JP2018512431A - 親ホモ二量体抗体種からのヘテロ二量体多重特異性抗体の精製方法 - Google Patents

親ホモ二量体抗体種からのヘテロ二量体多重特異性抗体の精製方法 Download PDF

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Abstract

少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープ（「標的」とも呼ばれ、全体を通して同じ意味で用いられる）に共結合する目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）をＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種が含まれる組成物から精製する方法を提供し、そのような方法を実施するために用いられ得る試薬も提供する。本発明は、とりわけ、第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含む、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに有利に共結合する目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）を、ＭＡＩ及び少なくとも２つの対応する親ホモ二量体抗体種を含む組成物から精製する方法を提供する。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１４６，１１６号、及び２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４９，１８０号の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
配列表
本出願はＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を包含し、その全体を参照により本明細書に援用する。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年４月７日に作成され、名称が２００９１８６−０１７０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが１４５，０７２バイトである。
本発明は、とりわけ、ホモ二量体種、例えば親ホモ二量体種からの多重特異性抗体の分離及び精製方法、ならびにこの方法を実施するのに有用な試薬に関する。
全体を通して参照する特許、特許出願、及び非特許刊行物をはじめとして、本明細書で引用するすべての参照文献は、あらゆる目的のためにその全体を参照によりここに明確に援用する。
抗体及び抗体ベースの分子は診断ツール及び治療薬としての魅力的な候補の代表である。これまで、３０を超える治療用モノクローナル抗体が、癌、臓器移植、自己免疫障害及び炎症性障害、感染症、ならびに心血管疾患をはじめとする多様な適応症分野に承認され、適用に成功してきた。
しかし、こうした抗体の大半は単一エピトープを認識する単一特異性抗体であり、この単一エピトープを介した標的分子の活性の活性化または抑制のいずれかをするように選択することができる。しかし、多くの生理学的反応が誘発されるには、２つ以上の異なるタンパク質またはタンパク質サブユニットの、またはその間の架橋、「クロストーク」または共結合が必要となる。重要な例はヘテロメリック細胞表面受容体複合体の活性化である。こうした受容体複合体では、活性化は通常、一方または両方の受容体コンポーネントの近接性に関連した活性化をもたらす異なるタンパク質上の複数のドメインとのリガンド相互作用を介して達成される。
多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体などは、複数のエピトープまたは抗原に共結合することができるので、こうしたより複雑な生理学的プロセス、及びそれに関連する病状のいくつかに対処し、治療に利用する手段として魅力的な分子の代表である。
二重特異性抗体を生成するためのあるアプローチでは、二重特異性体とするための抗体断片を用いなければならない。例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、鎖ダイアボディ、Ｆａｂ２二重特異性体（例えばＣｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， Ｖｏｌ． １５７（２）：２２０−２３３ （２００９）を参照）など、またはそのような断片を含む非天然型との関連では、抗体可変領域（Ｆｖ）の相当な多様性により、実質的にあらゆる抗原またはエピトープを認識するＦｖを生成することが可能となるので、断片ベースの多重特異性体生成の典型的なアプローチは新しい可変領域の導入である。そのような断片には全長抗体の複雑な四次構造がないので、可変軽鎖及び重鎖は単一の遺伝子コンストラクト中で連結することができる。多くの場合、これらの型は細菌中で高度に発現させることができ、小さなサイズゆえに好ましい透過性という利点を有し得るが、インビボで急速に排泄され、生産及び安定性に関して製造上の障害を提示し得る。これらの欠点の主な原因は、抗体断片は一般に抗体の定常領域を欠き、それに関連する機能的特性、例えば、大きなサイズ、高い安定性、ならびに血清中で長い半減期を維持する（すなわち胎児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎ）、または精製のための結合部位の役割を果たす（すなわちプロテインＡ及びプロテインＧ）様々なＦｃ受容体及びリガンドへの結合性などを欠くことである。
より最近の研究では、二重結合性を全長抗体様型に組み込むことによって、断片ベースの二重特異性体の欠点に対処する試みが行われている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５［１１］：１２９０−１２９７；米国特許出願第１２／４７７，７１１号（ＵＳ ２００９／０３１１２５３として公開）；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９， ｍＡｂｓ １［２］：１２８−１４１；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６９３（ＷＯ ２００９／０３２７８２として公開）；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３［５］：３６１−３６７；米国特許出願第０９／８６５，１９８号；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４７２（ＷＯ ２００６／０２０２５８として公開））。
また他にも、天然ＩｇＧ型である（すなわち、天然（すなわち「野生型」）ＩｇＧに見られるのと同じ指向性で相互作用する２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有する）二重特異性抗体を生成する試みがなされている。しかし、二重特異性抗体を生成する最も直接的な方法（単一の細胞中での２つの抗体の発現）では、それぞれの重鎖がホモ及びヘテロ二量体の両方を形成し、２つのそれぞれの軽鎖はいずれの重鎖とも対合することができるので、目的の種のほかに複数の種が生じる。
所望の鎖間のヘテロ二量体化を誘導するために免疫グロブリン鎖の１つまたは複数に変異を組み込むことによって、または他の不要な抗体種からの所望のヘテロ二量体抗体の分離を容易にする精製スキームを可能にするために、この異質性の問題の対処に多大な努力が注がれている。
ＵＳ ５，７３１，１６８、ＵＳ ５，８０７，７０６、ＵＳ ５，８２１，３３３、ＵＳ ７，６４２，２２８、及びＵＳ ７，６９５，９３６、ならびに他の等価物は、異なる抗原特異性を有する２つの異なる重鎖及び共通の軽鎖を含むヘテロ多量体抗体の生成について記載しており、各重鎖はＦｃ領域にヘテロ二量体相互作用界面を組み込むように改変されている。この改変は各重鎖のＣＨ３ドメインに標的変異を組み込むことを含み、一方の重鎖にはくぼみが形成され、他方の重鎖には相補的な突出部が形成されて、その結果、突出部がくぼみの中に嵌入及び挿入され、これにより、２つの重鎖のヘテロ二量体化を促進する。
ＷＯ２０１３／１３６１８６は、異なる抗原特異性を有する２つの異なる重鎖を含むヘテロ多量体抗体の生成について記載しており、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティー試薬に対する少なくとも１つの重鎖のＣＨ１領域の結合性を減少または除去するように少なくとも１つの重鎖が改変されている。しかし、このアプローチの最終結果は非天然アミノ酸配列を含む抗体の生成であり、そのため、そのような非天然アミノ酸配列を含まない抗体と比較して、免疫原性の増加、Ｆｃエフェクター機能の望ましくない変化、及び他の不都合な障害の高いリスクを有する抗体が生成される可能性を大きく増加させる。
ＷＯ ２００７／１１４３２５及び対応する出願公開第ＵＳ ２００９／０２６３３９２号は、各重鎖間の等電点（ｐＩ）の差を増加させる目的で抗体の各重鎖定常領域に特異的アミノ酸変異を組み込むことによって改変されている、共通の軽鎖を含む特定の二重特異性抗体の精製について教示している。組換えヘテロ二量体二重特異性抗体は次に、イオン交換クロマトグラフィーにかけられ、ヘテロ二量体種の２つの重鎖における組換えｐＩ差増加変異から得られたｐＩ差の増大に基づいてホモ二量体親種から分離される。しかし、ＷＯ ２０１３／１３６１８６に開示されている方法と同様に、ＷＯ ２００７／１１４３２５及びＵＳ ２００９／０２６３３９２に開示されている方法はＦｃ領域中への非天然アミノ酸配列の導入を必要とするので、最終結果は、そのような非天然アミノ酸配列を含まない抗体と比較して、免疫原性の増加、Ｆｃエフェクター機能の望ましくない変化、及び他の不都合な障害の高いリスクを有する抗体の生成となる。
ＷＯ ２０１４／０７８７２９は、タンパク質、例えばモノクローナル抗体などは、水性環境では表面にたいていは荷電した極性アミノ酸を有し、表面残基は複数の化学的及び酵素的修飾を受けることができ、静電表面上の差によって特徴づけられるタンパク質バリアント不純物の異種性混合物をもたらすと教示している。この参照文献はさらに、イオン交換クロマトグラフィー法でｐＨ及びイオン強度勾配を用いることにより、単一の抗体種をその種のこうした混入バリアント、例えば荷電バリアント、分解生成物などの存在について分析する方法を教示している（その実施例を参照）。例示された方法で用いられている溶出バッファーはピペラジン、トリス、及びイミダゾールを含む。この参照文献では、目的の多重特異性重鎖ヘテロ二量体抗体（ＭＡＩ）及びＭＡＩの重鎖が由来する２つの親重鎖ホモ二量体抗体種のそれぞれを含む組成物からのＭＡＩの精製は実証されていない。加えて、Ｈｅｆｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ． ２９５（２）， ｐａｇｅｓ １８０−１８５ （２００１）は、タンパク質組成物中のイミダゾールの存在は多くの場合、タンパク質凝集体の生成をもたらすので、複数の抗体種を含む組成物から個々の抗体種を分離または精製しようとする場合に、イミダゾールがローディングまたは溶出バッファーのいずれかに含まれるあらゆるクロマトグラフィープロセスは複雑になる可能性があると教示している。
Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （ｍＡｂｓ， Ｖｏｌ． ５（６）， ｐａｇｅｓ ９６２−９７３ （２０１３））は、Ｆａｂアーム交換の制御によるＩｇＧ１型の安定な二重特異性抗体の生成を報告している。この方法は、２つの親種の還元（後述）後に２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を誘導する親重鎖のＣＨ３領域中への変異の導入；変異親ホモ二量体単一特異性抗体の発現；親ホモ二量体抗体の精製；重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を維持しながら重鎖間ジスルフィド結合が還元されるように、発現された親ホモ二量体抗体サンプルを適切な還元条件におくこと；２つの異なる親重鎖間のジスルフィド結合形成を促進するために還元された抗体を（再）酸化条件におくこと；残った親ホモ二量体種（及び他の不純物）からのヘテロ二量体抗体種の分離を含む。Ｇｒａｍｅｒは、親ホモ二量体種からの所望のヘテロ二量体種の分離または精製には、「どのホモ二量体対の性質も極めて著しく異なり得るので、カチオン交換クロマトグラフィーはおそらく一般に適用できないであろう」とも教示している。
したがって、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）をＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を含む組成物から調製及び／または精製する方法であって、親ホモ二量体種からの目的のヘテロ二量体抗体の形成または精製のいずれかを容易にするためにＭＡＩ（もしくは親抗体）の改変を必要としない方法を提供する必要性が依然として存在する。この必要性は、目的の多重特異性抗体が天然型（すなわち「野生型」）、例えば天然ＩｇＧアイソタイプ型（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びこれらのハイブリッド）などである場合で特に大きい。
米国特許出願公開第２０１２／４７７７１１号明細書 国際公開第２００９／０３２７８２号 米国特許出願公開第２００９／８６５１９８号明細書 国際公開第２００６／０２０２５８号 米国特許第５７３１１６８号明細書 米国特許第５８０７７０６号明細書 米国特許第５８２１３３３号明細書 米国特許第７６４２２２８号明細書 米国特許第７６９５９３６号明細書 国際公開第２０１３／１３６１８６号 国際公開第２００７／１１４３２５号 国際公開第２０１４／０７８７２９号
Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， Ｖｏｌ． １５７（２）：２２０−２３３ （２００９） Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５［１１］：１２９０−１２９７ Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９， ｍＡｂｓ １［２］：１２８−１４１ Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３［５］：３６１−３６７ Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２ Ｈｅｆｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ． ２９５（２）， ｐａｇｅｓ １８０−１８５ （２００１） Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （ｍＡｂｓ， Ｖｏｌ． ５（６）， ｐａｇｅｓ ９６２−９７３ （２０１３））
本発明は、とりわけ、第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含む、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープ（「標的」とも呼び、全体を通して同じ意味で用いる）に有利に共結合する目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）（全体を通して同じ意味で「多重特異性抗体」、「重鎖ヘテロ二量体抗体」、「目的の多重特異性抗体」、「多重特異性抗体アナログ」、「アナログ」、または「抗体アナログ」と呼ぶ）を、ＭＡＩ及び少なくとも２つの対応する親ホモ二量体抗体種を含む組成物から精製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１親ホモ二量体抗体種は第１ＨＣ可変領域を含む第１ポリペプチドの１コピーを含み、第２親ホモ二量体抗体種は第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドの１コピーを含む。いくつかの実施形態において、第１親ホモ二量体抗体種は第１ＨＣ可変領域を含む第１ポリペプチドの２コピーを含み、第２親ホモ二量体抗体種は第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドの２コピーを含む。いくつかの実施形態において、第１親ホモ二量体抗体種は第１ＨＣ可変領域を含む第１ポリペプチドを２コピーより多く（すなわち３コピー以上）含み、第２親ホモ二量体抗体種は第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを２コピーより多く（すなわち３コピー以上）含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩ及び少なくとも２つの対応するホモ二量体種を含む組成物は、宿主細胞集団、例えば原核宿主細胞または真核宿主細胞；細菌宿主細胞；酵母宿主細胞；哺乳類宿主細胞；昆虫宿主細胞；Ｐｉｃｈｉａ酵母細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母宿主細胞などによって発現される。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩ及び少なくとも２つの対応するホモ二量体種を含む組成物は、少なくとも２つのホモ二量体種をコードする核酸で形質転換されたそのような宿主細胞を含む宿主細胞集団によって発現される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩは抗体を含む。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩは免疫グロブリンを含む。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩはＩｇＧを含む。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩはＩｇアイソタイプハイブリッドを含む。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩは、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド、及びＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド、またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドを含む。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩはＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドを含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１重鎖ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２重鎖ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、第１及び第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、
ｉ）ＭＡＩ、第１重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのコピーまたは第１重鎖ポリペプチドの少なくとも２つのコピーのいずれかを含む第１親ホモ二量体抗体種、及び第２重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのコピーまたは第２重鎖ポリペプチドの少なくとも２つのコピーのいずれかを含む第２親ホモ二量体抗体種を含む組成物を入手すること；ならびに
ｉｉ）ＭＡＩを第１及び第２親ホモ二量体抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施すること；
を含み、
それによってＭＡＩを精製する方法を提供する。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、実施ステップｉｉ）は
組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびに
ｐＨ依存的にＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルとクロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施すること；
を含む。ある実施形態において、異なる等電点は実際の等電点である。ある他の実施形態において、異なる等電点は計算等電点である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液はそれぞれ異なる負対数酸解離定数（ｐＫａ）を有する少なくとも２種の緩衝剤を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明の方法は、溶出ステップを実施する前に溶離液の第１サンプル中、望ましい開始ｐＨで
組成物；または
組成物−クロマトグラフィー材料複合物；
のいずれかを調製または平衡化することをさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明の方法は、望ましい終了ｐＨに調製された大量の溶離液の第２サンプルをクロマトグラフィー材料−組成物複合物に流すことをさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液がクロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明の方法は、溶離液がクロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれて発生するｐＨ勾配を含み、ｐＨ勾配はステップｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液がクロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生し、ｐＨ勾配はリニアｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液がクロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生し、ｐＨ勾配はステップｐＨ勾配段階及びリニアｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液がクロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生し、ｐＨ勾配それぞれは２つ以上のステップｐＨ勾配段階及びリニアｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ｐＨ勾配はリニアｐＨ勾配段階の前にステップｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ｐＨ勾配はリニアｐＨ勾配段階の後にステップｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ｐＨ勾配は実質的にリニアなｐＨ勾配段階を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ｐＨ勾配は実質的にリニアなｐＨ勾配段階である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩ、第１親ホモ二量体抗体種、及び第２親ホモ二量体抗体種それぞれは実質的に区別可能な溶出体積でクロマトグラフィー材料から溶出する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩ、第１親ホモ二量体抗体種、及び第２親ホモ二量体抗体種それぞれはｐＨ依存的にクロマトグラフィー材料から溶出する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は
次の緩衝剤：Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、及びギ酸の
少なくとも２つ；
少なくとも３つ；
少なくとも４つ；
少なくとも５つ；
少なくとも６つ；
少なくとも７つ；もしくは
８つ；または
次の緩衝剤：メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンの
少なくとも２つ；
少なくとも３つ；
少なくとも４つ；
少なくとも５つ；もしくは
少なくとも６つ；
のいずれかを含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は
（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
のいずれかを含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は
次の緩衝剤：Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、及びギ酸の
少なくとも２つ；
少なくとも３つ；
少なくとも４つ；
少なくとも５つ；
少なくとも６つ；
少なくとも７つ；または
８つ；
を含むが、
ただし、溶離液は次のイミダゾール；ピペラジン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）のいずれも含まない。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は（ｉ）ＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに任意により少なくとも１つの塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩のいずれかから本質的になる。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は
（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸；及び塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
のいずれかからなる。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液はＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液の各サンプルは、０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択される濃度範囲で少なくとも１つの塩を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液の各サンプルは約１０ｍＭの濃度で少なくとも１つの塩を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液の各サンプルは約１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１重鎖親ホモ二量体抗体種に由来する第１重鎖ポリペプチドの実際の等電点と第２重鎖親ホモ二量体抗体種に由来する第２ポリペプチドの実際の等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
ある実施形態において、第１抗体、例えば第１免疫グロブリン、第１ＩｇＧ、または第１親ホモ二量体抗体種などの実際の等電点と第２抗体、例えば第２免疫グロブリン、第２ＩｇＧ、または第２親ホモ二量体抗体種などの実際の等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
ある実施形態において、第１親ホモ二量体抗体種の実際の等電点と第２親ホモ二量体抗体種の実際の等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１重鎖親ホモ二量体抗体種に由来する第１重鎖ポリペプチドの計算等電点と第２重鎖親ホモ二量体抗体種に由来する第２ポリペプチドの計算等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
ある実施形態において、第１抗体、例えば第１免疫グロブリン、第１ＩｇＧ、または第１親ホモ二量体抗体種などの計算等電点と第２抗体、例えば第２免疫グロブリン、第２ＩｇＧ、または第２親ホモ二量体抗体種などの計算等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
ある実施形態において、第１親ホモ二量体抗体種の計算等電点と第２親ホモ二量体抗体種の計算等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、望ましい開始ｐＨは、９．０未満；８．５未満；８．０未満；７．５未満；７．０未満；６．５未満；６．０未満；５．５未満；５．０未満；４．５未満；４．０未満；３．５未満；もしくは３．０未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、望ましい終了ｐＨは、７．０超；７．５超；８．０超；８．５超；９．０超；９．５超；１０．０超；１０．５超；もしくは１１．０超；１１．５超；１２．０超；１２．５超；１３．０超；１３．５超；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）は約３〜１１である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）は、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される範囲である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）は、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される異なる範囲にある。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）は、約３．７５；約４．７６；約６．１０；約６．９０；約８．０４；約８．４４；約９．３９；及び約１０．５０からなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩは第１軽鎖可変領域を含む第３ポリペプチドをさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩは第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドをさらに含み、第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドのそれぞれは第２軽鎖可変領域を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１軽鎖可変領域及び第２軽鎖可変領域は同一である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドは同一である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドそれぞれはＦｃ領域をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドそれぞれは野生型Ｆｃ領域をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドそれぞれは、ＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域、ＩｇＧ３アイソタイプＦｃ領域、ＩｇＧ３アイソタイプＦｃ領域、またはＩｇＧ４アイソタイプＦｃ領域をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドそれぞれはＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドそれぞれは、第１親ホモ二量体抗体種、第２親ホモ二量体種、またはＭＡＩのｐＩを変化させるために改変されてはいないＦｃ領域をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドそれぞれは、第１親ホモ二量体抗体種、第２親ホモ二量体種、またはＭＡＩのｐＩを変化させるために改変されてはいないＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩが天然抗体型であるか；少なくとも第１親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；少なくとも第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；第１親ホモ二量体抗体種が天然型であり、かつ、第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；またはＭＡＩが天然抗体型であり、第１親ホモ二量体抗体種が天然型であり、かつ、第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるかのいずれかである。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ＭＡＩ；第１親ホモ二量体抗体種；第２親ホモ二量体抗体種；第１親ホモ二量体抗体種及び第２親ホモ二量体抗体種；またはＭＡＩ、第１親ホモ二量体抗体種及び第２親ホモ二量体抗体種が、ＩｇＧ１型、及びＩｇＧ２型、及びＩｇＧ３型、もしくはＩｇＧ４型であるか、またはハイブリッド型であるかのいずれかである。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィーは実質的に同じイオン強度で実施される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液のイオン強度は溶出ステップの間中実質的に同じままである。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液の第１サンプル及び溶離液の第２サンプルそれぞれは実質的に同じイオン強度を有する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィーである。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィーは、カチオン交換クロマトグラフィー；アニオン交換クロマトグラフィー；多モードクロマトグラフィー；及び混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィー材料は、アニオン交換体及びカチオン交換体からなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィー材料は、強カチオン交換体；強アニオン交換体；多モード交換体；及び混合モード交換体からなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィー材料は、強カチオン交換体及び強アニオン交換体からなる群から選択される。