JPH10309200A - 緩衝液組成 - Google Patents

緩衝液組成

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JPH10309200A
JPH10309200A JP5464698A JP5464698A JPH10309200A JP H10309200 A JPH10309200 A JP H10309200A JP 5464698 A JP5464698 A JP 5464698A JP 5464698 A JP5464698 A JP 5464698A JP H10309200 A JPH10309200 A JP H10309200A
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enzyme
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利明 平山
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アルカリ域緩衝液において、炭酸水素イオン
を放出せしめる炭酸化合物を有効成分として含有せしめ
ることによる安定化された緩衝液組成物を提供する。 【解決手段】 pH8〜11のアルカリ域緩衝液(但
し、炭酸系緩衝液を除く)を用い、主成分としてアルカ
リ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭
酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とす
る緩衝液組成、及び当該緩衝液組成のpH変動の抑制方
法。 【効果】 再現性の良好な酵素的測定用の組成物であ
り、緩衝液の濃度を低減した測定用の組成物となし得
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、pH8〜11のア
ルカリ域緩衝液(但し、炭酸系緩衝液を除く)を用い、
主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵素含
有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化
合物を有効成分とする緩衝液組成、およびpH8〜11
のアルカリ域緩衝液(但し、炭酸系緩衝液を除く)を用
い、主成分としてアルカリ域にて酵素的反応を行なう酵
素含有組成であって、炭酸水素イオンを放出せしめる炭
酸化合物を有効成分として含有せしめることを特徴とす
る当該緩衝液組のpH変動の抑制方法に関する。好まし
くは酵素的測定用の組成において、炭酸水素イオンを放
出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝液組成に関
するものであり、生化学分野における基本的に重要な緩
衝液組成であり、被検液、例えば、生体成分における基
質の測定や酵素活性の測定に重要な技術である。
【0002】
【従来の技術】従来、緩衝液は、生化学反応、例えば酵
素的な基質の測定、基質を用いる酵素活性測定や酵素を
マーカーとした酵素活性測定に基づく免疫測定法などに
おいて、反応媒体のpHの変動を押さえるべく開発さ
れ、有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液または生化学用
緩衝液などの多くの緩衝液が開発されてきた。
【0003】有機アミン系緩衝液としては、例えば、ジ
エタノールアミン緩衝液、2−エチルアミノエタノール
緩衝液、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール、
N−メチル−D−グルカミン等が挙げられる。また、グ
ッド緩衝液としては、例えば、MES(2−(N−Mo
rphilino)ethanesulfonic a
cid)緩衝液、Bis−Tris(Bis(2−hy
droxyethyl)iminotris(hydr
oxymethyl)methane)緩衝液、ADA
(N−(2−Acetamido)iminodiac
etic acid)緩衝液、PIPES(Piper
azine−N,N’−bis(2−ethanesu
lfonic acid)緩衝液、ACES(N−(2
−Acetamido)−2−aminoethane
sulfonic acid)緩衝液、MOPSO(3
−(N−Morpholino)−2−hydroxy
propanesulfonic acid)緩衝液、
BES(N,N−Bis(2−hydroxyethy
l)−2−aminoethanesulfonic
acid)緩衝液、MOPS(3−(N−Morpho
lino)propanesulfonic aci
d)緩衝液、TES(N−Tris(hydroxym
ethyl)methyl−2−aminoethan
esulfonic acid)緩衝液、HEPES
(N−2−hydroxyethylpiperazi
ne−N’−2−ethanesulfonic ac
id)緩衝液、DIPSO(3−[N,N−Bis(2
−hydroxyethyl)amino]−2−hy
droxypropanesulfonic aci
d)緩衝液、TAPSO(N−Tris(hydrox
ymethyl)methyl−2−hydroxy−
3−aminopropanesulfonic ac
id)緩衝液、POPSO(Piperazine−
N,N’−bis(2−hydroxypropane
