JP2006109777A - クレアチンキナーゼ活性測定試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】安価で安定性に優れかつ異臭を放たない、ＣＫ活性測定試薬、ＣＫを活性化する方法およびＣＫ活性を測定する方法の提供。
【解決手段】無機硫黄化合物を含みかつチオール化合物を含まない、クレアチンキナーゼ活性測定試薬およびそれを用いた方法。

Description

本発明は、クレアチンキナーゼの活性を測定するための試薬に関する。

クレアチンキナーゼ（以下、ＣＫと略記する）は、生体内において骨格筋、脳、心筋、平滑筋、神経系等に存在し、エネルギー代謝上重要な役割を果たしている。血清中においてこのＣＫの活性（ＣＫ活性）が上昇している場合、多発性筋炎、心筋梗塞、甲状腺機能低下症などが疑われ、それが低下している場合には甲状腺機能亢進症などが疑われることが知られている。これらの理由により、臨床検査の分野においてはＣＫ活性を測定することは重要なことになっている。

ＣＫ活性を測定する試薬としては、従来から種々の試薬（ＣＫ活性測定試薬）が開発されているが、特に近年においては、使い勝手のよい液状のＣＫ活性測定試薬が提供されている。この液状のＣＫ活性測定試薬は、ＣＫを活性化するためにＮ−アセチルシステイン（以下、ＮＡＣと略記）などのチオール化合物を必須成分として含有し、さらにチオール化合物の安定性を保つために、亜硫酸ナトリウムなどの無機硫黄化合物を含有している（例えば特許文献１、２）。
しかし、チオール化合物は比較的高価な試薬であるうえに不安定であり、さらに、特有の異臭を発する物質である。そのため、ＣＫ活性測定試薬の製造現場においては、かかる異臭による健康上の問題やその不安定性に起因する試薬管理上の問題が無視できないものとなっている。また、ＣＫ活性測定試薬の使用現場においても、試薬が放つ異臭が問題となっている。
したがって、製造現場および使用現場のいずれにおいても、新たなＣＫ活性測定試薬の開発が強く望まれている。しかしながら、チオール化合物を含有する現有の試薬の上記問題点を克服したＣＫ活性測定試薬は、未だ開発されていないのが現状である。

特表２００３−５１７２６４号公報 特開平９−７０２９８号公報

本発明の課題は、安価で安定性に優れかつ異臭を放たない、ＣＫ活性測定試薬、ＣＫを活性化する方法およびＣＫ活性を測定する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記状況に鑑み鋭意検討する中で、驚くべきことに、従来のＣＫ活性測定試薬においてＣＫの活性化のために不可欠であるとされていたチオール化合物を用いる代わりに、無機硫黄化合物を用いることによってＣＫが活性化されることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、無機硫黄化合物を含みかつチオール化合物を含まない、クレアチンキナーゼ活性測定試薬に関する。

また、本発明は、第一試薬と第二試薬とからなる、前記クレアチンキナーゼ活性測定試薬に関する。
さらに、本発明は、無機硫黄化合物が、第一試薬および／または第二試薬に含まれる、前記クレアチンキナーゼ活性測定試薬に関する。
また、本発明は、無機硫黄化合物が、亜硫酸、スルホキシル酸、チオ硫酸、二チオン酸、二硫酸、二亜硫酸、亜ジチオン酸、ポリチオン酸およびこれらの塩から選択された１種または２種以上である、前記クレアチンキナーゼ活性測定試薬に関する。
また、本発明は、無機硫黄化合物が、０．３ｍｍｏｌ/Ｌ〜１０ｍｍｏｌ/Ｌの濃度で含まれる、前記クレアチンキナーゼ活性測定試薬に関する。
さらに、本発明は、チオール化合物の非存在下において、無機硫黄化合物をクレアチンキナーゼに接触せしめる工程を含む、クレアチンキナーゼを活性化する方法に関する。
そして、本発明は、クレアチンキナーゼを活性化する前記方法を用いてクレアチンキナーゼを活性化した後にクレアチンキナーゼ活性を測定する工程を含む、クレアチンキナーゼ活性を測定する方法に関する。

ＣＫには活性型（ＳＨ体）および不活性型（ＳＳ体）が存在するため、その活性を体内における状態に忠実に、正確に測定するためには、検体中のＣＫを活性型にする必要がある。しかしながら、ＣＫは体内から取り出されると容易に不活性型に変化してしまうため、ＣＫを活性型にして活性を測定するためには、不活性型ＣＫを再度活性化する必要がある。従来技術においては、ＣＫを活性化する成分としてチオール化合物が必須であるとされ、チオール化合物として前記のとおりＮＡＣなどが用いられていた。また、チオール化合物に代わるＣＫを活性化する成分は見出されていなかった。