単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィーは、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、Ｐｏｒｏｒｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＵＮＯｓｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択されるクロマトグラフィー材料を用いることをさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィーは、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬから選択されるクロマトグラフィー材料を用いることをさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィー材料はイオン交換クロマトグラフィー材料である。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、クロマトグラフィー材料は、カチオン交換クロマトグラフィー材料；アニオン交換クロマトグラフィー材料；多モードクロマトグラフィー材料；及び混合モードクロマトグラフィー材料からなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、Ｐｏｒｏｒｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＵＮＯｓｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬから選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１重鎖可変領域または第２重鎖可変領域のいずれかは、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１重鎖可変領域及び第２重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、第２重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、第１重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、第２重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、ライブラリーの少なくとも１つは少なくとも１つの軽鎖をさらに含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、組成物は、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって発現される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、組成物は、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって発現される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、組成物は、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド、及び第４ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって発現される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、コードされたポリペプチドそれぞれは宿主細胞によって発現される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、組成物は宿主細胞によって発現される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、実質的にすべての宿主細胞は、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド、及び第４ポリペプチドで形質転換または形質移入されている。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、実質的にすべての宿主細胞は、ＭＡＩ、第１親抗体種及び第２親抗体種を発現する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、宿主細胞は、真核細胞；真菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳類細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞；哺乳類細胞；ＣＯＳ細胞；ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞；及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、イオン交換溶離液は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるためのカチオン交換溶離液またはアニオン交換溶離液を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるための、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩を含むイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるための、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及びＮａＣｌを含むイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるためのアニオン交換溶離液を含むイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるための、メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩を含むアニオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるための、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及びＮａＣｌを含むカチオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、親ホモ二量体種からＭＡＩを分離するのに用いるためのアニオン交換溶離液を含むイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、カチオン交換溶離液は、ＴＲＩＳ、ピペラジン、またはイミダゾールを含まない。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩から本質的になるイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩からなるイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、本発明は、ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を含む組成物からＭＡＩを精製するために用いられる上記のいずれか１つに記載のイオン交換溶離液を提供する。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液は、０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択される濃度範囲で少なくとも１つの塩を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液の各サンプルは約１０ｍＭの濃度で少なくとも１つの塩を含む。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、塩はＮａＣｌである。
単独で、または本明細書に開示の任意の他の実施形態と組み合わせて用いられ得るある実施形態において、溶離液の各サンプルは約１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。
当業者であれば理解するように、上記及び全体を通して開示するあらゆるすべての実施形態は任意の組合せで実施されてよく、したがって、すべてのそのような組合せを企図し、ここに開示し、本発明の範囲内に含める。
図１Ａ及び１Ｂは、実施例に記載の例示的な溶離液の組成（緩衝剤及び塩）を示す。例示的な溶離液中のリストした各成分（緩衝剤及び塩）の最終濃度、ならびにリストした各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）を示す。図１Ａは、カチオン交換法のために設計された例示的な溶離液組成物を示す（しかし、実施例に記載のように、特定のアニオン交換法にも用いた）。図１Ｂは、実施例のいくつかで用いた例示的なアニオン交換溶離液組成物を示す。 図１Ａ及び１Ｂは、実施例に記載の例示的な溶離液の組成（緩衝剤及び塩）を示す。例示的な溶離液中のリストした各成分（緩衝剤及び塩）の最終濃度、ならびにリストした各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）を示す。図１Ａは、カチオン交換法のために設計された例示的な溶離液組成物を示す（しかし、実施例に記載のように、特定のアニオン交換法にも用いた）。図１Ｂは、実施例のいくつかで用いた例示的なアニオン交換溶離液組成物を示す。 Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムを用いて、２つの異なる重鎖ホモ二量体抗体種に由来する２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）ならびに２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む目的の多重特異性抗体を分離した、実施例１に記載のカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。２つの異なる重鎖の計算等電点（ｐＩ）は０．６８ｐＨ単位異なっていた（「ＨＣ ΔｐＩ：０．６８」）。２つの対応する親ホモ二量体抗体種（それぞれ「ｍＡｂ Ａホモ二量体」及び「ｍＡｂ Ｂホモ二量体」）の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なる（「ｍＡＢ ΔｐＩ：１．３３」）。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；ｍＬ＝ミリリットル単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体種）はＩｇＧ１型であった。 ４つの異なる目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）を分離する塩勾配（すなわちイオン強度勾配）カチオン交換クロマトグラフィー及びｐＨ勾配カチオン交換クロマトグラフィーの能力の比較を示し、各ＭＡＩは、４セットの２つの対応する親ホモ二量体抗体種のうちの１セットに由来する２つの異なる重鎖ポリペプチド；及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む。２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は、図及び実施例５に記載のように、それぞれ１．３３、０．２６、０．１１、及び０．１ｐＨ単位異なっていた。実験に用いた樹脂及びバッファー組成物を図３の上表に示す。 図４Ａ〜４Ｃは、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（図４Ａ及び図４Ｂ）またはＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム（図４Ｃ）のいずれかを用いて、２つの対応する重鎖親ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例２に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。２つの異なる重鎖のｐＩ計算値は０．２５ｐＨ単位異なっており、２つの対応する親ホモ二量体種のｐＩ計算値は０．５９ｐＨ単位異なっていた。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点（ｐＩ）の差；ｍＬ＝ミリリットル単位の溶出体積。図４Ａは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．６〜ｐＨ８．２；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の０．２２８ミリグラム（ｍｇ）の全タンパク質材料の分離を示す。図４Ｂは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．９〜ｐＨ７．９；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の１．５７ｍｇの全タンパク質材料の分離を示す。図４Ｃは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．９〜ｐＨ７．９；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の８．８８ｍｇの全タンパク質材料の分離を示す。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図４Ａ〜４Ｃは、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（図４Ａ及び図４Ｂ）またはＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム（図４Ｃ）のいずれかを用いて、２つの対応する重鎖親ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例２に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。２つの異なる重鎖のｐＩ計算値は０．２５ｐＨ単位異なっており、２つの対応する親ホモ二量体種のｐＩ計算値は０．５９ｐＨ単位異なっていた。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点（ｐＩ）の差；ｍＬ＝ミリリットル単位の溶出体積。図４Ａは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．６〜ｐＨ８．２；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の０．２２８ミリグラム（ｍｇ）の全タンパク質材料の分離を示す。図４Ｂは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．９〜ｐＨ７．９；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の１．５７ｍｇの全タンパク質材料の分離を示す。図４Ｃは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．９〜ｐＨ７．９；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の８．８８ｍｇの全タンパク質材料の分離を示す。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図４Ａ〜４Ｃは、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（図４Ａ及び図４Ｂ）またはＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム（図４Ｃ）のいずれかを用いて、２つの対応する重鎖親ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例２に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。２つの異なる重鎖のｐＩ計算値は０．２５ｐＨ単位異なっており、２つの対応する親ホモ二量体種のｐＩ計算値は０．５９ｐＨ単位異なっていた。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点（ｐＩ）の差；ｍＬ＝ミリリットル単位の溶出体積。図４Ａは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．６〜ｐＨ８．２；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の０．２２８ミリグラム（ｍｇ）の全タンパク質材料の分離を示す。図４Ｂは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．９〜ｐＨ７．９；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の１．５７ｍｇの全タンパク質材料の分離を示す。図４Ｃは、表示したｐＨ範囲（約ｐＨ６．９〜ｐＨ７．９；ｙ軸を参照）にわたるリニア勾配の間の８．８８ｍｇの全タンパク質材料の分離を示す。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００カラムを用いて、２つの対応する重鎖ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例３に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。図５Ａは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．６８ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が１．３３ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｂは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．４８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｃは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２５ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．５９ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｄは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２４であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．２６ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｅは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２１であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．３８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００カラムを用いて、２つの対応する重鎖ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例３に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。図５Ａは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．６８ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が１．３３ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｂは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．４８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｃは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２５ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．５９ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｄは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２４であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．２６ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｅは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２１であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．３８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００カラムを用いて、２つの対応する重鎖ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例３に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。図５Ａは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．６８ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が１．３３ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｂは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．４８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｃは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２５ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．５９ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｄは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２４であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．２６ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｅは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２１であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．３８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００カラムを用いて、２つの対応する重鎖ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例３に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。図５Ａは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．６８ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が１．３３ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｂは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．４８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｃは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２５ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．５９ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｄは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２４であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．２６ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｅは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２１であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．３８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図５Ａ〜５Ｅは、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００カラムを用いて、２つの対応する重鎖ホモ二量体種から２つの異なる重鎖ポリペプチド（重鎖「Ａ」及び重鎖「Ｂ」）及び２コピーの同一軽鎖（すなわち「共通軽鎖」）を含む多重特異性抗体を分離した、実施例３に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。図５Ａは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．６８ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が１．３３ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｂは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．４８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｃは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２５ｐＨ単位であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．５９ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｄは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２４であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．２６ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図５Ｅは、２つの重鎖間のｐＩ計算値の差が０．２１であり；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．３８ｐＨ単位異なっていたヘテロ二量体及び親種の分離を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 図６Ａ〜６Ｇは、実施例６に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験（図６Ａ〜６Ｇ）の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。表示順にそれぞれ配列番号４０〜４３と開示される配列。 本明細書に開示の方法が、親ホモ二量体抗体種の重鎖ＶＨ領域がわずか１アミノ酸だけ異なる場合に、ＭＡＩ及びその親ホモ二量体抗体種を含む組成物からＭＡＩを分離する能力を提供することを示す。ＩＡＥＹは配列番号４０であり；ＩＡＱＹは配列番号４１であり；ＩＳＫＹは配列番号４２であり；ＶＡＫＨは配列番号４３である。 図８Ａ〜８Ｃは、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬまたはＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬのそれぞれを用いた、重鎖のｐＩ計算値の差が０．０９である（２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１０ｐＨ単位異なっていた）ＩｇＧ１型の抗体種の精製度を比較した、実施例４に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。クロマトグラフィー条件は実施例４に記載の通りであった。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。図８Ａは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬであり（カラム体積は１ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ４．０〜ｐＨ１１．０（ｐＨ勾配範囲＝７．０ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図８Ｂは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬであり（カラム体積は８ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ６．６５〜７．６５（ｐＨ勾配範囲＝１．０ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図８Ｃは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬであり（カラム体積は８ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ６．８７〜７．２７（ｐＨ勾配範囲＝０．４ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。 図８Ａ〜８Ｃは、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬまたはＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬのそれぞれを用いた、重鎖のｐＩ計算値の差が０．０９である（２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１０ｐＨ単位異なっていた）ＩｇＧ１型の抗体種の精製度を比較した、実施例４に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。クロマトグラフィー条件は実施例４に記載の通りであった。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。図８Ａは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬであり（カラム体積は１ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ４．０〜ｐＨ１１．０（ｐＨ勾配範囲＝７．０ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図８Ｂは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬであり（カラム体積は８ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ６．６５〜７．６５（ｐＨ勾配範囲＝１．０ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図８Ｃは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬであり（カラム体積は８ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ６．８７〜７．２７（ｐＨ勾配範囲＝０．４ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。 図８Ａ〜８Ｃは、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬまたはＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬのそれぞれを用いた、重鎖のｐＩ計算値の差が０．０９である（２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１０ｐＨ単位異なっていた）ＩｇＧ１型の抗体種の精製度を比較した、実施例４に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。クロマトグラフィー条件は実施例４に記載の通りであった。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ１型であった。図８Ａは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬであり（カラム体積は１ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ４．０〜ｐＨ１１．０（ｐＨ勾配範囲＝７．０ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図８Ｂは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬであり（カラム体積は８ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ６．６５〜７．６５（ｐＨ勾配範囲＝１．０ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。図８Ｃは、用いた交換体がＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬであり（カラム体積は８ｍＬであった）、ｐＨ勾配をｐＨ６．８７〜７．２７（ｐＨ勾配範囲＝０．４ｐＨ単位）で実施したヘテロ二量体及び親種の分離を示す。 実施例７に記載の実験の結果を示す。 実施例７に記載の実験の結果を示す。 実施例７に記載の実験の結果を示す。 実施例７に記載の実験の結果を示す。 実施例７に記載の実験の結果を示す。 実施例７に記載の実験の結果を示す。 実施例８に記載の実験の結果を示す。 実施例８に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例９に記載の実験の結果を示す。 実施例１０に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。 実施例１０に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。 実施例１０に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。 実施例１０に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。すべての抗体（ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種）は天然ＩｇＧ４型であった。 実施例１１に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。 実施例１１に記載の独立したカチオン交換クロマトグラフィー実験の略図を示す。Ａ２８０＝２８０ｎｍの波長で測定した吸光度単位；ΔｐＩ＝２つの異なる重鎖間の計算等電点の差；実行時間＝ミリリットル（ｍＬ）単位の溶出体積。ＭＡＩはハイブリッド天然ＩｇＧ１／天然ＩｇＧ４型であり、第１親ホモ二量体抗体種は天然ＩｇＧ１型であり、第２親ホモ二量体抗体種は天然ＩｇＧ４型であった。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１３に記載の実験の結果を示す。 実施例１４に記載の実験の結果を示す。 実施例１５に記載の実験の結果を示す。 実施例１５に記載の実験の結果を示す。 図２６Ａ及び２６Ｂは併せて、開示及び特許請求する方法に従う使用に適した例示的なクロマトグラフィー材料（「樹脂」及び「マトリックス」）ならびにそれらの特徴のいくつかのリストを示す。 図２６Ａ及び２６Ｂは併せて、開示及び特許請求する方法に従う使用に適した例示的なクロマトグラフィー材料（「樹脂」及び「マトリックス」）ならびにそれらの特徴のいくつかのリストを示す。
