DE69736202T2

DE69736202T2 - Verfahren für die quantitative bestimmung von bikarbonationen in flüssigkeiten und vorrichtung für die trockenanalyse

Info

Publication number: DE69736202T2
Application number: DE69736202T
Authority: DE
Inventors: Hideaki Tanaka; Yoshikazu Amano
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2017-10-01
Also published as: WO1999016897A1; EP1028165A4; EP1028165A1; EP1028165B1; DE69736202D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Element zur trockenen Analyse zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in einer flüssigen Probe. Insbesondere sind das Verfahren und das Element für die trockene Analyse zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in einer flüssigen Probe wie Blut oder Urin im klinischen Test nützlich, bei dem eine schnelle und genaue Messung erforderlich ist.
Stand der Technik
Ein übliches Verfahren zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in einer flüssigen Probe ist die Messung des Partialdrucks von Kohlensäure in der Flüssigkeit und der Wasserstoffionenkonzentration (pH) unter Verwendung von Elektroden. Die Bicarbonationen-Konzentration kann durch Berechnung aus den oben genannten Werten bestimmt werden. Jedoch ist dieses Verfahren im Hinblick auf die Notwendigkeit der gleichzeitigen Messung sowohl des Carbonsäure-Partialdrucks als auch des pH-Wertes der Flüssigkeit nachteilig.
Eine weitere herkömmliche Methode besteht darin, die Umwandlung von Bicarbonat-Ionen in Kohlendioxid unter sauren Bedingungen auszunutzen und das Volumen des gebildeten Kohlendioxids zu messen. Im Allgemeinen ist eine Ausrüstung im großen Maßstab erforderlich, um das Gasvolumen präzise zu messen und daher ist dieses Verfahren für die Messung einer großen Zahl von Proben nachteilig.
Um diese Nachteile auszuräumen, wurden einige enzymatische Verfahren entwickelt. Das in dem japanischen Patent KOKAI 4-210599 offenbarte enzymatische Verfahren macht von den folgenden Reaktionen Gebrauch:
und die Bicarbonat-Ionen werden durch Messung der Abnahme der Absorption bei 340 nm von NAD(P) bestimmt.
In der oben beschriebenen Gleichung steht PEPC für Phosphoenolpyruvatcarboxylase, PEP steht für Phosphoenolpyruvinsäure, MDH steht für Malatdehydrogenase, NADH steht für die reduzierte Form von Nikotinamidadenindinukleotid, NAD(P)H steht für die reduzierte Form von Nikotinamidadenindinukleotidphosphat und sowohl NAD als auch NADP steht für die oxidierte Form von Nikotinamidadenindinukleotid bzw. die oxidierte Form von Nikotinamidadenindinukleotidphosphat.
Die in dem japanischen Patent KOKAI 4-248997 offenbarte Methode verwendet Phosphoenolpyruvatcarboxykinase anstelle von PEPC.
Die oben beschriebenen Verfahren bzw. Methoden weisen jedoch die folgenden Nachteile auf:

1. Um die Absorption bei 340 nm zu messen, muss das Analysegerät mit einer Ultraviolettlichtquelle und einem Detektionssystem für Ultraviolettstrahlung ausgerüstet sein. Somit wird das Analysegerät größer und teurer.
2. In Anbetracht der Reaktionsgeschwindigkeit ist es, da die Absorption von NAD(P)H bei 340 nm hoch ist, schwierig, die erforderliche Menge an NAD(P)H für die Umwandlung der Gesamtmenge an Oxalessigsäure, die bei der oben beschriebenen Reak tion gebildet wird, in Äpfelsäure von Beginn an zu inkorporieren. Im Ergebnis wird daher der Bestimmungsbereich eng.
3. Obwohl die oben erwähnte hohe Absorption vermieden werden kann, indem die Messwellenlänge zu einem niedrigeren Absorptionsbereich hin verschoben wird, wie zum Beispiel 380 nm, und indem eine genügende Menge an NAD(P)H inkorporiert wird, ist die Messung instabil, da das Spektrum nicht flach, sondern schief bzw. schräg ist.

