JPH0142679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体試料中のグルタミン酸オキザロ酢
酸トランスアミナーゼ（GOTと略称する）を測
定する為に使用する組成物に関する。更に詳しく
はNADH及びＬ―アスパラギン酸と共に紫外部
吸収法（後に詳述する）によるGOT測定試薬に
供する組成物に関する。

本発明の目的は、NADH及びＬ―アスパラギ
ン酸と共に紫外部吸収法（以下UV法と略称す
る）によるGOT測定の為に使用する常温で寿命
の長い組成物を提供し、試薬の浪費を防ぐ他マル
チチヤンネル自動分析機の能率を向上し、省力の
効果を挙げるにある。尿や血液など生体試料中の
GOTの定量は各種疾患の診断及び治療、たとえ
ば心疾患と肝疾患の区別、急性肝障害と慢性肝障
害の区別など臨床診断、経過観察の指標として臨
床検査の重要な項目の一つである。

UV法はGOTの触媒作用によつてＬ―アスパラ
ギン酸とα―ケトグルタル酸とから生成されるオ
キザロ酢酸（以下略記する場合はOAAと表す）
を、共役酵素として共存させたリンゴ酸脱水素酵
素（以下略記する場合はMDHと表す）の触媒作
用で、NADHによりリンゴ酸へ還元し、その際
のNADHのNADへの酸化反応速度（NADHの
特性吸収波長である340nmの減少速度）を測定す
ることによりGOTを測定する方法である。以上
の記載の理解の為に次の第１及び第２反応式を参
照されたい。

第１反応式 Ｌ―アスパラギン酸＋α― ケトグルタル酸GOD ―――→ グルタミン酸＋オキザロ酢酸 第２反応式 オキザロ酢酸＋NADHMDH ―――→ リンゴ酸＋NAD UV法は発色法と呼ばれるフエニルヒドラジン
を使用するGOTの測定方法に比して、正確度精
度共に良好で優れたGOTの測定方法である。然
しUV法は測定に共役酵素および補酵素を使用す
るので、その試薬を室温において測定状態で保存
する場合には１日前後しか有効な活性を保持し得
ない。（ここで測定状態とは、そのままで測定に
用いることのできる状態にあることを意味する。）
このためにマルチチヤンネルの自動分析機にセツ
トした試薬溶液を頻繁に交換しなければならず、
煩雑で、手間がかかり且つ寿命の切れたものを棄
てる回数が多く試薬の浪費が多い。それ故にこれ
らの欠点を解決する為に、室温における測定状態
で安定性の優れた試薬組成物の出現が強く望まれ
ている。

GOTの測定に使用するNADHはPH9〜11のア
ルカリ性におけば室温にても安定であることが公
知である。しかもNADHのPH9〜11の液をGOT
測定に必要な其の他の試薬（PHを測定時の値と
したもの）と合しても、その緩衝能を失わない様
にすることが出来るので、NADHについてその
寿命には実際上問題はない。又α―ケトグルタル
酸及びＬ―アスパラギン酸も殺菌剤を使用すれば
その安定性は問題なく保たれる。然しMDH及び
LDH（乳酸脱水素酵素）の安定性、即ち寿命につ
いて新しい方法の開発が強く要望されている。

本発明者らはこのような要望に応へる為、安定
性の高い、即ち室温において測定状態で長期間保
存の可能なGOT測定用試薬組成物の検索に努力
した結果、NADH及びＬ―アスパラギン酸と共
にGOT測定用に供する、室温で寿命の長い組成
物を見出し、本発明を完成した。

本発明は「還元型ベーターニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NADH）及びＬ―アスパ
ラギン酸と共にグルタミン酸オキザロ醋酸トラン
スアミナーゼ（GOT）の測定用に供するもので
あつて、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、
α―ケトグルタル酸、スルフヒドリル化合物、キ
レート剤、殺菌剤及びPH緩衝剤を含み、上記ス
ルフヒドリル化合物が0.01〜100mM、キレート
剤が0.01〜50mMの範囲の濃度にあることを特徴
とする組成物。」である。