これに対して、本発明においては、ＣＫを活性化する成分として、チオール化合物の代わりに無機硫黄化合物が用いられる。無機硫黄化合物は、チオール化合物と同様に、不活性型ＣＫのＳ−Ｓ結合を解裂せしめＳ−Ｈとすることによって、ＣＫを活性化せしめるものと推測される。そして本発明者らの研究により、無機硫黄化合物は、チオール化合物に比して、はるかに低濃度においてＣＫを活性化することから、本発明のＣＫ活性測定試薬においては、ＣＫを活性化する成分として、無機硫黄化合物を含有し、チオール化合物を用いる必要がないことが明らかになった。
上記のとおり、チオール化合物の安定化のために用いられていた無機硫黄化合物のみを活性化成分として含有し、チオール化合物を用いない液状のＣＫ活性測定試薬はこれまで知られていない。すなわち、本発明は、ＣＫの活性化にチオール化合物を用いないという、従来の技術常識に全く反する、新たな知見に基づく新規な発明なのである。

本発明のＣＫ活性測定試薬は、無臭であるばかりでなく、高価なチオール化合物を一切用いる必要がない。また、本願発明の試薬に含まれる無機硫黄化合物は、従来のＣＫ活性測定試薬に用いられているＮＡＣなどのＣＫ活性化剤と比較して、その１０分の１以下の量によってＣＫを活性化することができる。すなわち、無機硫黄化合物を用いることによって、ＣＫの活性化を、チオール化合物よりはるかに効率的に実行することができる。したがって、本発明のＣＫ活性測定試薬によれば、検体中のＣＫ活性の測定を、安価、安全かつ簡便な方法によって行うことができる。
また、本発明の試薬のうち、第一試薬と第二試薬とからなるものによれば、日本臨床化学会常用基準法（勧告法）に従った操作でＣＫ活性の測定を実行することができる。
また、本発明の試薬のうち、無機硫黄化合物が、第一試薬および／または第二試薬に含まれるものによれば、その他の試薬を用いる必要がないため、ＣＫ活性の測定を、より簡便に実行することができる。
また、本発明の試薬のうち、無機硫黄化合物が、亜硫酸、スルホキシル酸、チオ硫酸、二チオン酸、二硫酸、二亜硫酸、亜ジチオン酸、ポリチオン酸およびこれらの塩から選択された１種または２種以上であるものによれば、ＣＫ活性の測定を、より効率的に実行することができる。
さらに、本発明の試薬のうち、無機硫黄化合物が、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含まれるものによれば、より効率的かつ安価に実行することができる。
また、本発明のクレアチンキナーゼを活性化する方法においては、無臭であるうえに、高価なチオール化合物は用いられない。また、無機硫黄化合物は、ＣＫをチオール化合物より効率的に活性化する。したがって、本発明のクレアチンキナーゼを活性化する方法によれば、検体中のＣＫの活性化を、安価、安全かつ簡便な方法によって実行することができる。
そして、本発明のクレアチンキナーゼ活性を測定する方法によれば、検体中のＣＫの活性を、安価、安全かつ簡便な方法によって測定することができる。

本発明は、以上のとおりの効果を有するものであり、臨床検査の分野における心筋梗塞などの診断に大いに貢献するものである。

ＣＫ活性測定試薬におけるＣＫ活性の測定は、一般に次のような原理、すなわち、クレアチンリン酸からβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略記）またはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨと略記）を生成する一連の反応のうち、ＣＫがクレアチンリン酸のクレアチンへの反応を触媒すること、に基づいて行われる。より詳細には、ＣＫ活性の測定は、下記反応により生成するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの吸光度を測定することにより行われる。

本発明のＣＫ活性測定試薬は、１試薬系であっても２試薬以上の多試薬系であってもよい。日本臨床化学会常用基準法（勧告法）においては、２試薬系が推奨されている。したがって、勧告法に従う場合には、２試薬系が好ましい。
第一試薬および第二試薬からなる２試薬系の場合の本発明のＣＫ活性測定試薬の基本組成の例を表１に示す。無機硫黄化合物は、所定の濃度において、第一試薬および／または第二試薬に含有せしめることができる。

各試薬中の成分は、ＣＫ活性に影響を与えない範囲において、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有せしめることができる。また、マグネシウムの安定性向上のためにＥＤＴＡを、および／またはアデニレートキナーゼの妨害反 応を解消するためにアデノシン５’−モノリン酸（ＡＭＰ）やＰ^１，Ｐ^５−ジ（アデノシン５’）ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）などを含有せしめたものは好ましい。