Die EP 0 387 697 A2 offenbart ein Verfahren und ein Reagenzsystem zur Bestimmung der Menge einer in einer biologischen Testprobe vorhandenen Aminotransferase. Die Aminotransferase wird bestimmt, indem eine Testprobe, welche eine Aminotransferase enthält, mit ihrer korrespondierenden Aminosäure, einer Ketosäure, einer Dehydrogenase oder einer Reduktase und einer reduzierten Form von Thionikotinamidadenindinukleotid oder einem Analogen davon zur Herstellung einer flüssigen Mischung daraus in Kontakt gebracht wird. Die sichtbare Absorption des flüssigen Gemisches wird gemessen und mit der in der Testprobe vorhandenen Menge an Aminotransferase korreliert.
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Vermeidung der oben genannten Mängel bei den herkömmlichen Bestimmungsmethoden für Bicarbonat-Ionen in flüssigen Proben. Insbesondere ist eine Aufgabe dieser Erfindung die Bereitstellung eines Reaktionssystems, das es ermöglicht, Bicarbonat-Ionen in Flüssigkeiten schnell, einfach und stabil unter Verwendung eines kompakten Instruments mit einer Quelle sichtbaren Lichts und ausreichender Substratdichte zu messen. Eine weitere wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Elements für die trockene Analyse zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in Flüssigkeiten.
Offenbarung der Erfindung
Diese Erfindung ist gemacht worden, um die oben genannten Probleme zu lösen und Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren und ein Element für die Trockenanalyse zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in Flüssigkeiten unter Verwendung von Phosphoenolpyruvatcarboxylase und Malatdehydrogenase als konjugiertes Enzym, worin ThioNAD(P)H und NAD(P)H als Substrat für Malatdehydrogenase verwendet werden.
In dem oben beschriebenen Reaktionssystem läuft die Reaktion wie folgt ab:
Da ThioNAD(P)H einen Absorptionspeak bei 400 nm aufweist, kann eine Quelle sichtbaren Lichts und ein entsprechendes Detektionssystem verwendet werden.
In dem Fall, in dem nur ThioNAD(P)H als Substrat verwendet wird, ist der Bestimmungsbereich eng, da die Absorption von ThioNAD(P)H so hoch ist wie die von NAD(P)H. Jedoch kann dieses Phänomen vermieden werden, indem die Verwendung einer Quelle sichtbaren Lichts beibehalten wird und der Bestimmungsbereich durch Verringerung des quantitativen Vereinigungsverhältnisses von Bicarbonat-Ionen zur NAD(P)H-Menge gespreizt wird.
Es ist nicht klar, welche Art von konkurrierender Reaktion auftritt, wenn Bicarbonat-Ionen mit ThioNAD(P)H und NAD(P)H in Kontakt geraten, aber überraschenderweise zeigte die Mes sung an vielen Proben mit Bicarbonat-Ionen verschiedener Konzentrationen Reproduzierbarkeit in einem breiten Bestimmungsbereich. Daher ist auch der zweite oben beschriebene Nachteil überwunden worden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, welcher die Beziehung zwischen der Bicarbonationen-Konzentration gemäß dem erfindungsgemäßen Beispiel mit ThioNADH als Substrat und der optischen Dichte der Reaktionsflüssigkeit zeigt.
2 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Bicarbonationen-Konzentration gemäß dem Beispiel mit einem Gemisch aus ThioNADH und NADH als Substrat und der optischen Dichte der Reaktionsflüssigkeit zeigt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die im Rahmen der Erfindung verwendbare Phosphoenolpyruvatcarboxylase fungiert zur Herstellung von Oxalessigsäure aus Phosphoenolpyruvinsäure und schließt EC 4.1.1.31, EC 4.1.1.32, EC 4.1.1.38 und EC 4.1.1.49 ein. Jedoch ist die Gegenwart von GDP für EC 4.1.1.32 erforderlich, anorganischer Phosphor ist für EC 4.1.1.38 nötig bzw. ADP ist für EC 4.1.1.49 erforderlich.
