JP5701885B2

JP5701885B2 - チオ−ｎａｄ（ｐ）ｈを用いた第ｘｉｉｉ因子の測定方法

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Publication number: JP5701885B2
Application number: JP2012531248A
Authority: JP
Inventors: クリスト、ゲルリンデ; カッペル、アンドレアス; フィツフム、フランク
Original assignee: シーメンスヘルスケアダイアグノスティクスプロダクツゲゼルシヤフトミツトベシユレンクテルハフツング
Priority date: 2009-10-05
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2030-06-16
Also published as: US20120190052A1; EP2486144B1; ES2436072T3; DE102009048198A1; WO2011042071A1; JP2013506401A; EP2486144A1

Description

本発明は、インビトロ診断の分野の発明であり、血液凝固因子ＸＩＩＩ（第ＸＩＩＩ因子、ＦＸＩＩＩ）の測定方法及び前記方法を実施するための試験キットに関する。

第ＸＩＩＩ因子は、血液凝固カスケードの最後に作用する血液凝固因子であり、持続的な創傷閉塞のために重要な役割を果たす。血液凝固の最終段階であるフィブリン形成において、トロンビンは、フィブリノーゲンを分解する。こうして生じたフィブリンモノマーは、凝集して自然発生的に長い繊維になり、最終的に、可溶性のフィブリンポリマーからなる緻密で分枝した網状構造を生じる。第ＸＩＩＩ因子も、また、トロンビンによって活性化され、それにより、第ＸＩＩＩａ因子が生じる。第ＸＩＩＩａ因子は、このフィブリンポリマーの架橋を引き起こし、それにより、このフィブリン塊を、機械的に、より安定とし、より変形できなくし、プラスミンによる分解に対して、より耐性とする。先天性又は後天性の第ＸＩＩＩ因子欠損症は、出血傾向、創傷治癒障害並びに流産を引き起こすことがある。その臨床的な重要性の故に、第ＸＩＩＩ因子欠損症の除外又は確認のための第ＸＩＩＩ因子の測定は、血液凝固診断の重要な要素である。

触媒不活性のプロ酵素である第ＸＩＩＩ因子の活性形である第ＸＩＩＩａ因子は、トランスグルタミナーゼであり、このトランスグルタミナーゼは、フィブリン分子のリシル−及びグルタミニル−アミノ酸側鎖の間での分子間アミド結合の形成によるフィブリンポリマーの三次元的な架橋を触媒する。この反応の際に、アンモニア（ＮＨ₃）又はアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）が遊離される。この現象が、第ＸＩＩＩ因子の測定のための多様な試験方法において、利用される。以後、「アンモニア」の概念を、アンモニア及びアンモニウムイオンについて、同義に使用する。

非特許文献１には、繊維素を除去した血漿試料中での第ＸＩＩＩ因子の測定方法が記載されており、そこでは、試料の第ＸＩＩＩ因子は、トロンビンにより活性化されて第ＸＩＩＩａ因子となる。更に、この試料を、第ＸＩＩＩａ因子による分子間アミド結合の形成のための基質の役割をするβ−カゼイン及びエチルアミンと、混合する。この反応の際に遊離するアンモニアを定量的に検出するために、この試料を、更にＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ヒドリド）及びＮＡＤＰＨ依存性の指示反応（インジケーター反応）の成分、つまりグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）及びα−ケトグルタレートと、混合する。アンモニアが存在する場合には、ＧＬＤＨは、α−ケトグルタレートをグルタメートに変換する。この反応は、付加的にＮＡＤＰＨを消費し、ＮＡＤＰＨが酸化された形態のＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）が生成する。ＮＡＤＰ＋は、ＮＡＤＰＨとは異なる吸収スペクトルを有するので、この試験バッチの吸収（吸光度又は光学密度とも言われる）は、ＮＡＤＰＨ消費に比例し、従って、アンモニア量に比例し、従って、第ＸＩＩＩ因子量又は第ＸＩＩＩ因子活性に比例して、変化する。別法として、この試験バッチ中にＮＡＤＰＨの代わりにＮＡＤＨを使用することもできる。ＮＡＤ（Ｐ）＋とは対照的に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、約２６０ｎｍにおける吸収極大の他に、約３４０ｎｍにおいて吸収極大を有する。吸収極大の正確な位置は、一般に多様なパラメータ、特に溶液の誘電率及びｐＨ値、に依存する。一般に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸収極大は、３３５〜３４５ｎｍの範囲内にある。３４０ｎｍの波長における試験バッチの吸収の変化を測定することにより、試料中の第ＸＩＩＩ因子の定量的測定が可能になる。