sulfonic acid)緩衝液、HEPPSO
(N−2−Hydroxyethylpiperazi
ne−N−2−hydroxypropane−3−s
ulfonic acid)緩衝液、EPPS(N−2
−Hydroxyethylpiperazine−
N’−3−propanesulfonic aci
d、別名HEPPS)緩衝液、Tricine(Tri
s(hydroxymethyl)methylgly
cine)緩衝液、Bicine(N、N−Bis(2
−hydroxyethyl)glycine)緩衝
液、TAPS(N−Tris(hydroxymeth
yl)methyl−3−aminopropanes
ulfonic acid)緩衝液、CHES(2−
(Cyclohexylamino)ethanesu
lfonic acid)緩衝液、CAPSO(3−N
−Cyclohexylamino−2−hydrox
ypropanesulfonic acid)緩衝
液、CAPS(3−Cyclohexylaminop
ropanesulfonic acid)緩衝液等が
挙げられる。
【0004】さらに、上記以外の緩衝能を有する生化学
用緩衝液としては、例えば、クエン酸−第2リン酸ナト
リウム系、塩酸−ベロナールナトリウム−酢酸ナトリウ
ム系、第1リン酸カリウム−第2リン酸ナトリウム系、
第1リン酸カリウム−ホウ砂系、第1リン酸カリウム−
水酸化ナトリウム系、塩酸−コリジン系、塩酸−ベロナ
ールナトリウム系、塩酸−トリスアミノメタン系、塩酸
−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナトリウム系、ホウ酸−ホウ
砂系、塩酸−アミノメチルプロパンジオール系、塩化ア
ンモニウム−アンモニア系、グリシン−水酸化ナトリウ
ム系、ホウ酸−水酸化ナトリウム系、塩酸−ジメチルグ
リシンナトリウム系、ホウ砂−水酸化ナトリウム系、ホ
ウ砂−炭酸ナトリウム系、セーレンセン緩衝液、グリシ
ン−塩化ナトリウム−塩酸系、第2クエン酸ナトリウム
−塩酸系、第2クエン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム
系、ホウ砂−塩化ナトリウム系、ミカエリス緩衝液、ベ
ロナールナトリウム−酢酸ナトリウム−塩酸系、クラー
ク−ルブス緩衝液、ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナト
リウム系、アトキンス−パンチン緩衝液、パリティッシ
ュ緩衝液、コルトホフ緩衝液、マックイルベイン緩衝
液、ハスチング−センドロイ緩衝液、ブリトン−ロビン
ソン緩衝液、グッド緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、トリ
ス−マレイン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝液、ベロナー
ル−酢酸塩緩衝液などが挙げられ、何らこれらに限定さ
れるものではない。
【0005】従来の生化学検査、例えば、アルカリフォ
スファターゼの活性測定は、アルカリ域緩衝液としてジ
エタノールアミン緩衝液や2−エチルアミノエタノール
緩衝液等を用いて行われてきたが(臨床化学19
(2)、p213−227、1990年)、pHの僅か
な変化でも、酵素の活性値が大きく変動することが知ら
れてきた。
【0006】また、アルカリ域緩衝液を開封保存した後
当該アルカリ域緩衝液を用いて、3αヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定やアルカリフ
ォスファターゼ活性測定を行うと、胆汁酸測定値やアル
カリフォスファターゼ活性値の変動が見られ、再現性に
乏しい問題があった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】このように、緩衝液を
開封保存した場合、原因は不明であるが、緩衝液のpH
が変動し、一定のpHを得ることが非常に困難である。
特に、アルカリ域緩衝液を開封保存した場合は、pHの
低下が起こり、例えば、酵素活性を測定する場合は、酵
素の反応性の劣化が生じる欠点があった。従って、pH
8〜11のアルカリ緩衝液にて、例えば生体成分である
基質の酵素的測定や酵素活性測定などの酵素反応を伴う
酵素的測定のための酵素活性の劣化を生じさせない緩衝
液の開発が本発明の目的である。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムが
pH8〜11のアルカリ域緩衝液を用い、アルカリ域に
て酵素的反応を伴う組成の酵素の反応性を安定化させる
こと見いだした。即ち、本発明は、アルカリ域にて酵素
的反応を行なう酵素の一つである3αヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定において、通
常の0.2Mジエタノールアミン緩衝液(pH9.2)
を用いて胆汁酸測定を行うと、開封保存した当該緩衝液
で、経時的に測定値の低下が観察されたことから、種々
の検討を加えた結果、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水
素カリウムを当該緩衝液に含有せしめると、胆汁酸の測
定値の低下が非常に改善され、再現性の良好な測定結果
が得られることを見いだした。
【0009】同様に、アルカリ域にて酵素的反応を行な
う酵素の例示としてのアルカリフォスファターゼの活性
測定を0.2Mジエタノールアミン緩衝液(pH9.