Als Malatdehydrogenase gibt es EC 1.1.1.37, EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39, EC 1.1.1.40, EC 1.1.1.83 und EC 1.1.99.16. Die im Rahmen der Erfindung verwendbare Malatdehydrogenase fungiert zur Herstellung von Äpfelsäure aus Oxalessigsäure und schließt EC 1.1.1.37 und EC 1.1.99.16 ein.
Die erfindungsgemäße Messreagenzzusammensetzung erfordert auch (ein) Substrat(e) der oben genannten zwei Typen von Konjugat-Enzymen sowie die konjugierten Enzyme. Das Substrat bzw. die Substrate für Phosphoenolpyruvatcarboxylase schließt bzw. schließen Phosphoenolpyruvinsäure (einschließlich ihres Derivats, auf das das Enzym einwirken kann) ein. Die Erfindung ist gekennzeichnet durch die Verwendung einer Kombination von Thionikotinamidadenindinukleotid in reduzierter Form (ThioNADH) oder Thionikotinamidadenindinukleotidphosphat in reduzierter Form (ThioNADPH) und Nikotinamidadenindinukleotid in reduzierter Form (NADH) oder Nikotinamidadenindinukleotidphosphat in reduzierter Form (NADPH) als Substrat für die Malatdehydrogenase. ThioNADPH ist handelsüblich und wird beispielsweise von der Sigma Chemical Company in den USA geliefert. Ein geeignetes Mischungsverhältnis (molares Verhältnis) von ThioNAD(P)H/NAD(P)H ist 1/0,05 bis 1/2, vorzugsweise 1/0,1 bis 1/1, mehr bevorzugt 1/0,2, bis 1/0,7.
Die Messreagenzzusammensetzung kann weitere Komponenten wie bekannte Enzymaktivatoren (z.B. Mg²⁺), Stabilisatoren, pH-Puffer, z.B. Trishydroxymethylaminomethan, und dergleichen enthalten.
Eine geeignete Menge an Phosphoenolpyruvinsäure ist etwa 1,5 bis 10 Mol, vorzugsweise etwa 2 bis 5 Mol pro Mol an Bicarbonat-Ionen. Eine wünschenswerte Enzymkonzentration ist im Falle eines Geschwindigkeitsassays bzw. Zeiteinheitsassays etwa 50 bis 2.000 U/L, vorzugsweise etwa 100 bis 1.000 U/L für Phosphoenolpyruvatcarboxylase und etwa 1.000 bis 50.000 U/L, vorzugsweise 2.000 bis 20.000 U/L für Malatdehydrogenase. Im Falle eines Endpunktassays beträgt die geeignete Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Konzentration etwa 2.000 bis 200.000 U/L, vorzugsweise etwa 3.000 bis 100.000 U/L und eine geeignete Malatdehydrogenase-Konzentration ist etwa 2.000 bis 300.000 U/L, vorzugsweise 5.000 bis 200.000 U/L. Eine geeignete Menge der Summe von ThioNAD(P)H und NAD(P)H ist etwa 1 bis 10 Mol, vorzugsweise etwa 1,5 bis 5 Mol pro Mol HCO₃ ^–. Ein geeignetes Verhältnis (Aktivitätsverhältnis) von Phosphoenolpyruvatcar boxylase/Malatdehydrogenase ist etwa 1 bis 20, vorzugsweise etwa 1 bis 10.
Die Reaktion wird bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 10, vorzugsweise bei einem pH-Wert von ± 1 um das Optimum für beide Enzyme bei 20 bis 40°C, im Allgemeinen bei Raumtemperatur, 1 bis 15 Minuten lang durchgeführt. Die Messung kann unter Verwendung des Geschwindigkeitsassayverfahrens oder des Endpunktverfahrens bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße Messreagenzzusammensetzung kann sowohl für die Trockenanalyse als auch für die Nassanalyse verwendet werden.
Ein bevorzugtes analytisches Element für die Trockenanalyse umfasst einen drei- oder mehrschichtigen Aufbau aus einem wasserundurchlässigen Träger und mindestens zwei wasserdurchlässigen Schichten.
Als Träger kann ein wasserundurchlässiger, lichtdurchlässiger Träger verwendet werden, welcher in konventionell bekannten Elementen zur trockenen Analyse Anwendung findet. Typische wasserundurchlässige, lichtdurchlässige Träger sind ein transparenter Film oder eine Folie aus Polyethylenterephthalat, Polycarbonat von Bisphenol A, Polystyrol, Celluloseester, wie Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat und Celluloseacetatpropionat oder dergleichen. Die Dicke des Trägers liegt üblicherweise im Bereich von etwa 50 μm bis 1 mm, vorzugsweise etwa 80 μm bis etwa 300 μm.
