H, em vista de possíveis medições quantitativas falsamente elevadas de amônia.
[00039] No entanto, pode ser mostrado pelos inventores, e está documentado na presente divulgação, que mesmo sob condições que são menos do que subideais (especialmente a um pH superior a 9, ou mesmo superior) uma certa proporção de GLDH retém atividade, na presença de 2- oxoglutarato e NAD(P)H. O impacto dessa descoberta pode ser exemplificado, de forma não limitante, pelo ensaio de diagnóstico Roche Diagnostics cobas® NH3. O presente ensaio cobas® NH3 usa dois reagentes diferentes, R1 e R2, que são misturados com a amostra que se suspeita conter amônia. R1 contém 2-oxoglutarato como um reagente líquido pronto para uso. Imediatamente antes do uso, R2 deve ser preparado de novo a partir de material sólido e soluções aquosas e, após a conclusão da preparação, conter NADPH, GLDH e 2- oxoglutarato. Assim, o kit de ensaio de diagnóstico cobas® NH3 atualmente disponível não contém dois reagentes de ensaio prontos para uso, mas apenas um. O kit contém outros frascos com teor líquido e material sólido, a partir do qual o reagente R2 deve ser preparado manualmente antes do uso.
[00040] Portanto, um primeiro aspecto, que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, é um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, o kit contendo 2-oxoglutarato, glutamato desidrogenase capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato (= GLDH) e NAD(P)H, em que o kit compreende um primeiro e um segundo recipiente, em que o primeiro recipiente contém um primeiro reagente aquoso com uma primeira quantidade de GLDH, o primeiro reagente tendo um pH capaz de manter a atividade enzimática de GLDH, em que o segundo recipiente contém um segundo reagente aquoso com NAD(P)H, 2-oxoglutarato e uma segunda quantidade de GLDH, em que a atividade enzimática de GLDH por mLdo primeiro reagente é maior que a atividade enzimática de GLDH por mLde reagente no segundo reagente, e em que o pH do segundo reagente é capaz de manter a atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H e 2-oxoglutarato, sendo assim capaz de formar L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no segundo reagente.
[00041] É importante observar que nem o primeiro nem o segundo reagente no kit de ensaio, conforme fornecido neste documento, requerem uma etapa de preparação manual separada antes do uso. Assim, em uma modalidade do kit de ensaio, o kit pode compreender (mais especificamente compreende) apenas dois recipientes com duas soluções aquosas, em que qualquer uma das duas soluções inclui um ou mais compostos selecionados a partir de NAD(P)H, GLDH e 2-oxoglutarato. Em uma modalidade, o NAD(P)H está presente apenas no segundo reagente.
[00042] Em uma modalidade, o pH do primeiro reagente é de pH 7 a pH 9 e, mais especificamente, entre pH 8 e pH 9. Modalidades específicas são valores de pH do primeiro reagente, em que um valor particular é selecionado a partir de 8,5 a 8,9.
[00043] No que diz respeito ao segundo reagente em particular, uma conclusão central que é a base do presente relatório é que, com o objetivo de eliminar amônia do reagente contendo NAD(P)H, a GLDH pode ser usada sob condições que foram consideradas tecnicamente inadequadas para usar.
Assim, as condições podem ser selecionadas para o reagente NAD(P)H que principalmente favorecem a estabilidade de NAD(P)H, ou seja, reduzem a tendência de liberação de amônia. Além disso, a presença da enzima GLDH mantém o reagente livre de amônia. Um fator importante neste contexto é o pH do reagente que é selecionado para ser substancialmente alcalino. Assim, em uma modalidade, o pH do segundo reagente é de pH 8 a pH 11 e, mais especificamente, entre pH 8 e pH 10, ainda mais especificamente entre pH 9 e pH 10.
[00044] O Exemplo 2 ilustra de uma forma não limitante que o reagente cobas® NH3L2 R1 recentemente desenvolvido fornece a maior porção da atividade enzimática de GLDH, a ser usada para detecção de amônia na amostra. Notavelmente, o reagente R1 não contém 2-oxoglutarato. Este é um exemplo de modalidade em que o 2-oxoglutarato está presente apenas no segundo reagente.