特許文献１及び非特許文献２は、遊離されたアンモニアを介して第ＸＩＩＩ因子を定量する同様の方法を記載している。特許文献１は、前処理していないフィブリン含有血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法を記載している。反応バッチ中で障害となるフィブリン塊の形成を妨げるために、この試料は、更に、フィブリン凝集阻害剤と混合される。この試料の第ＸＩＩＩ因子は、Ｃａ²⁺イオンの存在下で、トロンビンによって活性化されて、第ＸＩＩＩａ因子となる。更に、この試料を、第ＸＩＩＩａ因子による分子間アミド結合の形成のための基質の役割をする合成グルタミン含有ペプチド及びグリシンエチルエステルと混合する。この反応の際に遊離するアンモニアを定量的に検出するために、この試料を、更に、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドヒドリド）及びＮＡＤＨ依存性の指示反応の成分、つまりグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）及びα−ケトグルタレート、と混合する。アンモニアの存在下で、ＧＬＤＨは、α−ケトグルタレートをグルタメートに変換する。この反応は、更にＮＡＤＨを消費し、ＮＡＤＨの酸化された形態であるＮＡＤ＋を生じる。ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＨとは異なる吸収スペクトルを有するため、この試験バッチの吸収は、ＮＡＤＨ消費に比例して、従ってアンモニア量に比例して、従って第ＸＩＩＩ因子量ないし第ＸＩＩＩ因子活性に比例して、変化する。別法として、この試験バッチにおいて、ＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを使用することもできる。３４０ｎｍの波長における試験バッチの吸収の変化を測定することにより、試料中の第ＸＩＩＩ因子の定量的測定が可能になる。特許文献１に記載された試験原理に基づき市販されている試験は、シーメンスヘルスケアダイアグノスティクスプロダクツゲゼルシヤフトミツトベシユレンクテルハフツング社のＢｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）第ＸＩＩＩ因子試験である。

上記方法は、試料に内在する妨害物質により比較的影響を受けやすいという欠点を有する。個々のケースにおいて、患者の試料が、１つ以上の内在性の、つまり身体に独自の、物質を異常に高い濃度で含有することがあり、これらの物質が測光検出方法において許容濃度を超えた場合に、妨害とみなされ、体系的な誤りを引き起こしかねない。溶血性、黄疸性及び／又は高脂血症性の血清試料又は血漿試料、即ち、異常に高いヘモグロビン濃度、ビリルビン濃度及び／又はトリグリセリド濃度を有する、いわゆるＨＩＬ試料が問題を引き起こすことが知られている。この干渉物質の異常に高い濃度の原因は、患者の病理学的状態又は不適切な試料採取若しくは試料貯蔵である可能性がある。

欧州特許公開第３３６３５３Ａ２号明細書

Ｍｕｓｚｂｅｋ，Ｌ．ｅｔａｌ．［Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）３１（１），３５−４０］Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒｅｔａｌ．著（ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．１９９１，６５（５）：５３５−４０）

従って、本発明の根底をなす課題は、試料に内在する妨害物質による影響をあまり受けない第ＸＩＩＩ因子の測定方法を提供することであった。前記課題は、特に、高いヘモグロビン濃度、高いビリルビン濃度及び／又は高いトリグリセリド濃度を有する試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定を可能にする方法を提供することにあった。

前記課題は、第ＸＩＩＩ因子を測定する公知の方法において、
ａ）試料を、
Ｉ．第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化するための物質（例えば、Ｃａ²⁺イオンの存在下におけるトロンビン）、ＩＩ．第ＸＩＩＩａ因子のための受容体基質（例えばグルタミン含有ペプチド）、ＩＩＩ．第ＸＩＩＩａ因子のためのアミノ基供与体基質（例えば第１級アミン）、ＩＶ．ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、及び、Ｖ．アンモニアの存在下において、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化させることができる薬剤（例えば、グルタメートデヒドロゲナーゼとα−ケトグルタレートとからなる薬剤）と、
混合し、
ｂ）この試験バッチの吸収の変化を測定する方法であって、
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの代わりに、３５０ｎｍを超える波長に吸収極大を有するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの類縁体、いわゆるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体、を使用する方法により解決される。

チオ−ＮＡＤＨを用いた第ＸＩＩＩ因子測定を示す図。ヘモグロビンが混入された血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子測定を示す図であって、上側の図は、ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示し、下側の図は、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。コレステロールが混入された血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子測定を示す図であって、上側の図は、ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示し、下側の図は、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。ビリルビンが混入された血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子測定を示す図であって、上側の図は、ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示し、下側の図は、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。

発明を実施するための態様

簡素化のために、ＮＡＤＨのリン酸化された形及びリン酸化されていない形の両方を表現する場合には、つまり、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨが同様に考慮されている場合には、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」の用語を使用する。酸化された状態でのＮＡＤＨのリン酸化された形及びリン酸化されていない形の両方を表現する場合には、つまりＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋が同様に考慮されている場合には、「ＮＡＤ（Ｐ）＋」の用語を使用する。