本発明において、無機硫黄化合物とは、亜硫酸、スルホキシル酸、チオ硫酸、二チオン酸、二硫酸、二亜硫酸、亜ジチオン酸、ポリチオン酸またはこれらの塩などを意味する。これらの塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩などが挙げられる。無機硫黄化合物として、具体的には亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸カルシウム、スルホキシル酸ナトリウム、スルホキシル酸カリウム、スルホキシル酸カルシウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム、二チオン酸ナトリウム、二チオン酸カリウム、二チオン酸カルシウム、二硫酸ナトリウム、二硫酸カリウム、二硫酸カルシウム、二亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸カリウム、二亜硫酸カルシウム、亜ジチオン酸ナトリウム、亜ジチオン酸カルシウム、亜ジチオン酸カリウム、ポリチオン酸ナトリウム、ポリチオン酸カリウム、ポリチオン酸カルシウムが挙げられる。

かかる無機硫黄化合物は、1種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。十分なＣＫ活性効果を得るためには、取り扱い易さの面から亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリムまたは二亜硫酸ナトリウムが好ましい。
また、２種類以上の試薬を含む系の場合は、無機硫黄化合物をいずれの試薬に含ませてもよい。また、無機硫黄化合物を全ての試薬に含ませることも可能である。例えば、２試薬系の場合においては、第一試薬のみが無機硫黄化合物を含むもの、第二試薬のみが無機硫黄化合物を含むものおよび第一試薬および第二試薬が無機硫黄化合物を含むもののいずれでもよい。これらの２試薬系の場合において、より高いＣＫ活性化効果を得るためには、無機硫黄化合物の安定性の見地から、無機硫黄化合物を第２試薬のみに含ませたものが好ましい。

無機硫黄化合物の試薬中における濃度は、ＣＫの最大活性値が得られる０．３９ｍｍｏｌ／Ｌ〜１２．５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．７８ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．３ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、特にヒト検体を測定する場合には１．６ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．３ｍｍｏｌ／Ｌが最も好ましい。これに対して、ＮＡＣを用いた従来の試薬におけるＮＡＣの濃度は、約２５ｍｍｏｌ／Ｌである。したがって、本発明の試薬においては、ＮＡＣを用いた場合に比して、その１０分の１以下の濃度でＣＫ活性を最大とすることができるのである。
なお、多試薬系の場合、該化合物のＣＫ活性測定時濃度（終濃度）は、ＣＫ活性測定時に多試薬が混合されることにより試薬中の濃度よりも希釈される。終濃度としては、ＣＫの最大活性値が得られる０．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．６３ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、特にヒト検体を測定する場合には１．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌが最も好ましい。本発明の試薬によれば無機硫黄化合物をこれらの濃度範囲において用いることにより、ＮＡＣを用いた場合の１０分の１以下の濃度において、ＣＫを最大限に活性化することができる。

本発明において、チオール化合物とは、ＳＨ基を有する化合物全般を意味するものであって、とくに従来のＣＫ活性測定試薬に用いられているものを意味する。具体的には、ＮＡＣ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、チオグリセロール（ＴＧ）、システイン、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸などである。
本発明においては、かかるチオール化合物を含まないことにより、無臭かつ安価なＣＫ活性測定試薬を提供することができる。

本発明のＣＫ活性測定試薬を用いてＣＫ活性を測定する対象となる試料としては、典型的には、血液、血清、血漿、尿、大便、唾液などである。
なお、本発明のＣＫ活性測定試薬の形態は、操作の簡便性の面から液状のものが好ましい。その溶媒としては、ＣＫ活性に影響を与えないものであればいずれの溶媒も用いることができる。典型的には水が好適に用いられる。

本発明のＣＫを活性化する方法は、チオール化合物非存在下、クレアチンキナーゼと無機硫黄化合物とを接触させることにより行われる。用いられる試薬の種数、無機硫黄化合物の種類および濃度は、前記本発明の試薬のそれに対応するものを用いる。
本発明のＣＫを活性化する方法を用いることによって、従来の方法より安価、安全かつ簡便にＣＫ活性を測定することができる。本発明のＣＫ活性を測定する方法は、さらＣＫ活性を定量する工程を含む。かかる定量する工程は、Ｕ−３２００形、Ｕ−３３００形などの分光光度計、Ｈ−７１７０形、Ｈ−７２５０形、ＢＭ−１６５０形などの汎用型自動分析装置などを用いて行うことができる。

以下に、実施例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例におけるＣＫ活性測定試薬は、下記表２に記載の組成からなる２試薬系のものを用いた。

（実施例１）亜硫酸ナトリウムによるＣＫの活性化（第二試薬に添加）
表２に記載の第二試薬に表３に記載の各所定量の亜硫酸ナトリウムを添加してＣＫ活性測定試薬を調製し、自動分析装置によりＣＫ活性を測定した。なお、検体はコントロール血清であるトレースチェックレベル２（関東化学（株）製）、Ａａｌｔ Ｈ（（株）シノテスト製）、Ｌ−コンセーラＡ（日水製薬（株）；登録商標）、ヒト由来のものをそれぞれ用いた。
その結果、亜硫酸ナトリウム無添加の場合（ＮＯ．１１）と比較して、亜硫酸ナトリウムの第二試薬への添加により、ＣＫが添加濃度に依存して活性された（表３）。