従来よりスルフヒドリル化合物を、GOTの測
定用の組成物に配合した例がある（例えば特公昭
50−18399）が、これはNADHの安定化を目的と
したものであり、且キレート剤との併用でなく、
また凍結乾燥状態で安定性をみたもので、本質的
に本発明と異る。またキレート剤をGOTの測定
用組成物に配合した例（例えば特開昭55−42599、
特公昭41−16534）もあるが、これは発色の安定
性のため、或は低温状態における安定化を計つた
ものであり且スルフヒドリル化合物との併用でな
く本発明と本質的に異る。凍結乾燥状態あるいは
低温状態で安定性があつても室温状態では安定性
がないのが通常である。従つて前述の如き先行技
術によつて本発明が当業者により容易に発明し得
たものではない。低温と室温との安定性に及ぼす
影響の差が甚だ大であることは、例えばイアトロ
アツセイTA―Ｅキツト（ヤトロン社製）GOT測
定試薬では、低温（６〜８℃）では７日間も安定
であるのに室温（25〜30℃）では５時間に過ぎな
い。

本発明におけるGOTの測定原理は前記の第１
反応式及び同第２反応式に基くものでGOTは
NADHの減少速度に比例する。一定温度におけ
る340nmの吸光度の減少を分光光度計により測定
すればGOTの活性が求められる。

なお本発明の組成物中の必須成分であるMDH
の作用は第２反応式等より明白であるが乳酸脱水
素酵素が同じく必須成分であることはこれらの反
応式では理解出来ない。LDHが必須である理由
は次の通りである。

本発明は生体試料中のGOTを測定する為に使
用する組成物に関するものであるが、一般に生体
試料中にはLDHとピルビン酸が含まれる。した
がつて血清にNADHのみを添加してもLDHによ
つてピルビン酸とNADHから乳酸とNADが生成
される。即ち次の第３反応式が進行する。

ピルビン酸＋NADHLDH ――→ 乳酸＋NAD 本来は前記第２反応式即ち オキザロ酢酸＋NADHMDH ――→ リンゴ酸＋NAD によるNADHの減少を測定することにより、
GOTの活性を測定するべきところであるが、第
３反応式によるNADHの減少も測定してしまう。

そこでGOT測定試薬（試薬１）中に予めLDH
を添加することにより、短時間のうちに前記の第
３反応式を進行せしめ、その後に第２反応式だけ
によるNADHの減少を測定する。

又前記の第１反応式により、Ｌ―アスパラギン
酸とα―ケトグルタル酸からGOTの作用により
生ずるオキザロ酢酸は、不安定で反応中に非酵素
的に脱炭酸分解してピルビン酸変換し負の誤差の
原因となる。この負の誤差を防ぐ為にもLDHを
加える必要がある。

オキザロ酢酸＋NADHMDH ――→ リンゴ酸＋NAD 〓 −CO₂ ピルビン酸＋NADHLDH ――→ 乳酸＋NAD 以上を要約すると生体試料中にLDH及びピル
ビン酸が含まれている為の正誤差、及び生成する
オキザロ酢酸が不安定で反応中に非酵素的に分解
し、ピルビン酸に変換することによる負の誤差を
防止するためにLDHをGOT測定用試薬に加える
要がある。

なお本発明の組成物に使用するMDHは微生物
起源のもの例えば酵母起源のものが好ましい。そ
の理由は本発明のGOT測定用組成物に微生物起
源のMDHを用いると、その寿命は室温において
10日以上あるが、動物臓器起源のMDHを用いる
と２日後に活性が50％低下する場合が多いからで
ある。一方本発明に使用するLDHはあらゆる起
源のもの、即ち、動物起源のもの微生物起源のも
の等が使用出来る。