Der Träger kann auf seiner Oberfläche mit einer Grundierschicht versehen sein, um die Haftung zwischen dem Träger und der darauf auflaminierten Reagenzschicht zu erhöhen. Anstelle der Grundierschicht kann die Trägeroberfläche durch physika lische oder chemische Aktivierung zur Erhöhung der Haftung behandelt werden.
Wasserdurchlässige Schichten sind Reagenzschicht, Lichtabschirmschicht, Haftschicht, Ausbreitungsschicht, Wasserabsorptionsschicht und dergleichen, die im Folgenden beschrieben werden.
Auf dem Träger wird die Reagenzschicht vorgesehen (direkt oder durch (eine) andere Schicht(en) wie eine Grundierschicht o.ä.). Die Reagenzschicht ist eine wasserabsorbierende wasserdurchlässige Schicht, in der mindestens ein Teil der vorher erwähnten Reagenzzusammensetzung im Wesentlichen gleichförmig in einem hydrophilen Polymerbindemittel dispergiert ist.
Das hydrophile Polymer, das als Bindemittel für die Reagenzschicht verwendet werden kann, ist im Allgemeinen ein natürliches oder synthetisches hydrophiles Polymer mit einem Quellverhältnis im Bereich von etwa 150% bis etwa 2.000, vorzugsweise von etwa 250% bis etwa 1.500 bei 30°C. Beispiele für ein solches hydrophiles Polymer sind Gelatinen (z.B. sauer verarbeitete Gelatine oder Deionisationsgelatine, etc.), Gelatinederivate (z.B. phthalsaure Gelatine, Hydroxyacrylat-Propfgelatine, etc.), Agarose, Pullulan, Pullulanderivate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon usw., die in dem japanischen Patent KOKAI 58-171864 oder 60-108753 offenbart sind.
Die Reagenzschicht kann eine bis zu einem gewissen Grad durch Zugabe eines Vernetzungsmittels vernetzte (gehärtete) Schicht sein. Als Beispiele für das Vernetzungsmittel sind Vinylsulfonylvernetzungsmittel, wie 1,2-bis(Vinylsulfonylacetamid)ethan und bis(Vinylsulfonylmethyl)ether, Aldhehyde, etc., für Gelatine, Aldehyde, Epoxyverbindungen mit 2 Glycidylgruppen und dergleichen für Methallylalkohol-Copolymere bekannt.
Eine geeignete Trockendicke für die Reagenzschicht liegt im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 100 μm, vorzugsweise von etwa 3 μm bis etwa 30 μm. Zweckmäßigerweise ist die Reagenzschicht im Wesentlichen transparent.
Eine lichtabschirmende Schicht kann gegebenenfalls auf der Reagenzschicht vorgesehen werden. Die Lichtabschirmschicht ist wasserdurchlässig oder wasserpermeabel, wo feine Teilchen mit Lichtabschirmeigenschaft von Lichtabsorption und/oder Lichtreflexion durch das hydrophile Polymerbindemittel mit geringer Filmbildungseigenschaft in dispergiertem Zustand gehalten werden. Die Lichtabschirmschicht blockiert die Farbe der Probe, die auf die später beschriebene Ausbreitungsschicht punktförmig aufgebracht wird, insbesondere die der roten Komponenten von Hämoglobin im Falle von Gesamtblutproben, wenn eine nachweisbare Änderung, wie eine Farbänderung oder Färbung, die in der Reagenzschicht auftritt, von der Seite des lichtdurchlässigen Trägers durch Reflexionsphotometrie gemessen wird. Diese Schicht fungiert auch als lichtreflektierende Schicht oder Hintergrundschicht. Beispiele für die lichtreflektierenden feinen Teilchen sind Titandioxidteilchen (in Form von mikrokristallinen feinen Körnern vom Rutil-Typ, Anatas-Typ oder Brookit-Typ mit einer Korngröße von etwa 0,1 μm bis 1,2 μm), Bariumsulfatteilchen, Aluminiumteilchen oder Mikroflocken. Beispiele für lichtabsorbierende feine Teilchen sind Ruß, Gasruß, Kohlenstoff-Mikrokugeln und dergleichen. Unter diesen lichtabschirmenden feinen Teilchen sind feine Titandioxidteilchen, Bariumsulfatteilchen wünschenswert bzw. bevorzugt. Insbesondere sind Titanoxidteilchen vom Anatas-Typ die am meisten bevorzugten lichtabschirmenden feinen Teilchen.
