JPH01112999A - グルコース測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素を含むグルコース測定用組成物に関する
。

尿や血液など体液中のグルコースの定量は、各種疾患の
診断、たとえば糖尿病の診断や治療、経過の観察あるい
は低血糖症の発見に利用されるきわめて重要な臨床検査
項目の一つである。

従来から、生体試料中のグルコースの定量法としては、
グルコースの還元力を利用した各種の化学的方法が利用
されて来たが、反応試薬が発癌性を有すること等のため
に、最近では酵素法が繁用されるに至った。

酵素法としては、グルコースオキシダーゼ法およびヘキ
ソキナーゼ法などがもちいられている。

然し酵素は一般にきわめて不安定であり、測定状態で保
存する時、グルコースオキシダーゼ法の市販のキットを
用いた場合は３日間程度、ヘキソキナーゼ法の市販のキ
ットを用いた場合は１日しか有効に活性を保持し得ない
。

従って、マルチチャンネルの自動分析機にかけた試薬溶
液を、頻繁に交換しなければならず、煩雑で手間がかか
り且つ試薬のロスも大きい。それ故、これらの欠点を解
決する方策が強く望まれている。

本発明者らは、かかる要請に答えるため、安定性の高い
、長期間保存可能な試薬を検索したところ、スルフヒド
リル化合物及び／又はキレート剤並びにＡＴＰ、ＮＡＤ
、Ｍｇイオン、ＨＫ、ＮＡＤを補酵素とし得るグルコー
ス−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、殺菌剤
及びｐＨ緩衝剤を含む組成物が、極めて安定であり、こ
れを用いてこれと検体とを混合し、室温にて１定時間放
置１＆３４０ｎｍの吸光度を測定することにより、検体
中のグルコースの正確な定量が可能であり、且つ該組成
物の水溶液の室温における寿命が従来の市販のキットの
ものに比し著しく延長されることを見出し本発明を完成
した。

即ち、本発明は、「スルフヒドリル化合物及び／又はキ
レート剤並びにＡＴＰ％ＮＡＤ、Ｍｇイオン、ＨＫ、０
６ＰＤＨ，ＲＷＪ剤及ｄｐＨ１ｉｋ１１ｉ１剤を含む水
溶液であることを特徴とし、上記スルフヒドリル化合物
は１〜５０ｍＭ濃度、キレート剤は０．１〜２０ｍＭ濃
度であるグルコース測定用組成物、」である。

但し上記のＡＴＰはアデノシントリフオスフエートヲ、
ＮＡＤは酸化型ベータニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドを、ＨＫはヘキソキナーゼを、Ｇ６ＰＤＨはＮＡ
Ｄを補酵素とし得るグルコース−６−燐酸デヒドロゲナ
ーゼを８味する。

本発明の目的は、水に溶解後室温においても寿命の長い
グルコース定量用の組成物を提供し、グルコース定量を
焼串化するにある。

本発明の組成物の各成分のい好ましい濃度は、次の通り
である。ｐＨ緩衝剤０．０２５〜０．２５Ｍ濃度、ＡＴ
Ｐｏ、４〜５ｍＭ濃度、Ｍｇイオン１〜２５ｍＭ濃度、
ＨＫｏ、３＝５ｕ／ｍ１、Ｇ６　ＰＤＨ０，３〜５　ｕ
／ｍｅ、Ｒ菌剤Ｑ、１〜３０ｍＭ１度、スルフヒドリル
化合物１〜５０ｍＭ濃度、キレート剤０．１〜２０ｍＭ
濃度、又さらに使用時に非イオン性界面活性剤を０〜０
．　１重量％添加することが好ましい。

この他に、本発明の組成物にアルブミン等の蛋白質、糖
、糖アルコール及びグリセロールの如きポリオール類等
の凍結乾燥安定剤を加えることも出来る０本発明の組成
物に加えるｐＨ１ｌ街剤は、使用時においてＰＨ６，５
〜８．５の範囲の一部または全部に緩衝簡のあるものが
好ましい。

本発明の思想は、異なった観点からは、前記の本発明組
成物の水溶液を使用して検体中のグルコースを分析する
方法、として把握することも出来る。

本発明に係わるグルコース定量の原理を式で示せば次の
通りである。

グルコース定量ＴＰ＃り７レコースー６−ｊＪ［＋＾Ｏ
Ｐヘキソキナーゼ グルコース−６−燐酸＃６−ホスホグルコン酸＋Ｎ／１
０　　７　　　　　　　　　＋Ｎ＾０１！グルコースー
６−燐酸 デヒドロゲナーゼ 上記の反応式においＮ八りは、酸化型ベータニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドを表す、又ＮＡＤＨは、還
元型ベータニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを表
す。