[00045] O segundo reagente (R3) recém-desenvolvido contém a menor porção de GLDH, porém o suficiente para manter o mecanismo de eliminação de amônia. Assim, em uma modalidade, a razão entre a atividade enzimática de GLDH por mLpresente no primeiro reagente e a atividade enzimática de GLDH por mLpresente no segundo reagente é de 15:1 a 1,5:1, mais especificamente de 10:1 a 2:1, ainda mais especificamente de 5:1 a 2:1, ainda mais especificamente, a razão é de cerca de 3:1. Em outra modalidade, em relação à atividade enzimática de GLDH total fornecida pelos reagentes compreendidos no kit, o segundo reagente contém uma quantidade de atividade enzimática de GLDH de 1% a 30%, a quantidade sendo mais especificamente selecionada a partir de 2% a 5%, 5% a 7%, 7% a 10%, 10% a 15%, 15% a 20%, 20% a 25% e 25% a 30%.
[00046] A descrição acima das modalidades relativas ao primeiro aspecto são igualmente aplicáveis para o segundo aspecto e os outros aspectos também. Assim, um segundo aspecto, que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, é um método para fornecer um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, o kit compreendendo dois reagentes aquosos diferentes, os reagentes contendo em solução aquosa 2-oxoglutarato, glutamato desidrogenase capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato (= GLDH) e NAD(P)H, o método compreendendo as etapas de preparar um primeiro reagente por dissolução de GLDH em um uma solução aquosa com um pH capaz de manter a atividade enzimática de GLDH, preparar um segundo reagente pela dissolução, em uma solução aquosa, de 2-oxoglutarato, GLDH e NAD(P)H, e ajustar o pH do segundo reagente para ser permissivo para manter atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H e 2-oxoglutarato, permitindo assim a formação de L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no segundo reagente, fornecer o primeiro e o segundo reagentes em recipientes separados e combinar os recipientes em um kit de peças, fornecendo portanto um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa.
[00047] O terceiro aspecto, que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, refere-se ao uso de um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto, para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa.
[00048] Outra vantagem notável da tecnologia apresentada neste relatório é o aumento da vida útil e estabilidade aprimorada de um reagente que é fabricado em solução aquosa e contém NAD(P)H, tendo em vista a contaminação da amônia pela decomposição do cossubstrato. Assim, o quarto aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação refere-se a um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto, em que a concentração de amônia no segundo reagente é cerca de 1,5 µM ou menos, mais especificamente de cerca de 0,01 µM a cerca de 1,5 µM.
[00049] O quinto aspecto, que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, fornece uma mistura compreendendo (i) uma amostra líquida aquosa suspeita de conter amônia e (ii) o segundo reagente do kit de ensaio, incluindo um kit de ensaio de acordo com para o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto. Em um exemplo específico, a quantidade de amônia do segundo reagente que se soma à quantidade de amônia presente na amostra é de cerca de 1,5 µM ou menos.
[00050] Neste documento, é relatado, como um sexto aspecto que está relacionado a todos os outros aspectos e modalidades da presente divulgação, um dispositivo automatizado capaz de formar uma mistura de acordo com o quinto aspecto, em que o dispositivo é combinado com (i) uma amostra líquida aquosa em um recipiente de amostra e (ii) um kit de ensaio de acordo com o primeiro aspecto ou um kit de ensaio obtido pela prática do método do segundo aspecto. Em uma modalidade relacionada a todos os outros aspectos e modalidades, o kit de ensaio compreende um cassete de reagente, em que o cassete de reagente compreende pelo menos um primeiro e um segundo compartimento selado, em que o primeiro compartimento é o primeiro recipiente de acordo com o primeiro aspecto dado acima, e o segundo compartimento é o segundo recipiente, conformemente. Assim, em uma modalidade relacionada a todos os aspectos e modalidades fornecidos neste documento, é fornecido um kit de ensaio do primeiro aspecto, em que o primeiro e o segundo recipientes são combinados em qualquer um de um suporte, um rack e um cassete, em que as aberturas do primeiro e segundo recipientes são fechadas e seladas. Assim, qualquer usuário pode reconhecer se as soluções estão ou não em seu estado original após a fabricação. Em uma modalidade mais específica, o primeiro e o segundo recipientes são combinados em um cassete de reagente cobas® compatível com qualquer uma das plataformas Roche Diagnostics cobas® c 311, c 501/502 e c 701/702. Nesta modalidade, o cassete de reação fornece compartimentos separados que funcionam como primeiro e segundo recipientes,
conforme fornecido neste documento.
[00051] Os seguintes exemplos e figuras são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo da qual é estabelecido nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da invenção.
[00052] Figura 1 Fórmulas químicas de NADP+ e NADPH
[00053] Figura 2 Espectros de UV/vis experimentais de NADP+ e NADPH conforme relatado em De Ruyck J. et al. Chem Phys Lett 450 (2007) 119-122.