本発明は、とりわけ、少なくとも２つの異なる親ホモ二量体抗体種（本明細書全体を通して同じ意味で「親抗体種」、「ホモ二量体親抗体種」、「重鎖ホモ二量体親抗体種」、「重鎖ホモ二量体親種」などと呼ぶ）から、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）（本明細書全体を通して同じ意味で「ヘテロ二量体抗体種」、または「重鎖ヘテロ二量体抗体」、こうした用語の代替となる単数形及び複数形、などと呼ぶ）を分離、分割及び精製する方法を提供する。有利には、本開示の方法は、ホモ二量体親抗体種のいずれかへの、そのような親抗体種からのＭＡＩの分離、分割、または精製を目的とした変異の組込みまたは導入を必要としない。
本方法は、とりわけ、上述の種のそれぞれを含む組成物を入手すること、及びその組成物でクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィーを実施し、それによって、ＭＡＩを第１親抗体種及び第２親抗体種のそれぞれから分離することを含む。ある実施形態において、ＭＡＩは第１重鎖（ＨＣ）可変領域及び第２重鎖可変領域を含む第１ポリペプチドを含み、第１及び第２可変領域は異なる抗原特異性及び異なる等電点（ｐＩ）を有する。ある実施形態において、異なる等電点は異なる実際の等電点である。ある他の実施形態において、異なる等電点は異なる計算等電点である。ある他の実施形態において、ＭＡＩは第１軽鎖可変領域を含む第３ポリペプチドをさらに含む。ある他の実施形態において、ＭＡＩは第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドをさらに含み、第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドのそれぞれは第２軽鎖可変領域を含む。ある他の実施形態において、第１軽鎖可変領域及び第２軽鎖可変領域は同一である。ある他の実施形態において、第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドは同一である（すなわち、これらは「共通軽鎖」となる）。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、「特異性」は、目的の抗原の１つ以上の抗原決定基、例えば１つ以上のエピトープなどとは反応し、かつ目的の抗原の他のエピトープまたは目的の他の抗原とは反応しないことを可能にする抗体の特性のことをいう。当該技術分野において理解されるように、抗体特異性は、エピトープ及び／または抗体の結合部位の化学組成、物理的力、エネルギー的優位性、立体障害、及び分子構造またはトポロジーに依存する。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、「アフィニティー」は抗体−エピトープ相互作用の強度、または安定性のことをいう。エピトープに対するアフィニティーが高い抗体は比較的強固に及び／または安定してエピトープに結合する一方で、エピトープに対するアフィニティーが低い抗体は比較的弱く及び／またはより不安定に結合する。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、目的の抗原のエピトープ（複数可）に対する特異性を有する抗体を「収集する」または「収集した」とは、そのような特異性を有しない抗体からそのような特異性を有する抗体を区別する（または区別した）ことを意味する。目的の抗原のエピトープ（複数可）に対する特異性を有する抗体を収集すること、または抗体を収集したことは、それらを区別するために、そのような特異性を有しない抗体からの抗体の物理的分離を必要としなくてもよい。しかし、ある実施形態において、目的の抗原のエピトープ（複数可）に対する特異性を有する抗体を収集することは、そのような特異性を有しない抗体からそのような抗体を物理的に分離することを含む。抗体を収集する例示的な方法及び手段は当該技術分野において公知であり、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、及びこれらの組合せが挙げられる。
全体を通して開示する方法においてそのような特異性を判定するために、当該技術分野におけるそのような特異性を判定する任意の手段を用いてよく、例えば、検出可能標識でそのような抗体を標識化すること；検出可能標識を検出すること；抗原のエピトープ（複数可）に結合している抗体の機能的な結果、例えばそのようなエピトープ（複数可）に対する特異性を有することが既知の別の抗体との競合などを検出すること；目的の抗原と既知のタンパク質相互作用パートナーまたはリガンドとの間のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−リガンド相互作用の変化が挙げられる。
本明細書全体で用いる場合、「共通軽鎖」は、少なくとも２つの異なる重鎖ポリペプチドと独立して安定的に対合し、それによって、それぞれの独立した場合において、各重鎖ポリペプチドの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを生成することができる軽鎖可変領域を含むポリペプチドを含む。したがって、共通軽鎖の２つのコピーのそれぞれは、第１重鎖ポリペプチド及び第２重鎖ポリペプチドと安定的に対合することができ、その結果、天然型、例えばＩｇＧアイソタイプ型、例えばＩｇＧ１型、及びＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、及び／またはＩｇＧ４型などの多重特異性（例えば二重特異性）ヘテロ二量体抗体ＭＡＩは、２つの異なる抗原に対する特異性を有する。
本明細書全体で用いる場合、「安定な対」は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチド、例えば共通軽鎖などとの間の天然または天然様相互作用が生じ、ＭＡＩが化学的及び機能的に意味のある安定な状態にあることを意味する。
本明細書全体で用いる場合、「安定」は比較的固定されている及び／または恒常的であることを意味する。したがって、「安定」なＭＡＩまたは関連するポリペプチドの「安定」な対は、例えば、安定な形態で収集及び／または単離され得るものであり、そのため、その形態が実質的に保存されており、安定な形態の化学的及び／または機能的特性を観察することができるものである。
本明細書全体で用いる場合、「天然」、「野生型」は、天然環境、例えば動物または動物種、例えばヒトまたはヒト種などにおいて存在する型である分子、ポリペプチド、抗体、型、免疫グロブリン、免疫グロブリン定常領域、Ｆｃ領域、重鎖、軽鎖、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＭＡＩ、親ホモ二量体抗体種、親ホモ二量体抗体種由来の重鎖などといった構造または存在を表現する。そのような「天然」または「野生型」構造または存在は、例えば、非組換え構造または存在からそのような組換え構造または存在を分割、分離、または精製する能力を増加または向上させる目的でそのような構造または存在に組み込まれた変異を保有または含有しない。例えば、「天然」または「野生型」のＭＡＩ、親ホモ二量体抗体種、親ホモ二量体抗体種由来の重鎖などは、本明細書全体で開示する方法に従ってクロマトグラフィーを実施することによってそのような異なる形態を分離、分割、または精製する能力を増加または向上させるために、そのようなＭＡＩ、親ホモ二量体抗体種、親ホモ二量体抗体種由来の重鎖の異なる形態間における実際の等電点または計算等電点のいずれかの差を増加または増大させる変異を有するように組換えられていない。
本明細書全体で用いる場合、「天然様」は、その構造または存在の天然型の実質的に大部分の特性を有するか、または対応する天然構造または存在とかなりの程度で物理的及び／または機能的に類似するように、もしくは模倣するように設計されている構造または存在を表現する。
ある実施形態において、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、第１及び第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、ｉ）ＭＡＩ、第１ポリペプチドの１つのコピーを含む第１親抗体種、及び第２ポリペプチドの１つのコピーを含む第２親抗体種を含む組成物を入手すること；ならびにｉｉ）ＭＡＩを第１及び第２親抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施することを含み、それによってＭＡＩを精製する方法を提供する。ある実施形態において、異なる等電点は異なる実際の等電点である。ある他の実施形態において、異なる等電点は異なる計算等電点である。ある実施形態において、実施ステップｉｉ）は、ａ．組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびにｂ．ｐＨ依存的にＭＡＩ及び親抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルとクロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施することを含む。
ある実施形態において、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、第１及び第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、ｉ）ＭＡＩ、第１ポリペプチドの２つのコピーを含む第１親抗体種、及び第２ポリペプチドの２つのコピーを含む第２親抗体種を含む組成物を入手すること；ならびにｉｉ）ＭＡＩを第１及び第２親抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施することを含み、それによってＭＡＩを精製する方法を提供する。ある実施形態において、異なる等電点は異なる実際の等電点である。ある他の実施形態において、異なる等電点は異なる計算等電点である。ある実施形態において、実施ステップｉｉ）は、ａ．組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびにｂ．ｐＨ依存的にＭＡＩ及び親抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルとクロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施することを含む。
本発明の方法の開発に関連して、出願人らは驚くべきことに、多くの先行方法に反して、本発明の方法を実施して成功させるのに、ＭＡＩ（または親抗体種）のＦｃ領域（またはさらに言えば任意の他の部分）は、対応する親ホモ二量体抗体種からのヘテロ二量体ＭＡＩのアフィニティーまたはイオン交換のいずれかで媒介される分割、分離、または精製を向上させるように設計または意図された形で、組換え、変異誘発、置換、または他の方法により改変される必要がないことを発見した。したがって、開示及び特許請求する方法は、有利なことに、免疫原性、ＰＫ、及びそのような非天然変異が組み込まれたＭＡＩに関連する他の障害の多くを付与することのないＭＡＩの調製及び精製をもたらす。
したがって、ある実施形態において、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、第１及び第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、ｉ）ＭＡＩ、第１ポリペプチドの１つのコピーを含む第１親抗体種、及び第２ポリペプチドの１つのコピーを含む第２親抗体種を含む組成物を入手すること；ならびにｉｉ）ＭＡＩを第１及び第２親抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施することを含み、それによってＭＡＩを精製する方法を提供するが、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドの少なくとも１つは、天然型、例えば天然ＩｇＧ型、例えば天然ＩｇＧ１型、天然ＩｇＧ２型、天然ＩｇＧ３型、天然ＩｇＧ４型、天然ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド型、天然ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド型、または天然ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッド型などである。ある実施形態において、異なる等電点は異なる実際の等電点である。ある他の実施形態において、異なる等電点は異なる計算等電点である。ある実施形態において、実施ステップｉｉ）は、ａ．組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびにｂ．ｐＨ依存的にＭＡＩ及び親抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルとクロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施することを含む。
したがって、ある実施形態において、目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、第１及び第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、ｉ）ＭＡＩ、第１ポリペプチドの２つのコピーを含む第１親抗体種、及び第２ポリペプチドの２つのコピーを含む第２親抗体種を含む組成物を入手すること；ならびにｉｉ）ＭＡＩを第１及び第２親抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施することを含み、それによってＭＡＩを精製する方法を提供するが、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドの少なくとも１つは、天然型、例えば天然ＩｇＧ型、例えば天然ＩｇＧ１型、天然ＩｇＧ２型、天然ＩｇＧ３型、天然ＩｇＧ４型、天然ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド型、天然ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド型、または天然ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッド型などである。ある実施形態において、異なる等電点は異なる実際の等電点である。ある他の実施形態において、異なる等電点は異なる計算等電点である。ある実施形態において、実施ステップｉｉ）は、ａ．組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびにｂ．ｐＨ依存的にＭＡＩ及び親抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルとクロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施することを含む。
本明細書全体で用いる場合、「精製」は、ＭＡＩに関してはＭＡＩ及び１つ以上の親ホモ二量体種を含む不均質な組成物から実質的に均質なサンプルを生成するように、１つの種、例えばヘテロ二量体ＭＡＩなどを他の種、例えば１つ以上の親ホモ二量体種などから分離することを意味する。
本明細書全体で用いる場合、「入手」は、ある材料、例えばＭＡＩ、親ホモ二量体抗体種、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチド、軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチド、上記のいずれかを含むＭＡＩ、上記のいずれかを含む親ホモ二量体抗体種、上記のいずれかを含む組成物、及び／または上記のいずれかを含むクロマトグラフィー材料−組成物複合物などを発見、受領、または他の形で所有するようになることを意味する。さらに、入手は、抗原に対する特異性を有するそのような材料を同定するために、抗原を用いてそのような材料のバリアントを含むライブラリーを照会することによって、そのような材料を発見することをいう場合がある。入手は、さらにまた代替として、そのような材料を別の供給元または人物から受領することを含む場合がある（例えば別の既に特定または同定された抗体または抗体配列など）。
本明細書全体で用いる場合、「組成物」は、ヘテロ二量体ＭＡＩ及び２つの対応する親ホモ二量体抗体種などの種の集合を含有する流体、例えば液体などを意味する。そのような組成物は、第１及び第２ポリペプチド、ならびに任意により第３及び第４ポリペプチド（これらは同一の軽鎖可変領域を含み得る）を発現させることによって生成される。
目的のヘテロ二量体多重特異性抗体（全体を通して「ヘテロＭＡＩ」または「ＭＡＩ」と同じ意味で用いる）は、第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２ポリペプチドを含み、第１及び第２重鎖可変領域がアミノ酸配列において異なり、異なる抗原特異性を有する目的の抗体種を意味する。第１及び第２ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、２つの異なる親ホモ二量体抗体種の重鎖ポリペプチドに含まれている、及び／またはこれに由来する。ある実施形態において、ＭＡＩは第１軽鎖可変領域を含む第３ポリペプチドをさらに含む。さらなる実施形態において、ＭＡＩは第２軽鎖可変領域を含む第４ポリペプチドをさらに含む。ある実施形態において、第１及び第２軽鎖可変領域は同一である。またさらなる実施形態において、第３及び第４ポリペプチドは同一である（すなわち、これらは「共通軽鎖」となる）。
「親ホモ二量体抗体種」（全体を通して「ホモ二量体親抗体種」、「親抗体種」、「ホモ二量体親種」、「ホモ二量体抗体種」などと同じ意味で用いる）は、ＭＡＩの特異性が得られるか、または由来し、ＭＡＩが生成されるもとの２つの抗原特異性のうちの一方を有する重鎖の少なくとも１つのコピー；及びＭＡＩの特異性が得られるか、または由来し、ＭＡＩが生成されるもとの２つの抗原特異性のうちの一方を有する重鎖の少なくとも２つのコピーを含む抗体種を意味する。ある実施形態において、第１及び第２重鎖可変領域を含む各親ホモ二量体抗体種のポリペプチドは、第１及び第２軽鎖可変領域を含む第３及び第４ポリペプチドとともに宿主細胞中で発現される。いくつかの実施形態において、第１及び第２軽鎖可変領域はアミノ酸配列が同一である。ある実施形態において、第３及び第４ポリペプチドはアミノ酸配列が同一である（すなわち、第３及び第４ポリペプチドは「共通軽鎖」となる）。ある実施形態において、親ホモ二量体種は、ＭＡＩの特異性が得られるか、または由来し、ＭＡＩが生成されるもとの２つの抗原特異性のうちの一方を有する重鎖の２つのコピーを含む。
本明細書全体で用いる場合、「クロマトグラフィー」は、最も広義に、目的の種に加えて他の種を含む組成物からの目的の種の分離または精製のために当該技術分野において利用可能な一連の実験を意味する。組成物をクロマトグラフィー材料と接触させ、その結果として、組成物の様々な成分がクロマトグラフィー材料に吸着し、これによりクロマトグラフィー材料−組成物複合物が形成され得る。その後、溶離液をクロマトグラフィー材料−組成物複合物と接触させると、溶離液の存在下でのクロマトグラフィー材料に対するそれぞれの種のアフィニティーの差に応じて吸着した種の差次的脱離、または「溶出」が生じる。
クロマトグラフィーは調製用または分析用であり得る。調製用クロマトグラフィーの目的は、より高度な使用のために混合物の成分を分離することである（したがって、精製の形態である）。分析用クロマトグラフィーは一般により少量の材料で行われ、混合物中のアナライトの相対比を測定するためのものである。この２つは相互に排他的ではない。
本明細書全体で用いる場合、「接触」は、例えば共有結合性または非共有結合性相互作用などによって、物理的に相互作用することを意味する。非共有結合性相互作用としては、疎水性、親水性、イオン性、カチオンアニオン性、極性、双極性、ファンデルワールス力などが挙げられる。「接触」した、または「接触」している材料は互いに物理的に接している。ある実施形態において、材料、例えばクロマトグラフィー材料などを抗体種、例えばＭＡＩ及び対応するホモ二量体親抗体種などを含む組成物と接触させた結果、クロマトグラフィー材料−組成物複合物が生成され、組成物中のすべての抗体種のうちの少なくとも２つ、ことによると３つ、あるいはさらに多くがクロマトグラフィー材料と物理的に相互作用して付着したままとなる。
「クロマトグラフィー材料−組成物複合物」は、それまで接触または相互作用していなかった２つの材料またはより多くの材料の間の物理的相互作用によって生成される多成分材料を意味する。物理的相互作用は、生理化学的相互作用、例えば２種類の分子実体の間の、及び／または相互作用する材料それぞれに存在するある官能基もしくは部分の間の共有結合性または非共有結合性相互作用などであり得る。クロマトグラフィー材料−組成物複合物は、組成物をクロマトグラフィー材料に接触させると同時にまたはその後でクロマトグラフィー材料上／中に吸着される組成物の１つ以上の抗体種を含み得るが、こうした吸着はクロマトグラフィー材料上の官能基と抗体種のある領域または部分との間の生理化学的引力または相互作用に起因する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はカチオン交換材料である。いくつかの実施形態において、カチオン交換材料は、負に帯電し、固相上または固相中に通す水溶液中のカチオンとの交換のための遊離カチオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、カチオン交換材料は膜、モノリス、または樹脂であり得る。いくつかの実施形態において、カチオン交換材料は樹脂であり得る。カチオン交換材料は、カルボン酸官能基またはスルホン酸官能基、例えば限定はしないがスルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、またはオルトホスフェートなどを含み得る。上記のいくつかの実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィー材料はカチオン交換クロマトグラフィーカラムである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はアニオン交換材料である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、正に帯電し、固相上または固相中に通す水溶液中のアニオンとの交換のための遊離アニオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アニオン交換材料は膜、モノリス、または樹脂であり得る。一実施形態において、アニオン交換材料は樹脂であり得る。いくつかの実施形態において、アニオン交換材料は、一級アミン、二級アミン、三級アミンもしくは四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、またはジエチルアミノエチル官能基を含み得る。上記のいくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー材料はアニオン交換クロマトグラフィーカラムである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、イオン交換材料には従来のクロマトグラフィー材料または対流クロマトグラフィー材料を利用してよい。従来のクロマトグラフィー材料としては、例えば、灌流性材料（例えばポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散性材料（例えば架橋アガロース樹脂）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂はＰｏｒｏｓ樹脂とすることができる。いくつかの実施形態において、架橋アガロース樹脂はスルホプロピル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（「ＳＰＳＦＦ」）樹脂であり得る。対流クロマトグラフィー材料は膜（例えばポリエーテルスルホン）またはモノリス材料（例えば架橋ポリマー）であり得る。ポリエーテルスルホン膜はＭｕｓｔａｎｇであり得る。架橋ポリマーモノリス材料は架橋ポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−エチレンジメタクリレート）であり得る。
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はクロマトグラフィーカラム；例えばカチオン交換クロマトグラフィーカラムまたはアニオン交換クロマトグラフィーカラムに入っている。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーカラムは液体クロマトグラフィーに用いられる。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーカラムは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に用いられる。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーカラムはＨＰＬＣクロマトグラフィーカラム；例えばカチオン交換ＨＰＬＣカラムまたはアニオン交換ＨＰＬＣカラムである。
カチオン交換クロマトグラフィー材料の例は当該技術分野において公知であり、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０及びＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０ＨＴが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、カチオン交換材料はＰｏｒｏｓ ＨＳ５０である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ樹脂はＰｏｒｏｓ ＨＳ ５０μｍまたはＰｏｒｏｓ ＨＳ ２０μｍ粒子である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｓ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、及びＳｏｕｒｓｅ ３０Ｓからなる群から選択される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓからなる群から選択される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｓ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓからなる群から選択される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓからなる群から選択される。
アニオン交換クロマトグラフィー材料の例は当該技術分野において公知であり、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｑ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ １０ ＳＡＸ及びＴｏｓｏｈ ＧＳＫｇｅｌ Ｑ ＳＴＡＴ ７ μΜ ＷＡＸならびにＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｓｏｕｒｓｅ ３０Ｑ、及びＱ ＨＰからなる群から選択される。多モードイオン交換クロマトグラフィー材料の例はＣａｐｔｏ ＭＭＣである。
本明細書全体で用いる場合、「ｅｌｕａｎｔ（溶離液）」（「ｅｌｕｅｎｔ（溶離液）」と同じ意味で用いる）は、クロマトグラフィー材料上に吸着した種を脱離させるために用いられる流体、例えば溶液などを含む。開示及び特許請求する方法に従う使用のための溶離液は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つの異なる緩衝剤を含む。数及び化学的素性の選択は、当業者がその間で実質的にリニアなｐＨ勾配を発生させようと望む所望のｐＨ範囲に基づいてなされ得る。ｐＨ範囲の選択は、今度は、本明細書全体で開示するように、第１重鎖ポリペプチド及び第２重鎖ポリペプチドの実際の等電点または計算等電点、もしくは理論等電点の差（「ΔｐＩ」）の判定に基づいてなされ得る。あるいは、所望であれば、当業者は今度は、本明細書全体で開示するように、第１親ホモ二量体抗体種及び第２親ホモ二量体抗体種の実際の等電点または計算等電点、もしくは理論等電点の差（（「ΔｐＩ」）の判定に基づいて選択してよい。したがって、当業者は、ポリペプチドのｐＩ（加えてそれらのｐＩの差）に関係するｐＨ範囲を十分にカバーするｐＫａを有する緩衝剤を選択するように選んでよい。
本明細書全体で用いる場合、「等電点」（本明細書全体で「ｐＩ」とも呼ぶ）は、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば重鎖ポリペプチド、親ホモ二量体抗体種、ＭＡＩ、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどが正味電荷を有しないｐＨであり、一般にｐＨ値として表される。等電点は「計算（もしくは理論）等電点」または「実際の（実験的に測定された）等電点」であり得る。
本明細書全体で用いる場合、「計算等電点」（または「理論等電点」）は、ポリペプチドまたはタンパク質の一次配列を、ポリペプチドもしくはタンパク質（もしくはその構成アミノ酸）及び／またはそれが曝露され得る溶媒成分もしくは他の化学種の化学的及び物理的性質；予測される二次構造的特徴及びトポロジー；特定のイオン化基の予測される溶媒への曝露などに関する仮定の、ある所定のパラメータに基づいて、予測的または理論上のｐＩ値が得られるように設計されたアルゴリズム、プログラム、コードなどにかけることによって報告または判定される等電点値である。ｐＩを計算するためのツール及び方法の非限定例としては、Ｂａｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｖｏｌ． ７２（３）， ｐｐ． ７６５−７８３ （２００８）；Ｓｔｏｔｈａｒｄ Ｐ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ． ２８（６）， ｐｐ． １１０２−１１０４ （２０００）；及び例えばワールドワイドウェブ上のハイパーテキストプロトコルトランスファーｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ （ＳＭＳ）に開示されているものが挙げられる。いずれにせよ、いかなる理論にも縛られることを望むものではなく、当業者であれば理解するように、重鎖ポリペプチド、親ホモ二量体抗体種、ＭＡＩ、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどについてｐＩを計算する際、例えば特定のシステイン残基、例えばジスルフィド架橋に関与し得るものなどを非イオン化性とみなすこと、及び／またはＮ末端グリコシル化部位と推測されるものを非イオン化性とみなすことが好ましい場合がある。
本明細書全体で用いる場合、「実際の等電点」（または「実際の等電点」）は、当該技術分野において利用可能な方法及びツールを用いて、ポリペプチドもしくはタンパク質、例えば重鎖ポリペプチド、親ホモ二量体抗体種、ＭＡＩ、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどの物理的サンプル（またはそのようなサンプルを含有する組成物、例えば溶液など）のｐＩを測定することによって報告または判定される等電点値である。
本明細書全体で用いる場合、「緩衝剤」は、別の酸または塩基の添加後にも溶液、例えば溶離液などの酸性度（ｐＨ）を選択した値付近に維持するために用いられる酸または塩基、一般に弱酸または弱塩基である。すなわち、緩衝剤の機能は溶液に酸または塩基が添加された際の急速なｐＨ変化を防止することである。緩衝剤の特性は一様ではなく、他よりも可溶性のものがあったり、酸性のものもあれば、塩基性のものもあったりする。所与の緩衝剤が最大限に溶液を緩衝することができる効果的なｐＨは、だいたいその緩衝剤の酸解離定数の負対数（「ｐＫａ」）付近である。酸会合定数（の負対数）は溶液中の酸強度の定量的尺度である。各酸は異なるｐＫａを有する。これは、酸−塩基反応との関係においては解離として知られている化学反応の平衡定数である。Ｋａ値が大きいほど、溶液中の分子の解離が多く、したがってその酸はより強力である。このように、強酸は弱酸よりも容易に脱プロトン化する傾向がある。
ある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤のｐＫａは約３〜約１１である。
ある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤のｐＫａは、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される範囲にある。
ある実施形態において、溶離液は少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）は、約３．７５；約４．７６；約６．１０；約６．９０；約８．０４；約８．４４；約９．３９；及び約１０．５０からなる群から選択される。
本明細書全体で用いる場合、「ｐＨ依存的」はｐＨ変化とともに変化するように振る舞うことを意味する。例えば、異なるｐＩを有する種は、溶離液がｐＨ勾配を発生させることができる場合、異なる区別可能な時間、溶離液の量でカラムから溶出する。そのようなｐＨ勾配は、ある実施形態において、望ましい開始ｐＨで溶離液のサンプルを調製し、望ましい終了ｐＨで溶離液の別のサンプルを調製することによって発生させる。ある実施形態において、望ましい開始ｐＨは、７．０未満；６．５未満；６．０未満；５．５未満；５．０未満；４．５未満；４．０未満；３．５未満；もしくは３．０未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。ある実施形態において、望ましい終了ｐＨは、７．０超；７．５超；８．０超；８．５超；９．０超；９．５超；１０．０超；１０．５超；もしくは１１．０超；１１．５超；１２．０超；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