上記の反応により、グルコースが消費され、グルコース
の減少量はＮＡＤＨの生成量に等しい。

従ってＮＡＤＨの示す３４Ｑｎｍにおける吸光度増加量
を、分光光度計により測定し、検体中のグルコース濃度
を測定することが出来るのである。

上記のグルコース測定方法は、ヘキソキナーゼ法（）Ｉ
Ｋ法と略称される）と呼ばれ、グルコース定量法として
、 ■　グルコースに対する特異性が高い。

■　正確で検量線を必要としない。

■　妨害が少ない。

■　迅速に行える。

等の長所を有する優れた測定法である。然しなから、測
定に使用される液の組成が不安定で、室温において、長
時間保存出来ない大きな欠点があった。

この課題を兄事に解決したのが本発明であって、スルフ
ヒドリル化合物及び／又はキレート剤並びに殺菌剤及び
ｐＨ緩衝剤を存在させることにより、上記分析用の液の
保存安定性が顕著に改善され、室温における寿命が延長
された。

従来、一般に酵素を生体より精製する際に、各種のスル
フヒドリル化合物、あるいはキレート剤が使用されてき
ている。これは、冷却下に生体細胞を摩砕して酵素を取
り出す際、及び酵素の精銅、保存時酵素が破壊されるこ
とを防ぐ為に用いられるのである。従って、この様に酵
素製造時にスルフヒドリル化合物又はキレート剤が使用
されることが知られていても、グルコースをヘキソキナ
ーゼ法により定量する際に、測定液の寿命を延長する効
果を有することは、全く予想されなかったことである。

又スルフヒドリル化合物又はキレート剤を、酵素を製造
する際に使用することがあるので、本発明の組成物に用
いられるヘキソキナーゼ又は６６ＰＤＨに、これらの化
合物が随伴する回部性が考えられないでもない、然しな
がら、実際上は酵素を製造する際に使用されるこれら化
合物の量は、酵素の量に見合う程度の量であり、これら
を用いてグルコース測定用組成物をｍ製する場合には、
スルフヒドリル化合物及び／又はキレート剤は、他の成
分により希釈されて本発明の組成物において必要な濃度
の範囲外になり、本発明組成物の如き寿命を延長する効
果は見出されない、このことは、市販の多数のＨＫ法グ
ルコース分析用キットにつき、ランダムに調べた結果裏
付けられた。

本発明の効果は、第１に当該組成物が室温状態において
、長時間寿命を保つ点にある０本発明の第２の効果とし
て、ブランクの吸光度が安定していて、測定精度を向上
させる特長があるが、これも重要である。ヘキソキナー
ゼ法でグルコースを分析する場合、スルフヒドリル化合
物及び／又はキレート剤が存在しないと、試薬ブランク
の吸光度が大きく経時的に変化し、測定値がバラつく原
因となる。

本発明においては、スルフヒドリル化合物又はキレート
剤の何れかが存在するだけでも良いが、両者が存在する
場合が特に効果が著しい、又本発明の組成物の使用時に
おけるスルフヒドリル化合物及びキレート剤の好ましい
濃度は、前述の如くそれぞれ１〜５０ｍＭ濃度及び０．
１〜２０ｍＭ濃度である。

本明細書に記載されている室温、とは、特に記載がない
限り０〜３０℃を意味する。

本発明の組成物を使用して、検体中のグルコースを測定
する原理については既に述べた。実際グルコースを測定
するには、本発明の組成物の水溶液と検体とを混合して
、室温で一定時間放Ｗｌｔ＆、生成するＮＡＤＨの３４
０ｎｍの吸光度を測定する。

従って、本発明の組成物に用いる諸化合物、殺菌剤、ｐ
Ｈ緩衝剤等は、勿論添加される非イオン性界面活性剤、
凍結乾燥安定剤等に３４０ｎｍの吸光度測定を著しく妨
害するものがあってはならない、勿論、これらの諸成分
において３４０ｎｍに吸収があっても、ブランクテスト
値を差し引くことにより、グルコース分析値の測定に実
際上形響を及ぼさぬ範囲であれば差し支えない。

本発明の組成物に加える好ましい殺菌剤の例としては、
アルカリ金属のアジ化物、メチレンゲルタロニトリルの
臭化物等が挙げられる０本発明の組成物に用いられるス
ルフヒドリル化合物を例示すれば、還元型グルタチオン
、システィン、Ｎ−アセチルシスティン、チオラクトイ
ルグリシン、チオリンゴ酸、チオグリセロールである。

又本発明の組成物に用いられる、キレート剤を例示すれ
ば、ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢！１１）、ＥＧ
ＴＡ（エチレングリコールエーテルジアミン四酢ｆ１１
）である、これらの例示化合物は、何れも３４Ｑｎｍに
おけるグルコース測定に大きな妨害を与えない。

本発明に使用されるヘキソキナーゼは、ＢｅｒｇｍＶｅ
ｒ　　編、　”Ｍｅｔｈｏｄ　　ｏｆ　　　Ｅｎｚｙ＊
ａｔｉｃ　　Ａｒ＋ａｌｙｓｉｓ’　　２ｎｄ。

Ｅｎｇｌ、　Ｅｄ、　　１巻　ｐ　４７３＋　ｐ４５９
　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７４）に、又
ＮＡＤを補酵素とし得るＧ６ＰＤＨは、Ｗｏｏｄ　　編
、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’　
４１＠　ｐ１９６＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１
９７５）に＄を処して測定することが出来る。これらの
測定法は、今日当業者が常時使用するありふれたもので
ある。