[00054] Figura 3A-C Descrição das instruções de trabalho para um ensaio de diagnóstico aprimorado para detecção e quantificação de amônia, de acordo com os ensinamentos do presente relatório.
[00055] Figura 4A-H Representação das estruturas moleculares de formas oxidadas de cossubstratos para GLDH: (A) NAD +, (B) NADP+, (C) 3-Acetilpiridina-NAD+, (D) 3-Acetilpiridina-NADP+, (E) 3-Piridina- aldeído-NAD+, (F) 3-Piridina-aldeído-NADP+, (G) Tionicotina-amida-NAD+, (H) Tionicotina-amida-NADP+.
[00056] Figura 5 Representação gráfica dos resultados dos experimentos listados na Tabela 1 (vide Exemplo 4 e Tabela 1).
[00057] Figura 6 Comparação da (i) solução de trabalho do segundo reagente original (R3) [linha sólida] conforme descrito no Exemplo 2 (contendo NADPH) e (ii) solução de trabalho modificada R3' (segundo reagente modificado de acordo com a presente divulgação) em que NADPH foi substituída por NADH [linha pontilhada], para obter mais detalhes, vide o Exemplo 5. Leituras de extinção para NADPH [linha sólida] e NADH [linha pontilhada].
EXEMPLO 1
DETERMINAÇÃO DIAGNÓSTICA DE AMÔNIA EM UMA AMOSTRA DE PLASMA USANDO UM KIT DE ENSAIO DO ESTADO DA TÉCNICA (DESIGNAÇÃO DE ENSAIO "NH3")
[00058] Um kit de ensaio Roche cobas® NH3 (Amônia) para analisadores Roche/Hitachi (incluindo as plataformas MODULAR P; kit de ensaio obtido da Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, Cat. nº 11877984216 com Cat. nºs 20751995190, 20752401190, 20753009190 como calibradores).
[00059] Antes do uso, R2 foi preparado em três etapas, trazendo assim em solução uma preparação sólida (ou seja, livre de água) de NADPH: (1) fornecer de cada um de um frasco 2a e um frasco 2b que são fornecidos como peças do kit de ensaio, seguido pela reconstituição do teor do frasco 2b adicionando 0,5 mLde reagente do frasco 2a ao frasco 2b e misturar, seguido pela incubação da mistura por 10 minutos à temperatura ambiente, com agitação suave ocasional, obtendo-se assim uma primeira solução no frasco 2b.
(2) fornecer um frasco 2 fornecido como peça do kit de ensaio e o frasco 2a da etapa (1), seguido pela reconstituição do teor do frasco 2 adicionando 4,5 mLde reagente do frasco 2a ao frasco 2 e misturar por inversão suave, obtendo assim uma segunda solução no frasco 2.
(3) fornecer o frasco 2b com a primeira solução obtida como resultado da etapa (1) e fornecer o frasco 2 com a segunda solução obtida como resultado da etapa (2), adicionando 150 µl da primeira solução do frasco 2b para a segunda solução no frasco 2, e misturar por inversão suave, obtendo assim a solução de trabalho R2 pronta para uso.
[00060] A solução de trabalho R1 fornecida como peça do kit continha tampão trietanolamina: 151 mmol/L, pH 8,6; 2-oxoglutarato: 16,6 mmol/L; ADP: ≥ 1,2 mmol/L; e adicionalmente conservantes.
[00061] A solução de trabalho R2 pronta para uso obtida como resultado da etapa (3) detalhada acima continha NADPH: ≥ 458 µmol/L; GLDH (fígado bovino; 25 °C): ≥ 24,3 U/ml; tampão trietanolamina: 151 mmol/L, pH 8,6; 2-oxoglutarato: 16,6 mmol/L; ADP: ≥ 1,2 mmol/L; e adicionalmente conservantes.
[00062] O kit de ensaio, especificamente R1 e R2, foi usado de acordo com as instruções do fabricante em uma plataforma Roche/Hitachi MODULAR P.