ある実施形態において、ＭＡＩの第１ポリペプチドの計算等電点及び第２ポリペプチドの計算等電点の間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０５ｐＨ単位；０．０２５ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
ある実施形態において、第１抗体、例えば第１免疫グロブリン、第１ＩｇＧ、または第１親ホモ二量体抗体種などの計算等電点と第２抗体、例えば第２免疫グロブリン、第２ＩｇＧ、または第２ホモ二量体抗体種などの計算等電点との間の差は、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０５ｐＨ単位；０．０２５ｐＨ単位未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である。
本明細書で開示及び特許請求する方法では、クロマトグラフィー材料からＭＡＩ及び／または親ホモ二量体抗体種を溶出するために、溶離液をクロマトグラフィー材料−組成物複合物に流す。ある実施形態において、溶出される種は実質的に均質なサンプルの個々の溶液として溶出され、各サンプルは１つの種、例えばＭＡＩなどを含有し、測定可能な量の他の種、例えば親ホモ二量体抗体種などを実質的に含まない。他の実施形態では、１つの種、例えばＭＡＩなどが一連のまとまった量の溶液に溶出されるように、種がクロマトグラフィー材料から溶出され、そのうちのいくつかはＭＡＩの実質的に均質なサンプルを含み、いくつかは様々な少量の１つ以上の親ホモ二量体抗体種を伴って主な種としてＭＡＩを含む。そのような実施形態において、当業者は、ＭＡＩの実質的に均質なサンプルを含むまとまった量を保持し、他のまとまった量を廃棄するように定型的に選択し得る。
したがって、当業者であれば理解するように、本発明の方法は、ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種がクロマトグラフィー材料から溶出することを可能とし、その結果、これらの種が互いに実質的に区別可能となる。本明細書全体で用いる場合、「実質的に区別可能」とは、そのような種がクロマトグラフィー的に十分に分離されており、そのため、それぞれの種のサンプルが他の種を実質的に含まないで収集され得ることを意味する。そのような分離は、例えば時間、溶離液体積などの関数としてカラムから溶出するタンパク質材料の濃度を監視する他の手段の可視化を可能にするクロマトグラフィー記録で可視化され得る。そのような区別可能な分離は、それぞれの種の実質的にすべてが互いに分離される溶出、または２つ以上の種の溶出体積の間である量の重複が生じる溶出を含み得る。ある程度の重複が生じる実施形態において、当業者であれば理解するように、上記の通り、重複を全くまたは実質的に含まないと観察される溶離液体積が収集され、そうして、特許請求する方法に従う分離が達成され得る。
本明細書全体で用いる場合、「流す」（及び代替として「流した」）は、クロマトグラフィー材料及び／またはクロマトグラフィー材料−組成物複合物に十分な量の溶離液を加える及び／または通過させ、その結果として、材料及び／または複合物を溶離液と接触させることを意味する。当該技術分野において理解されるように、溶出ステップの前に材料またはマトリックスを平衡化するために、カラム体積の数倍に相当するそのような流体／溶液を流し、溶出ステップを実施する際に数倍体積に相当する量を流す場合がある。これは、ｐＨ勾配の傾き、ひいては、カラム上に吸着した様々な種を溶出するために必要となる全溶出体積を増加または減少させるために変更することができる。
しかし、有利には、ＭＡＩの大部分が重鎖ポリペプチドのｐＩまたはｐＩ差に関係無くそのようなＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を含む組成物から精製され得るように、当業者が所望し得る本明細書全体を通して記載するようなｐＨスケールの大部分にわたって、リニアｐＨ勾配段階；リニアｐＨ勾配段階の前の少なくとも１つのステップｐＨ勾配段階；リニアｐＨ勾配段階の後の少なくとも１つのステップｐＨ勾配段階；リニアｐＨ勾配段階のみ；実質的にリニアなｐＨ勾配段階などを含むｐＨ勾配を形成するために溶離液が用いられるように、多数の緩衝剤を本明細書に開示の適切な濃度で含む溶離液が調製され得るとさらに発見された。例えば、単一タンパク質混合物中の特定のモデルタンパク質を溶出すると判明したある例示的な溶離液（Ｋｒｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．， Ｖｏｌ． １２８５， ｐａｇｅｓ ７８−８７ （２０１３）を参照）は、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１で効果的に緩衝し、その結果、実質的にリニアなｐＨ勾配がこの範囲全体で発生し得るが、これは、Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、ギ酸、及びＮａＣｌを含有する。開示及び特許請求する方法のある実施形態に特に適していると意外にも発見された別の溶離液は、メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩を含む。本明細書全体を通して開示するように、これらの溶離液は、全体を通して開示及び特許請求する方法に規定するＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を含む組成物から様々なＭＡＩを精製するのにも効果的であることが発見された。これらの溶離液は約３〜約１１のｐＨ範囲にわたって実質的にリニアなｐＨ勾配を発生させるのに効果的であるので、本発明は、ある実施形態において、ＭＡＩの第１及び第２重鎖ポリペプチド（ひいては、対応する親ホモ二量体抗体種中の重鎖）のｐＩに関係なく、またはｐＩをあらかじめ知ることなく、ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種組成物を含む組成物からＭＡＩを精製するための方法を提供する。
本明細書全体で用いる場合、「リニアｐＨ勾配段階」または「リニアｐＨ勾配」は、全体を通して同じ意味で用いられ、比較的大きな溶離液体積または比較的多数の連続したカラム溶離液画分にわたってクロマトグラフィー材料及び／またはクロマトグラフィー材料−組成物複合物に流れるまたは流される溶出液の、ほとんど、または実質的に滑らかな一定の単位体積当たりの変化率を示すｐＨ勾配を意味する。
本明細書全体で用いる場合、「ステップｐＨ勾配段階」または「ステップｐＨ勾配」は、全体を通して同じ意味で用いられ、比較的少量の溶離液または比較的少数の連続したカラム溶離液画分にわたってクロマトグラフィー材料及び／またはクロマトグラフィー材料−組成物複合物に流れるまたは流される際に、溶離液の大きなｐＨ変化が生じるような比較的急なｐＨ変化を示すｐＨ勾配を意味する。そのようなステップｐＨ勾配段階は、実際には、観察可能な単位溶離液体積当たりの変化率を示すが、それでもなお、そのようなステップｐＨ勾配段階は、本明細書全体で用いる場合、リニアｐＨ勾配段階と区別可能である。ある実施形態において、そのようなステップｐＨ勾配段階は、リニアｐＨ勾配段階と比較して実質的に瞬間的な単位溶離液体積当たりのｐＨ変化率を示すと考えられる。
しかし、さらに、ＭＡＩ−親ホモ二量体親種混合物から特定のＭＡＩを分離することを目的としたクロマトグラフィー手順にそのようなステップｐＨ勾配段階を含めるのが望ましく有用であり得る状況においても、本明細書全体を通して記載する溶離液を用いて、ステップｐＨ勾配段階が採用され得ることが意外にも発見された。
ある実施形態において、溶離液は次の薬剤：イミダゾール；ピペラジン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含まない。
ある実施形態において、溶離液はＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに任意により少なくとも１つの塩から本質的になる。
他の実施形態において、溶離液はＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに少なくとも１つの塩からなる。
本発明の方法により、様々な塩濃度を選択することによって溶離液のイオン強度を望むように調整または操作することができる。したがって、ある実施形態において、塩濃度は、０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択され得る。
ある実施形態において、溶離液はＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む。
ある実施形態において、溶離液はＮａＣｌを約１０ｍＭの濃度で含む。
本明細書で開示及び特許請求する本発明の方法において、出願人らは、そのような組成物からのＭＡＩの容易な精製を助長するローディングバッファー及び溶離液組成物の両方をさらに発見し、また、ローディングバッファー及び溶出バッファーの両方に同じバッファー組成物（本明細書全体を通して「溶離液」と称する）が都合よく用いられ得ることをさらに発見した。すなわち、第１ｐＨ（「ローディングｐＨ」）のバッファー組成物の第１サンプル及び第２ｐＨ（「溶出ｐＨ」）のバッファー組成物の第２サンプルを調製しさえすればよく、ローディングｐＨ及び溶出ｐＨは、本発明の方法の溶出ステップ中に実質的にリニアなｐＨ勾配を発生させるために、当業者によって選択される。実質的にリニアなｐＨ勾配が適用されるべき望ましいｐＨ範囲は、例えばＭＡＩに含まれる各重鎖の予想されるｐＩの計算に基づいて決定され得る。同様に、適用されるべき勾配の傾きの決定は、ＭＡＩに含まれる各重鎖間のｐＩ単位の差（ΔｐＩ）を求めることによって与えられ得る。
本明細書全体を通して開示するように、本発明の方法は、ＭＡＩの精製、及び本方法を実施するための試薬、例えば緩衝剤、溶離液などをもたらす。
用語「抗体」は、本明細書において最も広義に用いられ、特に少なくともモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び抗体断片を包含する。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認知されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。
「抗体」は、例えばタンパク質；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；サイトカイン；ケモカイン；成長因子；神経伝達物質；炭水化物含有生体分子；脂質もしくは脂肪酸含有生体分子；または他の生体分子であり得る抗原に、そのような抗原上に存在するエピトープを介して特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはその誘導体のこともいう。
本明細書全体で用いる場合、「抗体」は、抗体の１つ以上の可変領域または可変ドメインを含むポリペプチドのこともいい、そのような可変領域（複数可）または可変ドメイン（複数可）は、１つ以上の抗原の１つ以上のエピトープに会合及び結合可能である。
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で用いる場合、少なくとも２つの共有結合しているアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は、自然発生アミノ酸及びペプチド結合でできていてもよく、または合成ペプチド模倣構造、すなわち「アナログ」、例えばペプチドなどでできていてもよい。
抗体（「免疫グロブリン」、または「免疫グロブリン分子」と同じ意味で用いる）は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体などとすることができ、１対の軽鎖（ＬＣ）及び１対の重鎖（ＨＣ）の２対のポリペプチド鎖からなり、それらすべてがジスルフィド結合によって相互結合している構造的に関係があるタンパク質のクラスを含み得る。免疫グロブリンの構造は良く同定されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ． ７ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照。
従来の天然抗体の構造単位は典型的に四量体を含む。各四量体は典型的にポリペプチド鎖の２つの同一のペアで構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（典型的に約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（典型的に約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を含む。ヒト軽鎖はκ及びλ軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥに定まる。ＩｇＧはいくつかのサブクラスを有し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＭはサブクラスを有し、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＡはいくつかのサブクラスを有し、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が挙げられるがこれらに限定されない。このように、本明細書で用いる場合、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンのクラス及びサブクラスのいずれかを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。これらの抗体クラス間を区別する特徴はそれらの定常領域であるが、可変領域に微妙な差が存在する場合もある。
軽鎖及び重鎖のそれぞれは、可変領域及び定常領域と呼ばれる２つの異なる領域でできている。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３で連結した４つの免疫グロブリンドメインで構成され、それぞれ「可変重ドメイン」（「重鎖可変ドメイン」とも呼び、全体を通して同じ意味で用いる）、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、及び重鎖定常ドメイン３を指す（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３とも呼ばれ、それぞれ可変重ドメイン、定常γ１ドメイン、定常γ２ドメイン、及び定常γ３ドメインを指す）。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＬ−ＣＬで連結した２つの免疫グロブリンドメインで構成され、それぞれ「可変軽ドメイン」（「軽鎖可変ドメイン」とも呼び、全体を通して同じ意味で用いる）及び軽鎖定常ドメインを指す。定常領域は配列多様性をそれほど示さず、重要な生化学的現象を誘発するための複数の天然タンパク質への結合を担う。可変及び定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を本明細書では「全長抗体」と呼ぶ。ヒト及びマウスをはじめとするほとんどの哺乳類において、ＩｇＧアイソタイプの全長抗体は四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一のペアからなり、各ペアは１つの軽鎖及び１つの重鎖を有し、各軽鎖はＶＬ及びＣＬを含み、各重鎖はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。いくつかの哺乳類、例えばラクダ及びラマにおいて、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖可変ドメインのみからなる場合があり、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメインを含む。
重鎖定常領域は、典型的に３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成されており、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインはヒンジ領域によって連結されている。各軽鎖は典型的に軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬ」または「ＶＬ」と略す）及び軽鎖定常ドメインで構成されている。ＶＨ及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される超可変性の領域（すなわち配列及び／または構造的に定まるループの形態が超可変性であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは典型的に３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列されている。典型的に、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９２を参照）に記載されている方法によって行われる。この番号付けシステムを用いると、ペプチドの実際の一次アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、または挿入に相当するより少ないまたは追加のアミノ酸を含む場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、ＶＨ ＣＤＲ２の残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによると５２ａ）ならびに重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによると残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列の相同な領域における「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントによって決定され得る。
用語「可変」、「可変ドメイン」、または「可変領域」は、それぞれ同じ意味で、配列に可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合アフィニティーの決定に関与する免疫グロブリンドメインの一部（すなわち「可変ドメイン（複数可）」）のことをいう。可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しておらず、重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。こうしたサブドメインは「超可変」領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち非超可変）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれる。自然発生重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、概してβ−シート構造をとる４つのＦＲＭ領域を含み、ＦＲＭ領域は、β−シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結されている。各鎖中の超可変領域はＦＲＭによって互いに近くに位置し、他の鎖の超可変領域とともに、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９９１を参照、全体を参照により援用する）。定常ドメインは抗原結合性に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存的な細胞媒介細胞傷害性及び補体活性化などを示す。
用語「フレームワーク領域」は、より多様な（すなわち超可変性）ＣＤＲの間に存在する、当該技術分野において認知されている抗体可変領域の一部のことをいう。そのようなフレームワーク領域は典型的にフレームワーク１〜４（ＦＲＭ１、ＦＲＭ２、ＦＲＭ３、及びＦＲＭ４）と呼ばれ、３次元空間において６つのＣＤＲ（重鎖から３つ及び軽鎖から３つ）の提示のための足場を与えて抗原結合表面を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖コンフォメーションのことをいう。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうち５つは可能なコンフォメーションの限られたレパートリーしか有しないことがわかっている。各カノニカル構造はポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴づけることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分における高いアミノ酸配列可変性にもかかわらず、非常に類似した３次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．， １９８７， １９６： ９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， １９９６， ２６３： ８００）。さらに、とられるループ構造とその周りのアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラスのコンフォメーションは、ループの長さ及びループ中の、さらには保存されたフレームワーク中（すなわちループ外）の重要な位置にあるアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスの割当てはこうした重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
本明細書で用いる場合、「位置」はタンパク質または核酸の配列中の場所を意味する。タンパク質位置は、連続的に、または確立された形式、例えば抗体可変領域についてのＫａｂａｔインデックスもしくは抗体定常領域についてのＥＵインデックスに従って番号付けされ得る。例えば、２９７位はヒト抗体ＩｇＧ１中の位置である。対応する位置は上記で概説したように、一般に他の親配列とのアラインメントによって決定される。
本明細書で用いる場合、「残基」は、タンパク質中の位置及びその関連するアミノ酸の素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７とも呼ばれ、Ｎ２９７とも呼ばれる）はヒト抗体ＩｇＧ１中の残基である。いくつかの実施形態においては核酸塩基をいうこともできる。
用語「カノニカル構造」は、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９２）によって列挙されているように、抗体の一次配列についての考慮も含み得る。Ｋａｂａｔ番号付け方式は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した形で番号付けするための広く採用されている標準である。抗体のカノニカル構造を決定するために、追加の構造的な考慮を用いることもできる。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けには完全に反映されていない差を、Ｃｈｏｔｈｉａらの番号付けシステムによって記述することができる、及び／または他の技術、例えば結晶構造解析及び二次元もしくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、適切なシャーシ配列を同定することが可能となるカノニカルクラスに入れられ得る（例えば、ライブラリーに様々なカノニカル構造を含める要求に基づく）。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け及びＣｈｏｔｈｉａらによって記載されているような構造的な考慮、ならびに抗体構造のカノニカルな側面を解釈するためのそれらが意味することは文献に記載されている。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、「Ｆｃ領域」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジのことをいう。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。したがって、上記から逸脱することなく、「Ｆｃ領域」は「ＣＨ２ドメインまたはそのバリアント」及び「ＣＨ３ドメインまたはそのバリアント」を含むとも定義され得る。Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。Ｆｃは単独でこの領域のことをいう場合もあれば、Ｆｃポリペプチド、例えば抗体との関係においてこの領域のことをいう場合もある。本明細書で用いる場合、「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域のすべてまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは抗体、Ｆｃ融合体、単離Ｆｃ、及びＦｃ断片を含む。
本発明の多価抗体アナログの可変軽鎖（ＶＬ）及び対応する可変重ドメイン（ＶＨ）は、全体を通して同じ意味で抗原と相互作用する「抗原結合部位」とも呼ぶ結合ドメインを含む。したがって、本発明の多価抗体アナログの「第１可変軽ドメイン」及び「第１可変重ドメイン」はともに「第１抗原結合部位」を形成する。同様に、本発明の多価抗体アナログの「第２可変軽ドメイン」及び「第２可変重ドメイン」はともに「第２抗原結合部位」を形成する。本発明の多価抗体アナログの「第３可変軽ドメイン」及び「第３可変重ドメイン」はともに「第３抗原結合部位」を形成し、以下も同様である。
当業者であれば理解するように、本発明に従う使用のための抗原結合部位は、それを含むＶＨ、ＶＬ、及び／またはＣＤＲを含め、任意のその起源から入手または誘導され得る。したがって、そのような抗原結合部位、ＶＨ、ＶＬ、及び／またはＣＤＲは、それによって認識される標的に対する抗体を発現するハイブリドーマ細胞から；それによって認識される標的に対する抗体を発現する免疫化ドナー由来のＢ細胞から；それによって認識される標的に対する抗体を発現するように刺激されたＢ細胞から；及び／または抗原結合抗体（もしくはその抗原結合断片）について複数のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを含むライブラリーをスクリーニングすることによって同定された抗体もしくは抗体断片の同定から入手または誘導され得る。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、例えばその抗原結合領域の１つ以上の部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、直線状抗体、一本鎖抗体、ならびにインタクトな抗体及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書で用いる場合、「ｓｃＦｖ」はリンカー配列によって連結された２つの可変領域からなるポリペプチドを意味し、例えば「リンカー」（「リンカー部分」とも呼び、全体を通して同じ意味で用いる）は下記でより詳細に記載する。
「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、本明細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメインは１つのポリペプチドを含み、ＶＬ及びＣＬドメインは別のポリペプチドを含み、２つのポリペプチドは少なくとも１つのポリペプチド間ジスルフィド結合を介して互いに連結されている。Ｆａｂは単独でこの領域のことをいう場合もあれば、全長抗体または抗体断片との関係においてこの領域のことをいう場合もある。
「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に存在する配列と交換された非ヒト抗体のことをいう。一般にヒト化抗体において、抗体全体は、ＣＤＲを除いて、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲの範囲内を除いてそのような抗体と同一である。ＣＤＲは、その１つ、いくつか、またはすべてが非ヒト生物に由来する核酸によってコードされ、ヒト抗体可変領域のフレームワーク中に移植されて、その特異性が移植されたＣＤＲによって決定される抗体を生成する。そのような抗体の生成は例えばＷＯ ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。最初の移植コンストラクトで失われたアフィニティーを取り戻すために、選択したアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への「復帰突然変異」が必要とされることが多い（例えば米国特許第５，６９３，７６２号を参照）。ヒト化抗体は、任意により免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むことになり、そのため、典型的にはヒトＦｃ領域を含むことになるであろう。非ヒト抗体をヒト化、再形成、及び再表面形成する様々な技術及び方法が当該技術分野において公知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ， ２００４， Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ， ５３３−５４５， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ）、及びそこに引用されている参照文献を参照）。ある変形形態において、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：１９８６−１９９８及び２００４年１２月３日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｈｏｓｔ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」という名称の米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載されている方法を用いて抗体の免疫原性を減少させる。
「インタクトな抗体」は全長重鎖及び軽鎖ならびにＦｃ領域を含むものである。インタクトな抗体は「全長ヘテロ二量体」抗体または免疫グロブリンとも呼ばれる。
用語「可変」とは、配列に可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する免疫グロブリンドメインの一部（すなわち「可変ドメイン（複数可）」）のことをいう。可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しておらず、重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。こうしたサブドメインは「超可変」領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち非超可変）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれる。自然発生重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、概してβ−シート構造をとる４つのＦＲＭ領域を含み、ＦＲＭ領域は、β−シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結されている。各鎖中の超可変領域はＦＲＭによって互いに近くに位置し、他の鎖の超可変領域とともに、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９９１を参照、全体を参照により援用する）。定常ドメインは抗原結合性に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存的な細胞媒介細胞傷害性及び補体活性化などを示す。
本発明の「シャーシ」は、それぞれＣＤＲＨ３またはＣＤＲＬ３の一部ではない抗体重鎖可変（ＩＧＨＶ）または軽鎖可変（ＩＧＬＶ）ドメインの一部を表す。本発明のシャーシは、ＦＲＭ１の最初のアミノ酸から始まりＦＲＭ３の最後のアミノ酸で終わる抗体の可変領域の一部と定義される。重鎖の場合、シャーシは約Ｋａｂａｔ位１から約Ｋａｂａｔ位９４までを含むアミノ酸を含む。軽鎖（κ及びλ）の場合、シャーシは約Ｋａｂａｔ位１から約Ｋａｂａｔ位８８までを含むと定義される。本発明のシャーシは、本明細書で提示するか、または公開データベースで利用可能な対応する生殖細胞系の可変ドメイン配列と比較してある改変を含有し得る。こうした改変は、組換え（例えばＮ結合型グリコシル化部位の除去）による場合もあれば、自然発生（例えば対立遺伝子変異の原因となる）の場合もある。例えば、当該技術分野において、免疫グロブリン遺伝子レパートリーは多型であることが知られており（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ， ２００８， ８６： １１１；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００８， ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５１− ００８−０３２５−ｚ（オンラインで公開）、それぞれ全体を参照により援用する）、こうした対立遺伝子バリアントの代表的なシャーシ、ＣＤＲ（例えばＣＤＲＨ３）及び定常領域も本発明に包含される。いくつかの実施形態において、特定の実施形態において用いられる対立遺伝子バリアント（複数可）は、異なる患者集団に存在する対立遺伝子変異に基づいて、例えば、こうした患者集団において非免疫原性である抗体を同定するために選択され得る。ある実施形態において、本発明の抗体の免疫原性は、患者集団の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子における対立遺伝子変異に依存し得る。そのような対立遺伝子変異は本発明のライブラリーの設計においても考慮され得る。本発明のある実施形態において、シャーシ及び定常領域はベクター上に含まれ、相同組換えによってＣＤＲ３領域がそれらの間に導入される。いくつかの実施形態において、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドは重鎖シャーシに従い、部分的な（１つもしくは２つの場合）または完全な（３つの場合）コドンのいずれかを形成し得る。完全なコドンが存在する場合、これらのヌクレオチドは、「テール」と呼ばれ、９５位を占めるアミノ酸残基をコードする。
ある実施形態において、第１重鎖可変領域；第２重鎖可変領域；第１軽鎖可変領域；第２軽鎖可変領域；可変領域に含まれる１つ以上のＣＤＲ；第１ポリペプチド；第２ポリペプチド；第３ポリペプチド；第４ポリペプチ；１つ以上の親ホモ二量体抗体種；及び／またはＭＡＩのうちの１つ以上は、上記抗体コンポーネントまたは領域のいずれかの固有のメンバーを含む１つ以上のライブラリーから１つ以上の抗原に対する１つ以上の選別を実施することによって得られる。
ある実施形態において、抗体、例えばＭＡＩなどの第１重鎖可変領域または第２重鎖可変領域のいずれかは、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる。