MDH及びLDHを含む溶液の安定化に、特に室
温における安定化に、スルフヒドリル化合物及び
キレート剤を添加すると、良好な結果が得られる
ことに関する公知技術は、全く知られていなかつ
た。本願発明者らは、測定系に悪影響を与えない
化合物を種々調査研究した結果、スルフヒドリル
化合物及びキレート化合物を添加すると、MDH
及びLDHを含む溶液が室温で安定化できること
を見出したのである。

本発明で使用する殺菌剤、スルフヒドリル化合
物、キレート剤は水溶性であつて、340nmにおけ
る吸収の余りない（UV法によるGOTの測定に大
きな妨害を与えない）ものであればいずれも使用
できる。

本発明に使用することのできる殺菌剤は、たと
えばアルカリ金属のアジ化物、メチレングルタロ
ニトリルの臭化物、種種の抗生物質等である。

又本発明に使用されるスルフヒドリル化合物に
は、たとえば還元型グルタチオン、システイン、
Ｎ―アセチルシステイン、チオラクトイルグリシ
ン（以下略す場合はTLGと表す）、チオリンゴ
酸、チオグリセロール等を挙げることができる。

本発明に使用するキレート剤は、たとえばエチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコ
ールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）等であ
る。

本発明組成物のキレート剤の濃度は0.01〜
50mM、スルフヒドリル化合物の濃度は0.01〜
100mMである。他の成分の好ましい濃度範囲は
次の通りである。

MDH 0.1〜5u／ml LDH 0.1〜5u／ml α―ケトグルタル酸 1.0〜50mM 緩衝剤 0.025〜0.25M 殺菌剤 0.1〜30mM なお本組成物と共に使用するNADH及びＬ―
アスパラギン酸の好適な濃度はそれぞれ0.1〜
0.5mM濃度及び0.05〜1.5M濃度である。又これ
らの各成分の分散性を良好にする為非イオン性界
面活性剤を添加するのが好ましいが、その好適濃
度は０〜0.1重量％である。

本発明組成物におけるスルフヒドリル化合物の
濃度範囲は前記の通り0.01〜100mMであるが、
この範囲を下廻るとその効果が大きく減じ上廻る
とLDHのみならずMDHの活性をも大きく減ず
る。スルフヒドリル化合物についてチオリンゴ酸
の場合好ましい濃度は0.01〜0.5mM、Ｎ―アセチ
ルシステイン（NACと略称する）やTLG及び還
元型グルタチオンの場合は、好ましい濃度は0.01
〜10mMの範囲である。

本発明に用いる緩衝剤はPH5.5〜9.0の範囲の
一部又は全部で緩衝能のあるもののうち、340nm
に余り吸収かなく、UV法によるGOTの測定に大
きな妨害を与えないものであればよい。

上記のMDH及びLDH両酵素の活性測定は
Methods of Enzymatic Analysis（2nd.Eng.Ed.1
巻485，２巻574）Academic Press（1974）に記
載の方法に準じて行なつた。ただし測定温度は30
℃とした。具体的にはMDHについては前記の第
２反応式、LDHについては次の第３反応式 ピルビン酸＋NADHLDH ――→ 乳酸＋NAD に基きNADHの340nm吸収の減少速度を測定し
て酵素を定量する。

次に本発明組成物の実施例を挙げ、その組成物
の安定性等について説明する。

実施例 α―ケトグルタル酸 15mM チオラクトイルグリソン 1mM EDTA 3mM アジ化ナトリウム 0.02重量％ （重量％はトリス緩衝液に対する値以下同
様） トリトンＸ―100 0.01重量％ （ロームアンドハース社製） 酵母起源MDH 1.5u／ml （ｕ／はトリス緩衝液における値以下同
様） ブタ心臓起源LDH 1.5u／ml 以上各成分をPH7.8の0.1Mトリス（ヒドロキ
シメチルアミノ）メタン塩酸緩衝液（以下トリス
緩衝液と略称）に加えこの液を試薬１とする。こ
の試薬１が本発明組成物の実施例である。なおト
リトンＸ―100は本発明組成物の必須成分でない
が本発明の実施態様として加えられている。

