JP3217172B2 - Ｌ−フコースの定量方法 - Google Patents
Ｌ−フコースの定量方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査試薬に用いら
れるＬ−フコースの定量法に関する。
れるＬ−フコースの定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】尿中のＬ−フコースは悪性腫瘍、胃潰
瘍、肝硬変等において上昇することが知られており、Ｌ
−フコースの定量は上記疾患の無痛検査法として臨床診
断の場での利用が期待されている（日本臨床、第４８
巻、１０２５−１０２７頁、１９９０年増刊号、日本臨
床社刊）。
瘍、肝硬変等において上昇することが知られており、Ｌ
−フコースの定量は上記疾患の無痛検査法として臨床診
断の場での利用が期待されている（日本臨床、第４８
巻、１０２５−１０２７頁、１９９０年増刊号、日本臨
床社刊）。
【０００３】Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ〔Ｅ．Ｃ．
１．１．１．１２３〕は補酵素ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の存在下Ｌ−フコ
ースを酸化しＬ−フコノ−１．５−ラクトン及び還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）ま
たは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰＨ）を産生する酵素で、微生物及び動物体
内に存在が認められている〔アグリカルチャルバイオロ
ジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．），第５３巻，１４９３−１５０１頁，１９８９
年〕。ＮＡＤ依存性のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの
性質を利用した分析試料中のＬ−フコースの定量方法が
知られている（特開昭６２−１７５１９７号公報）。
１．１．１．１２３〕は補酵素ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の存在下Ｌ−フコ
ースを酸化しＬ−フコノ−１．５−ラクトン及び還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）ま
たは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰＨ）を産生する酵素で、微生物及び動物体
内に存在が認められている〔アグリカルチャルバイオロ
ジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．），第５３巻，１４９３−１５０１頁，１９８９
年〕。ＮＡＤ依存性のＬ−フコースデヒドロゲナーゼの
性質を利用した分析試料中のＬ−フコースの定量方法が
知られている（特開昭６２−１７５１９７号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】臨床検査で汎用されて
いる自動分析機で酵素反応を用いた定量法を行うために
は、定量に使用する酵素反応が飽和するまでの時間が５
分以内であることが好ましい。従来のＬ−フコースデヒ
ドロゲナーゼを用いたフコースの定量法は、該酵素反応
が飽和するまでの時間が長すぎて、自動分析機に使用で
きなかった。
いる自動分析機で酵素反応を用いた定量法を行うために
は、定量に使用する酵素反応が飽和するまでの時間が５
分以内であることが好ましい。従来のＬ−フコースデヒ
ドロゲナーゼを用いたフコースの定量法は、該酵素反応
が飽和するまでの時間が長すぎて、自動分析機に使用で
きなかった。
【０００５】本発明により、酵素反応が飽和するまでの
時間が５分以内と短く自動分析機に使用可能なＬ−フコ
ースの定量法が提供される。
時間が５分以内と短く自動分析機に使用可能なＬ−フコ
ースの定量法が提供される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のＬ−
フコースに、ＮＡＤまたはＮＡＤＰおよびリン酸イ
オン、アンモニウムイオンまたはピロリン酸イオンの存
在下、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰの減少量あるいはＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨの生成量を測定することを特徴とするＬ−フコー
スの定量方法に関する。
フコースに、ＮＡＤまたはＮＡＤＰおよびリン酸イ
オン、アンモニウムイオンまたはピロリン酸イオンの存
在下、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰの減少量あるいはＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨの生成量を測定することを特徴とするＬ−フコー
スの定量方法に関する。
【０００７】具体的には水性媒体中に、該酵素、補酵素
および各種イオンを加え、これにＬ−フコースを含有す
る試料を加えて反応させ、反応液の吸光度の変化を測定
することにより、Ｌ−フコースを定量することができ
る。
および各種イオンを加え、これにＬ−フコースを含有す
る試料を加えて反応させ、反応液の吸光度の変化を測定
することにより、Ｌ−フコースを定量することができ
る。
【０００８】水性媒体としてはトリス塩酸緩衝液、ビシ
ン緩衝液、グッドの緩衝液、シュウ酸緩衝液、マレイン
酸緩衝液、グリシン緩衝液、マロン酸緩衝液、クエン酸
緩衝液等を用い、該緩衝液はアルブミン等の安定化剤、
塩化ナトリウム等の塩類、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）等のキレート剤、アラニン等のアミノ酸、ポリ
エチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエ
ーテル〔ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標名）〕等の界面
活性剤等を含有していてもよい。
ン緩衝液、グッドの緩衝液、シュウ酸緩衝液、マレイン
酸緩衝液、グリシン緩衝液、マロン酸緩衝液、クエン酸
緩衝液等を用い、該緩衝液はアルブミン等の安定化剤、
塩化ナトリウム等の塩類、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）等のキレート剤、アラニン等のアミノ酸、ポリ
エチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエ
ーテル〔ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標名）〕等の界面
活性剤等を含有していてもよい。
【０００９】反応液に存在させる各イオンの濃度は、リ
ン酸イオン０．０４Ｍ〜１Ｍ、アンモニウムイオン０．
０１Ｍ〜１Ｍ、ピロリン酸イオン０．０１Ｍ〜１Ｍであ
る。
ン酸イオン０．０４Ｍ〜１Ｍ、アンモニウムイオン０．
０１Ｍ〜１Ｍ、ピロリン酸イオン０．０１Ｍ〜１Ｍであ
る。
【００１０】リン酸イオン、アンモニウムイオンまたは
ピロリン酸イオンは反応液中に単独または組み合わせて
存在すればよく、反応液中にリン酸イオン、アンモニウ
ムイオンまたはピロリン酸イオンの供給源を添加すれば
よい。
ピロリン酸イオンは反応液中に単独または組み合わせて
存在すればよく、反応液中にリン酸イオン、アンモニウ
ムイオンまたはピロリン酸イオンの供給源を添加すれば
よい。
【００１１】リン酸イオンの供給源としては、リン酸ア
ンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸一カリ
ウム、リン酸二カリウム、リン酸鉄、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸
マグネシウムアンモニウム、リン酸リチウム等が挙げら
れる。
ンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸一カリ
ウム、リン酸二カリウム、リン酸鉄、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸
マグネシウムアンモニウム、リン酸リチウム等が挙げら
れる。
【００１２】アンモニウムイオンの供給源としては、硝
酸アンモニウム、亜硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ア
ンモニウム、フタル酸水素アンモニウム、臭化アンモニ
ウム等があげられる。
酸アンモニウム、亜硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ア
ンモニウム、フタル酸水素アンモニウム、臭化アンモニ
ウム等があげられる。
【００１３】ピロリン酸イオンの供給源としては、ピロ
リン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸リ
チウム、ピロリン酸アンモニウム、ピロリン酸マグネシ
ウム等があげられる。
リン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸リ
チウム、ピロリン酸アンモニウム、ピロリン酸マグネシ
ウム等があげられる。
【００１４】本発明に用いられるＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼとは、〔Ｅ．Ｃ．１．１．１．１２３〕に属す
る酵素であればどのようなものでもよく、動物、微生
物、植物等から得られたもの、またはそれらの遺伝子を
用いて、微生物もしくは動物細胞から遺伝子工学の手法
により生産されたものでもよい。
ゲナーゼとは、〔Ｅ．Ｃ．１．１．１．１２３〕に属す
る酵素であればどのようなものでもよく、動物、微生
物、植物等から得られたもの、またはそれらの遺伝子を
用いて、微生物もしくは動物細胞から遺伝子工学の手法
により生産されたものでもよい。
【００１５】補酵素としては、ＮＡＤまたはＮＡＤＰが
使用される。本発明において試料中のＬ−フコースの量
は、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの作用で消費される
補酵素量と対応するので、該酵素反応におけるＮＡＤも
しくはＮＡＤＰの減少量またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈの生成量を測定することにより、Ｌ−フコース量を定
量することができる。
使用される。本発明において試料中のＬ−フコースの量
は、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの作用で消費される
補酵素量と対応するので、該酵素反応におけるＮＡＤも
しくはＮＡＤＰの減少量またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈの生成量を測定することにより、Ｌ−フコース量を定
量することができる。
【００１６】ＮＡＤもしくはＮＡＤＰの減少量の測定法
としては、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの４６０ｎｍ、（励起
光３４０ｎｍ）における蛍光強度を測定する方法等があ
げられる。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を測定す
る方法としては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの持つ３４
０ｎｍにおける吸光度を測定する方法があげられる。ま