2)を用いて、活性測定を行うと、開封保存した当該緩
衝液で、経時的に測定値の低下が観察されたが、上記し
たような炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを
当該緩衝液に含有せしめると、アルカリフォスファター
ゼの活性値の低下が劇的に軽減されることを見いだし
た。
【0010】さらに、本発明においてpH8〜11のア
ルカリ域緩衝液を用いる組成において、炭酸水素ナトリ
ウムや炭酸水素カリウム等の炭酸水素イオンを放出せし
める炭酸化合物を用いることにより再現性良く測定し得
るもので、この炭酸水素イオンを放出せしめるカルシウ
ムやマグネシウムの炭酸化合物も同様に良好な結果を示
すことを見い出し、その結果、従来の炭酸水素イオンを
含有していないアルカリ域緩衝液組成に比べて開封条件
下において格段に酵素的測定における再現性が向上した
ことを見出した。
【0011】本発明は上記の知見により完成されたもの
であって、pH8〜11のアルカリ域緩衝液(但し、炭
酸系緩衝液を除く)を用い、主成分としてアルカリ域に
て酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭酸水素
イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とする緩衝
液組成、およびpH8〜11のアルカリ域緩衝液(但
し、炭酸系緩衝液を除く)を用い、主成分としてアルカ
リ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭
酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とし
て含有せしめることを特徴とする当該緩衝液組のpH変
動の抑制方法であって、例えば3αヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸の安定的測定やアル
カリフォスファターゼの活性の安定的測定などの酵素的
測定用の緩衝液組成に用いることを可能となし、本発明
の炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分
として含有せしめた緩衝液組成は、酵素反応を伴う基質
または酵素活性の測定のための酵素的測定用の組成とし
て好適に使用できることを見出した。
【0012】本発明のアルカリ域緩衝液(但し、炭酸系
緩衝液を除く)を含有する組成としては、pH領域とし
てpHが8〜11の範囲で大いに有効であり、その緩衝
液としては、例えば、pH8〜11の間に適宜に調整で
きる有機アミン系緩衝液、グッド緩衝液やその他に、ク
エン酸−第2リン酸ナトリウム系、塩酸−ベロナールナ
トリウム−酢酸ナトリウム系、第1リン酸カリウム−第
2リン酸ナトリウム系、第1リン酸カリウム−ホウ砂
系、第1リン酸カリウム−水酸化ナトリウム系、塩酸−
コリジン系、塩酸−ベロナールナトリウム系、塩酸−ト
リスアミノメタン系、塩酸−ホウ砂系、ホウ酸−炭酸ナ
トリウム系、ホウ酸−ホウ砂系、塩酸−アミノメチルプ
ロパンジオール系、塩化アンモニウム−アンモニア系、
グリシン−水酸化ナトリウム系、ホウ酸−水酸化ナトリ
ウム系、塩酸−ジメチルグリシンナトリウム系、ホウ砂
−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−炭酸ナトリウム系、セ
ーレンセン緩衝液、グリシン−塩化ナトリウム−塩酸
系、第2クエン酸ナトリウム−塩酸系、第2クエン酸ナ
トリウム−水酸化ナトリウム系、ホウ砂−塩化ナトリウ
ム系、ミカエリス緩衝液、ベロナールナトリウム−酢酸
ナトリウム−塩酸系、クラーク−ルブス緩衝液、ホウ酸
−塩化カリウム−水酸化ナトリウム系、アトキンス−パ
ンチン緩衝液、パリティッシュ緩衝液、コルトホフ緩衝
液、マックイルベイン緩衝液、ハスチング−センドロイ
緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、マレイン酸塩緩
衝液、トリス−マレイン酸塩緩衝液、ベロナール緩衝
液、ベロナール−酢酸塩緩衝液などの生化学用緩衝液な
どが挙げられ、これらの緩衝液以外であっても、pH8
〜11のアルカリ域にて緩衝能を有するものであれば何
ら限定されない。
【0013】また、有機アミン系緩衝液としては、例え
ば、ジエタノールアミン緩衝液、2−エチルアミノエタ
ノール緩衝液、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノ
ール、N−メチル−D−グルカミン等が挙げられる。さ
らに、グッド緩衝液としては、例えば、MES(2−
(N−Morphilino)ethanesulfo
nic acid)緩衝液、Bis−Tris(Bis
(2−hydroxyethyl)iminotris
(hydroxymethyl)methane)緩衝
液、ADA(N−(2−Acetamido)imin
odiacetic acid)緩衝液、PIPES
(Piperazine−N,N’−bis(2−et
hanesulfonic acid)緩衝液、ACE
S(N−(2−Acetamido)−2−amino
ethanesulfonic acid)緩衝液、M
OPSO(3−(N−Morpholino)−2−h
ydroxypropanesulfonic aci
d)緩衝液、BES(N,N−Bis(2−hydro
xyethyl)−2−aminoethanesul
fonic acid)緩衝液、MOPS(3−(N−
Morpholino)propanesulfoni
c acid)緩衝液、TES(N−Tris(hyd
roxymethyl)methyl−2−amino
ethanesulfonic acid)緩衝液、H