この実施例の試薬１を調製し27℃に保存し、調
製後12日迄その成分であるLDHの活性を測定し
た結果、第１図の線No.１で示す。なおこの実施例
の組成物からチオラクトイルグリシンを欠いた試
料について同様に試験し、LDHの活性を測定し
た結果、第１図の線No.２で示す。第１図に示めさ
れている通り試薬１中のLDHの活性は27℃にお
いて10日以上にわたつて安定である。

次にNADH4mM、アジ化ナトリウム0.02重量
％、トリトンＸ―100 0.01重量％、EDTA2mM
を１重量％NaHCO₃溶液に加えこれを試薬２と
する。上記の重量％はNaHCO₃溶液中の値であ
る。またＬ―アスパラギン酸1M、アジ化ナトリ
ウム0.02重量％（トリス緩衝液に対する値以下同
様）、トリトンＸ―100の0.01重量％を0.1M濃度
PH7.8のトリス緩衝液に加えこれを試薬３とす
る。

ヒトの血清を検体として採取し27℃に保ち、こ
の血清（0.05ml）に27℃に保存した上記試薬１
（0.4ml）及び試薬２（0.03ml）を加え撹拌し、５
分後にその340nmの吸光度を測定し、更に手ばや
くその検体に27℃の第３試薬（0.12ml）を加えて
撹拌し、それから10分後に検体の340nmの吸光度
を測定し、両測定値及びその経過時間（10分間）
から検体血清中のGOTを算出したところ、
700u／の値を得た。同じ血清につき上記と同
じ各試薬を使用し同じ方法で６日後及び12日後に
測定したところ同じ測定値を得た。

上記の試薬１、試薬２及び試薬３を使用し、コ
ントロール血清によるGOTの活性を30℃で測定
した。其の結果を第２図に示す。縦軸がGOTの
活性（ｕ／）であり横軸はコントロール血清の
使用量を表す。第２図に示めされる通り、
1400u／迄直線性を示す。

又上記の試薬１、試薬２及び試薬３を使用し、
コントロール血清を使用し、市販のUV法GOT測
定用試薬キツトとの測定値の相関を検討した結果
第３図に示す通りの結果を得た。第３図の縦軸は
試薬１、試薬２及び試薬３を使用して得た値
（ｕ／）であり、横軸が市販キツトの試薬を使
用して得た値（ｕ／）である。両者はよく一致
している。なお使用した市販キツトはフジサワキ
ツトである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明組成物である試薬１及び試薬１
の組成物よりスルフヒドリル化合物であるチオラ
クトイルグリシンを欠いた組成物の調整後27℃に
保存した場合その組成物中のLDHの安定性を示
す図である。第２図はコントロール血清を検体と
して本発明組成物を使用してGOT活性を測定し
た結果を示す図である。縦軸はGOTの活性ｕ／
を横軸は血清量を示す。第３図はコントロール
血清による本発明組成物を使用したものとGOT
測定用市販キツトの試薬を使用して得たGOTの
活性測定結果の相関を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 還元型ベーターニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチド（NADH）及びＬ―アスパラギン酸
   の両者と共にグルタミン酸オキザロ醋酸トランス
   アミナーゼ（GOT）の測定用に供するものであ
   つて、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、α
   ―ケトグルタル酸、スルフヒドリル化合物、キレ
   ート剤、殺菌剤及びPH緩衝剤を含み、上記スル
   フヒドリル化合物が0.01〜100mM、キレート剤
   が0.01〜50mMの範囲の濃度にあることを特徴と
   するGOT測定用組成物。