（実施例２）各種無機硫黄化合物によるＣＫの活性化
表２に記載の第二試薬に、亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムまたはチオ硫酸ナトリウムを５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ添加したＣＫ活性測定試薬を調製し、実施例１と同様にＣＫ活性を測定した。なお、検体はコントロール血清であるトレースチェックレベル１、レベル２（関東化学（株）製）、ＣＲＥＡＴＩＮＥ ＫＩＮＡＳＥ ＭＭ ＩＳＯＺＹＭＥ（Ａａｌｔｏ社製 ）、ヒト血清、コンセーラＡ（日水製薬（株）；登録商標）、セラクリアＨＥ ＡＮ（アズウェル社製；登録商標）、ネスコール（アズウェル社製；登録商標）を用いた。
その結果、いずれの無機硫黄化合物を添加した場合においても、無添加時と比較して、ＣＫを活性化する効果が認められた（表４）。
なお、これらの各種無機硫黄化合物によるＣＫ活性化の強さは、従来のＮＡＣと亜硫酸ナトリウムを含むＣＫ活性測定試薬（比較例１）と同等以上のものであることが認められた（表５）。

（比較例１）チオール化合物を含む試薬（１）によるＣＫの活性化
表２の第一試薬にＮＡＣ ２０ｍｍｏｌ／Ｌ、亜硫酸ナトリウム１０ｍｍｏｌ／Ｌを添加した従来のＣＫ活性測定試薬を調製し、自動分析装置によりＣＫ活性を測定した。その結果を表５に示す。なお、検体は実施例２と同一のものを用いた。

（実施例３）各種無機硫黄化合物とＮＡＣによる活性化比較（第一試薬に添加）
表２に記載の第一試薬に亜硫酸ナトリウムまたは亜ジチオン酸ナトリウムを所定量添加して、それらの濃度の異なるＣＫ活性測定試薬を調製し、自動分析装置によりＣＫ活性を測定した。なお、検体は酵素標準品であるトレースキャリブ（関東化学（株）製）、コントロール血清であるトレースチェック レベル２（関東化学（株）製）、Ｌ−コンセーラＡ（日水製薬（株）；登録商標）、ヒトを用いた。
その結果、亜硫酸ナトリウムおよび亜ジチオン酸ナトリウム（ハイドロサルファイト）添加のいずれにおいても、約１．６ｍｍｏｌ／ＬでＣＫ活性が最大となった（表６、表７）。
なお、ＮＡＣを用いた従来のＣＫ活性測定試薬（比較例２）においては、ＣＫ活性は２５ｍｍｏｌ／Ｌで最大となった（表８）。すなわち、本願発明のＣＫ活性測定試薬は、従来品を２０倍以上上回るＣＫ活性化効果を有することが明らかになった。

（比較例２）チオール化合物を含む試薬（２）によるＣＫの活性化
実施例３において、亜硫酸ナトリウムをＮＡＣに替えた以外は同じ条件でＣＫ活性を測定した。その結果を表８に示す。ＮＡＣを添加した場合、２５ｍｍｏｌ／ＬでＣＫの最大活性が得られることが確認された。

本発明は、無機硫黄化合物を含みかつチオール化合物を含まない、クレアチンキナーゼ活性測定試薬である。そのため、本発明のＣＫ活性測定試薬によれば、検体中のＣＫ活性の測定を、安価、安全かつ簡便な方法によって実行することができる。したがって、本発明は、心筋梗塞などの診断などに好ましく利用されるため、臨床検査用試薬等の製造業および関連産業の発展に寄与するところ大である。

Claims (7)

1. 無機硫黄化合物を含みかつチオール化合物を含まない、クレアチンキナーゼ活性測定試薬。
2. 第一試薬と第二試薬とからなる、請求項１に記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
3. 無機硫黄化合物が、第一試薬および／または第二試薬に含まれる、請求項２に記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
4. 無機硫黄化合物が、亜硫酸、スルホキシル酸、チオ硫酸、二チオン酸、二硫酸、二亜硫酸、亜ジチオン酸、ポリチオン酸およびこれらの塩から選択された１種または２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
5. 無機硫黄化合物が、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含まれる、請求項１〜４のいずれかに記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
6. チオール化合物の非存在下において、無機硫黄化合物をクレアチンキナーゼに接触せしめる工程を含む、クレアチンキナーゼを活性化する方法。
7. 請求項６に記載のクレアチンキナーゼを活性化する方法を用いてクレアチンキナーゼを活性化した後にクレアチンキナーゼ活性を測定する工程を含む、クレアチンキナーゼ活性を測定する方法。