「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体」の概念は、本発明の目的において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと同様に、アンモニアを変換するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性のデヒドロゲナーゼのための補基質として機能することができる物質である。本発明においては、酸化された形態及び還元された形態で異なる吸収極大を有する類縁体が重要であり、この場合、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体の還元された形態の吸収極大は、３５０ｎｍを超える波長にある。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体は、好適には、有機の環式及び複素環式化合物であり、これらの化合物は、ヒドリドイオンの移動の概念に基づくレドックス反応、つまり、２つの電子を有するプロトンの等価物が移動されるレドックス反応、を可能にする。
特に、上記化合物は、還元の際に、つまりヒドリドイオンの受け取りの際に、キノイド型からベンゼノイド型に移行することができ且つその逆に移行することができる有機化合物、好適には、複素環式化合物を含む。特に、ピリジンの誘導体が有利である。中でも、ニコチンアミドの構造類縁体が有利である。

特に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのニコチンアミド基が他の基に交換されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ構造類縁体が、有利である。ここでは、ヒドリドイオンの移動の概念に基づくレドックス反応、つまり、２つの電子を有するプロトンの等価物が移動されるレドックス反応、を可能にする、有機の環式及び複素環式化合物が有利である。特に、ここには、有機化合物、好適にはキノイド型から、還元の際に、つまりヒドリドイオンの受け取りの際に、ベンゼノイド型に移行することができ且つその逆に移行することができる複素環式化合物、が含まれている。特にピリジン誘導体が有利である。

本発明による方法における使用のためには、ピリジン環の４位に置換基を有する類縁体、例えば４−メチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、は、ピリジン誘導体から除外される。この種の類縁体は、化学的に、例えば亜二チオン酸塩により、還元することができる（Ｍ．Ｊａｒｍａｎ及びＦ．Ｓｅａｒｌｅ著：ＰｏｔｅｎｔｉａｌｃｏｅｎｚｙｍｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＶ−Ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ４−ｍｅｔｈｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，４５５−４６４，１９７２）。しかし、立体的な理由から、ヒドリドイオンの酵素に触媒される移動には、ほとんど適していない。

ピリジン基が３位に側鎖を有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ構造類縁体が、特に好適である。好適な置換基としては、カルボニル化合物、例えばアルデヒド基、アセチル基、カルボン酸基、チオアルデヒド基、チオアセチル基、チオカルボン酸基、チオカルボン酸アミド基、セレノアルデヒド基、セレノアセチル基、セレノカルボン酸基、セレノカルボン酸アミド基等、が挙げられる。

ここで、ピリジン類縁体である、３−アセチルピリジン、３−（カルボ）アルデヒドピリジン、チオニコチンアミド及びセレノニコチンアミドを有する、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ構造類縁体が、特に有利である。このグループの中でも、更にチオニコチンアミドが、特に有利である。

セレノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、３−アセチルピリジンアデノシンジヌクレオチドヒドリド及び３−アルデヒドピリジンアデノシンジヌクレオチドヒドリドの吸収極大は、その反応が監視できるところ、例えば、それぞれ、約４１７ｎｍ、４００ｎｍ、３６５ｎｍ及び３５８ｎｍに、存在する（ＷｅｒｎｅｒＨｅｎｓｅｌ，ＤａｇｍａｒＲａｋｏｗ，ＷｏｌｆｒａｍＣｈｒｉｓｔ著：Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎａｌｏｇｓ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８，１２８−１３７，１９７５；Ｃｈｒｉｓｔ，Ｗ．及びＣｏｐｅｒＨ．著：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｓｅｌｅｎｏｎｉｃｔｏｉｎａｍｉｄｅ−ａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ａｎａｎａｌｏｇｕｅｏｆＮＡＤＰ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２，Ｎｕｍｂｅｒ４，２６７−２６９）。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは異なる酵素反応速度論的特性を有していてもよい。例えば、類縁体の転換が、あまり良好ではない可能性がある。これは、反応バッチ中の前記類縁体、酵素又は他の成分の濃度を調整することによって、反応が十分な程度に、なお進行するように少なくとも部分的に、補償することができる。相応する酵素によって転換されないか又はそれどころか禁止剤として機能する類縁体は、本発明による類縁体ではない。例えば、４位に置換基を有するピリジン類縁体、例えば４−メチルニコチンアミドアルデヒドジヌクレオチド、が適していないのは、このためである（上記参照）。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体の探索又は発見は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性デヒドロゲナーゼにより触媒される酵素反応を用いて、行なうことができる。例えば、相応するスクリーニング法の場合、第ＸＩＩＩ因子試験においても使用される系を、使用することができる。本発明による方法において使用するのに適しているＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を同定するために、先ず、その類縁体のスペクトル特性を測定するのが好ましい。還元された形態のスペクトル特性を測定するのが有利である。類縁体は、３５０ｎｍより高い波長に、吸収極大を有していなければならない。この相応する類縁体を試験溶液に添加し、関連する波長領域における吸収の変化を追跡する。この場合、この類縁体を多様な濃度で使用するのが有利である。このために、例えば、多様な濃度を有する還元された形態の類縁体の溶液２０μＬを、イミダゾール緩衝剤８４．７ｍＭ、２−オキソグルタレート１３．６ｍＭ、酢酸アンモニウム２１７ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸０．９ｍＭ及びアデノシン−５’−二リン酸１．７ｍＭを含有する、ｐＨ７．９の試験溶液２，８８０μＬ中にピペットで量り取る。還元された類縁体が転換される、つまり酸化される、場合には、吸収が低下し、これは測光により、追跡することができる。このようにして、本発明によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を突き止めることができる。