ある実施形態において、抗体、例えばＭＡＩなどの第１重鎖可変領域及び第２重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる。
ある実施形態において、抗体、例えばＭＡＩなどの第１重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、第２重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる。
ある実施形態において、抗体、例えばＭＡＩなどの第１重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、第２重鎖可変領域は、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる。
ある実施形態において、ライブラリーの少なくとも１つは少なくとも１つの軽鎖をさらに含む。
当業者であれば理解するように、用語「ｌｉｂｒａｒｙ（ライブラリー）」及び「ｐｌｕｒａｌｉｔｙ（複数）」（ならびに「ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ライブラリー）」及び「ｐｌｕｒａｌｉｔｉｅｓ（複数）」）は容易に同じ意味で用いられ得る。しかし、全体を通して開示する本発明との関係においては、「複数」の要素、例えば抗体、抗体をコードする核酸、または宿主細胞などは、実質的に同一な多くのまたはほとんどのメンバーを含み得るが、要素、例えば抗体、抗体をコードする核酸、または宿主細胞などの「ライブラリー」は、固有の多くのまたはほとんどのメンバーを含み得る。
ある実施形態において、特許請求する方法に従う選別に１つ以上のナイーブライブラリーが用いられ得る。「ナイーブライブラリー」は、特定の抗原に対する特異性を有する抗体の存在について照会されていないポリヌクレオチド（またはそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）のライブラリーのことをいう。「ナイーブライブラリー」は、抗原の任意の群、または特定の抗原に対する特異性を有する抗体配列に限定されていない、または別様に偏っていない、もしくは富化されていないライブラリーのこともいう。そのため、ナイーブライブラリーは「限定ライブラリー」及び「成熟ライブラリー」（例えばアフィニティー成熟ライブラリーなど）とは異なるが、これらは両方とも下記で説明する。
ナイーブライブラリーは「免疫前」ライブラリーも含み得るが、これは、自然発生抗体配列、例えばヒト抗体配列などの、そのような自然発生配列がネガティブセレクション及び／または体細胞超変異を受ける前のものに類似した配列多様性及び長さ多様性を有するライブラリーのことをいう。そのような免疫前ライブラリーは、免疫前レパートリーを反映もしくは模倣するように設計及び調製され得る、及び／または、ヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子集、ならびにヒト重鎖及び軽鎖配列の他の大きなデータベース（例えば、公知の生殖細胞系配列；その全体を参照により援用するＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００７， ３２４： ２６にある配列；その全体を参照により援用するＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００６， ５７： ９１７にある配列；ならびに再構成ＶＫ及びＶλに編集された配列）から知ることのできる合理的な設計に基づいて設計及び調製され得る。さらなる情報は、例えば、それぞれその全体を参照により援用するＳｃａｖｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．， １９９９， １６： ２３４；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， １９９２， ２２７： ７９９；及びＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９９８， １８８： ２１５１に見出され得る。本発明のある実施形態において、ヒトのレパートリーに見られる可能なＶ、Ｄ、及びＪ多様性、ならびに接合多様性（すなわちＮ１及びＮ２）を表すカセットが、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして新規に合成される。例示的なそのような免疫前ライブラリー、ならびにそれを含むポリヌクレオチド配列（及びそれによってコードされるポリペプチド配列）の設計及び組成は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００６， ５７： ９１７）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， １９９６， ２５：１３０；ＷＯ ２００９／０３６３７９；及びＷＯ ２０１２／０９５６８にさらに記載されている。
本開示の発明の実施に用いられる抗体との関係において、そのような抗体のライブラリー（または複数の抗体）は、それぞれ固有の一次酸配列を有する多くのまたはほとんどのメンバーを含むことになるであろうが、そのようなライブラリー（または複数の抗体）は同一のアミノ酸配列を有するメンバーも含み得る。ある実施形態において、そのようなメンバーの可変領域は、そのようなメンバー間のアミノ酸配列における差の多くを含むことになるであろう。
本開示の発明の実施に用いられる宿主細胞との関係において、複数のそのような宿主細胞（またはそのライブラリー）は、その多くがそれぞれ固有の抗体を発現する宿主細胞メンバーを含むことになるであろうが、複数のそのような宿主細胞（またはそのライブラリー）は、同一の抗体配列を発現するメンバーも含み得る。ある実施形態において、そのような宿主細胞は、宿主細胞によって一括して発現される抗体ライブラリーを一括してコードする核酸も含有することになるであろう。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、「多様性」は種類の豊富さまたは顕著な異質性のことをいう。用語「配列多様性」は、配列、例えば天然ヒト抗体に見られるもののいくつかの可能性をまとめて代表する様々な配列のことをいう。例えば、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）配列多様性は、重鎖ＣＤＲ３配列を形成するための、Ｎ１及びＮ２領域を含めた、公知のヒトＤＨ及びＨ３−ＪＨセグメントの組合せの様々な可能性のことをいう場合がある。軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）配列多様性は、軽鎖ＣＤＲ３配列を形成するための、ＣＤＲＬ３に寄与する自然発生軽鎖可変領域（すなわちＬ３−ＶＬ）及び接合（すなわちＬ３−ＪＬ）セグメントの組合せの様々な可能性のことをいう場合がある。本明細書で用いる場合、Ｈ３−ＪＨはＣＤＲＨ３に寄与するＩＧＨＪ遺伝子の一部のことをいう。本明細書で用いる場合、Ｌ３−ＶＬ及びＬ３−ＪＬはそれぞれ、ＣＤＲＬ３に寄与するＩＧＬＶ及びＩＧＬＪ遺伝子（κまたはλ）の一部のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「発現」は、限定はしないが転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含めたポリペプチドの産生に関与するあらゆるステップを含む。
本発明のある実施形態において、抗体ライブラリーは化学的に合成し、かつ、物理的に実現するのに十分小さく、しかし、任意の抗原を認識する潜在性を有する抗体をコードするのに十分大きくなるように設計される。ある実施形態において、抗体ライブラリーは約１０７〜約１０２０種の異なる抗体及び／またはライブラリーの抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、または１０２０種の異なる抗体及び／または抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むように設計される。ある実施形態において、ライブラリーは、約１０３〜約１０５、約１０５〜約１０７、約１０７〜約１０９、約１０９〜約１０１１、約１０１１〜約１０１３、約１０１３〜約１０１５、約１０１５〜約１０１７、または約１０１７〜約１０２０種の異なる抗体を含むかまたはコードし得る。ある実施形態において、ライブラリーの多様性は、上記で列挙した多様性の１つ以上よりも大きいまたは小さい、例えば、約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、もしくは１０２０よりも大きい、または約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、もしくは１０２０よりも小さいとして特徴づけられ得る。本発明のある他の実施形態において、目的の抗体が上記で列挙したサイズのライブラリー中に物理的に実現されて存在する確率は、少なくとも約０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または９９．９％である（特定の配列がライブラリー中に物理的に実現されて存在する確率のさらなる情報については、詳細な説明のライブラリーサンプリングを参照）。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、本開示の方法に従う使用に適した抗体ライブラリーは、例えば、ＷＯ２００９０３６３７９；ＷＯ２０１２００９５６８；ＷＯ２０１０１０５２５６；ＵＳ ８，２５８，０８２；ＵＳ ６，３００，０６４；ＵＳ ６，６９６，２４８；ＵＳ ６，１６５，７１８；ＵＳ ６，５００，６４４；ＵＳ ６，２９１，１５８；ＵＳ ６，２９１，１５９；ＵＳ ６，０９６，５５１；ＵＳ ６，３６８，８０５；ＵＳ ６，５００，６４４などに開示されているような当該技術分野において利用可能な任意の方法によって設計及び調製され得る。
例えば、ライブラリーは、免疫前レパートリーを反映もしくは模倣するように設計及び調製され得る、及び／または、ヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子集、ならびにヒト重鎖及び軽鎖配列の他の大きなデータベース（例えば、公知の生殖細胞系配列；その全体を参照により援用するＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００７， ３２４： ２６にある配列；その全体を参照により援用するＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００６， ５７： ９１７にある配列；ならびに再構成ＶＫ及びＶλに編集された配列−本明細書とともに出願された添付書類Ａ及びＢを参照）から知ることのできる合理的な設計に基づいて設計及び調製され得る。さらなる情報は、例えば、それぞれその全体を参照により援用するＳｃａｖｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．， １９９９， １６： ２３４；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， １９９２， ２２７： ７９９；及びＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９９８， １８８： ２１５１に見出され得る。本発明のある実施形態において、ヒトのレパートリーに見られる可能なＶ、Ｄ、及びＪ多様性、ならびに接合多様性（すなわちＮ１及びＮ２）を表すカセットが、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして新規に合成される。本発明のある実施形態において、ＣＤＲ配列をコードするオリゴヌクレオチドカセットが、重鎖または軽鎖シャーシ配列を含有する１つ以上のアクセプターベクターとともに酵母に導入される。哺乳類ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡからのプライマーベースのＰＣＲ増幅またはテンプレートで誘導されるクローニングのステップは用いない。標準的な相同組換えによって、レシピエント酵母がシャーシ配列（複数可）及び定常領域を含有するアクセプターベクター（複数可）にカセット（例えばＣＤＲ３）を組換え、遺伝子的に増殖、発現、ディスプレイ、及びスクリーニングすることができる適切に配列した合成全長ヒト重鎖及び／または軽鎖免疫グロブリンライブラリーが生成される。当業者であれば、アクセプターベクターに含まれるシャーシは、全長ヒト重鎖及び／または軽鎖以外のコンストラクトを生成するように設計することができることを容易に認識するであろう。例えば、本発明のある実施形態において、シャーシは、ＣＤＲを含有するオリゴヌクレオチドカセットがアクセプターベクターに組換えられる際に、抗体断片、またはそのサブユニットをコードする配列が生成されるように、抗体断片または抗体断片のサブユニットをコードするポリペプチドの一部をコードするように設計され得る。ある実施形態において、本発明は、約１０７〜約１０２０種の抗体メンバーを含む合成免疫前ヒト抗体レパートリーを提供するが、このレパートリーは
（ａ）選択されたヒト抗体重鎖シャーシ（すなわち、Ｋａｂａｔの定義を用いた重鎖可変領域のアミノ酸１〜９４）；（ｂ）ヒトＩＧＨＤ及びＩＧＨＪ生殖細胞系配列に基づいて設計されたＣＤＲＨ３レパートリーであって、以下を含むＣＤＲＨ３レパートリー：
（ｉ）任意により、１つ以上のテール領域；
（ｉｉ）末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の作用によって優先的にコードされ、ヒトＢ細胞によって機能的に発現されるアミノ酸タイプの２０種未満からなる群から選択される約０〜約１０アミノ酸を含む１つ以上のＮ１領域；
（ｉｉｉ）１つ以上の選択されたＩＧＨＤセグメントに基づく１つ以上のＤＨセグメント、及び１つ以上のそのＮまたはＣ末端切断；
（ｉｖ）ＴｄＴの作用によって優先的にコードされ、ヒトＢ細胞によって機能的に発現されるアミノ酸の２０種未満からなる群から選択される約０〜約１０アミノ酸を含む１つ以上のＮ２領域；ならびに
（ｖ）１つ以上のＩＧＨＪセグメントに基づく１つ以上のＨ３−ＪＨセグメント、及び１つ以上のそのＮ末端切断（例えばＸＸＷＧまで）；（ｃ）１つ以上の選択されたヒト抗体κ及び／またはλ軽鎖シャーシ；ならびに
（ｂ）「Ｌ」がκまたはλ軽鎖であり得るヒトＩＧＬＶ及びＩＧＬＪ生殖細胞系配列に基づいて設計されたＣＤＲＬ３レパートリー；
を含む。そのようなライブラリーを調製する手段及び方法は、例えばＷＯ２００９０３６３７９；ＷＯ２０１２００９５６８；ＷＯ２０１０１０５２５６に開示されている。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、「特異性」は、目的の抗原の１つ以上の抗原決定基、例えば１つ以上のエピトープなどとは反応し、かつ目的の抗原の他のエピトープまたは目的の他の抗原とは反応しないことを可能にする抗体の特性のことをいう。当該技術分野において理解されるように、抗体特異性は、エピトープ及び／または抗体の結合部位の化学組成、物理的力、エネルギー的優位性、立体障害、及び分子構造またはトポロジーに依存する。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、「アフィニティー」は抗体−エピトープ相互作用の強度、または安定性のことをいう。エピトープに対するアフィニティーが高い抗体は比較的強固に及び／または安定してエピトープに結合する一方で、エピトープに対するアフィニティーが低い抗体は比較的弱く及び／またはより不安定に結合する。
当業者によって理解され、また、全体を通して開示するように、目的の抗原のエピトープ（複数可）に対する特異性を有する抗体を「収集する」または「収集した」とは、そのような特異性を有しない抗体からそのような特異性を有する抗体を区別する（または区別した）ことを意味する。目的の抗原のエピトープ（複数可）に対する特異性を有する抗体を収集すること、または抗体を収集したことは、それらを区別するために、そのような特異性を有しない抗体からの抗体の物理的分離を必要としなくてもよい。しかし、ある実施形態において、目的の抗原のエピトープ（複数可）に対する特異性を有する抗体を収集することは、そのような特異性を有しない抗体からそのような抗体を物理的に分離することを含む。抗体を収集する例示的な方法及び手段は当該技術分野において公知であり、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など、及びこれらの組合せが挙げられる。
全体を通して開示する方法においてそのような特異性を判定するために、当該技術分野におけるそのような特異性を判定する任意の手段を用いてよく、例えば、検出可能標識でそのような抗体を標識化すること；検出可能標識を検出すること；抗原のエピトープ（複数可）に結合している抗体の機能的な結果、例えばそのようなエピトープ（複数可）に対する特異性を有することが既知の別の抗体との競合などを検出すること；目的の抗原と既知のタンパク質相互作用パートナーまたはリガンドとの間のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−リガンド相互作用の変化が挙げられる。
多くの場合、抗体発見プロセスの一部として１つ以上の成熟ライブラリー選別を含むことが望ましい。そのような成熟ライブラリー選別、例えばアフィニティー成熟ライブラリー選別などは、本明細書に開示の方法に有利に組み込まれ得る。
「成熟ライブラリー」は、抗原に対する特異性を有する抗体配列の存在についてのライブラリー、例えばナイーブライブラリーまたは免疫前ライブラリーなどの照会で同定される抗体配列の少なくとも１つの特性を強化または改善するように設計されているライブラリーのことをいう。そのような成熟ライブラリーは、ナイーブライブラリーの照会で得られるか、または同定される、１つ以上のＣＤＲ；１つ以上の抗原結合領域；１つ以上のＶＨもしくはＶＬ領域；及び／または１つ以上の重鎖もしくは軽鎖に対応する核酸配列（本明細書において「抗体リード」と呼ぶ）を、元の抗体リードと照らして多様性が導入されたライブラリーを生成するためにインビトロまたはインビボでさらに変異誘発するように設計されたライブラリー中に組み込むことによって生成され得る。そのような成熟ライブラリー及びその作製方法は、例えばＷＯ ２００９／０３６３７９（例えばページ７５〜７７）；及びＷＯ ２０１２／０９５６８（例えばページ６９〜７２）で提供されており、目的のＣＤＲＨ３が未変化のままであり、重鎖フレームワーク領域、ＣＨＲＨ１、及び／またはＣＨＤＨ２領域が多様化される多様化が実施されている成熟ライブラリー；目的のＣＤＲＬ３が未変化のままであり、軽鎖フレームワーク領域、ＣＨＲＬ１、及び／またはＣＨＤＬ２領域が多様化されているライブラリー；あらかじめ作製された多様な軽鎖が１つ以上の目的の重鎖と組合せられているライブラリーが挙げられる。
「限定ライブラリー」は、１つの目的の抗原に対する特異性を有する抗原結合領域について、例えばナイーブライブラリーから選別を実施することによって得られたか、または同定された、１つ以上の固有の重鎖、１つ以上の固有の軽鎖、または１つ以上の固有の重鎖及び１つ以上の固有の軽鎖を含むライブラリーのことをいい、別の目的の抗原に対する特異性を有する抗原結合領域を得るまたは同定するために用いられる。そのような限定ライブラリーは典型的に、それぞれ軽鎖または重鎖の数をはるかに超える多数の重鎖または軽鎖のいずれかを含む。ある実施形態において、固有の重鎖の数は、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、１０８、もしくは少なくとも１０９、またはこれよりも多く、固有の軽鎖の数は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００である。ある実施形態において、固有の重鎖の数は１０７〜１０８であり、固有の軽鎖の数は１０未満、好ましくは約５である。
ある実施形態において、全体を通して開示する方法は、複数の宿主細胞の使用を含み得るが、そのメンバーは抗体のライブラリーをまとめてコードする核酸をまとめて含有し、そのような宿主細胞は目的の抗原に対するバインダーについて照会される抗体のライブラリーをまとめて発現する。全体を通して開示する方法に従ってそのような複数の宿主細胞を調製及び採用する場合、照会される複数の宿主細胞の中から目的の抗原に対する特異性を有する抗体を発現する宿主細胞が収集されるべきであるか、またはそのような宿主細胞によってコードされる抗体が収集され得るかのいずれかである。ある実施形態において、抗体は宿主細胞が抗体を発現及び分泌した後に収集される。
全体を通して開示する方法における宿主細胞の使用によれば、本明細書に記載の技術のいずれか、または他の好適な技術によって生成されたポリヌクレオチドのライブラリーは、そのような宿主細胞に導入され、それによって発現され、所望の構造及び／または活性を有する抗体を同定するためにスクリーニングされ得る。抗体の発現は、例えば、無細胞抽出物（及び例えばリボソームディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核宿主細胞（例えば細菌ディスプレイ）、または真核宿主細胞（例えば酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ）を用いて行うことができる。本発明のある実施形態において、抗体ライブラリーは酵母によって発現及び／またはコードされる。ある実施形態において、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓａｉｅである。他の実施形態において、酵母はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、無細胞抽出物中で発現させることができるテンプレートとして機能するように組換えられる。例えば米国特許第５，３２４，６３７号；５，４９２，８１７号；５，６６５，５６３号（それぞれその全体を参照により援用する）に記載のようなベクター及び抽出物を用いることができ、多くは市販されている。ポリヌクレオチド（すなわち遺伝子型）をポリペプチド（すなわち表現型）に連結するためのリボソームディスプレイ及び他の無細胞技術を用いることができ、例えばＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）（例えば、米国特許第６，３４８，３１５号；６，２６１，８０４号；６，２５８，５５８号；及び６，２１４，５５３号を参照、それぞれその全体を参照により援用する）である。
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ及びＳｋｅｒｒａによって記載されたものなどで発現させることができる。（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９８９， １７８： ４７６；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９１， ９： ２７３、それぞれその全体を参照により援用する）。変異型タンパク質は、その全体を参照により援用するＢｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９８９， １７８： ４７６によって記載されているように、培地及び／または細菌の細胞質中における分泌のために発現させることができる。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬをコードする単一のドメインは、シグナル配列、例えばｏｍｐＡ、ｐｈｏＡまたはｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １９８７， １６９： ４３７９、その全体を参照により援用する）などをコードする配列の３’末端にそれぞれ結合させる。これらの遺伝子融合体は、単一のベクターから発現させ、リフォールディングして活性形態に戻ることができるＥ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌させることができるように、ジシストロニックコンストラクトに組み立てられる。（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９１， ９： ２７３、全体を参照により援用する）。例えば、抗体重鎖遺伝子を抗体軽鎖遺伝子と同時に発現させて抗体または抗体断片を産生することができる。
本発明の他の実施形態において、抗体配列は、例えばＵＳ２００４００７２７４０；ＵＳ２００３０１０００２３；及びＵＳ２００３００３６０９２（それぞれその全体を参照により援用する）に記載されているような分泌シグナル及び脂質化部分を用いて、原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉの膜表面上で発現させる。
哺乳類細胞などの高等真核細胞、例えば骨髄腫細胞（例えばＮＳ／０細胞）、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、及びヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞も本発明の抗体の発現に用いることができる。典型的には、哺乳類細胞で発現させる抗体は、培養培地中に分泌されるように、または細胞の表面上に発現されるように設計される。抗体または抗体断片は、例えば、インタクトな抗体分子として、または個々のＶＨ及びＶＬ断片、Ｆａｂ断片、単一ドメインとして、もしくは一本鎖（ｓｃＦｖ）として産生させることができる（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ， １９８８， ８５： ５８７９、その全体を参照により援用する）。
あるいは、例えば、Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ， ２００７， １０４： ８２４７（その全体を参照により援用する）に記載されているような固定化細胞周辺発現（ＡＰＥｘ ２−ハイブリッド表面ディスプレイ）によって、または例えば、Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００７， ２５： ５６３（その全体を参照により援用する）に記載されているような他の固定化方法によって、抗体を発現及びスクリーニングすることができる。
本発明の他の実施形態において、哺乳類細胞ディスプレイ（Ｈｏ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ， ２００６， １０３： ９６３７、その全体を参照により援用する）を用いて抗体を選別することができる。
本発明のライブラリーから得られる抗体のスクリーニングは任意の適切な手段によって行うことができる。例えば、標準的なイムノアッセイ及び／またはアフィニティークロマトグラフィーによって結合活性を評価することができる。触媒機能、例えばタンパク質分解機能についての本発明の抗体のスクリーニングは、標準的なアッセイ、例えば、米国特許第５，７９８，２０８号（その全体を参照により援用する）に記載されているようなヘモグロビンプラークアッセイを用いて達成することができる。治療標的に結合する候補の抗体の能力の判定は、例えば、表面プラズモン共鳴に基づいて所与の標的または抗原への抗体の結合率を測定するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）測定器を用いてインビトロでアッセイすることができる。複数の動物モデルのいずれかを用いてインビボアッセイを行うことができ、そしてその後、適宜ヒトにおいて試験することができる。細胞ベースの生物学的アッセイも企図される。
上述のように、本発明の方法は、所望のＭＡＩの有意な量及び純度を得るために、ヘテロ二量体化モチーフの設計または組換えを必要としない。しかし、本発明の方法はそのようなモチーフを含めることが可能である。ヘテロ二量体対またはそのようなヘテロ二量体対を含む開示の多重特異性抗体アナログの間の相互作用は、ヘテロ二量体対界面において、その界面での突出部がくぼみの中に入る相補的領域の形成；その界面での非自然発生ジスルフィド結合の形成；その界面におけるロイシンジッパー；その界面における疎水性領域；及び／またはその界面における親水性領域によって促進され得る。「突出部」は、第１ポリペプチドの界面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置換することによって構築される。突出部と同一またはほぼ同等のサイズの代償的な「くぼみ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えばアラニンまたはスレオニン）に置換することによって、第２ポリペプチドの界面上に任意により形成される。適切な位置及び寸法の突出部またはくぼみが第１または第２ポリペプチドのいずれかの界面に存在する場合、それぞれ対応するくぼみまたは突出部を隣接する界面に組換えるだけでよい。非自然発生ジスルフィド結合は、遊離チオール含有残基が第２ポリペプチド上の別の遊離チオール含有残基と相互作用し、その結果、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間でジスルフィド結合が形成されるように、第１ポリペプチド上で自然発生アミノ酸を遊離チオール含有残基、例えばシステインなどで置換することによって構築される。本発明に従う例示的なヘテロ二量体化対及びその作製方法は、当該技術分野において利用可能であり、例えば、ＵＳ ２０１１／００５４１５１；ＵＳ ２００７／００９８７１２などに開示されている。
ある実施形態において、ヘテロ二量体対は本発明の多重特異性抗体アナログのＦｃ領域内に含まれる。そのようなヘテロ二量体対を含むＦｃ領域を「ヘテロ二量体Ｆｃ領域」と呼ぶ。
したがって、ある実施形態において、多重特異性抗体アナログは、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントを含み、ａ）ＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの突出部及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの対応するくぼみを含むか、またはＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つのくぼみ及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの対応する突出部を含むかのいずれかである。ある他の実施形態において、多重特異性抗体アナログは、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントを含み、ａ）ＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの置換された負電荷アミノ酸及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの対応する正電荷アミノ酸を含むか、またはｂ）ＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの置換された正電荷アミノ酸及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの対応する置換された負電荷置換アミノ酸を含むかのいずれかである。
「天然」抗体（すなわち、天然Ｂ細胞による天然生物学的抗体合成を経てインビボで生成される抗体）におけるＦｃ機能に関して、抗体のＦｃ領域は複数のＦｃ受容体及びリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる多数の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧでは、Ｆｃ領域、Ｆｃは、ＩｇドメインＣγ２及びＣγ３ならびにＣγ２につながるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに対するＦｃ受容体の重要なファミリーはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は抗体と免疫系の細胞アームとの間の伝達を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃをはじめとするＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃをはじめとするＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）をはじめとするＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５）。これらの受容体は典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内のいくつかのシグナル伝達現象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びγδＴ細胞をはじめとする様々な免疫細胞で発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、結合された抗原の部位にこれらのエフェクター細胞が動員され、典型的には細胞内のシグナル伝達現象ならびに重要なその後の免疫応答、例えば炎症媒介物質の放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、及び細胞傷害性攻撃などをもたらす。細胞傷害性及び食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する潜在的機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６；Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０）と呼ばれる。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存的細胞媒介ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。
「天然」抗体のＦｃ領域の特有の特徴は、Ｎ２９７で生じる保存されたＮ結合型グリコシル化である。この炭水化物（またはオリゴ糖と呼ばれることもある）は、抗体にとって重要な構造的及び機能的役割を果し、抗体が哺乳類発現系を用いて産生されなければならない主な理由の１つである。ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合にはこの改変が必要とされ、Ｎ２９７炭水化物の組成の変化またはその除去はこれらのタンパク質への結合に影響を及ぼす。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する本発明の多重特異性抗体アナログはＦｃバリアントを含む。Ｆｃバリアントは親Ｆｃポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸改変を含み、アミノ酸改変（複数可）によって１つ以上の特性が最適化される。Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインバリアント、ＣＨ３ドメインバリアント、またはＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントの両方のいずれかをさらに含む。本明細書において、「改変」は、タンパク質、ポリペプチド、抗体、本発明の多重特異性抗体アナログ、または免疫グロブリンの物理的、化学的、または配列の特性における変化を意味する。アミノ酸改変は、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失とすることができる。本明細書において、「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の別のアミノ酸との置き換えを意味する。例えば、置換Ｙ３４９Ｔは、３４９位のチロシンがスレオニンで置き換えられたバリアントポリペプチド、この場合は定常重鎖バリアントのことをいう。本明細書で用いる場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の追加を意味する。本明細書で用いる場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。