EPES(N−2−hydroxyethylpipe
razine−N’−2−ethanesulfoni
c acid)緩衝液、DIPSO(3−[N,N−B
is(2−hydroxyethyl)amino]−
2−hydroxypropanesulfonic
acid)緩衝液、TAPSO(N−Tris(hyd
roxymethyl)methyl−2−hydro
xy−3−aminopropanesulfonic
acid)緩衝液、POPSO(Piperazin
e−N,N’−bis(2−hydroxypropa
nesulfonic acid)緩衝液、HEPPS
O(N−2−Hydroxyethylpiperaz
ine−N−2−hydroxypropane−3−
sulfonic acid)緩衝液、EPPS(N−
2−Hydroxyethylpiperazine−
N’−3−propanesulfonic aci
d、別名HEPPS)緩衝液、Tricine(Tri
s(hydroxymethyl)methylgly
cine)緩衝液、Bicine(N,N−Bis(2
−hydroxyethyl)glycine)緩衝
液、TAPS(N−Tris(hydroxymeth
yl)methyl−3−aminopropanes
ulfonic acid)緩衝液、CHES(2−
(Cyclohexylamino)ethanesu
lfonic acid)緩衝液、CAPSO(3−N
−Cyclohexylamino−2−hydrox
ypropanesulfonic acid)緩衝
液、CAPS(3−Cyclohexylaminop
ropanesulfonic acid)緩衝液等が
挙げられる。
【0014】なお、本発明のアルカリ域緩衝液において
は炭酸系緩衝液を除くものであり、この炭酸系緩衝液と
しては、例えば炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの
緩衝液またはそれらのカリウム塩による緩衝液などであ
り、炭酸塩に基づく緩衝液を意味し、本発明におけるア
ルカリ域緩衝液とは別途に炭酸水素イオンを放出せしめ
る炭酸化合物を有効成分とするpH変動抑制剤として含
有せしめるものと区別する目的のものである。
【0015】アルカリ域緩衝液を用いる組成として、当
該アルカリ域緩衝液として、有機アミン系緩衝液を用い
る場合は、20mM〜2Mの濃度、好ましくは20mM
〜1Mの濃度、最適には20mM〜500mMの濃度に
調整した水性媒体として用いれば良い。また、好適な水
性媒体としては水、具体的には精製水が挙げられ、適宜
に補酵素、可溶性塩類、界面活性剤、安定化剤や防腐剤
などを含有してもよい。
【0016】また、アルカリ域緩衝液を含有する組成と
して、当該アルカリ域緩衝液として、グッド緩衝液また
は生化学用緩衝液を用いる場合は、20mM〜1Mの濃
度、好ましくは20mM〜500mMの濃度、最適には
20mM〜300mMの濃度に調整して用いれば良い。
さらに本発明における、主成分としてアルカリ域にて酵
素的反応を行なう酵素としては、上記の緩衝液のpH8
〜11のアルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触
媒し得るものであれば何ら限定されるものでなく、例え
ば酵素の至適pHや安定pHが酸性域にあっても目的の
酵素作用をpH8〜11のアルカリ域にて当該基質に対
して酵素作用を触媒し得るものであってもよく、好まし
くは酵素の至適pHや安定pHのいずれか、または両方
がアルカリ域にあって目的の酵素作用をpH8〜11の
アルカリ域にて当該基質に対して酵素作用を触媒し得る
ものであり、好適には3αヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ、7αヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼ、11αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、1
6αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、17αヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、21αヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼなどのステロイドデヒド
ロゲナーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素の至
適pHや安定pHのいずれか、または両方がアルカリ域
にある酵素が挙げられ、さらに例えばアルコールデヒド
ロゲナーゼ(基質:エタノール、補酵素:NAD、緩衝
液pH8.5〜8.8)、ラクテートデヒドロゲナーゼ
(基質:乳酸、補酵素:NAD、緩衝液pH9〜1
0)、ガラクトースデヒドロゲナーゼ(基質:ガラクト
ース、補酵素:NAD、至適pH8〜9)が挙げられ
る。
【0017】また当該酵素としては、例えば胆汁酸であ
る基質の測定の目的としての酵素である3αヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼの使用形態でもよく、また
例えばアルカリフォスファターゼを生体内酵素活性測定
の目的とする使用形態でもよく、さらに例えばアルカリ
フォスファターゼを免疫測定における酵素マーカーとし
て酵素活性測定の目的とする使用形態でもよいものであ
る。
【0018】従ってまた、本発明の緩衝液組成に含有さ
れる酵素の量としては、基質の測定の目的、生体内酵素
活性測定の目的、免疫測定における酵素マーカーの酵素
活性測定の目的によって、適宜異なるものである。基質