相応するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体の合成は、ピリジン類縁体を用いて行なうことができる。先ず、このピリジン類縁体を化学的に合成し、同様に化学的方法を用いてモノヌクレオチド類縁体にアルキル化し、次いで、例えばＮＡＤ−ピロホスホリラーゼを用いて酵素的に、又はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を用いて化学的に、縮合させて、相応するＮＡＤ（Ｐ）＋類縁体又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体にする。原則として、酸化された形態、即ち、ＮＡＤ（Ｐ）＋類縁体が、先ず、合成される。ジホスホピリジンヌクレオチド又はＮＡＤ（Ｐ）＋類縁体の還元は、次いで、例えば、亜二チオン酸塩によって、行なうことができる（ＷｅｒｎｅｒＨｅｎｓｅｌ，ＤａｇｍａｒＲａｋｏｗ，ＷｏｌｆｒａｍＣｈｒｉｓｔ著：Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎａｌｏｇｓ，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８，１２８−１３７，１９７５；Ｍ．Ｊａｒｍａｎ及びＦ．Ｓｅａｒｌｅ著：ＰｏｔｅｎｔｉａｌｃｏｅｎｚｙｍｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＶ−Ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｔｐｅｒｔｉｅｓｏｆ４−ｍｅｔｈｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，４５５−４６４，１９７２）。

チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、他の類縁体と比較して、特に長波長領域にある吸収極大を示し、更に、たいていのデヒドロゲナーゼにより酵素的に良好に転換され、比較的安定であり且つ市場で入手可能であるので、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体は、特に有利である。他の有利なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体は、セレノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈである。

チオ−ＮＡＤＨ（チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドヒドリド）又はチオ−ＮＡＤＰＨ（チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ヒドリド）は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨと同様にして、酸化することができ、つまりチオ−ＮＡＤ＋又はチオ−ＮＡＤＰ＋に酸化することができ、且つ、公知のように、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとは異なる光学特性を示すので、チオ−ＮＡＤ＋又はチオ−ＮＡＤＰ＋への酸化による吸収の変化は、約３４０ｎｍ〜約４３０ｎｍの波長で測定することができる。

従って、本発明の主題は、試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法における、３５０ｎｍを超える波長に吸収極大を有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体の、使用である。

本発明の他の主題は、試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法における、チオ−ＮＡＤＨ又はチオ−ＮＡＤＰＨ（つまり、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の、使用である。

本発明の他の主題は、試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法における、セレノ−ＮＡＤＨ又はセレノ−ＮＡＤＰＨ（つまり、セレノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の、使用である。

本発明は、更に、試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法であって、
ａ）前記試料を、
Ｉ．第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化するための物質又は物質混合物、
ＩＩ．少なくとも１つのグルタミニル基を有する、第ＸＩＩＩａ因子のための受容体基質、
ＩＩＩ．第ＸＩＩＩａ因子のためのアミノ基供与体基質、
ＩＶ．３５０ｎｍを超える波長に吸収極大を有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体、及び
Ｖ．アンモニアの存在下に、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を相応するＮＡＤ（Ｐ）＋類縁体に、酸化することができる薬剤、
を含有する１種以上の試薬と混合し、そして、
ｂ）前記試験バッチの吸収の変化を測定する、測定方法に関する。

本発明による方法の有利な実施態様の場合には、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体として、使用される。

本発明による方法の他の有利な実施態様の場合には、セレノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体として、使用される。

第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子へ活性化させるための物質として、特に、トロンビン、例えばヒト又はウシ由来のトロンビン又は組み換えにより製造されたトロンビン、が適している。同様に、試料中に含まれるプロトロンビンを直接的に又は間接的にトロンビンに活性化し、このトロンビンが次いで更に第ＸＩＩＩ因子を活性化することにより、第ＸＩＩＩ因子の活性化に間接的に作用する物質又は物質混合物、例えば第Ｘａ因子、ヘビ毒のエカリン、又は組織因子、リン脂質及びＣａ²⁺イオンからなる混合物、が適している。