EXEMPLO 2
ELIMINAÇÃO DE AMÔNIA POR MEIO DA ADIÇÃO DE DIFERENTES QUANTIDADES DE GLDH EM R2
[00063] A solução de trabalho R2 foi preparada conforme descrito no Exemplo 1. As alíquotas foram misturadas com diferentes quantidades de
GLDH EXEMPLO 3
DETERMINAÇÃO DIAGNÓSTICA DE AMÔNIA EM UMA AMOSTRA DE PLASMA USANDO O NOVO KIT DE ENSAIO COM ESTABILIZAÇÃO APRIMORADA DE NADPH (DESIGNAÇÃO DE ENSAIO "NH3L2")
[00064] Um kit de ensaio cobas® NH3L2 (Amônia) recém- desenvolvido para analisadores Roche/Hitachi (incluindo as plataformas cobas c c 311, c 501/502; kit de ensaio composto pelos inventores, usando Cat. nºs.
20751995190, 20752401190, 20753009190 como calibradores) foi fornecido. O kit é composto por duas soluções de trabalho diferentes, R1 e R3, que estão prontas para usar.
[00065] A solução de trabalho R1 fornecida como peça do kit continha tampão BICINE (= N,N-bis(2-hidroxietil)-glicina): 300 mmol/L, pH 8,3; GLDH (microbiana): ≥ 16,7 μkat/L; detergentes; conservante.
[00066] A solução de trabalho R3 fornecida como peça do kit continha GLDH (microbiana): ≥ 5,0 μkat/L; 2-oxoglutarato: 78 mmol/L; NADPH:
≥ 1,3 mmol/L; estabilizador; tampão não reativo.
[00067] O kit de ensaio, especificamente R1 e R3, foi usado de acordo com as instruções representadas nas Figuras 3A-C em uma plataforma Roche/Hitachi cobas c.
EXEMPLO 4
ELIMINAÇÃO DE AMÔNIA POR MEIO DA ADIÇÃO DE DIFERENTES QUANTIDADES DE GLDH EM R2 TABELA 1 Quantidade de GLDH enriquecida com Temperatura de # adicionada à solução, Tempo de Incubação NH3 incubação em U/ml 1 Nenhum (= 0) Não n.d. 2 °C a 8 °C 2 Nenhum (= 0) Sim n.d. 2 °C a 8 °C 3 Nenhum (= 0) Não 7 35 °C 4 Nenhum (= 0) Não 10 d 35 °C 5 Nenhum (= 0) Não 14 d 35 °C 6 1 Não n.d. 2 °C a 8 °C 7 1 Sim n.d. 2 °C a 8 °C 8 1 Não 7 35 °C 9 1 Não 10 d 35 °C 10 1 Não 14 d 35 °C 11 2 Não n.d. 2 °C a 8 °C 12 2 Sim n.d. 2 °C a 8 °C 13 2 Não 7 35 °C 14 2 Não 10 d 35 °C 15 2 Não 14 d 35 °C 16 5 Não n.d. 2 °C a 8 °C 17 5 Sim n.d. 2 °C a 8 °C 18 5 Não 7 35 °C 19 5 Não 10 d 35 °C 20 5 Não 14 d 35 °C 21 10 Não n.d. 2 °C a 8 °C 22 10 Sim n.d. 2 °C a 8 °C 23 10 Não 7 35 °C 24 10 Não 10 d 35 °C 25 10 Não 14 d 35 °C 26 14 Não n.d. 2 °C a 8 °C 27 14 Sim n.d. 2 °C a 8 °C 28 14 Não 7 35 °C 29 14 Não 10 d 35 °C 30 14 Não 14 d 35 °C
[00068] Uma solução aquosa foi preparada a fresco, a solução continha 2-oxoglutarato: 78 mmol/L; NADPH: ≥ 1,3 mmol/L; e tampão não reativo. Diferentes quantidades de GLDH foram adicionadas a alíquotas da solução aquosa. Uma alíquota foi adicionalmente enriquecida com uma quantidade conhecida de amônia. Diferentes condições de incubação foram aplicadas às soluções de teste preparadas individualmente.
[00069] A Tabela 1 sumariza as composições e condições. A Figura 5 é uma representação gráfica dos resultados, ou seja, a concentração de amônia (também referida como “c[NH3]”) detectada após cada experimento é representada pela altura de cada bloco individual no diagrama 3D. Quanto mais um bloco representado é estendido ao longo do eixo Y dado pela seta na Figura 5 (ou seja, quanto mais alto é o respectivo bloco no diagrama), maior é a concentração de amônia que foi detectada no respectivo experimento. Cada bloco representa um experimento conforme fornecido na lista numerada da Tabela 1, e as designações de número dadas aos blocos individuais na Figura 5 correspondem à numeração [#] na Tabela 1.