Typische Polymerbindemittel mit hydrophilen Eigenschaften und Filmbildungsvermögen sind schwach-hydrophile regenerierte Cellulose, Celluloseacetat, etc., zusammen mit hydrophilen Polymeren, die dem hydrophilen Polymeren ähnlich sind, welches zur Herstellung der oben erwähnten Reagenzschicht verwendet wird. Bevorzugte hydrophile Polymere sind Gelatinen, Gelatinederivate und Polyacrylamid. Ein bekanntes Härtungsmittel (Vernetzungsmittel) kann der Gelatine oder einem Gelatinederivat zugesetzt werden. Das Aufbringen einer wässrigen Lösung eines hydrophilen Polymeren, worin die lichtabschirmenden feinen Teilchen auf der Reagenzschicht durch gute bekannte Auftragsverfahren dispergiert sind, und anschließendes Trocknen vermag die lichtabschirmende Schicht herzustellen. Anstelle des Vorsehens der lichtabschirmenden Schicht können die lichtabschirmenden feinen Teilchen in die Ausbreitungsschicht, die später beschrieben wird, eingearbeitet werden.
Eine Haftschicht kann zusammen mit jeder beliebigen weiteren Schicht auf der Reagenzschicht vorgesehen werden, um die später beschriebene Ausbreitungsschicht darauf direkt oder optisch durch eine Lichtabschirmschicht oder dergleichen unter Laminierung zu adherieren.
Die Haftschicht besteht vorzugsweise aus einem hydrophilen Polymeren und sie kann sich der Ausbreitungsschicht anschließen, wobei entsprechende Schichten integriert werden, während sie befeuchtet oder durch Absorption von Wasser aufgequollen wird. Als Beispiele für das hydrophile Polymer, das zur Herstellung der Haftschicht angewandt werden kann, können die gleichen hydrophilen Polymeren, die bereits zur Verwendung bei der Herstellung der Reagenzschicht beschrieben wurden, erwähnt werden. Unter diesen Polymeren sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid usw. bevorzugt. Eine geeignete Trockendicke der Haftschicht liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 μm bis etwa 20 μm, vorzugsweise von etwa 1 μm bis etwa 10 μm.
Die Haftschicht kann auch auf (einer) andere(n) Schicht(en) vorgesehen sein, um die Haftkraft zwischen anderen Schichten zusätzlich zur Reagenzschicht zu verbessern. Die Haftschichten können durch Aufbringen wässriger hydrophiler Polymerlösung, zu der ein Tensid oder dergleichen gegebenenfalls zugesetzt worden ist, auf den Träger, oder auf die Reagenzschicht durch gut bekannte Auftragsverfahren oder andere gut bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die poröse Ausbreitungsschicht kann eine Ausbreitungsschicht aus Stoff, wie in dem japanischen Patent KOKAI 55-164356, 57-66359, etc. offenbart, wie zum Beispiel aus einfacher Webart unter Einschluss von breitem Gewebe, und Popeline, eine gestrickte bzw. gewirkte Ausbreitungsschicht, wie in dem japanischen Patent KOKAI 60-222769, etc. offenbart, wie Trikotagen, Doppeltrikotagen oder Milaneser, eine Ausbreitungsschicht aus Stoff oder Gewirk, geätzt durch eine Ätzlösung, wie in dem japanischen Patent KOKAI 1-172753, eine Ausbreitungsschicht aus organischer Polymerfaserpulpe enthaltend Papier, wie in dem japanischen Patent KOKAI 57-148250 offenbart, ein Membranfilter (mattierte bzw. getrübte Polymerschicht), wie in dem Patent KOKOKU 53-21677 und der USP 3,992,158 beschrieben, kontinuierliche Mikroräume enthaltende poröse Schichten, worin Polymerteilchen, Glasteilchen oder Diatomeenerde in einem hydrophilen Polymerbindemittel dispergiert sind, oder eine kontinuierliche poröse Schicht, worin Polymerteilchen so miteinander verbunden sind, dass sie bei einem Punkt durch Verwendung eines Polymerhaftstoffs, welcher nicht in Wasser quillt (dreidimensionale Gitterstrukturschicht) in Kontakt stehen, oder ähnliches sein.