の測定の目的における緩衝液組成に含有される酵素の量
としては、例えば、緩衝液組成中0.001〜200単
位、好ましくは0.05〜100単位であり、また生体
内酵素活性測定の目的における緩衝液組成に含有される
酵素の量としては、生体内酵素の量に依存するものであ
るが、例えば緩衝液組成中0.0001〜200単位、
好ましくは0.01〜100単位であり、免疫測定にお
ける酵素マーカーの酵素活性測定の目的における緩衝液
組成に含有される酵素の量としては極めて微量であり、
例えば緩衝液組成中0.0001m単位〜1単位、好ま
しくは0.001m単位〜0.5単位である。
【0019】以下に、本発明について詳しく説明する
が、特に限定されるものではない。炭酸水素イオンを放
出せしめる炭酸化合物として、例えば炭酸水素ナトリウ
ムをアルカリ域緩衝液、例えばジエタノールアミン緩衝
液に加えて調整するに当たっては、下記の如く行えば良
い。即ち、ジエタノールアミン緩衝液(pH9.2)の
調製は、ジエタノールアミン(DEA)(和光純薬工業
社製)20.827gを精製水に溶解させる。次いで、
適宜にデヒドロゲナーゼなどの酵素的測定のための補酵
素、安定化剤や防腐剤、例えば6.6mmolのNAD
H、1.3gのデキストラン、0.7gのBSA(牛血
清アルブミン)、および0.5gのNaN3 を添加し、
さらに炭酸水素ナトリウムを0g、4.2g、8.4
g、12.6g、16.8g、あるいは21.0gを添
加し、30℃でpHを計測しながら、1NのHClある
いは1NのNaOHを加え、pHを9.2に合わせ、精
製水で全量を1,000mlとし、それぞれ0.2Mの
DEA緩衝液(pH9.20)、50mM炭酸水素ナト
リウム添加0.2MのDEA緩衝液(pH9.20)、
100mM炭酸水素ナトリウム添加0.2MのDEA緩
衝液(pH9.20)、150mM炭酸水素ナトリウム
添加0.2MのDEA緩衝液(pH9.20)、200
mM炭酸水素ナトリウム添加0.2MのDEA緩衝液
(pH9.20)、250mM炭酸水素ナトリウム添加
0.2MのDEA緩衝液(pH9.20)を調製する。
【0020】この場合、有機アミン系緩衝液の1つであ
るジエタノールアミン緩衝液への炭酸水素ナトリウムな
どの炭酸化合物の添加濃度はモル濃度において10mM
〜1Mであれば良く、望ましくは20mM〜500mM
であれば良い。また、グッド緩衝液、例えば、Bici
ne緩衝液に、同様に炭酸水素ナトリウムなどの炭酸化
合物の添加濃度は10mM〜1Mであり、望ましく20
mM〜500mMであれば良い。
【0021】このようにして作製したアルカリ域緩衝液
を含有する組成物、例えば、3μl〜5mlの適宜な量
に、生体成分における基質の測定用の酵素、例えばNA
DやNADPまたはそれらの還元型であるNADHやN
ADPH、チオ−NADやチオ−NADPまたはそれら
の還元型であるチオ−NADHやチオ−NADPHなど
の補酵素を利用する種々のデヒドロゲナーゼ、好適には
3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼなどの酵素
を0.1〜100U/ml添加し、開封保存しても、そ
の後に例えば20〜40℃にてレートアッセイやエンド
ポイントアッセイを行なっても、3αヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定の安定的な測
定が可能となる。
【0022】例えば、3αヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ活性測定または基質の測定は以下のように行
えばよい。反応液(40mMトリス−塩酸緩衝液pH
8.0、1mMNAD(興人化学社製)、0.025%
ニトロテトラゾリウムブルー(NTB;同仁化学社
製)、5U/mlジアホラーゼ(旭化成工業社製)、
0.4%トリトンX−100(米山化学社製)含む溶
液)0.5mlに、0.02mlの酵素液を添加し、3
7℃で予備加温した後、基質溶液(メタノールで溶解し
た20mMアンドロステロン(シグマ社製)溶液)を
0.025ml添加し、37℃、5分間、反応させた
後、反応停止液(0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(和
光純薬工業社製))2.5mlを添加し、反応において
生成された色素を550nm付近の吸光度にて測定し、
3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性または
基質であるアンドロステロンを測定できる。
【0023】さらに、3αヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼを用いた胆汁酸測定の例示としては、R1溶
液(30mMグリシン、1.35mMチオ−NAD(オ
リエンタル酵母工業社製)、0.8%塩化ナトリウム、
0.1%トリトンX100および0.05%NaN3
含むpH4.0溶液)1.30mlに、胆汁酸溶液0.
015mlを添加し、37℃、5分間反応させた後、R
2溶液(200mMジエタノールアミン、6.6mMN
ADH、9.5U/ml3αヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ(旭化成工業社製)および0.05%Na
3 を含むpH9.2溶液)0.65mlを添加し、3
7℃、2分後から、レートアッセイ法にて、デヒドロゲ
ナーゼを用いた可逆反応に基づく酵素サイクリングの反
応にて生成されたチオ−NADHの量を400nm付近
の吸光度にて測定するか、反応にて減少したNADHの
量を340nm付近の吸光度にて測定などの吸光度変化
量を測定すれば良い。
【0024】同様にして、既知濃度の胆汁酸溶液(シグ
マ社製グリコケノデオキシコール酸(GCDCA)0.