[00070] Notavelmente, por meio da presença de GLDH, a concentração de amônia pode ser mantida de forma reprodutível em uma faixa entre 0,01 µM e 1,5 µM. Os blocos relacionados à GLDH no diagrama da Figura 5 correspondem a valores de 0,02 µM a 1,3 µM.
[00071] No final da incubação a 35 °C dos experimentos ## 10, 15, 20, 25 e 30 (ou seja, no final do intervalo de 14 d) a atividade de GLDH sobrevivente remanescente na solução aquosa foi determinada. A Tabela 2 sumariza os resultados.
TABELA 2 sobrevivência da atividade de GLDH em # Atividade inicial de GLDH, em U/ml U/mL após 14 dias a 35 °C 10 1 0,13 15 2 0,91 sobrevivência da atividade de GLDH em # Atividade inicial de GLDH, em U/ml U/mL após 14 dias a 35 °C 20 5 1,66 25 10 3,53 30 14 5,18
[00072] Deve-se notar que as condições de incubação aplicadas foram projetadas para mimetizarem a cepa fornecida por um tempo mais longo sob condições ambientais (por exemplo, temperatura ambiente) sobre o reagente e, em particular, sobre a atividade enzimática nele contida. Assim, a implicação na vida útil do reagente causada pela presença de um mecanismo de eliminação de amônia baseado em GLDH torna-se aparente pelos dados relatados neste documento.
[00073] É interessante ver que mesmo a menor quantidade de GLDH (experimento # 10) foi bem-sucedida na remoção de qualquer amônia que se formou durante o período de incubação. Quando isso é comparado ao resultado da mesma solução, mas na ausência de GLDH (experimento # 5), torna-se aparente que mesmo sob restrição, ou seja, sob condições que não são ideais para a atividade e/ou estabilidade de GLDH, é bem possível encontrar as condições sob as quais a enzima é ativa o suficiente para garantir a remoção eficiente de amônia da decomposição do cossubstrato.
[00074] Como o cossubstrato está presente em uma concentração de saturação, o consumo no processo de eliminação foi considerado insignificante, ou seja, irrelevante para o desempenho do kit de ensaio cobas® NH3L2 (Amônia) recém-desenvolvido.
EXEMPLO 5
[00075] Foi preparada uma solução de trabalho R3 como apresentada no Exemplo 2 e uma solução de trabalho R3' na qual NADH substituiu NADPH. Cada solução foi colocada em uma cubeta, e a extinção no ou próximo ao máximo da absorção UV de NADH ou NADPH foi medida continuamente. Em um determinado momento (após 15 min), uma solução de amônia foi adicionada à cubeta, ajustando a concentração de amônia na respectiva solução de trabalho para 100 µM. A extinção foi posteriormente registrada. Verificou-se que, em ambas as soluções de trabalho, a concentração do cossubstrato diminuiu, como se tornou aparente pela diminuição das leituras de extinção. A partir desses dados, concluiu-se que o mecanismo de eliminação de amônia da solução de trabalho (por meio da atividade enzimática de GLDH) funcionou na presença de ambos os cossubstratos. As medições foram feitas a 10 °C.
[00076] A Figura 6 mostra as leituras de extinção para NADPH (linha sólida) e NADH (linha pontilhada). O momento da adição de amônia é indicado pela seta fina que também marca o início do consumo do cossubstrato, indicado pela diminuição da extinção.
[00077] Deve-se notar neste documento que a quantidade de amônia adicionada foi muito alta e foi escolhida nesta concentração para indicar que uma baixa quantidade de GLDH, mesmo sob condições subideais, é capaz de reagir amônio e cossubstrato para produzir L-glutamato e água, eliminando assim a amônia da solução.
Claims (17)
1. KIT DE ENSAIO PARA DETERMINAR
QUANTITATIVAMENTE A CONCENTRAÇÃO DE AMÔNIA EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA AQUOSA, caracterizado por conter 2-oxoglutarato, glutamato desidrogenase capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato (= GLDH) e NAD(P)H, em que o kit compreende um primeiro e um segundo recipientes, em que o primeiro recipiente contém um primeiro reagente aquoso com uma primeira quantidade de GLDH, o primeiro reagente tendo um pH capaz de manter a atividade enzimática de GLDH, em que o segundo recipiente contém um segundo reagente aquoso com NAD(P)H, 2-oxoglutarato e uma segunda quantidade de GLDH, em que a atividade enzimática de GLDH por mL do primeiro reagente é maior do que a atividade enzimática de GLDH por mL de reagente no segundo reagente, e em que o pH do segundo reagente é capaz de manter a atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H e 2-oxoglutarato, sendo assim capaz de formar L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no segundo reagente.