「少なくとも１つのグルタミニル基を有する、第ＸＩＩＩａ因子のための受容体基質」との概念は、例えばアミノ酸グルタミン酸アミドからの、少なくとも１つのグルタミニル基、を有するポリペプチド又は擬似ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｍｉｍｅｔｉｋｕｍ）である。公知の第ＸＩＩＩａ因子のための受容体基質は、例えば、β−カゼイン並びに多数の合成ペプチドである。適切な合成ペプチドは、例えば欧州特許公開第３１４０２３Ａ２号明細書に、記載されている。

「第ＸＩＩＩａ因子のためのアミノ基供与体基質」の概念は、特に第１級アミンである。好適な第１級アミンは、エタノールアミン、プトレシン、カダベリン、ジアミノエタン、アミノエタンである。特に好適な第１級アミンは、グリシンエチルエステル又はグリシンメチルエステルである。

「アンモニアの存在下に、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化することができる薬剤」とは、好適には、酵素／基質系であり、この系は、酵素と酵素のための基質とを有し、ここで、前記酵素は、前記基質に触媒的に作用し、これにより、アンモニアの存在下に、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に又はＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に（つまり、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に）酸化し、同様にチオ−ＮＡＤＨをチオ−ＮＡＤ＋に、又はチオ−ＮＡＤＰＨをチオ−ＮＡＤＰ＋に、又は本発明による他のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を、酸化する。

適切な酵素／基質系は、デヒドロゲナーゼ及びその基質であり、前記基質は、補因子としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を、アンモニアと共に、転換させる。これは、特に、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ-アミノ酸デヒドロゲナーゼ等の、アミノ酸デヒドロゲナーゼである。その例は、アラニン−デヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、セリン−２−デヒドロゲナーゼ、バリン−デヒドロゲナーゼ、ロイシン−デヒドロゲナーゼ、グリシン−デヒドロゲナーゼ、リシン−デヒドロゲナーゼ、トリプトファン−デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニン−デヒドロゲナーゼ、アスパレート−デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメレート−デヒドロゲナーゼ、Ｎ−メチルアラニン−デヒドロゲナーゼ、Ｌ−エリトロ−３，５−ジアミノヘキサノエート−デヒドロゲナーゼ、及び、２，４−ジアミノペンタノエート−デヒドロゲナーゼである。アミノ化の上述の反応方向のための、それぞれの基質は、アンモニア及びそれぞれのオキソ化合物である。上記例の順序に応じて、これらは、アミノ酸デヒドロゲナーゼのための２−オキソ酸、並びにピルベート、アルファ−ケトグルタレート（２−オキソグルタレート）、３−ヒドロキシピルベート、３−メチル−２−オキソブタノエート、４−メチル−２−オキソペンタノエート、グリオキシレート、１，２−ジデヒドロピペリジン−２−カルボキシレート、インドール−３−イル−ピルベート、フェニルピルベート、オキサロアセテート、Ｌ−２−アミノ−６−オキソヘプタンジオエート、ピルベート及びメチルアミン、（Ｓ）−５−アミノ−３−オキソヘキサノエート、及びＬ−２−アミノ−６−オキソヘプタンジオエートである。適切な酵素／基質系は、例えば、グルタメートヒドロゲナーゼ／ケトグルタレート系又はアラニンデヒドロゲナーゼ／ピルベート系又はセリン−２−デヒドロゲナーゼ／３−ヒドロキシピルベート系又はバリンデヒドロゲナーゼ／３−メチル−２−オキソブタノエート系又はロイシンデヒドロゲナーゼ／４−メチル−２−オキソペンタノエート系又はグリシンデヒドロゲナーゼ／グリオキシレート系又はリシンデヒドロゲナーゼ／１，２−ジデヒドロピペリジン−２−カルボキシレート系又はフェニルアラニン／フェニルピルベート系又はアスパルテートデヒドロゲナーゼ／オキサロアセテート系又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ／Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン−６−ホスフェート系である。

本発明による方法の有利な実施態様の場合には、試料、好適には血漿試料、を更にフィブリン凝集阻害剤と混合する。フィブリン凝集阻害剤は、トロンビンにより誘発された、フィブリンモノマーの凝集を抑制する物質である。このようにして、フィブリノーゲン含有試料中でのフィブリン凝血塊の発生を抑制する。そうしないと、このフィブリン凝血塊は、試験バッチの吸収測定に不利な影響を及ぼしかねないためである。好適なフィブリン凝集阻害剤は、合成ペプチド、例えば、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社（スイス国）のＰｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）ＦＧとして市場で入手可能である）を有するペプチドである。フィブリン凝集阻害剤として使用することができる他の有利なペプチド、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａを有する特に好適なペプチド、は、欧州特許公開第４５６１５２Ａ２号明細書に記載されている。