本明細書に開示のＦｃバリアントは、少なくとも１つのアミノ酸改変のためにその親とはアミノ酸配列が異なる。本明細書に開示する本発明の多重特異性抗体アナログは、親と比べて２つ以上のアミノ酸改変、例えば親と比べて約１〜５０アミノ酸改変、例えば、約１〜１０アミノ酸改変、約１〜５アミノ酸改変などを有し得る。したがって、Ｆｃバリアントの配列及び親Ｆｃポリペプチドの配列は実質的に相同である。例えば、本発明においてバリアントＦｃバリアント配列は、親Ｆｃバリアント配列との約８０％の相同性、例えば、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、少なくとも約９８％の相同性、少なくとも約９９％の相同性などを有することになるであろう。本明細書に開示の改変は糖型改変も含む。改変は、分子生物学を用いて遺伝子的に行われ得るか、または酵素的もしくは化学的に行われ得る。
本明細書に開示のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、置換Ｙ３４９Ｔは、３４９位のチロシンがスレオニンで置き換えられたバリアントポリペプチド、この場合は定常重鎖バリアントのことをいう。同様に、Ｙ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｙ３４９Ｔ及びＴ３９４Ｆを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の素性は不特定であってよく、その場合、上記のバリアントは３４９Ｔ／３９４Ｆと呼ばれる。置換が施される順序は任意であり、換言すれば、例えば３４９Ｔ／３９４Ｆは３９４Ｆ／３４９Ｔと同じＦｃバリアントであることに留意されたい。別途注記のない限り、本明細書において述べる定常領域及びＦｃの位置は、ＥＵインデックスまたはＥＵ番号付け方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従って番号付けられる。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ番号付け方式におけるようなＥＵインデックスはＥＵ抗体の番号付けのことをいう（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９６９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５）。
ある実施形態において、本明細書に開示のＦｃバリアントはヒトＩｇＧ配列に基づいており、したがって、ヒトＩｇＧ配列が、限定はしないが他の生物由来の配列、例えばげっ歯類及び霊長類配列をはじめとする他の配列を比較する「ベース」配列として用いられる。免疫グロブリンは、他の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭなど由来の配列も含み得る。本明細書に開示のＦｃバリアントは１つの親ＩｇＧとの関連で組換えられるが、バリアントは別の第２親ＩｇＧとの関連で組換えられ得るか、または「移入」され得ることを企図する。これは、典型的には第１及び第２ＩｇＧの配列間の配列または構造相同性に基づいて、第１及び第２ＩｇＧ間の「等価な」または「対応する」残基及び置換を決定することによって行われる。相同性を立証するためには、本明細書で概説した第１ＩｇＧのアミノ酸配列を第２ＩｇＧの配列と直接比較する。アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を可能にする（すなわち、任意の欠失及び挿入によって保存されている残基の排除を回避する）、当該技術分野において公知の相同性アラインメントプログラム（例えば種間で保存されている残基を用いる）の１つ以上を用いて、配列をアラインメントした後、第１免疫グロブリンの一次配列中の特定のアミノ酸と等価な残基を定義する。保存された残基のアラインメントはそのような残基の１００％を保存し得る。しかし、保存された残基が７５％を超える、またはわずか５０％のアラインメントも等価な残基を定義するのに十分である。等価な残基は、すでに構造が決定されているＩｇＧの三次構造レベルでの第１及び第２ＩｇＧ間の構造相同性を決定することによっても定義され得る。この場合、等価な残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の主鎖原子（Ｎに対してＮ、ＣＡに対してＣＡ、Ｃに対してＣ及びＯに対してＯ）の２つ以上の原子座標が、アラインメント後で約０．１３ｎｍ以内にあるものと定義される。別の実施形態において、等価な残基はアラインメント後で約０．１ｎｍ以内にある。アラインメントは、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の重なりが最大となるように最良モデルの向き及び位置を合わせて達成される。残基がどれだけ等価または対応していると決定されるかにかかわらず、また、ＩｇＧが作製される親ＩｇＧの素性にかかわらず、伝えようとしていることは、本明細書に開示したように発見されたＦｃバリアントは、Ｆｃバリアントとの大きな配列または構造相同性を有する任意の第２親ＩｇＧに組み込まれ得るということである。したがって、例えば、親抗体がヒトＩｇＧ１であるバリアント抗体が生成される場合、上記の方法または等価な残基を決定するための他の方法を用いることによって、バリアント抗体は異なる抗原に結合する別のＩｇＧ１親抗体、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体などで組換えられ得る。繰り返すが、上記のように、親Ｆｃバリアントの背景状況は、本明細書に開示のＦｃバリアントを他の親ＩｇＧに移入できるかどうかに影響を与えない。
上記のようなＣＨ３ドメインバリアントを含むか、またはＣＨ３ドメインバリアントであるＦｃバリアントは、３４９、３５１、３５４、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９６、３９７、３９９、４０１、４０５、４０７、４０９、４１１、及び４３９からなる群から選択されるＣＨ３ドメイン中の位置において少なくとも１つの置換を含み得るが、ここで、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。好ましい実施形態において、ＣＨ３ドメインバリアントは、重鎖ごとに少なくとも１つの、３４９Ａ、３４９Ｃ、３４９Ｅ、３４９Ｉ、３４９Ｋ、３４９Ｓ、３４９Ｔ、３４９Ｗ、３５１Ｅ、３５１Ｋ、３５４Ｃ、３５６Ｋ、３５７Ｋ、３６４Ｃ、３６４Ｄ、３６４Ｅ、３６４Ｆ、３６４Ｇ、３６４Ｈ、３６４Ｒ、３６４Ｔ、３６４Ｙ、３６６Ｄ、３６６Ｋ、３６６Ｓ、３６６Ｗ、３６６Ｙ、３６８Ａ、３６８Ｅ、３６８Ｋ、３６８Ｓ、３７０Ｃ、３７０Ｄ、３７０Ｅ、３７０Ｇ、３７０Ｒ、３７０Ｓ、３７０Ｖ、３９２Ｄ、３９２Ｅ、３９４Ｆ、３９４Ｓ、３９４Ｗ、３９４Ｙ、３９５Ｔ、３９５Ｖ、３９６Ｔ、３９７Ｅ、３９７Ｓ、３９７Ｔ、３９９Ｋ、４０１Ｋ、４０５Ａ、４０５Ｓ、４０７Ｔ、４０７Ｖ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４１１Ｄ、４１１Ｅ、４１１Ｋ、及び４３９Ｄからなる群から選択されるＣＨ３ドメイン置換を含む。これらのバリアントのそれぞれは、各重鎖Ｆｃ領域について個別にまたは任意の組合せで用いることができる。当業者であれば理解するであろうが、各重鎖は異なる数の置換を含むことができる。例えば、Ｆｃ領域を構成する重鎖の両方が単一の置換を含んでもよく、一方の鎖が単一の置換を含み、他方が２つの置換を含んでもよく、両方が２つの置換を含むこともできる（各鎖は異なる置換を含むことになるであろうが）、など。
いくつかの実施形態において、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントは組合せて、すなわち、重鎖Ｆｃドメインごとに２つ以上の上記で概説した群から選択されるバリアントが作製される。
本発明の多重特異性抗体アナログの設計及び調製に用いられ得るヘテロ二量体化に有利な他のＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントは、例えばＲｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９［７］：６１７−６２１；米国特許第５，７３１，１６８号；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９６：９５−１０１；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３［４］：１９５−２０２；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５［２５］：１９３７−１９６４６；及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／００００７１（ＷＯ ２００９／０８９００４として公開）で提供されている。
本明細書に開示のＦｃバリアントは、Ｆｃ受容体またはＦｃリガンドへの結合性の改善または低減のために最適化され得る。「Ｆｃ受容体」または「Ｆｃリガンド」は、本明細書で用いる場合、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ−リガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドとしては、ＦｃγＲ（上記のように、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩ及びＦｃＲｎを含むがこれらに限定されない）、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、及びウイルスＦｃγＲが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲに相同なＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も含まれる。ＦｃリガンドにはＦｃに結合する未発見の分子も含まれ得る。
本発明の多重特異性抗体アナログは、限定はしないがＦｃ受容体に対するアフィニティーの向上または低減をはじめとして、特性を最適化するように設計され得る。本明細書で用いる場合、Ｆｃポリペプチドより「大きいアフィニティー」または「改善されたアフィニティー」または「向上したアフィニティー」または「良好なアフィニティー」は、結合アッセイでのバリアント及び親ポリペプチドの量が実質的に同じである場合に、Ｆｃバリアントが親Ｆｃポリペプチドよりも有意に高い会合平衡定数（ＫＡもしくはＫａ）または低い解離平衡定数（ＫＤもしくはＫｄ）でＦｃ受容体に結合することを意味する。例えば、Ｆｃ受容体結合アフィニティーが改善されたＦｃバリアントは、親Ｆｃポリペプチドと比較して、約５倍〜約１０００倍、例えば約１０倍〜約５００倍のＦｃ受容体結合アフィニティーの改善を示し得るが、Ｆｃ受容体結合アフィニティーは、例えば、限定はしないがＢｉａｃｏｒｅをはじめとする本明細書に開示の結合法によって、当業者により測定される。したがって、本明細書で用いる場合、親Ｆｃポリペプチドと比較して「低減されたアフィニティー」は、Ｆｃバリアントが親Ｆｃポリペプチドよりも有意に低いＫＡまたは高いＫＤでＦｃ受容体に結合することを意味する。高いまたは低いアフィニティーは、アフィニティーの絶対レベルに対して定義することもできる。
当業者であれば理解するであろうが、用語「抗体」は、本明細書において最も広義に用いられ、特に少なくともモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、及びこれらの誘導体を包含する。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認知されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。「抗体」は、例えばタンパク質；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；サイトカイン；ケモカイン；成長因子；神経伝達物質；炭水化物含有生体分子；脂質もしくは脂肪酸含有生体分子；または他の生体分子であり得る抗原に、そのような抗原上に存在するエピトープを介して特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはその誘導体のこともいう。
抗体（「免疫グロブリン」、または「免疫グロブリン分子」と同じ意味で用いる）は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体などとすることができ、１対の軽鎖（ＬＣ）及び１対の重鎖（ＨＣ）の２対のポリペプチド鎖からなり、それらすべてがジスルフィド結合によって相互結合している構造的に関係があるタンパク質のクラスを含む。免疫グロブリンの構造は良く同定されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ． ７ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照。
従来の天然抗体の構造様式は典型的に四量体を含む。各四量体は典型的にポリペプチド鎖の２つの同一のペアで構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（典型的に約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（典型的に約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を含む。ヒト軽鎖はκ及びλ軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥに定まる。ＩｇＧはいくつかのサブクラスを有し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＭはサブクラスを有し、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＡはいくつかのサブクラスを有し、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が挙げられるがこれらに限定されない。このように、本明細書で用いる場合、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンのクラス及びサブクラスのいずれかを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。これらの抗体クラス間を区別する特徴はそれらの定常領域であるが、可変領域に微妙な差が存在する場合もある。
軽鎖及び重鎖のそれぞれは、可変領域及び定常領域と呼ばれる２つの異なる領域でできている。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３で連結した４つの免疫グロブリンドメインで構成され、それぞれ「可変重ドメイン」（「重鎖可変ドメイン」とも呼び、全体を通して同じ意味で用いる）、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、及び重鎖定常ドメイン３を指す（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３とも呼ばれ、それぞれ可変重ドメイン、定常γ１ドメイン、定常γ２ドメイン、及び定常γ３ドメインを指す）。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＬ−ＣＬで連結した２つの免疫グロブリンドメインで構成され、それぞれ「可変軽ドメイン」（「軽鎖可変ドメイン」とも呼び、全体を通して同じ意味で用いる）及び軽鎖定常ドメインを指す。定常領域は配列多様性をそれほど示さず、重要な生化学的現象を誘発するための複数の天然タンパク質への結合を担う。可変及び定常領域を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を本明細書では「全長抗体」と呼ぶ。ヒト及びマウスをはじめとするほとんどの哺乳類において、ＩｇＧアイソタイプの全長抗体は四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一のペアからなり、各ペアは１つの軽鎖及び１つの重鎖を有し、各軽鎖はＶＬ及びＣＬを含み、各重鎖はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。いくつかの哺乳類、例えばラクダ及びラマにおいて、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖可変ドメインのみからなる場合があり、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメインを含む。
重鎖定常領域は、典型的に３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成されており、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインはヒンジ領域によって連結されている。各軽鎖は典型的に軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬ」または「ＶＬ」と略す）及び軽鎖定常ドメインで構成されている。ＶＨ及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される超可変性の領域（すなわち配列及び／または構造的に定まるループの形態が超可変性であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは典型的に３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列されている。典型的に、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９２を参照）に記載されている方法によって行われる。この番号付けシステムを用いると、ペプチドの実際の一次アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、または挿入に相当するより少ないまたは追加のアミノ酸を含む場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、ＶＨ ＣＤＲ２の残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによると５２ａ）ならびに重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによると残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列の相同な領域における「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントによって決定され得る。
用語「可変」、「可変ドメイン」、または「可変領域」は、それぞれ同じ意味で、配列に可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合アフィニティーの決定に関与する免疫グロブリンドメインの一部（すなわち「可変ドメイン（複数可）」）のことをいう。可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しておらず、重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。こうしたサブドメインは「超可変」領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち非超可変）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれる。自然発生重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、概してβ−シート構造をとる４つのＦＲＭ領域を含み、ＦＲＭ領域は、β−シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結されている。各鎖中の超可変領域はＦＲＭによって互いに近くに位置し、他の鎖の超可変領域とともに、抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９９１を参照、全体を参照により援用する）。定常ドメインは抗原結合性に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存的な細胞媒介細胞傷害性及び補体活性化などを示す。
用語「フレームワーク領域」は、より多様な（すなわち超可変性）ＣＤＲの間に存在する、当該技術分野において認知されている抗体可変領域の一部のことをいう。そのようなフレームワーク領域は典型的にフレームワーク１〜４（ＦＲＭ１、ＦＲＭ２、ＦＲＭ３、及びＦＲＭ４）と呼ばれ、３次元空間において６つのＣＤＲ（重鎖から３つ及び軽鎖から３つ）の提示のための足場を与えて抗原結合表面を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖コンフォメーションのことをいう。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうち５つは可能なコンフォメーションの限られたレパートリーしか有しないことがわかっている。各カノニカル構造はポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴づけることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分における高いアミノ酸配列可変性にもかかわらず、非常に類似した３次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．， １９８７， １９６： ９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ， １９９６， ２６３： ８００）。さらに、とられるループ構造とその周りのアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラスのコンフォメーションは、ループの長さ及びループ中の、さらには保存されたフレームワーク中（すなわちループ以外）の重要な位置にあるアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスの割当てはこうした重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
用語「カノニカル構造」は、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， ｉｎ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９２）によって列挙されているように、抗体の一次配列についての考慮も含み得る。Ｋａｂａｔ番号付け方式は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した形で番号付けするための広く採用されている標準である。抗体のカノニカル構造を決定するために、追加の構造的な考慮を用いることもできる。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けには完全に反映されていない差を、Ｃｈｏｔｈｉａらの番号付けシステムによって記述することができる、及び／または他の技術、例えば結晶構造解析及び二次元もしくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、適切なシャーシ配列を同定することが可能となるカノニカルクラスに入れられ得る（例えば、ライブラリーに様々なカノニカル構造を含める要求に基づく）。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ番号付け及びＣｈｏｔｈｉａらによって記載されているような構造的な考慮、ならびに抗体構造のカノニカルな側面を解釈するためのそれらが意味することは文献に記載されている。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、「Ｆｃ領域」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジのことをいう。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。したがって、上記から逸脱することなく、「Ｆｃ領域」は「ＣＨ２ドメインまたはそのバリアント」及び「ＣＨ３ドメインまたはそのバリアント」を含むとも定義され得る。Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここで番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。Ｆｃは単独でこの領域のことをいう場合もあれば、Ｆｃポリペプチド、例えば抗体との関係においてこの領域のことをいう場合もある。本明細書で用いる場合、「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域のすべてまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは抗体、Ｆｃ融合体、単離Ｆｃ、及びＦｃ断片を含む。
本発明の目的の多重特異性抗体の可変軽鎖（ＶＬ）及び対応する可変重ドメイン（ＶＨ）は、全体を通して同じ意味で抗原と相互作用する「抗原結合部位」とも呼ぶ結合ドメインを含む。したがって、本発明の目的の多重特異性抗体の「第１可変軽ドメイン」及び「第１可変重ドメイン」はともに「第１抗原結合部位」を形成する。同様に、本発明の目的の多重特異性抗体の「第２可変軽ドメイン」及び「第２可変重ドメイン」はともに「第２抗原結合部位」を形成する。本発明の目的の多重特異性抗体の「第３可変軽ドメイン」及び「第３可変重ドメイン」はともに「第３抗原結合部位」を形成し、以下も同様である。
当業者であれば理解するように、本発明に従う使用のための抗原結合部位は、それを含むＶＨ、ＶＬ、及び／またはＣＤＲを含め、任意のその起源から入手または誘導され得る。したがって、そのような抗原結合部位、ＶＨ、ＶＬ、及び／またはＣＤＲは、それによって認識される標的に対する抗体を発現するハイブリドーマ細胞から；それによって認識される標的に対する抗体を発現する免疫化ドナー由来のＢ細胞から；それによって認識される標的に対する抗体を発現するように刺激されたＢ細胞から；及び／または抗原結合抗体（もしくはその抗原結合断片）について複数のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを含むライブラリーをスクリーニングすることによって同定された抗体もしくは抗体断片の同定から入手または誘導され得る。本発明に従う使用のための抗原結合部位を同定及び入手するのに用いるためのそのようなライブラリーの設計、調製、ディスプレイ、及び実現に関しては、例えばＷＯ ２００９／０３６３７９；ＷＯ２０１２００９５６８；ＷＯ２０１０１０５２５６；ＵＳ ８，２５８，０８２；ＵＳ ６，３００，０６４；ＵＳ ６，６９６，２４８；ＵＳ ６，１６５，７１８；ＵＳ ６，５００，６４４；ＵＳ ６，２９１，１５８；ＵＳ ６，２９１，１５９；ＵＳ ６，０９６，５５１；ＵＳ ６，３６８，８０５；ＵＳ ６，５００，６４４などを参照。
本発明の目的の多重特異性抗体の抗原結合部位、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲ、及びこれらの組合せの任意の１つ以上は様々な種由来の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのような抗原結合部位、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲ、及びこれらの組合せは、限定はしないがマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、及びサルをはじめとする非ヒト起源から入手され得る。いくつかの実施形態において、スキャホールド及び／またはフレームワーク領域は異なる種由来の混合物とすることができる。そのため、本発明に従う目的の多重特異性抗体はキメラ抗体及び／またはヒト化抗体を含み得る。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」は両方とも、２種以上に由来する領域が組合せられた抗体のことをいう。例えば、「キメラ抗体」は慣例的に、マウスまたは他の非ヒト種由来の可変領域（複数可）及びヒト由来の定常領域（複数可）を含む。
「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に存在する配列と交換された非ヒト抗体のことをいう。一般にヒト化抗体において、抗体全体は、ＣＤＲを除いて、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲの範囲内を除いてそのような抗体と同一である。ＣＤＲは、その１つ、いくつか、またはすべてが非ヒト生物に由来する核酸によってコードされ、ヒト抗体可変領域のフレームワーク中に移植されて、その特異性が移植されたＣＤＲによって決定される抗体を生成する。そのような抗体の生成は例えばＷＯ ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。最初の移植コンストラクトで失われたアフィニティーを取り戻すために、選択したアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への「復帰突然変異」が必要とされることが多い（例えば米国特許第５，６９３，７６２号を参照）。ヒト化抗体は、任意により免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むことになり、そのため、典型的にはヒトＦｃ領域を含むことになるであろう。非ヒト抗体をヒト化、再形成、及び再表面形成する様々な技術及び方法が当該技術分野において公知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ， ２００４， Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ， ５３３−５４５， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ）、及びそこに引用されている参照文献を参照）。ある変形形態において、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：１９８６−１９９８及び２００４年１２月３日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｈｏｓｔ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」という名称の米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載されている方法を用いて抗体の免疫原性を減少させる。
したがって、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体に含まれる抗原結合部位の任意の１つ以上、またはＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ、もしくはこれらの組合せの１つ以上は、非ヒト種に由来し得る、及び／また非ヒト抗体もしくは抗体断片のヒト化に起因し得る。非ヒト種から得られるか、または由来するそのようなＶＨ、ＶＬ、及び／またはＣＤＲは、本明細書に開示する本発明の多重特異性アナログに含まれる場合、「ヒト化」領域及び／またはドメインと呼ばれる。
本明細書に開示する本発明の抗体アナログは、好ましくは、それぞれヒンジ領域を含む第１及び第２ポリペプチドを含むが、各ヒンジ領域は分子間ジスルフィド結合に関与することができる少なくとも１つのチオール基を含み、そのため、第１及び第２ポリペプチドはジスルフィド結合形成の結果として共有結合している。当該技術分野において理解されるように、ジスルフィド結合形成のためのそのようなチオール基の導入をもたらす化学修飾が、そのようなヒンジ領域内のある残基中に（または残基上に）導入され得る。あるいは、チオール基はヒンジ領域内に存在するシステイン残基によってもたらされ得る。そのようなシステインは天然ヒンジポリペプチド配列によってもたらされ得るか、またはヒンジ領域をコードする核酸中への変異誘発によって導入され得る。本明細書で用いる場合、本発明の抗体アナログの「ヒンジ」または「ヒンジ領域」は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥなどの免疫グロブリンに見られるような天然または本来のヒンジ領域を含むかまたは構成し得るが、そのようなヒンジまたはヒンジ領域はその置換形態も含むかまたは構成し得る。さらに、そのようなヒンジまたはヒンジ領域は、ある実施形態において、全体を通して開示するような「リンカー部分」を含むかまたは構成し得る。他の実施形態において、ヒンジまたはヒンジ領域は、上記で開示したような天然または本来のヒンジ領域及び全体を通して開示するようなリンカー部分の両方を含み得る。
ある実施形態において、本明細書に開示する本発明の抗体アナログは１つ以上のリンカーまたはリンカー部分を含む。そのようなリンカーまたはリンカー部分はペプチドリンカー部分または非ペプチドリンカー部分を含み得る。用語「リンカー」及び「リンカー部分」などは、結合に利用可能な価数を有するポリペプチド及び結合に利用可能な価数を有する本発明の目的の多重特異性抗体に含まれるアミノ酸に順に共有結合した二価種（−Ｌ−）を意味する。利用可能な結合部位は、アミノ酸の側鎖（例えばリシン、システイン、またはアスパラギン酸側鎖、及びそのホモログ）を含むと都合がよい場合がある。いくつかの実施形態において、アナログ中の利用可能な結合部位は、リシンまたはシステイン残基の側鎖である。いくつかの実施形態において、アナログ中の利用可能な結合部位は、アナログを含むポリペプチドのＮ末端アミンである。いくつかの実施形態において、アナログ中の利用可能な結合部位は、アナログを含むポリペプチドのＣ末端カルボキシルである。いくつかの実施形態において、アナログ中の利用可能な結合部位は、アナログを含むポリペプチドの主鎖原子（例えばｃ−アルファ炭素原子）である。