094gを100mlに溶解し、その後40倍希釈し5
0μMに調製した溶液)を測定し、既知濃度の胆汁酸溶
液の吸光度変化量から、胆汁酸濃度を算出することがで
きる。上記の方法にて、R2溶液を、4℃にて開封保存
し、酵素添加後、0(初期値)、7、14、21、2
6、51日目で、3αヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼの残存活性、R2溶液のpH及び各種基質に対す
る感度を測定する。基質は、GCDCA(シグマ社
製)、セロノルム(第一化学薬品工業社製)、パソノル
ムL(第一化学薬品工業社製)及びパソノルムH(第一
化学薬品工業社製)等を用いればよい。
【0025】また、同様にアルカリ域緩衝液としてBi
cineを用いる場合は以下の様に行えば良い。即ち、
3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆
汁酸測定は、R2溶液(100mMBicine(同仁
化学社製)緩衝液、6.6mMNADH、9.5U/m
l3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(旭化成
工業社製)および0.05%NaN3 を含むpH9.0
の溶液)に炭酸水素ナトリウムを0〜50mM添加し、
4℃にて開封保存し、添加後、0(初期値)、21日目
で、3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存
活性及び各種基質に対する感度を測定する。
【0026】また、ジエタノールアミン緩衝液でのアル
カリフォスファターゼの活性測定は、例えば、以下の様
に行う。溶液(200mMジエタノールアミンに炭酸水
素ナトリウムを0mM(最終的な溶液のpH10.0
3)、200mM(最終的な溶液のpH10.11)、
500mM(最終的な溶液のpH10.08)、600
mM(最終的な溶液のpH10.10)または800m
M(最終的な溶液のpH10.10)を含有せしめた溶
液)を4℃にて開封保存し、保存後14日目で、アルカ
リフォスファターゼの活性を測定する。アルカリフォス
ファターゼの活性測定は、開封保存した当該溶液1ml
にアルカリフォスファターゼ基質であるp−ニトロフェ
ニルリン酸二ナトリウムを15mMの濃度で添加し、次
いでアルカリフォスファターゼ含有市販の管理血清であ
るセラクリアN(日本商事社製)20μlを添加する。
37℃、1分後から、レートアッセイ法にて、活性を算
出する。
【0027】また、アルカリ域緩衝液として、グッド緩
衝液、例えばTricine緩衝液を用いる場合は以下
の様に行えば良い。溶液(100mMTricine
(同仁化学社製)緩衝液に炭酸水素ナトリウムを0mM
(最終的な溶液のpH9.80)、100mM(最終的
な溶液のpH9.82)、200mM(最終的な溶液の
pH9.81)、300mM(最終的な溶液のpH9.
83)、400mM(最終的な溶液のpH9.82)ま
たは500mM(最終的な溶液のpH9.80)を含有
せしめた溶液)を4℃にて開封保存し、14日目で、ア
ルカリフォスファターゼの活性を前述したように測定す
る。
【0028】炭酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物
としては、アルカリ金属化合物やアルカリ土類金属化合
物があり、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリ
ウム、炭酸水素マグネシウムや炭酸水素カルシウム等が
挙げられる。
【0029】
【発明の実施の形態】つぎに実施例にもとづいて本発明
を説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
【0030】
【実施例1】 ジエタノールアミン緩衝液の調製 ジエタノールアミン(DEA)(和光純薬工業株式会社
製)20.827gを精製水に溶解させ、6.6mmo
lのNADH、1.3gのデキストラン、0.7gのB
SA、および0.5gのNaN3 を添加し、炭酸水素ナ
トリウムを0g、4.2g、8.4g、12.6g、1
6.8g、あるいは21.0gを添加し、30℃でpH
を計測しながら、1NのHClを加え、pHを9.2に
合わせ、精製水で全量を1,000mlとし、それぞれ
0.2MのDEA緩衝液(pH9.20)、50mM炭
酸水素ナトリウム添加0.2MのDEA緩衝液(pH
9.20)、100mM炭酸水素ナトリウム添加0.2
MのDEA緩衝液(pH9.20)、150mM炭酸水
素ナトリウム添加0.2MのDEA緩衝液(pH9.2
0)、200mM炭酸水素ナトリウム添加0.2MのD
EA緩衝液(pH9.20)、250mM炭酸水素ナト
リウム添加0.2MのDEA緩衝液(pH9.20)を
調製した。
【0031】
【実施例2】 (1)3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性
測定 反応液(40mMトリス−塩酸緩衝液pH8.0、1m
MNAD(興人化学社製)、0.025%ニトロテトラ
ゾリウムブルー(NTB;同仁化学社製)、5U/ml
ジアホラーゼ(旭化成工業社製)、0.4%トリトンX
ー100(米山化学社製)含む溶液)0.5mlに、
0.02mlの酵素液を添加し、37℃で予備加温した
後、基質溶液(メタノールで溶解した20mMアンドロ
ステロン(シグマ社製)溶液)を0.025ml添加
し、37℃、5分間、反応させた後、反応停止液(0.
5%ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業社製))
2.5mlを添加し、550nmの吸光度を測定し、3
αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性を測定し
た。 (2)3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによ
る胆汁酸測定 R1溶液(30mMグリシン、1.35mMチオ−NA
D(オリエンタル酵母工業社製)、0.8%塩化ナトリ
ウム、0.1%トリトンX−100および0.05%N
aN3 を含むpH4.0溶液)1.30mlに、胆汁酸
溶液0.015mlを添加し、37℃、5分間反応させ
た後、R2溶液(200mMジエタノールアミン、6.