他の実施態様においては、試料を、更に、ヘパリンを中和する物質、例えば臭化ヘキサジメトリン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）としても公知）、と混合し、ヘパリンのトロンビン阻害作用を排除する。ヘパリンは、例えばヘパリン治療された患者の試料中に存在することがあり得る。

試料と混合して試験バッチにされる成分Ｉ〜Ｖは、それぞれ別個に、つまり別個の試薬の形で、順に、試料と混合することができるが、これらの成分は、唯一のピペット工程で試料と混合される唯一の試薬の形に統合することもできる。この１つの試薬又はこれらの複数の試薬は、好適には、上記物質が溶かされている緩衝マトリックスを含有することができる。適切な緩衝マトリックスは、例えば、ＨＥＰＥＳ、ビシン、ＮａＣｌ、アルブミン及び／又は、例えばアジ化ナトリウムのような、保存剤、を含有し、好適には６．０〜９．０、特に好適には６．５〜８．５、のｐＨ値を有する。カルシウムイオンは、第ＸＩＩＩ因子の活性化のために必要であるので、緩衝マトリックスは、更にカルシウム塩、好適には塩化カルシウム、を含有する。１つの試薬又は複数の試薬と試料との混合は、手作業で又は自動凝固測定装置中で、実施することができる。

試験バッチに添加されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体の量は、アンモニアの存在下に、前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を相応するＮＡＤＰ＋類縁体に酸化させることができる薬剤の量に応じて、最適化される。グルタメートデヒドロゲナーゼ／ケトグルタレート系を使用する場合に、この量は、例えばチオ−ＮＡＤＨについて、有利には、チオ−ＮＡＤＨの最終濃度が、試験バッチ中で、１０〜５００μＭ、有利には５０〜４００μＭ、となるように選択される。

本発明による方法において、アンモニアの存在下にＮＡＤＨをＮＡＤに酸化することができる薬剤としてグルタメートデヒドロゲナーゼ／ケトグルタレート系を使用する場合に、試験バッチに添加されるグルタメートデヒドロゲナーゼの量は、試験バッチ中のこの最終濃度が２〜５００ＩＵ／ｍＬ、有利には５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、となるように選択される。

試料材料として、特にフィブリノーゲン含有血漿が適している。しかしながら、脱フィブリン血漿中でも、本発明による方法により、第ＸＩＩＩ因子を測定することができる。

試験バッチの吸収変化（ΔＥ）の測定は、測定されるべき試験バッチを透過するように光線を送る光源と透過された光の強度を測定し電気信号に変換するする検出器とを備えた測光器を用いて行なう。吸収変化の測定は、約３４０ｎｍ〜約４３０ｎｍの波長、好適には約３８０〜約４２０ｎｍの波長、特に好適には約３９０〜約４１０ｎｍの波長、の光を用いて行なわれる。単位時間当たりで変化する吸収は、第ＸＩＩＩ因子活性と相関する。チオ−ＮＡＤＨの又はチオ−ＮＡＤＰＨの消費による試験バッチの吸収（Ｅ）の減少は、特に反応速度論の線形の範囲内で、第ＸＩＩＩ因子活性に正比例する。試料の第ＸＩＩＩ因子活性は、好適には、１００％の第ＸＩＩＩ因子活性を有すると定義される標準血漿貯留試料との比較により計算される。

本発明の他の主題は、試料中の第ＸＩＩＩ因子を測定するための本発明による方法を実施するための試験キットであって、この試験キットは、次の成分を有する。
１．第ＸＩＩＩ因子を活性化して第ＸＩＩＩａ因子にする物質又は物質混合物、好適にはトロンビン、を含有する第１の試薬；
２．以下の成分を含有する第２の試薬
・第ＸＩＩＩａ因子のための、少なくとも１つのグルタミニル基を有する、少なくとも１つの受容体基質、好適にはアミン受容体として少なくとも１つのグルタミニル基を有する合成ペプチド、
・第ＸＩＩＩａ因子のための少なくとも１つのアミノ基供与体基質、好適には第１級アミン、及び
・アンモニアの存在下に、ＮＡＤ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）＋に、又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を相応するＮＡＤ（Ｐ）＋類縁体に、酸化することができる、好適にはグルタメートデヒドロゲナーゼとケトグルタレートとからなる、少なくとも１つの薬剤；
及び
３．３５０ｎｍを超える波長に吸収極大を有する少なくとも１つのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を含有する第３の試薬。

好適な試験キットにおいて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類縁体を含有する試薬は、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はセレノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含有する。

これらの試薬は、更に、保存剤、塩、緩衝物質及び／又は安定剤、例えばアジ化ナトリウム及びアルブミン、を含有していてもよい。これらの試薬は、液体試薬として又は凍結乾燥物として準備してもよい。試験キットの試薬のいくつか又は全てが凍結乾燥物として存在する場合には、この試験キットは、更に、この凍結乾燥物を溶解するために必要な溶剤、例えば、蒸留水及び／又は適当な緩衝液、を含有していてもよい。