好ましくは、ＶＨまたはＶＬを抗体アナログのＣＨ３ドメインのＣ末端に共有結合させるためにリンカー部分が用いられる。第１ＶＨまたは第１ＶＬをそれぞれ第２ＶＨまたは第２ＶＬに共有結合させるためにもリンカー部分が用いられ得る。第１ＶＨまたは第１ＶＬをそれぞれ第２ＶＬまたは第２ＶＨに共有結合させるためにもリンカー部分が用いられ得る。一本鎖抗原結合部位、例えばｓｃＦｖなどのＶＨをそのような一本鎖抗原結合部位のＶＬに、及びその逆に、共有結合させるためにもリンカー部分が用いられ得る。そのような一本鎖抗原結合部位、例えばｓｃＦｖなどのＶＨまたはＶＬをＣＨ３ドメインまたはそのバリアントのＣ末端に結合させるためにもリンカー部分が用いられ得る。ＶＨをＣＬドメインのＮ末端にまたはＣＨ２のＮ末端に結合させるためにもリンカー部分が用いられ得る。ＶＬをＣＬドメインのＮ末端にまたはＣＨ２ドメインのＮ末端に結合させるためにもリンカー部分が用いられ得る。理解されるように、本明細書に開示する目的の多重特異性抗体のいずれかを調製するために、任意により複数の特異性を有するそのようなアナログに複数の抗原結合部位が含まれ得るように、上記の組合せ及び／または複数が用いられ得る。したがって、目的の多重特異性抗体は、二価、三価、四価、五価、六価、七価、もしくは八価など、及び／または二重、三重、四重、五重、六重、七重、もしくは八重特異性などを有する抗体アナログを生成するように、１、２、３、４、５、６、７、またはこれより多くのＶＬ、ＶＨ、及び／または一本鎖抗原結合部位、例えばｓｃＦｖなどを、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、ＶＨ、または第１ポリペプチドもしくは第２ポリペプチドに結合したＶＬなどに共有結合させる１つ以上のリンカーを用いることによって生成され得る。
したがって、ある実施形態において、目的の多重特異性抗体は、アナログの第１重鎖のＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントにリンカー部分を介して共有結合した第１ＶＬを含み、第２抗原結合部位を形成する。別の実施形態において、目的の多重特異性抗体は、アナログのＦｃ領域のＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントにリンカー部分を介して共有結合した第１ＶＨを含み、それによって第２抗原結合部位を形成する。
さらなる実施形態において、目的の多重特異性抗体は第３抗原結合部位を含み、第３抗原結合部位はリンカー部分を介して第１ＶＬまたは第１ＶＨのいずれかに共有結合している。またさらなる実施形態において、第３抗原結合部位は、一本鎖抗原結合部位、例えば一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）などを含み、ｓｃＦｖはリンカー部分を介して第２ＶＨに共有結合した第２ＶＬを含むか、または第２ＶＬがリンカー部分を介して第２ＶＨに共有結合している。
さらなる実施形態において、本発明の目的の多重特異性抗体は、追加の結合部位、例えば第４抗原結合部位、第５抗原結合部位、第６抗原結合部位などをさらに含み、そのうちの１つ以上は、目的の多重特異性抗体の他のＶＬ及び／またはＶＨにリンカー部分を介して結合している一本鎖抗原結合部位、例えばｓｃＦｖなどを含み得る。
ある実施形態において、リンカー部分は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含む。さらなる実施形態において、リンカー部分は、立体障害のないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及び／またはセリンなどで大部分が構成されている。ある実施形態において、リンカー部分は、［Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号２）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号３）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号４）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号５）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号１０）；及びこれらの組合せの群から選択される配列を含み、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び７５からなる群から選択される整数である。
そのようなリンカーは、酸性リンカー、塩基性リンカー、及び構造モチーフ、またはこれらの組合せ；ポリグリシン、ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、またはポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）；（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号１１）、または（Ｇｌｙ）５（配列番号１２）；（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１３）、（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１５）、またはＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１６）、［Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号１）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号２）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号３）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（配列番号４）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号５）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号６）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＳｅｒＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号７）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号８）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号９）、または［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ｎ（配列番号１０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号１７）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号１８）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号１９）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号２０）、［Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２２）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２３）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２４）を含み得るが、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び７５からなる群から選択される整数である。
ある実施形態において、荷電リンカー部分が用いられる。そのような荷電リンカー部分は、リンカー部分がそれぞれ７より低い、または７より高いｐｉを有するように、相当な数の酸性残基（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕなど）を含有し得るか、または相当な数の塩基性残基（例えばＬｙｓ、Ａｒｇなど）を含有し得る。当業者であれば理解し、またすべての他のものも同様であるが、所与のリンカー部分の酸性または塩基性残基の相対量が多いほど、リンカー部分のｐＩがそれぞれ低く、または高くなる。そのようなリンカー部分は、本明細書に開示する目的の多重特異性抗体に利点を与えるが、例えば、特定のｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えばｐＨ７．２以上ｐＨ７．６以下）、またはそのようなアナログを含む医薬組成物のｐＨなどでのそのようなポリペプチドの溶解性及び／または安定性を改善すること、ならびに、リンカー部分を介して結合しているアナログのドメイン及び／または領域の回転及び翻訳における柔軟性などの特性の最適化を可能にすることなどである。そのような特性は、当業者によって任意の所与の多重特異性アナログに応じて最適化及び調整されることが有利であり得る。
例えば、「酸性リンカー」は、７未満；６以上７以下；５以上６以下；４以上５以下；３以上４以下；２以上３以下；または１以上２以下のｐＩを有するリンカー部分である。同様に、「塩基性リンカー」は、７超；７以上８以下；８以上９以下；９以上１０以下；１０以上１１以下；１１以上１２以下、または１２以上１３以下のｐｉを有するリンカー部分である。ある実施形態において、酸性リンカーは、［Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号１７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号１８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号１９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］ｎ（配列番号２０）；［Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２２）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２３）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］ｎ（配列番号２４）；及びこれらの組合せからなる群から選択される配列を含有することになり、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び７５からなる群から選択される整数である。ある実施形態において、塩基性リンカーは、［Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］ｎ（配列番号２５）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］ｎ（配列番号２６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］ｎ（配列番号２７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］ｎ（配列番号２８）；［Ｇｌｙ−Ａｒｇ］ｎ（配列番号２９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］ｎ（配列番号３０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］ｎ（配列番号３１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］ｎ（配列番号３２）；及びこれらの組合せからなる群から選択される配列を含有することになり、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び７５からなる群から選択される整数である。
加えて、特定の構造モチーフまたは特徴、例えばαへリックスなどを有するリンカー部分が用いられ得る。例えば、そのようなリンカー部分は、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］ｎ（配列番号３３）からなる群から選択される配列を含有し得るが、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び７５であり、例えば、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］３（配列番号３４）、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］４（配列番号３５）、または［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］５（配列番号３６）などである。
またさらなる実施形態において、本開示の目的の多重特異性抗体に用いられる各リンカー部分は、独立して、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、もしくはポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号１１）、及び（Ｇｌｙ）５（配列番号１２）、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１３）、（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１５）、及びＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１６）、Ｇｌｙ及びＡｌａの組合せ、Ｇｌｙ及びＳｅｒの組合せ、Ｇｌｙ及びＧｌｕの組合せ、Ｇｌｙ及びＡｓｐの組合せ、Ｇｌｙ及びＬｙｓの組合せ、またはこれらの組合せを含む。
ある実施形態において、本発明の目的の多重特異性抗体は、例えばＣＨ２ドメインバリアント及び／またはＣＨ３ドメインバリアントを含み、こうしたバリアントはそれぞれ独立して少なくとも１つの異なるアミノ酸置換を含み、そのため、本発明の目的の多重特異性抗体の第１及び第２ポリペプチドのヘテロ二量体化がホモ二量体化よりも優先され、ヘテロ二量体ドメイン対が生成される。
本明細書全体を通して用いる目的の多重特異性抗体のドメインまたは領域の「バリアント」に関して、そのようなバリアントは、そのようなドメインまたは領域を含み、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親ポリペプチド配列のものとは異なるポリペプチド配列のことをいう。親ポリペプチド配列は、自然発生もしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチド配列であり得るか、またはＷＴ配列の改変型であり得る。好ましくは、バリアントは、親ポリペプチド、領域、またはドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸改変、例えば、親と比較して約１〜約１０アミノ酸改変、好ましくは約１〜約５アミノ酸改変を有する。本発明のバリアントポリペプチド配列は、好ましくは親配列との少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有することになるであろう。
「親ポリペプチド」、「親ポリペプチド配列」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」は、本明細書で用いる場合、後に改変されてバリアントポリペプチドまたはポリペプチド配列を生成する非改変ポリペプチドまたはポリペプチド配列を意味する。当該親ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、または自然発生ポリペプチドのバリアントもしくは組換え型であり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチドそのもののことをいう場合もあれば、親ポリペプチドを含む組成物、または親ポリペプチドをコードするアミノ酸配列のことをいう場合もある。
「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親Ｆｃ配列のものとは異なるＦｃ配列を意味する。ＦｃバリアントはＦｃ領域のみを包含し得るか、または実質的にＦｃによってコードされる抗体、Ｆｃ融合体、単離Ｆｃ、Ｆｃ断片、もしくは他のポリペプチドとの関係において存在し得る。Ｆｃバリアントは、Ｆｃポリペプチドそのもののことをいう場合もあれば、Ｆｃバリアントを含む組成物、またはＦｃバリアントをコードするアミノ酸配列のことをいう場合もある。
「Ｆｃポリペプチドバリアント」または「バリアントＦｃポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親Ｆｃポリペプチドとは異なるＦｃポリペプチドを意味する。「Ｆｃバリアント抗体」または「抗体Ｆｃバリアント」は、本明細書で用いる場合、Ｆｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸改変のために親抗体とは異なる抗体を意味する。
「タンパク質バリアント」または「バリアントタンパク質」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。「抗体バリアント」または「バリアント抗体」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親抗体とは異なる抗体を意味する。「ＩｇＧバリアント」または「バリアントＩｇＧ」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親ＩｇＧとは異なる抗体を意味する。「免疫グロブリンバリアント」または「バリアント免疫グロブリン」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのアミノ酸改変のために親免疫グロブリン配列のものとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。
ヘテロ二量体対またはそのようなヘテロ二量体対を含む開示の目的の多重特異性抗体の間の相互作用は、ヘテロ二量体対界面において、その界面での突出部がくぼみの中に入る相補的領域の形成；その界面での非自然発生ジスルフィド結合の形成；その界面におけるロイシンジッパー；その界面における疎水性領域；及び／またはその界面における親水性領域によって促進され得る。「突出部」は、第１ポリペプチドの界面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置換することによって構築される。突出部と同一またはほぼ同等のサイズの代償的な「くぼみ」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えばアラニンまたはスレオニン）に置換することによって、第２ポリペプチドの界面上に任意により形成される。適切な位置及び寸法の突出部またはくぼみが第１または第２ポリペプチドのいずれかの界面に存在する場合、それぞれ対応するくぼみまたは突出部を隣接する界面に組換えるだけでよい。非自然発生ジスルフィド結合は、遊離チオール含有残基が第２ポリペプチド上の別の遊離チオール含有残基と相互作用し、その結果、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間でジスルフィド結合が形成されるように、第１ポリペプチド上で自然発生アミノ酸を遊離チオール含有残基、例えばシステインなどで置換することによって構築される。本発明に従う例示的なヘテロ二量体化対及びその作製方法は、当該技術分野において利用可能であり、例えば、ＵＳ ２０１１／００５４１５１；ＵＳ ２００７／００９８７１２などに開示されている。
ある実施形態において、ヘテロ二量体対は本発明の目的の多重特異性抗体のＦｃ領域内に含まれる。そのようなヘテロ二量体対を含むＦｃ領域を「ヘテロ二量体Ｆｃ領域」と呼ぶ。
したがって、ある実施形態において、目的の多重特異性抗体は、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントを含み、ａ）ＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの突出部及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの対応するくぼみを含むか、またはＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つのくぼみ及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの対応する突出部を含むかのいずれかである。ある他の実施形態において、目的の多重特異性抗体は、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントを含み、ａ）ＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの置換された負電荷アミノ酸及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの対応する正電荷アミノ酸を含むか、またはｂ）ＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントが、それぞれ独立して、第１ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの置換された正電荷アミノ酸及び第２ポリペプチドのＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインのいずれかにおける少なくとも１つの対応する置換された負電荷置換アミノ酸を含むかのいずれかである。
「天然」抗体（すなわち、天然Ｂ細胞による天然生物学的抗体合成を経てインビボで生成される抗体）におけるＦｃ機能に関して、抗体のＦｃ領域は複数のＦｃ受容体及びリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる多数の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧでは、Ｆｃ領域、Ｆｃは、ＩｇドメインＣγ２及びＣγ３ならびにＣγ２につながるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに対するＦｃ受容体の重要なファミリーはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は抗体と免疫系の細胞アームとの間の伝達を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃをはじめとするＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃをはじめとするＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）をはじめとするＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５）。これらの受容体は典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内のいくつかのシグナル伝達現象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びγδＴ細胞をはじめとする様々な免疫細胞で発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、結合された抗原の部位にこれらのエフェクター細胞が動員され、典型的には細胞内のシグナル伝達現象ならびに重要なその後の免疫応答、例えば炎症媒介物質の放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、及び細胞傷害性攻撃などをもたらす。細胞傷害性及び食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する潜在的機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６；Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０）と呼ばれる。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存的細胞媒介ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。
異なるＩｇＧサブクラスはＦｃγＲに対して異なるアフィニティーを有し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は典型的にＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもかなり良好に受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５）。ＦｃγＲはＩｇＧのＦｃ領域に異なるアフィニティーで結合する。ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは細胞内シグナル伝達ドメインを有しない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、及びＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする免疫複合体誘発活性化の正調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、そのため阻害性である。したがって、前者は活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは阻害受容体と呼ばれる。アフィニティー及び活性におけるこれらの差にかかわらず、すべてのＦｃγＲは、Ｆｃ上の同じ領域、Ｃγ２ドメインのＮ末端及び前述のヒンジに結合する。
Ｆｃ上の重複するが別個の部位は補体タンパク質Ｃ１ｑへの界面として機能する。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを媒介するのと同様にして、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介する。Ｆｃ上のＣγ２ドメインとＣγ３ドメインとの間の部位は胎児性受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介し、この結合により、エンドサイトーシスされた抗体がエンドソームから血流中に再循環される（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６）。このプロセスは、全長分子の大きなサイズに起因する腎臓濾過の防止と相まって、１〜３週間の範囲の好ましい抗体の血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合は抗体輸送においても重要な役割を果たす。Ｆｃ上のＦｃＲｎの結合部位は細菌プロテインＡ及びＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質による強固な結合は典型的に、タンパク質精製時にプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって抗体を精製する手段として利用される。これらの領域、補体及びＦｃＲｎ／プロテインＡ結合領域の忠実度は、抗体の臨床的特性及びその開発の両方にとって重要である。
「天然」抗体のＦｃ領域の特有の特徴は、Ｎ２９７で生じる保存されたＮ結合型グリコシル化である。この炭水化物（またはオリゴ糖と呼ばれることもある）は、抗体にとって重要な構造的及び機能的役割を果し、抗体が哺乳類発現系を用いて産生されなければならない主な理由の１つである。ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合にはこの改変が必要とされ、Ｎ２９７炭水化物の組成の変化またはその除去はこれらのタンパク質への結合に影響を及ぼす。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体はＦｃバリアントを含む。Ｆｃバリアントは親Ｆｃポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸改変を含み、アミノ酸改変（複数可）によって１つ以上の特性が最適化される。Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインバリアント、ＣＨ３ドメインバリアント、またはＣＨ２ドメインバリアント及びＣＨ３ドメインバリアントの両方のいずれかをさらに含む。本明細書において、「改変」は、タンパク質、ポリペプチド、抗体、本発明の目的の多重特異性抗体、または免疫グロブリンの物理的、化学的、または配列の特性における変化を意味する。アミノ酸改変は、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失とすることができる。本明細書において、「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の別のアミノ酸との置き換えを意味する。例えば、置換Ｙ３４９Ｔは、３４９位のチロシンがスレオニンで置き換えられたバリアントポリペプチド、この場合は定常重鎖バリアントのことをいう。本明細書で用いる場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の追加を意味する。本明細書で用いる場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。
本明細書に開示のＦｃバリアントは、少なくとも１つのアミノ酸改変のためにその親とはアミノ酸配列が異なる。本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、親と比べて２つ以上のアミノ酸改変、例えば親と比べて約１〜５０アミノ酸改変、例えば、約１〜１０アミノ酸改変、約１〜５アミノ酸改変などを有し得る。したがって、Ｆｃバリアントの配列及び親Ｆｃポリペプチドの配列は実質的に相同である。例えば、本発明においてバリアントＦｃバリアント配列は、親Ｆｃバリアント配列との約８０％の相同性、例えば、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、少なくとも約９８％の相同性、少なくとも約９９％の相同性などを有することになるであろう。本明細書に開示の改変は糖型改変も含む。改変は、分子生物学を用いて遺伝子的に行われ得るか、または酵素的もしくは化学的に行われ得る。
本明細書に開示のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、置換Ｙ３４９Ｔは、３４９位のチロシンがスレオニンで置き換えられたバリアントポリペプチド、この場合は定常重鎖バリアントのことをいう。同様に、Ｙ３４９Ｔ／Ｔ３９４Ｆは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｙ３４９Ｔ及びＴ３９４Ｆを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の素性は不特定であってよく、その場合、上記のバリアントは３４９Ｔ／３９４Ｆと呼ばれる。置換が施される順序は任意であり、換言すれば、例えば３４９Ｔ／３９４Ｆは３９４Ｆ／３４９Ｔと同じＦｃバリアントであることに留意されたい。別途注記のない限り、本明細書において述べる定常領域及びＦｃの位置は、ＥＵインデックスまたはＥＵ番号付け方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従って番号付けられる。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ番号付け方式におけるようなＥＵインデックスはＥＵ抗体の番号付けのことをいう（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９６９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５）。
ある実施形態において、本明細書に開示のＦｃバリアントはヒトＩｇＧ配列に基づいており、したがって、ヒトＩｇＧ配列が、限定はしないが他の生物由来の配列、例えばげっ歯類及び霊長類配列をはじめとする他の配列を比較する「ベース」配列として用いられる。免疫グロブリンは、他の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧＤ、ＩｇＧＭなど由来の配列も含み得る。本明細書に開示のＦｃバリアントは１つの親ＩｇＧとの関連で組換えられるが、バリアントは別の第２親ＩｇＧとの関連で組換えられ得るか、または「移入」され得ることを企図する。これは、典型的には第１及び第２ＩｇＧの配列間の配列または構造相同性に基づいて、第１及び第２ＩｇＧ間の「等価な」または「対応する」残基及び置換を決定することによって行われる。相同性を立証するためには、本明細書で概説した第１ＩｇＧのアミノ酸配列を第２ＩｇＧの配列と直接比較する。アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を可能にする（すなわち、任意の欠失及び挿入によって保存されている残基の排除を回避する）、当該技術分野において公知の相同性アラインメントプログラム（例えば種間で保存されている残基を用いる）の１つ以上を用いて、配列をアラインメントした後、第１免疫グロブリンの一次配列中の特定のアミノ酸と等価な残基を定義する。保存された残基のアラインメントはそのような残基の１００％を保存し得る。しかし、保存された残基が７５％を超える、またはわずか５０％のアラインメントも等価な残基を定義するのに十分である。等価な残基は、すでに構造が決定されているＩｇＧの三次構造レベルでの第１及び第２ＩｇＧ間の構造相同性を決定することによっても定義され得る。この場合、等価な残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の主鎖原子（Ｎに対してＮ、ＣＡに対してＣＡ、Ｃに対してＣ及びＯに対してＯ）の２つ以上の原子座標が、アラインメント後で約０．１３ｎｍ以内にあるものと定義される。別の実施形態において、等価な残基はアラインメント後で約０．１ｎｍ以内にある。アラインメントは、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の重なりが最大となるように最良モデルの向き及び位置を合わせて達成される。残基がどれだけ等価または対応していると決定されるかにかかわらず、また、ＩｇＧが作製される親ＩｇＧの素性にかかわらず、伝えようとしていることは、本明細書に開示したように発見されたＦｃバリアントは、Ｆｃバリアントとの大きな配列または構造相同性を有する任意の第２親ＩｇＧに組み込まれ得るということである。したがって、例えば、親抗体がヒトＩｇＧ１であるバリアント抗体が生成される場合、上記の方法または等価な残基を決定するための他の方法を用いることによって、バリアント抗体は異なる抗原に結合する別のＩｇＧ１親抗体、ヒトＩｇＧ２親抗体、ヒトＩｇＡ親抗体、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ親抗体などで組換えられ得る。繰り返すが、上記のように、親Ｆｃバリアントの背景状況は、本明細書に開示のＦｃバリアントを他の親ＩｇＧに移入できるかどうかに影響を与えない。