6mMNADH、9.5U/ml3αヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ(旭化成工業社製)および0.0
5%NaN3 を含むpH9.2溶液)0.65mlを添
加し、37℃、2分後から、レートアッセイ法にて、吸
光度変化量を測定した。
【0032】同様にして、既知濃度の胆汁酸溶液(シグ
マ社製グリコケノデオキシコール酸(GCDCA)0.
094gを100mlに溶解し、その後40倍希釈し5
0μMに調製した溶液)を測定し、既知濃度の胆汁酸溶
液の吸光度変化量から、胆汁酸濃度を算出した。上記の
方法にて、R2溶液を、4℃にて開封保存し、酵素添加
後、0(初期値)、7、14、21、26、51日目
で、3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存
活性、R2溶液のpH及び各種基質に対する感度を測定
した。基質は、GCDCA(シグマ社製)、セロノルム
(第1化学薬品社製)、パソノルムL(第1化学薬品社
製)及びパソノルムH(第1化学薬品社製)を使用し
た。
【0033】結果を、表1〜表6に示した。
【0034】
【表1】
【0035】
【表2】
【0036】
【表3】
【0037】
【表4】
【0038】
【表5】
【0039】
【表6】
【0040】表1〜表6により、3αヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸測定において、炭
酸水素ナトリウムを添加した系においては、初期値に対
する相対感度が炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較
して、多いに向上していることが明らかとなった。かつ
炭酸水素ナトリウムの適宜な添加量によって、炭酸水素
ナトリウムの無添加の系の開封後のpHの変化に比べ
て、pHの変動を抑制して安定化効果を奏したものであ
った。
【0041】
【実施例3】 3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆
汁酸測定 R2溶液(100mMBicine(同仁化学社製)緩
衝液、6.6mMNADH、9.5U/ml3αヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ(旭化成工業社製)お
よび0.05%NaN3 を含むpH9.0の溶液)に炭
酸水素ナトリウムを0〜50mMの濃度で添加し、4℃
にて開封保存し、添加後、0(初期値)、21日目で、
3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの残存活性
及び各種基質に対する感度を実施例2と同様に測定し
た。結果を、表7に示した。
【0042】
【表7】
【0043】表7により、Bicine緩衝液において
も、炭酸水素ナトリウムを添加した系においては、初期
値に対する相対感度が炭酸水素ナトリウムが無添加の系
に比較して、多いに向上していることが明らかとなっ
た。
【0044】
【実施例4】 開封保存ジエタノールアミン緩衝液溶液におけるアルカ
リフォスファターゼの活性測定 溶液(200mMジエタノールアミンに炭酸水素ナトリ
ウムを0mM(最終的な溶液のpH10.03)、20
0mM(最終的な溶液のpH10.11)、500mM
(最終的な溶液のpH10.08)、600mM(最終
的な溶液のpH10.10)または800mM(最終的
な溶液のpH10.10)を含有せしめた溶液)を4℃
にて開封保存し、保存後14日目で、アルカリフォスフ
ァターゼの活性を測定した。
【0045】アルカリフォスファターゼの活性測定は、
開封保存した当該溶液1mlにアルカリフォスファター
ゼ基質であるp−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを
15mMの濃度で添加し、次いでアルカリフォスファタ
ーゼ含有市販の管理血清であるセラクリアN(日本商事
社製)20μlを添加した。37℃、1分後から、レー
トアッセイ法にて、活性を算出した。結果を、表8に示
した。
【0046】
【表8】
【0047】表8から、炭酸水素ナトリウムを添加した
系においては、炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較
して、活性の低下が大いに軽減されていることが明らか
となった。
【0048】
【実施例5】 開封保存したグッド緩衝液におけるアルカリフォスファ
ターゼの活性測定 グッド緩衝液の1つとして、Tricine緩衝液を用
いた。即ち、溶液(100mMTricine(同仁化
学社製)緩衝液に炭酸水素ナトリウムを0mM(最終的
な溶液のpH9.80)、100mM(最終的な溶液の
pH9.82)、200mM(最終的な溶液のpH9.
81)、300mM(最終的な溶液のpH9.83)、
400mM(最終的な溶液のpH9.82)または50
0mM(最終的な溶液のpH9.80)を含有せしめた
溶液)を4℃にて開封保存し、14日目で、アルカリフ
ォスファターゼの活性を測定した。アルカリフォスファ
ターゼの活性測定は実施例4と同様に実施した。結果
を、表9に示した。
【0049】
【表9】
【0050】表9から、炭酸水素ナトリウムを添加した
系においては、炭酸水素ナトリウムが無添加の系に比較
して、活性の低下が大いに軽減されていることが明らか
となった。
【0051】
【実施例6】 開封保存した生化学用緩衝液におけるアルカリフォスフ
ァターゼの活性測定 生化学用緩衝液の1つとして、塩酸−トリスアミノメタ
ン系緩衝液を用いた。即ち、溶液(50mMTris
(シグマ社製、商品名Trizma−base)緩衝液
に炭酸水素カリウムを0mM(最終的な溶液のpH9.