Die physikalische Aktivierungsbehandlung wie Glühentladungsbehandlung oder Koronaentladungsbehandlung, wie in dem japanischen Patent KOKAI 57-66359 offenbart, können auf mindestens einer Oberfläche des Stoffs, des Gewebes oder des „mined paper", der bzw. das als poröse Ausbreitungsschicht verwendet wird, durchgeführt werden, um die Haftkraft zwischen der Oberfläche des Trägers und der Überzugsschicht zu erhöhen. Der Stoff, das Gewebe oder „mined paper" können durch Entfetten durch Spülen in Wasser oder mit einer hydrophilen Behandlung mit einem Tensid oder einem hydrophilen Polymeren, wie in dem japanischen Patent KOKAI 55-164356, 57-66359 offenbart, usw. behandelt werden. Indem der Stoff oder das Papier einer oder mehreren der oben beschriebenen Behandlung(en) unterworfen wird, wird der Stoff oder das Papier hydrophil gemacht und die Haftkraft zwischen der Oberfläche des Trägers und der untersten Überzugsschicht, die mit der Oberfläche in Kontakt steht, kann verstärkt werden.
Was das erfindungsgemäße analytische Mehrschichtelement anbetrifft, so kann eine Wasserabsorptionsschicht zwischen dem Träger und der Reagenzschicht vorgesehen werden. Die Absorptionsschicht besteht im Wesentlichen aus einem hydrophilen Polymeren, das Wasser zur Quellung absorbiert, und es absorbiert das Wasser der wässrigen Flüssigkeitsprobe, das bzw. die die Oberfläche dieser Schicht erreicht. Im Fall einer Gesamtblutprobe beschleunigt sie die Permeation der Blutplasmakomponente in die Reagenzschicht. Das hydrophile Polymer, das für die Wasserabsorptionsschicht verwendet werden kann, kann aus dem Polymer ausgewählt werden, das für die Verwendung in der Reagenzschicht erwähnt worden ist. Bevorzugte hydrophile Polymere, die für die Wasserabsorptionsschicht verwendbar sind, sind im Allgemeinen Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol, insbesondere die oben erwähnten Gelatinen und entionisierte Gelatine. Die beste Auswahl ist dieselbe Gelatine, wie sie für die Reagenzschicht verwendet wird. Die Trockendicke der Wasserabsorptionsschicht liegt im Bereich von etwa 3 μm bis 100 μm, vorzugsweise etwa 5 μm bis etwa 30 μm. Die Beschichtungsmenge der Wasserabsorptionsschicht liegt im Bereich von etwa 3 g/m² bis etwa 100 g/m², vorzugsweise etwa 5 g/m² bis etwa 30 g/m². Durch Einarbeiten eines pH-Puffers, eines bekannten basischen Polymeren oder dergleichen, der bzw. das später näher beschrieben wird, in die Wasserabsorptionsschicht kann ein für die Praxis tauglicher pH-Wert im Analysebetrieb eingestellt werden. Außerdem kann ein bekanntes Beizmittel, ein Polymerbeizmittel, etc. in die Wasserabsorptionsschicht eingearbeitet werden.
Die Reagenzzusammensetzung kann in die Reagenzschicht oder in jede andere Schicht eingearbeitet werden. Zum Beispiel kann sie in die Reagenzschicht oder in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet werden. Die gesamte Reagenzzusammensetzung kann in die Reagenzschicht eingearbeitet werden. In diesem Fall werden Komponenten, die miteinander reagieren, getrennt voneinander eingearbeitet und die letztere Komponente wird eingearbeitet, so dass die Reaktion nicht vor der Messung abläuft, indem zum Beispiel die Komponente in Alkohol dispergiert und anschließend die Dispersion aufgebracht wird.
Beispiel 1
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt: 1) Enzymlösung