本明細書のヘキソキナーゼ及びＧ６ＰＤＨのデータは、
上記の測定法によって裏付られたものである。但し測定
温度は３０℃を用いた。

なお補の組成物の実際の状態は、水溶液である、以下実
施例及び比較例をあげ、本発明を具体的に示す、又これ
らの実施例及び比較例の成るものについては、それらの
組成物を使用して検体のグルコースを測定した結果等を
述べる。

実施例　ｌ Ａ、ＴＰ　　２ｍＭ濃度、ＮＡＤ　　１ｍＭｆｉ度、酢
酸マグネシウム１０ｍＭ濃度、Ｎ−アセチルシスティン
１０ｍＭ濃度、ＥＤＴＡ２ｍＭ濃度、アジ化ナトリウム
３ｍＭ１度、トリトンＸ１００　０．０１重量％、酵母
＄Ｉ　ＨＫ　ｌ　ｕ　／　ｍ’　ｌｌ及び乳酸菌１！Ｇ
６ＰＤＨｌｕ／ｍｊ！を含む０．１Ｍ１１１度トリス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸１ｉｆｆｘ液（ｐ
　Ｈ７，５）を実施例１の組成物とする。

上記実施例１の組成物を２６℃に保存した。この組成物
即ち液体試薬を３　ｍ　ｌ採取し、これに検体２０μｌ
を添加し、室温にて１０分後の３４０ｎｍの吸光度を測
定し、上記液体試薬の３４０ｎｍの吸光度（ブランク値
）を差し引いて検体中のグルコースを測定した。なおこ
の測定法を終末法と呼ぶことがある。

その結果を第１図のｌ１ｍ１に示す。

このｌｌ＆ｌＩの線に示される通り、１０日以上にわた
って測定値は同一の値を示した。この際の試薬ブランク
値（液体組成物に検体を加えない以外は、検体を加えた
ものと同じ条件で測定した値、以下同様）を、第１図の
隆２に示す、このブランク値も、１０日以上にわたって
一定の測定値を示し安定であった。

比較例　ｌ 市販のヘキソキナーゼ法グルコース定量用試薬キット（
藤沢メディカルサプライ社製ｕｖ用グルコース；スルフ
ヒドリル化合物及びキレート剤の何れも有効量は含まれ
ていない）を、所定の水に溶解し、これにアジ化ナトリ
ウムを３ｍＭ濃度になる様に添加した組成物を、室温（
２６℃）にて保存した。この液を用いて実施例１と同様
にしてグルコースを測定した。その結果は、第１図の嵐
３の線に示されている。この線によると３８迄に測定値
は大きく減少している。その際の試薬ブランクは、第１
図の胤４の線により示される様に１０日８に急上昇して
いる。

参考例　ｌ 前記の実施例１の組成物を使用し、種々のグルコース濃
度の検体につき、実施例１の場合と同様にしてグルコー
スの量を測定し、そのデータをグラフにプロットした。

その結果、吸光度と濃度との間に第２図に示す通りの直
線関係を得た。

又種々のグルコース濃度の検体につき、本発明の組成物
を使用した場合と、比較例１で用いたのと同じ市販のヘ
キソキナーゼ法グルコース定量用キットを使用した場合
の、測定値を比較した結果を第３図に示す。但し上記市
販のキットを使用した場合は、グルコース分析用の液体
組成物を調製したあと、数時間以内に全ての測定を終了
している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の組成物又は比較試薬を用いて行った
、グルコースの測定値及び試薬ブランクの経口変化を示
す図である。 第２図は、実施例１の組成物を使用して、検体中のグル
コース濃度（横軸）と３４０　ｎｍ吸光度（縦軸）の間
の直線性を示す図である。第３図は、本発明の組成物を
使用した場合（縦軸）と、市販へキンキナーゼ法グルコ
ース定量キットを使用して得た吸光度（横軸）の相関を
表す図である。 なお、第１〜３図において、第１図の−２および１１ｋ
Ｌ４以外の吸光度は試薬ブランクを差し引いた値である
。 特許出願人　　三菱油化株式会社 代理人　　弁理士　　堀　正　雄 オ　１　口 身　ｚｌｚ） ；＋　３　■ ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　□、０Ａ３与Ｏ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）スルフヒドリル化合物及び／又はキレート剤並び
   にＡＴＰ、ＮＡＤ、Ｍｇイオン、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、殺
   菌剤及びｐＨ緩衝剤を含む水溶液であることを特徴とし
   、上記スルフヒドリル化合物は１〜５０ｍＭ濃度、キレ
   ート剤は０．１〜２０ｍＭ濃度であるグルコース測定用
   組成物、但し上記のＡＴＰはアデノシントリフオスフェ
   ードを、ＮＡＤは酸化型ベータニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドを、ＨＫはヘキソキナーゼを、Ｇ６ＰＤ
   ＨはＮＡＤを補酵素とし得るグルコース−６−燐酸デヒ
   ドロゲナーゼを意味する。