20)または300mM(最終的な溶液のpH9.2
0)を含有せしめた溶液)を4℃にて開封保存し、14
日目で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。
アルカリフォスファターゼの活性測定は実施例4と同様
に実施した。
【0052】その結果、100mM炭酸水素カリウム含
有Tris緩衝液におけるpHおよびアルカリフォスフ
ァターゼの活性はそれぞれpH9.20および110U
/L(初期値、111U/L)であったが、炭酸水素カ
リウム不含Tris緩衝液におけるpHおよびアルカリ
フォスファターゼの活性はそれぞれpH8.90および
95U/L(初期値、110U/L)であった。
【0053】従って、炭酸水素カリウムを有効成分とし
て含む緩衝液組成物はpHの低下を抑制し、さらにアル
カリフォスファターゼの活性が再現性良く測定できるこ
とが明らかとなった。
【0054】
【発明の効果】アルカリ域緩衝液を用いる組成物は、上
記した3αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用
いた胆汁酸の活性測定やアルカリフォスファターゼ活性
測定等の他に、NADH等を用いたデヒドロゲナーゼの
活性測定またはその基質の測定、デヒドロゲナーゼを用
いた可逆反応に基づく酵素サイクリングによる酵素活性
測定やその基質の測定、キサンチンデヒドロゲナーゼ活
性測定等に利用され、炭酸化合物を含有せしめたアルカ
リ域緩衝液を用いる組成物は上記の酵素的測定において
再現性の良好な測定結果を与えることができ、さらに緩
衝液の濃度の低減化という効能を有するとともに、開封
後の組成物のpHを安定に維持、調整し得る。さらに、
本発明の緩衝液組成物は、酵素的測定用の媒体として好
適に用いられる。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 pH8〜11のアルカリ域緩衝液(但
    し、炭酸系緩衝液を除く)を用い、主成分としてアルカ
    リ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭
    酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とす
    る緩衝液組成。
  2. 【請求項2】 酵素が、デヒドロゲナーゼまたはアルカ
    リホスファターゼである請求項1記載の緩衝液組成。
  3. 【請求項3】 デヒドロゲナーゼが、ステロイドデヒド
    ロゲナーゼである請求項1記載の緩衝液組成。
  4. 【請求項4】 緩衝液が、20mM〜2M濃度の有機ア
    ミン系緩衝液、20mM〜1M濃度のグッド緩衝液また
    は20mM〜1M濃度の生化学用緩衝液である請求項1
    記載の緩衝液組成。
  5. 【請求項5】 炭酸化合物が、アルカリ金属またはアル
    カリ土類金属化合物である請求項1記載の緩衝液組成。
  6. 【請求項6】 アルカリ金属またはアルカリ土類金属化
    合物が、ナトリウムまたはカリウムであるアルカリ金
    属、またはカルシウムまたはマグネシウムであるアルカ
    リ土類金属化合物である請求項5記載の緩衝液組成。
  7. 【請求項7】 炭酸化合物が、10mM〜1M濃度の炭
    酸水素ナトリウムである請求項1記載の緩衝液組成。
  8. 【請求項8】 酵素が、基質の測定または酵素活性測定
    用酵素である請求項1記載の緩衝液組成。
  9. 【請求項9】 pH8〜11のアルカリ域緩衝液(但
    し、炭酸系緩衝液を除く)を用い、主成分としてアルカ
    リ域にて酵素的反応を行なう酵素含有組成であって、炭
    酸水素イオンを放出せしめる炭酸化合物を有効成分とし
    て含有せしめることを特徴とする当該緩衝液組のpH変
    動の抑制方法。
  10. 【請求項10】 酵素が、デヒドロゲナーゼまたはアル
    カリホスファターゼである請求項9記載の方法。
  11. 【請求項11】 デヒドロゲナーゼが、ステロイドデヒ
    ドロゲナーゼである請求項10記載の方法。
  12. 【請求項12】 緩衝液が、20mM〜2M濃度の有機
    アミン系緩衝液、20mM〜1M濃度のグッド緩衝液ま
    たは20mM〜1M濃度の生化学用緩衝液である請求項
    9記載の方法。
  13. 【請求項13】 炭酸化合物が、アルカリ金属またはア
    ルカリ土類金属化合物である請求項9記載の方法。
  14. 【請求項14】 アルカリ金属またはアルカリ土類金属
    化合物が、ナトリウムまたはカリウムであるアルカリ金
    属、またはカルシウムまたはマグネシウムであるアルカ
    リ土類金属化合物である請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】 炭酸化合物が、10mM〜1M濃度の
    炭酸水素ナトリウムである請求項9記載の方法。
  16. 【請求項16】 酵素が、基質の測定または酵素活性測
    定用酵素である請求項9記載の方法。
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