た以上の直接的な測定法以外に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨをテトラゾリウム塩と反応させて生成するホルマザ
ン色素の吸光度を測定する方法、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨおよび電子伝達体を経由して酸素に受容させること
により生成した過酸化水素量を測定する方法（特公昭６
３−２４８３９９号）、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから
ダイアホラーゼ（ＥＣ．１．６．９９）およびスーパー
オキサイドディスムターゼ（ＥＣ．１．１５．１．１）
を介して生成した過酸化水素量を測定する方法（特公平
１−１２８７９９号）等を用いることが可能である。
としては、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの４６０ｎｍ、（励起
光３４０ｎｍ）における蛍光強度を測定する方法等があ
げられる。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を測定す
る方法としては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの持つ３４
０ｎｍにおける吸光度を測定する方法があげられる。ま
た以上の直接的な測定法以外に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨをテトラゾリウム塩と反応させて生成するホルマザ
ン色素の吸光度を測定する方法、ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨおよび電子伝達体を経由して酸素に受容させること
により生成した過酸化水素量を測定する方法（特公昭６
３−２４８３９９号）、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから
ダイアホラーゼ（ＥＣ．１．６．９９）およびスーパー
オキサイドディスムターゼ（ＥＣ．１．１５．１．１）
を介して生成した過酸化水素量を測定する方法（特公平
１−１２８７９９号）等を用いることが可能である。
【００１７】以下に本発明方法をより詳細に説明する。
０．００５〜２Ｍ緩衝液（ｐＨ４〜１２）中にＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ０．１〜１００単位／ｍｌ、補酵
素０．０１〜２５ｍｇ／ｍｌ、リン酸イオン、アンモニ
ウムイオンまたはピロリン酸イオン等を０．０１〜１Ｍ
含有させて試薬液とする。これにＬ−フコースを含有す
る試料を加えて５〜５０゜Ｃ、好ましくは２５〜４０゜
Ｃで反応させる。反応時間は５分以内である。反応後、
例えば反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定する
等、前記した適当な測定方法により、試料中のＬ−フコ
ースを定量する。
０．００５〜２Ｍ緩衝液（ｐＨ４〜１２）中にＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ０．１〜１００単位／ｍｌ、補酵
素０．０１〜２５ｍｇ／ｍｌ、リン酸イオン、アンモニ
ウムイオンまたはピロリン酸イオン等を０．０１〜１Ｍ
含有させて試薬液とする。これにＬ−フコースを含有す
る試料を加えて５〜５０゜Ｃ、好ましくは２５〜４０゜
Ｃで反応させる。反応時間は５分以内である。反応後、
例えば反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定する
等、前記した適当な測定方法により、試料中のＬ−フコ
ースを定量する。
【００１８】以下に本発明の実施例を示す。
【００１９】
【実施例】実施例１ 分光光度計（日立２２８型）中に装着したセル中に、
０．１Ｍのリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン
酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニ
ウム、ピロリン酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ムまたは硝酸アンモニウム（対照は添加物無し）、０．
５％ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフ
ェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ＮＡＤ
Ｐ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）およびＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼ１０単位／ｍｌを含有した０．０５Ｍビシン緩
衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌを加えた。該溶液を３７℃で
５分間加温した後、０．００１５Ｍα−Ｌ−（−）−フ
コース０．０５ｍｌを加え、該酵素反応の継時変化を３
４０ｎｍにおける吸光度により測定した。得られた酵素
活性の継時変化から酵素反応が飽和するまでの時間を測
定した。結果を第１表に示す。
０．１Ｍのリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン
酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニ
ウム、ピロリン酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ムまたは硝酸アンモニウム（対照は添加物無し）、０．
５％ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフ
ェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ＮＡＤ
Ｐ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）およびＬ−フコースデヒドロ
ゲナーゼ１０単位／ｍｌを含有した０．０５Ｍビシン緩
衝液（ｐＨ８．０）３ｍｌを加えた。該溶液を３７℃で
５分間加温した後、０．００１５Ｍα−Ｌ−（−）−フ
コース０．０５ｍｌを加え、該酵素反応の継時変化を３
４０ｎｍにおける吸光度により測定した。得られた酵素
活性の継時変化から酵素反応が飽和するまでの時間を測
定した。結果を第１表に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】第１表によれば、リン酸イオン、アンモニ
ウムイオンまたはピロリン酸イオンの存在下では、Ｌ−
フコースデヒドロゲナーゼ反応が５分以内で飽和するこ
とが理解される。
ウムイオンまたはピロリン酸イオンの存在下では、Ｌ−
フコースデヒドロゲナーゼ反応が５分以内で飽和するこ
とが理解される。
【００２２】実施例２ ０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、
０．０６、０．０７、０．０８、０．０９または０．１
Ｍのリン酸一カリウムを用いる以外は実施例１と同様に
して酵素反応が飽和するまでの時間を算出した。結果を
第２表に示す。
０．０６、０．０７、０．０８、０．０９または０．１
Ｍのリン酸一カリウムを用いる以外は実施例１と同様に
して酵素反応が飽和するまでの時間を算出した。結果を
第２表に示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】第２表によれば、リン酸イオン濃度０．０
４Ｍ以上でＬ−フコースデヒドロゲナーゼ反応が５分以
内で飽和することが理解される。
４Ｍ以上でＬ−フコースデヒドロゲナーゼ反応が５分以
内で飽和することが理解される。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、自動分析機でも使用可能
なフコースの定量方法が提供される。
なフコースの定量方法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66
Claims (4)
- 【請求項１】 試料中のＬ−フコースに、ＮＡＤまた
はＮＡＤＰおよびアンモニウムイオンまたはピロリン
酸イオンの存在下、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを作
用させ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの減少量あるいはＮＡＤ
ＨまたはＮＡＤＰＨの生成量を測定することを特徴とす
るＬ−フコースの定量方法。 - 【請求項２】 試料中のＬ−フコースに、ＮＡＤまた
はＮＡＤＰおよび０．０１Ｍ〜１Ｍアンモニウムイオ
ンまたは０．０１Ｍ〜１Ｍピロリン酸イオンの存在下、
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤまた
はＮＡＤＰの減少量あるいはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
の生成量を測定することを特徴とするＬ−フコースの定
量方法。 - 【請求項３】 Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰおよびアンモニウムイオンまたはピ
ロリン酸イオンを含有することを特徴とする、Ｌ−フコ
ース定量用試薬。 - 【請求項４】 Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼが０．１
〜１００単位／ｍｌ、ＮＡＤまたはＮＡＤＰが０．０１
〜２５ｍｇ／ｍｌおよびアンモニウムイオンまたはピロ
リン酸イオンが０．０１〜１Ｍである請求項３記載の定
量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01862393A JP3217172B2 (ja) | 1993-02-05 | 1993-02-05 | Ｌ−フコースの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01862393A JP3217172B2 (ja) | 1993-02-05 | 1993-02-05 | Ｌ−フコースの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225795A JPH06225795A (ja) | 1994-08-16 |
| JP3217172B2 true JP3217172B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=11976756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01862393A Expired - Fee Related JP3217172B2 (ja) | 1993-02-05 | 1993-02-05 | Ｌ−フコースの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3217172B2 (ja) |
-
1993
- 1993-02-05 JP JP01862393A patent/JP3217172B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06225795A (ja) | 1994-08-16 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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