2. KIT DE ENSAIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela NAD(P)H estar presente apenas no segundo reagente.
3. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo pH do primeiro reagente ser de pH 7 a pH 9 e, mais especificamente, entre pH 8 e pH 9.
4. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo pH do segundo reagente ser de pH 8 a pH 11, e mais especificamente, entre pH 8 e pH 10, ainda mais especificamente, entre pH 9 e pH 10.
5. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela razão entre a atividade enzimática de GLDH por mL do primeiro reagente e a atividade enzimática de GLDH por mL do segundo reagente ser de 15:1 a 1,5:1, mais especificamente de 10:1 a 2:1, ainda mais especificamente de 5:1 a 2:1, ainda mais especificamente, a razão é de cerca de 3:1.
6. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por, em relação à atividade enzimática de GLDH total fornecida pelos reagentes compreendidos no kit, o segundo reagente conter uma quantidade de atividade enzimática de GLDH de 1% a 30%, sendo a quantidade mais especificamente selecionada a partir de 2% a 5%, 5% a 7%, 7% a 10%, 10% a 15%, 15% a 20%, 20% a 25% e 25% a 30%.
7. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo primeiro reagente conter um tampão selecionado a partir de N,N-bis(2-hidroxietil)-glicina e trietanolamina.
8. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo primeiro reagente conter um detergente.
9. MÉTODO PARA FORNECER UM KIT DE ENSAIO para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa, o kit compreendendo dois reagentes aquosos diferentes, os reagentes contendo, em solução aquosa, 2-oxoglutarato, glutamato desidrogenase capaz de reagir NAD(P)H como um cossubstrato (= GLDH) e NAD(P)H, o metódo caracterizado por compreender as etapas de: - preparar um primeiro reagente pela dissolução de GLDH, em uma solução aquosa, com um pH capaz de manter a atividade enzimática de GLDH, - preparar um segundo reagente pela dissolução, em uma solução aquosa, de 2-oxoglutarato, GLDH e NAD(P)H, e ajustar o pH do segundo reagente para ser permissivo para manter a atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H e 2-oxoglutarato, permitindo assim a formação de L-glutamato, NAD(P)+ e H2O no segundo reagente, - fornecer o primeiro e o segundo reagentes em recipientes separados, e combinar os recipientes em um kit de peças, fornecendo assim um kit de ensaio para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa.
10. USO DE UM KIT DE ENSAIO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou um kit de ensaio obtido pelo método, conforme definido na reivindicação 9, caracterizado por ser para determinar quantitativamente a concentração de amônia em uma amostra líquida aquosa.
11. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou kit de ensaio obtido pelo método, conforme definido na reivindicação 9, caracterizado pela concentração de amônia no segundo reagente ser de cerca de 1,5 µM ou menos, mais especificamente de cerca de 0,01 µM a cerca de 1,5 µM.
12. KIT DE ENSAIO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo segundo reagente ser obtido pelas etapas de: (a) dissolver, em uma solução aquosa, 2-oxoglutarato, GLDH e NAD(P)H, e ajustar o pH do segundo reagente para ser permissivo para manter a atividade enzimática de GLDH no segundo reagente para converter amônia, NAD(P)H, e 2-oxoglutarato, seguido por (b) incubar a solução aquosa obtida na etapa (a) a 35 °C por 14 d, em que a concentração de amônia no segundo reagente é de cerca de 0,02 µM a cerca de 1,3 µM.
13. KIT DE ENSAIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado por, no segundo reagente, a amônia liberada pela decomposição de NAD(P)H ser removida da solução aquosa por meio da atividade enzimática de GLDH que reage os íons amônio, NAD(P)H e 2-oxoglutarato em L-glutamato, NAD(P)+ e H2O.
14. MISTURA, caracterizada por compreender (i) uma amostra líquida aquosa suspeita de conter amônia, e (ii) o segundo reagente do kit de ensaio, conforme definido na reivindicação 13.
15. MISTURA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela amostra ser uma amostra biológica e, mais especificamente, plasma sanguíneo.
16. MISTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15, caracterizada pela mistura compreender adicionalmente o primeiro reagente do kit de ensaio.
17. DISPOSITIVO automatizado capaz de formar uma mistura, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado por ser combinado com (i) uma amostra líquida aquosa em um recipiente de amostra e (ii) um kit, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou um kit de ensaio obtido pelo método, conforme definido na reivindicação 9.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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