好適な試験キットにおいて、第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化するためのトロンビンを含有する第１の試薬は、更に、塩化カルシウム及び／又はフィブリン凝集阻害剤及び／又は臭化ヘキサジメトリンを含有する。

図１は、チオ−ＮＡＤＨを用いた第ＸＩＩＩ因子測定を示す。試験バッチの吸収の低下は、試料中の第ＸＩＩＩ因子濃度と比例する（実施例１参照）。
図２は、ヘモグロビンが混入された血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子測定を示す（実施例２参照）。上側の図は、ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。下側の図は、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。この破線で示す水平の線は、ヘモグロビン０ｍｇ／ｍＬの出発値からの１０％の乖離を示す。チオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験は、公知のＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験よりも本質的に高いヘモグロビン濃度の場合に初めて、１０％の境界を超える。
図３は、コレステロールが混入された血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子測定を示す（実施例２参照）。上側の図は、ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。下側の図は、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。この破線で示す水平の線は、コレステロール０ｍｇ／ｍＬの出発値からの１０％の乖離を示す。公知のＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験とは対照的に、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験は、ここで試験したコレステロール濃度の場合に、１０％の境界を全く超えない。
図４は、ビリルビンが混入された血漿試料中の第ＸＩＩＩ因子測定を示す（実施例２参照）。上側の図は、ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。下側の図は、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験結果を示す。この破線で示す水平の線は、ビリルビン０ｍｇ／ｍＬの出発値からの１０％の乖離を示す。公知のＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験とは対照的に、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験は、ここで試験したビリルビン濃度の場合に１０％の境界を全く超えない。

実施例１：
チオ−ＮＡＤＨを用いた第ＸＩＩＩ因子の本発明による測定
次の試薬を調製した：

活性剤試薬（ｐＨ８．３）：
・チオ−ＮＡＤＨ（ＯｒｉｅｎｔａｌＹｅａｓｔＣｏｍｐａｎｙ、ロッテルダム、オランダ国）２９２μＭ
・ウシのトロンビン（１０ＩＵ／ｍＬ）
・フィブリン凝集阻害剤としてのＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−アミド（２ｇ／Ｌ）
・塩化カルシウム（１．２ｇ／Ｌ）
・臭化ヘキサジメトリン（１０ｍｇ／Ｌ）
・ウシのアルブミン
・ビシン緩衝剤（１００ミリモル／Ｌ）

検出試薬（ｐＨ６．５）：
・グルタメートデヒドロゲナーゼ（２６０ＩＵ／ｍＬ）
・第ＸＩＩＩ因子受容体基質としてのＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ｌｌｅ−Ｇｌｙ−アミド（２．４ｇ／Ｌ）
・ＡＤＰ
・グリシンエチルエステル（１．４ｇ／Ｌ）
・α−ケトグルタレート（２．７ｇ／Ｌ）
・ウシのアルブミン
・ＨＥＰＥＳ緩衝剤（１０ミリモル／Ｌ）

この試験のために、ＢＣＳ（登録商標）−ＸＰ凝固分析装置（シーメンスヘルスケアダイアグノスティクスプロダクツゲゼルシヤフトミツトベシユレンクテルハフツング社、マールブルグ、ドイツ国）を用いて、活性剤試薬７５μＬ、検出試薬７５μＬ及び試料１５μＬをキュベット中で合一し、３７℃でインキュベートした。５分後に、４０５ｎｍの波長において、吸収の測定を開始した。評価のために、測定開始後の６０秒〜３５０秒の時間枠内で、１分ごとに、４０５ｎｍにおいて吸収の変化を計算した。較正のために、１０２％ｄ．Ｎ．（標準に対する百分率）の第ＸＩＩＩ因子濃度を有する標準として、標準ヒト血漿（シーメンスヘルスケアダイアグノスティクスプロダクツゲゼルシヤフトミツトベシユレンクテルハフツング社、マールブルグ、ドイツ国）を使用した。低い第ＸＩＩＩ因子濃度での較正点は、０．９％のＮａＣｌ溶液中での標準の希釈により得られ、高い第ＸＩＩＩ因子の濃度での較正点は、試験中の標準の体積を増加することにより得られた。図１は、典型的な較正曲線を示す。