Tris-Puffer 75 mM (pH 8)

PEPC (EC 4.1.1.31) 3 U/ml

MDH (EC 1.1.1.37) 30 U/ml

Mg²⁺ 19,8 mM

2) Substratlösung

Tris-Puffer 75 mM (pH 8)

PEP 6,75 mM

ThioNADH 0,45 mM

3) HCO₃ ^–-Lösung

0 mM

10 mM

20 mM

40 mM
Bei 37°C wurden 20 μl der Lösung 3) oben in jede Zelle eingebracht, danach wurden 2 ml der Lösung 1) und anschließend 1 ml der Lösung 2) oben der Zelle zugesetzt. Die Absorption bei 400 nm dieses Gemischs wurde fünf Minuten lang gemessen und eine Kalibrierungskurve unter Verwendung der gemessenen Absorption nach fünf Minuten aufgestellt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Aus den obigen Ergebnissen kann ersehen werden, dass die Bestimmung von Bicarbonat-Ionen bei einer Messwellenlänge von 400 nm möglich ist.
Beispiel 2
Anstelle der Substratlösung 2) oben, wurde die folgende Substratlösung 4) hergestellt: 4) Substratlösung

Tris-Puffer 75 mM (pH 8)

PEP 6,75 mM

ThioNADH 0,45 mM

NADH 0,23 mM
Danach wurden die Bicarbonat-Ionen in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die so erhaltene Kalibrierungskurve ist in 2 gezeigt.
Aus den Ergebnissen kann ersehen werden, dass der Bestimmungsbereich durch die Koexistenz von NADH in der Substratlösung beträchtlich erweitert wird.
Beispiel 3
Eine wässrige Lösung wurde auf einen klaren PET-Filmträger von 180 μm Dicke aufgebracht und anschließend getrocknet, wobei die folgenden Überzugsmengen erhalten wurden:

ThioNADH 2 g/m²

MDH (EC 1.1.1.37) 4000 U/m²

Tris-Puffer 4,85 g/m²

Polyoxyethylennonylphenylether 0,25 g/m²

Gelatine 10 g/m²
Eine wässrige Lösung wurde auf die oben beschriebene Überzugsschicht aufgebracht und anschließend getrocknet, wobei die folgenden Überzugsmengen erhalten wurden:

PEP 6 g/m²

PEPC (EC 4.1.1.31) 4500 U/m²

MgCl₂ 3 g/m²

Tris-Puffer 4,85 g/m²

Polyoxyethylennonylphenylether 0,25 g/m²

Gelatine 10 g/m²

Titandioxid 3,65 g/m²
Auf diese Schicht wurde ein Polyestergewirk auflaminiert und eine wässrige Lösung enthaltend Polyvinylalkohol und ein Ten sid wurde darauf aufgebracht, um das Ausbreiten der Probelösung zu kontrollieren.
Das so hergestellte analytische Element wurde in Stücke von etwa 1,3 × 1,4 cm Größe geschnitten, und in einen Halter mit einer Öffnung mit einem Durchmesser von 12 mm gegeben, um ein analytisches Element fertigzustellen.
Je 10 μl der in Beispiel 1 hergestellten Probenlösung 3) wurden auf 4 Stücke des analytischen Elements getröpfelt und die Messung wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Dann wurden ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.
Beispiel 4
Eine wässrige Lösung wurde auf einen klaren PET-Filmträger mit 180 μm Dicke aufgebracht und anschließend getrocknet, wobei die folgenden Überzugsmengen erhalten wurden:

ThioNADH 2 g/m²

NADH 1 g/m²

MDH (EC 1.1.1.37) 4000 U/m²

Tris-Puffer 4,85 g/m²

Polyoxyethylennonylphenylether 0,25 g/m²

Gelatine 10 g/m²
Danach wurden weitere analytische Elemente ähnlich wie in Beispiel 3 hergestellt und danach ähnliche Messungen durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten das gute Leistungsvermögen der Erfindung ähnlich wie in Beispiel 2.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Diese Erfindung stellt eine schnelle, genaue und einfache Methode zur Bicarbonationen-Bestimmung in biologischen Flüssigkeitsproben wie insbesondere in Blut, Urin, etc. bereit.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in Flüssigkeiten unter Verwendung von Phosphoenolpyruvatcarboxylase und Malatdehydrogenase als konjugiertes Enzym, worin ThioNAD(P)H und NAD(P)H als Substrat für Malatdehydrogenase verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das molare Verhältnis von ThioNAD(P)H/NAD(P)H 1/0,05-1/2 ist.
Element für die trockene Analyse zur Bestimmung von Bicarbonat-Ionen in Flüssigkeiten, welches mindestens zwei wasserdurchlässige Schichten umfasst, die auf einem wasserundurchlässigen Träger laminiert sind, wobei die wasserdurchlässigen Schichten als Ganzes Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Malatdehydrogenase und ThioNAD(P)H und NAD(P)H enthalten.
Element zur trockenen Analyse nach Anspruch 3, worin das molare Verhältnis von ThioNAD(P)H/NAD(P)H 1/0,05-1/2 ist.