実施例２：
ＨＩＬ試料中のチオ−ＮＡＤＨを用いた第ＸＩＩＩ因子の本発明による測定
標準ヒト血漿（ＳＨＰ、シーメンスヘルスケアダイアグノスティクス）を、ヘモグロビン、ビリルビン、トリグリセリド又はコレステロールと、これらの濃度を増加させながら、混合し、これらは、それぞれ、一定の体積でこの血漿に供給した。このために、５４０μＬのＳＨＰを、様々な濃度を有するそれぞれの物質の溶液６０μＬと、混合した。ヘモグロビンを、Ｔｒｉｓ緩衝した食塩水（ＴＢＳ：１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．６）中に溶かし、コレステロールをヒト血清アルブミン４０ｍｇ／ｍＬを有するＴＢＳ中に溶かし、ビリルビンを０．０５ＭＮａＯＨ中に溶かし、上記ＳＨＰに量り込んだ。出発値の測定のために、５４０μＬのＳＨＰを、物質を添加せずに、それぞれの緩衝液６０μＬと混合した。引き続き、各物質が混入された血漿試料の第ＸＩＩＩ因子活性を、本発明による方法によって、チオ−ＮＡＤＨ（実施例１参照）を用いて、３回繰り返して、測定した。比較のために、同じ試料を、ＮＡＤＨを使用するＢｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）第ＸＩＩＩ因子試験（シーメンスヘルスケアダイアグノスティクスプロダクツゲゼルシヤフトミツトベシユレンクテルハフツング社、マールブルグ、ドイツ国）を用いて、製造元の記載事項に基づき、３回繰り返して、測定した。各物質が混入された試料についての測定結果が、各物質が混入されていない試料についての測定結果から、１０％より高く相違する場合には、干渉が生じている。即ち、信頼し得る第ＸＩＩＩ因子測定は不可能である。

それぞれ、ヘモグロビン、コレステロール及びビリルビンが混入された試料についての結果を、図２〜４に示した。

表１には、Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）第ＸＩＩＩ因子試験（省略して、「ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験」）によって又は本発明による方法（省略して、「チオ−ＮＡＤＨ第ＸＩＩＩ因子試験」）によって干渉が観察されない、妨害物質の最大濃度が記載されている。この両方の試験の比較は、本発明による試験が、より高い濃度の妨害物質濃度を許容すること、つまり、試料に固有の妨害物質から、影響を受けにくいことを、示す。妨害物質がコレステロール又はビリルビンである場合に、本発明によるチオ−ＮＡＤＨ試験は、最大の投与量を許容するので、表１に示した濃度よりも高い濃度で初めて干渉が生じると想定される。

Claims

試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法であって、
ａ）前記試料を、
Ｉ．第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化するための物質又は物質混合物、
ＩＩ．少なくとも１つのグルタミニル基を有する、第ＸＩＩＩａ因子のための受容体基質、
ＩＩＩ．第ＸＩＩＩａ因子のためのアミノ基供与体基質、
ＩＶ．３５０ｎｍを超える波長に吸収極大を有するチオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及び
Ｖ．アンモニアの存在下に、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをチオ−ＮＡＤ（Ｐ）＋に、酸化することができる薬剤を有する１種以上の試薬と、
混合し、
ｂ）前記試験バッチの吸収の変化を測定する、測定方法。
工程ａ）において前記試料を更にフィブリン凝集阻害剤と混合する、請求項１に記載の方法。
前記第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化するための物質がトロンビンである、請求項１又は２に記載の方法。
少なくとも１つのグルタミニル基を有する、第ＸＩＩＩａ因子のための、受容体基質が、アミン受容体として少なくとも１つのグルタミン残基を有するポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
第ＸＩＩＩａ因子のためのアミノ基供与体基質が、第１級アミンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
アンモニアの存在下に、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをチオ−ＮＡＤ（Ｐ）＋へ酸化することができる薬剤が、酵素及び該酵素のための基質を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記酵素がグルタメートデヒドロゲナーゼであり、前記酵素のための基質がα−ケトグルタレートである、請求項６に記載の方法。
工程ａ）において、前記試料を、更に、ヘパリン中和物質又は塩化カルシウムと、混合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記試験バッチの吸収変化を、３４０ｎｍ〜４３０ｎｍの波長の光を用いて、測定する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法における、３５０ｎｍを超える波長に吸収極大を有するチオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの、使用。
試料中の第ＸＩＩＩ因子の測定方法を実施するための試験キットであって、以下の成分：
ａ．第ＸＩＩＩ因子を活性化して第ＸＩＩＩａ因子にする物質又は物質混合物を含有する第１の試薬、
ｂ．以下の成分を含有する第２の試薬、
・第ＸＩＩＩａ因子のための、少なくとも１個のグルタミニル基を有する、少なくとも１種の受容体基質、
・第ＸＩＩＩａ因子のための少なくとも１種のアミノ基供与体基質及び
・アンモニアの存在下に、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをチオ−ＮＡＤ（Ｐ）＋へ、酸化することができる少なくとも１種の薬剤、並びに
ｃ．３５０ｎｍより長い波長にある吸収極大を有するチオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含有する第３の試薬を含有する、試験キット。
前記第１の試薬が、第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化するトロンビン、及び、更に、塩化カルシウム、フィブリン凝集阻害剤又は臭化ヘキサジメトリンを含有する、請求項１１に記載の試験キット。