上記のようなＣＨ３ドメインバリアントを含むか、またはＣＨ３ドメインバリアントであるＦｃバリアントは、３４９、３５１、３５４、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９６、３９７、３９９、４０１、４０５、４０７、４０９、４１１、及び４３９からなる群から選択されるＣＨ３ドメイン中の位置において少なくとも１つの置換を含み得るが、ここで、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。好ましい実施形態において、ＣＨ３ドメインバリアントは、重鎖ごとに少なくとも１つの、３４９Ａ、３４９Ｃ、３４９Ｅ、３４９Ｉ、３４９Ｋ、３４９Ｓ、３４９Ｔ、３４９Ｗ、３５１Ｅ、３５１Ｋ、３５４Ｃ、３５６Ｋ、３５７Ｋ、３６４Ｃ、３６４Ｄ、３６４Ｅ、３６４Ｆ、３６４Ｇ、３６４Ｈ、３６４Ｒ、３６４Ｔ、３６４Ｙ、３６６Ｄ、３６６Ｋ、３６６Ｓ、３６６Ｗ、３６６Ｙ、３６８Ａ、３６８Ｅ、３６８Ｋ、３６８Ｓ、３７０Ｃ、３７０Ｄ、３７０Ｅ、３７０Ｇ、３７０Ｒ、３７０Ｓ、３７０Ｖ、３９２Ｄ、３９２Ｅ、３９４Ｆ、３９４Ｓ、３９４Ｗ、３９４Ｙ、３９５Ｔ、３９５Ｖ、３９６Ｔ、３９７Ｅ、３９７Ｓ、３９７Ｔ、３９９Ｋ、４０１Ｋ、４０５Ａ、４０５Ｓ、４０７Ｔ、４０７Ｖ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４１１Ｄ、４１１Ｅ、４１１Ｋ、及び４３９Ｄからなる群から選択されるＣＨ３ドメイン置換を含む。これらのバリアントのそれぞれは、各重鎖Ｆｃ領域について個別にまたは任意の組合せで用いることができる。当業者であれば理解するであろうが、各重鎖は異なる数の置換を含むことができる。例えば、Ｆｃ領域を構成する重鎖の両方が単一の置換を含んでもよく、一方の鎖が単一の置換を含み、他方が２つの置換を含んでもよく、両方が２つの置換を含むこともできる（各鎖は異なる置換を含むことになるであろうが）、など。
いくつかの実施形態において、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントは組合せて、すなわち、重鎖Ｆｃドメインごとに２つ以上の上記で概説した群から選択されるバリアントが作製される。
本発明の目的の多重特異性抗体の設計及び調製に用いられ得るヘテロ二量体化に有利な他のＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインバリアントは、例えばＲｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９［７］：６１７−６２１；米国特許第５，７３１，１６８号；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９６：９５−１０１；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３［４］：１９５−２０２；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５［２５］：１９３７−１９６４６；及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／００００７１（ＷＯ ２００９／０８９００４として公開）で提供されている。
本明細書に開示のＦｃバリアントは、Ｆｃ受容体またはＦｃリガンドへの結合性の改善または低減のために最適化され得る。「Ｆｃ受容体」または「Ｆｃリガンド」は、本明細書で用いる場合、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ−リガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドとしては、ＦｃγＲ（上記のように、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩ及びＦｃＲｎを含むがこれらに限定されない）、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、及びウイルスＦｃγＲが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲに相同なＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も含まれる。ＦｃリガンドにはＦｃに結合する未発見の分子も含まれ得る。
本発明の目的の多重特異性抗体は、限定はしないがＦｃ受容体に対するアフィニティーの向上または低減をはじめとして、特性を最適化するように設計され得る。本明細書で用いる場合、Ｆｃポリペプチドより「大きいアフィニティー」または「改善されたアフィニティー」または「向上したアフィニティー」または「良好なアフィニティー」は、結合アッセイでのバリアント及び親ポリペプチドの量が実質的に同じである場合に、Ｆｃバリアントが親Ｆｃポリペプチドよりも有意に高い会合平衡定数（ＫＡもしくはＫａ）または低い解離平衡定数（ＫＤもしくはＫｄ）でＦｃ受容体に結合することを意味する。例えば、Ｆｃ受容体結合アフィニティーが改善されたＦｃバリアントは、親Ｆｃポリペプチドと比較して、約５倍〜約１０００倍、例えば約１０倍〜約５００倍のＦｃ受容体結合アフィニティーの改善を示し得るが、Ｆｃ受容体結合アフィニティーは、例えば、限定はしないがＢｉａｃｏｒｅをはじめとする本明細書に開示の結合法によって、当業者により測定される。したがって、本明細書で用いる場合、親Ｆｃポリペプチドと比較して「低減されたアフィニティー」は、Ｆｃバリアントが親Ｆｃポリペプチドよりも有意に低いＫＡまたは高いＫＤでＦｃ受容体に結合することを意味する。高いまたは低いアフィニティーは、アフィニティーの絶対レベルに対して定義することもできる。
一実施形態において、本発明に特に有用なＦｃ改変は、１つ以上のＦｃγＲ及び／または補体タンパク質への結合性を低減または除去し、それによって、Ｆｃ媒介エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣなどを低減または除去するバリアントである。そのようなバリアントを本明細書では「ノックアウトバリアント」または「ＫＯバリアント」とも呼ぶ。ＦｃγＲ及び補体タンパク質への結合性を低減するバリアントは、Ｆｃ領域によって媒介される望ましくない相互作用の低減、及び本発明の目的の多重特異性抗体の選択性の調整に有用である。好ましいノックアウトバリアントは、２００７年１０月３１日に出願された「Ｆｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」という名称の米国特許出願第１１／９８１，６０６号に記載されている。好ましい改変としては、２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５、及び３２８位の置換、挿入、及び欠失が挙げられるがこれらに限定されず、ここで番号付けはＥＵインデックスに従う。好ましい置換としては、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、及び３２８Ｒが挙げられるがこれらに限定されず、ここで番号付けはＥＵインデックスに従う。好ましいバリアントは２３６Ｒ／３２８Ｒを含む。バリアントは、限定はしないがヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／またはＩｇＧ４ならびにこれらの組合せをはじめとする任意のＩｇＧアイソタイプまたはＩｇＧアイソタイプＦｃ領域との関係において用いられ得る。ＦｃγＲ及び補体結合性の低減及びＦｃ媒介エフェクター機能の低減に好ましいＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。ハイブリッドアイソタイプ、例えばＵＳ ２００６−０１３４１０５に記載されているようなハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２アイソタイプも有用であり得る。ＦｃγＲ及び補体相互作用を低減させるための他の改変としては、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、及び２３４Ｖ、ならびに変異的もしくは酵素的手段による、またはタンパク質をグリコシル化しない生物、例えば細菌などでの産生による２９７位のグリコシル化の除去が挙げられるが、これらに限定されない。これらの及び他の改変は、Ｓｔｒｏｈｌ， ２００９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５−６９１で概説されている。
ＦｃγＲ及び／または補体への結合性を改善するＦｃ改変も、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の設計及び調製に導入可能である。そのようなＦｃバリアントはＦｃ媒介エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／またはＣＤＣなどを強化し得る。ＦｃγＲ及び補体結合性の改善に好ましい改変は、例えば、ＵＳ ８，１８８，２３１及びＵＳ ２００６−０２３５２０８に記載されている。好ましい改変は、２３６、２３９、２６８、３２４、及び３３２からなる群から選択される位置の置換を含むが、ここで番号付けはＥＵインデックスに従う。好ましい置換としては、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、及び３３２Ｅが挙げられるがこれらに限定されない。好ましいバリアントとしては、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、及び２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが挙げられるがこれらに限定されない。ＦｃγＲ及び補体相互作用を強化するための他の改変としては、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７１、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５１、及び３９６Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。これらの及び他の改変はＳｔｒｏｈｌ， ２００９（同文献）で概説されている。
一実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂに対するアフィニティーを強化するＦｃバリアントを組み込み得る。そのようなバリアントは、本明細書における本発明の目的の多重特異性抗体に、Ｂ細胞及び単球をはじめとするＦｃγＲＩＩｂ＋細胞に関係する免疫調節活性を与え得る。一実施形態において、このＦｃバリアントは、１つ以上の活性化受容体と比較してＦｃγＲＩＩｂに対するアフィニティーを選択的に強化する。ＦｃγＲＩＩｂへの結合性を変化させるための改変は、２００８年５月３０日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＣＤ３２ｂ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ」という名称のＵ．Ｓ． ８，０６３，１８７に記載されている。特に、ＦｃγＲＩＩｂへの結合性を改善するＦｃバリアントは、ＥＵインデックスに従う２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、及び３３２からなる群から選択される位置の１つ以上の改変を含み得る。ＦｃγＲＩＩｂアフィニティーを強化するための好ましい置換としては、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ，２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、及び３３２Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、置換には、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、及び３２８Ｙが挙げられるがこれらに限定されない。ＦｃγＲＩＩｂへの結合性を強化するための好ましいＦｃバリアントとしては、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、及び２６７Ｅ／３２８Ｆが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、ＦｃＲｎ結合性を改善するＦｃバリアントを組み込み得る。そのようなバリアントは、本発明の目的の多重特異性抗体のインビボ薬物動態特性を向上させ得る。ＦｃＲｎへの結合性を増加させる、及び／または薬物動態特性を改善する好ましいバリアントとしては、２５９、３０８、４２８、及び４３４位の置換が挙げられるがこれらに限定されず、例えば２５９１、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、４３４Ｍ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９１／３０８Ｆ及び２５９１／３０８Ｆ／４２８Ｌ（ならびに２００８年１２月２２日に出願された「Ｆｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＦｃＲｎ」という名称の米国特許出願第１２／３４１，７６９号に記載されている他のもの）が挙げられるがこれらに限定されない。ＦｃＲｎに対するＦｃ結合性を増加させる他のバリアントとしては、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（８）： ６２１３−６２１６， Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６−３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００１， ２７６（９）：６５９１−６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ’ Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００２， １６９：５１７１−５１８０， Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：２３５１４−２３５２４）が挙げられるが、これらに限定されない。ＦｃＲｎ結合性を調節するための他の改変は、Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １８２：７６６３−７６７１に記載されている。
本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、限定はしないがヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／またはＩｇＧ４をはじめとする任意のＩｇＧアイソタイプまたはＩｇＧアイソタイプＦｃ領域との関係において、Ｆｃ改変を組み込むことができる。ＩｇＧアイソタイプは、ＦｃγＲ及び／または補体媒介エフェクター機能（複数可）を変化させるように選択され得る。ハイブリッドＩｇＧアイソタイプも有用であり得る。例えば、米国特許公開第２００６−０１３４１０５号は、特定の発明に用途を見出し得る複数のハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２定常領域を記載している。本発明のいくつかの実施形態おいて、本発明の目的の多重特異性抗体は、アイソタイプ改変、すなわち、代替的ＩｇＧにおけるアミノ酸タイプへの親ＩｇＧにおける改変のための手段を含み得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントが、２つのアイソタイプで異なる位置におけるＩｇＧ３由来のアミノ酸でＣＨ２及び／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ１の位置を置換するための置換手段によって構築され得る。したがって、１つ以上の置換手段、例えば２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２１、４３５Ｒ、及び４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。本発明の他の実施形態において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントが、２つのアイソタイプで異なる位置におけるＩｇＧ１由来のアミノ酸でＣＨ２及び／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ２の位置を置換するための置換手段によって構築され得る。したがって、１つ以上の置換手段、例えば、次のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（２３６位におけるグリシンの挿入を意味する）、及び３２７Ａの１つ以上を含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。
すべての抗体は重鎖の定常領域中の保存された位置に炭水化物を含有する。各抗体アイソタイプは異なる種類のＮ結合型炭水化物構造を有する。重鎖に結合した炭水化物の他に、最大３０％のヒトＩｇＧがグリコシル化Ｆａｂ領域を有する。ＩｇＧはＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に単一のＮ結合型二分岐炭水化物を有する。血清由来のまたはハイブリドーマもしくは組換え細胞でエクスビボ産生されたＩｇＧでは、ＩｇＧはＡｓｎ２９７結合炭水化物に関して異種性である。ヒトＩｇＧでは、コアオリゴ糖は一般に、異なる数の外側残基を伴って、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる。
本明細書における本発明の目的の多重特異性抗体は炭水化物部分も含み得るが、この部分は、オリゴ糖の記載に一般に用いられる命名法を参照して記載する。この命名法を用いている炭水化物化学の総説はＨｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ． １９８１， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５０：５５５−５８３に見出される。この命名法には、例えば、マンノースを表すＭａｎ；２−Ｎ−アセチルグルコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ；ガラクトースを表すＧａｌ；フコースを表すＦｕｃ；及びグルコースを表すＧｌｃが含まれる。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＡｃ、及び５−グルコリルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＧｃの省略表記によって記載される。
用語「グリコシル化」は、糖タンパク質へのオリゴ糖（互いに結合した２つ以上の単糖、例えば２〜約１２個の互いに結合した単糖）の結合を意味する。オリゴ糖側鎖は、典型的にＮまたはＯ結合のいずれかを介して糖タンパク質の主鎖に連結している。本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体のオリゴ糖は、一般にＮ結合型オリゴ糖としてＦｃ領域のＣＨ２ドメインに結合している。「Ｎ結合型グリコシル化」は、糖タンパク質鎖中のアスパラギン残基への炭水化物部分の結合のことをいう。当業者であれば、例えば、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３、ならびにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＤのＣＨ２ドメインのそれぞれは、残基２９７にＮ結合型グリコシル化のための単一の部位を有することを認識するであろう。
本明細書の解釈上、「成熟コア炭水化物構造」は、一般に、二分岐オリゴ糖に典型的な次の炭水化物構造：ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２からなる、Ｆｃ領域に結合しているプロセシングされたコア炭水化物構造のことをいう。成熟コア炭水化物構造は、一般にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合を介して糖タンパク質のＦｃ領域に結合している。「バイセクティングＧｌｃＮＡｃ」は、成熟コア炭水化物構造のα１，４マンノースに結合したＧｌｃＮＡｃ残基である。バイセクティングＧｌｃＮＡｃは、α（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ酵素（ＧｎＴＩＩＩ）によって酵素的に成熟コア炭水化物構造に結合させることができる。ＣＨＯ細胞は通常ＧｎＴＩＩＩを発現しないが（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：１３３７０−１３３７８）、そのように組換えられ得る（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１７６−１８０）。
本明細書では、改変糖型または組換え糖型を含む目的の多重特異性抗体について記載する。本明細書で用いる場合、「改変糖型」または「組換え糖型」は、タンパク質、例えば抗体に共有結合している炭水化物組成であって、親タンパク質のものとは化学的に異なる炭水化物組成を意味する。組換え糖型は、限定はしないがＦｃγＲ媒介エフェクター機能の強化または低減をはじめとする様々な目的に有用であり得る。一実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、Ｆｃ領域に共有結合されるフコシル化及び／またはバイセクティングオリゴ糖のレベルを制御するように改変される。
改変糖型を生成するための様々な方法が当該技術分野において公知である（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３；米国特許出願第１２／４３４，５３３号）。これらの技術は、例えば、組換えのもしくは組換えでない様々な生物もしくは細胞株（例えばＬｅｃ−１３ ＣＨＯ細胞もしくはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現させることによって、グリコシル化経路に関与する酵素（例えばＦＵＴ８［α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ］及び／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を抑制することによって、ＩｇＧが発現した後で炭水化物（複数可）を改変することによって、または酵素阻害剤としてのフコースアナログの存在下で抗体を発現させることによって、Ｆｃ領域に共有結合されるフコシル化及び／またはバイセクティングオリゴ糖のレベルを制御する。本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の糖型を改変するための他の方法としては、糖鎖組換え系統の酵母（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５）、蘚類（Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４（７）：１８２６−８）、及び植物（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１２）：１５９１−７）を用いることが挙げられる。改変糖型を生成するための特定の方法の使用は、実施形態をその方法に制限することを意図するものではない。むしろ、本明細書に開示の実施形態は、どのように生成されるかにかかわらず、改変糖型を有する本発明の目的の多重特異性抗体を包含する。
一実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、シアリル化のレベルを変化させるように糖鎖組換えされる。免疫グロブリンＧ分子中のシアリル化Ｆｃグリカンのレベルが高いと機能に悪影響を与える可能性があり（Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４（７）：１５２４−３４）、Ｆｃシアリル化のレベルの差が抗炎症活性の改変をもたらし得る（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：６７０−６７３）。抗体はＦｃコア多糖がシアリル化されると抗炎症特性を獲得し得るので、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体をシアル酸含有量の増加または低減のために糖鎖組換えすることが有利であり得る。
「組換え糖型」は、典型的に異なる炭水化物またはオリゴ糖のことをいい、したがって、例えば、免疫グロブリンは組換え糖型を含み得る。一実施形態において、本明細書に開示の組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化された本発明の目的の多重特異性抗体を含み、組成物中のグリコシル化抗体の約５１〜１００％、例えば抗体の８０〜１００％、９０〜１００％、９５〜１００％などは、フコースがない成熟コア炭水化物構造を含む。別の実施形態では、組成物中の抗体は、フコースがない成熟コア炭水化物構造及びさらにＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸改変を両方とも含む。代替的実施形態において、組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化された本発明の目的の多重特異性抗体を含み、組成物中のグリコシル化抗体の約５１〜１００％、抗体の８０〜１００％、９０〜１００％は、シアル酸がない成熟コア炭水化物構造を含む。別の実施形態では、組成物中の抗体は、シアル酸がない成熟コア炭水化物構造及びさらにＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸改変を両方とも含む。さらに別の実施形態では、組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化された本発明の目的の多重特異性抗体を含み、組成物中のグリコシル化抗体の約５１〜１００％、抗体の８０〜１００％、９０〜１００％は、シアル酸を含有する成熟コア炭水化物構造を含む。別の実施形態では、組成物中の抗体は、シアル酸を含有する成熟コア炭水化物構造及びさらにＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸改変を両方とも含む。別の実施形態では、組換え糖型及びアミノ酸改変の組合せが抗体に最適なＦｃ受容体結合特性をもたらす。
本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、さらなる最適化された特性をもたらす１つ以上の改変を含み得る。当該改変はアミノ酸改変であり得るか、または酵素的もしくは化学的に行われる改変であり得る。そのような改変（複数可）は、本発明の目的の多重特異性抗体に何らかの改善、例えば、その安定性、溶解性、機能、または臨床用途における向上をもたらす可能性がある。本明細書では、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体にさらなる改変を併せることによってなされ得る様々な改善を開示する。
一実施形態において、本明細書に開示する目的の多重特異性抗体の少なくとも１つの可変領域はアフィニティーが成熟され得る、換言すれば、標的抗原に対する抗体の結合性を強化するためにＶＨ及び／またはＶＬドメインにおいてアミノ酸改変がなされている。そのような種類の改変は、標的抗原への結合性の会合及び／または解離カイネティクスを改善し得る。他の改変としては、他の選択可能な標的と比較して標的抗原への選択性を改善するものが挙げられるが、これらには、非標的細胞と比較して標的細胞上で発現された抗原への選択性を改善する改変が含まれる。本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、本発明の目的の多重特異性抗体の内在化の低減または向上をもたらす１つ以上の改変を含み得る。
他の実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の、限定はしないが安定性、溶解性、及びオリゴマー状態をはじめとする、生物物理学的特性を改善するために改変が行われる。改変としては、例えば、本発明の目的の多重特異性抗体において、より優れた安定性をもたらすように、より好ましい分子内相互作用をもたらす置換、またはより高い溶解性のための極性アミノ酸での露出した非極性アミノ酸の置換を挙げることができる。本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体への他の改変としては、特定の形態またはホモ二量体もしくはホモ多量体分子を可能とするものが挙げられる。そのような改変としては、組換えジスルフィド、ならびに化学修飾または凝集法が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、タンパク質分解部位を除去する改変を含む。これらには、例えば産生収量を減少させるプロテアーゼ部位、及び投与されたタンパク質をインビボで分解するプロテアーゼ部位が含まれ得る。一実施形態において、共有結合分解部位、例えばアミド分解（すなわち、グルタミニル及びアスパラギニル残基のグルタミル及びアスパルチル残基へのアミド分解）、酸化、及びタンパク質分解部位などを除去するために、さらなる改変がなされる。除去することが特に有用なアミド分解部位は、アミド分解の傾向を高める部位であり、グリシンが後に続くアスパラギニル及びグルタミル残基（それぞれＮＧ及びＱＧモチーフ）が挙げられるがこれらに限定されない。そのような場合において、いずれかの残基の置換はアミド分解の傾向を著しく低減することができる。一般的な酸化部位としては、メチオニン及びシステイン残基が挙げられる。導入または除去いずれかを行うことのできる他の共有結合性改変としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン測鎖の“−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。さらなる改変には、翻訳後修飾、例えばＮ結合型またはＯ結合型グリコシル化及びリン酸化なども含まれ得るがこれらに限定されない。
改変には生物学的製剤の産生に一般に用いられる宿主または宿主細胞からの発現及び／または精製収量を改善するものが含まれ得る。これらとしては、様々な哺乳類細胞株（例えばＣＨＯ、ＨＥＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ ＬＴ３、Ｓａｏｓなど）、酵母細胞、細菌細胞、及び植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる改変には、鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖の能力を除去または低減する改変が含まれる。さらなる改変には、鎖内ジスルフィド結合を形成する重鎖の能力を除去または低減する改変が含まれる。
本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、限定はしないがＬｉｕ ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ， ２０１０， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９：４１３−４４４に記載されているものをはじめとする方法を用いて導入される非天然アミノ酸の使用を含む改変を含み得る。いくつかの実施形態において、こうした改変は上述した様々な機能的、生物物理学的、免疫学的、または製造上の特性の操作を可能にする。別の実施形態において、こうした改変は他の目的のためのさらなる化学修飾を可能にする。
本明細書では他の改変を企図する。例えば、本発明の目的の多重特異性抗体は、様々な非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーの１つに連結され得る。本発明の目的の多重特異性抗体の特異的または非特異的な化学または翻訳後修飾を可能とするために、さらなるアミノ酸改変が行われ得る。そのような改変としては、ＰＥＧ化及びグリコシル化が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ化を可能にするために用いることのできる特異的置換としては、ＰＥＧまたは別のポリマー部分を結合させるために効率的かつ特異的なカップリング化学を用いることができるような、新規なシステイン残基または非天然アミノ酸の導入が挙げられるが、これらに限定されない。特異的グリコシル化部位の導入は、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体中に新規なＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓ配列を導入することによって達成することができる。
免疫原性を低減させるための改変は、親配列に由来するプロセシング済みペプチドのＭＨＣタンパク質への結合性を低減する改変を含み得る。例えば、あらゆる一般的なＭＨＣ対立遺伝子に高いアフィニティーで結合すると予測される免疫エピトープが存在しないか、またはその数が最小限となるように、アミノ酸改変が組換えられるであろう。タンパク質配列中のＭＨＣ結合エピトープを同定するいくつかの方法が当該技術分野において公知であり、本明細書に開示の抗体中のエピトープをスコアリングするために用いられ得る。
共有結合性改変が本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の範囲内に含まれ、一般に翻訳後に行われるが、必ずしもそうとは限らない。例えば、いくつかの種類の共有結合性改変は、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と特定のアミノ酸残基を反応させることによって、分子中に導入することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の共有結合性改変は、１つ以上の標識の付加を含む。用語「標識基」は任意の検出可能な標識を意味する。いくつかの実施形態において、標識基は、立体障害の可能性を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して、本発明の目的の多重特異性抗体と結合させる。タンパク質を標識化するための様々な方法が当該技術分野において公知であり、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の生成に用いられ得る。
ある実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、本明細書において「結合体」とも呼ぶ「融合タンパク質」を含む。融合パートナーまたは結合パートナーはタンパク質または非タンパク質とすることができ、後者は一般に本発明の目的の多重特異性抗体及び結合パートナー上の官能基を用いて生成される。結合及び融合パートナーは、低分子化合物及びポリペプチドを含めた任意の分子であり得る。例えば、Ｔｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：５８４−５８８に様々な結合体及び方法が記載されている。可能な結合パートナーとしては、サイトカイン、細胞傷害剤、トキシン、放射性同位体、化学療法剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び他の治療活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、結合パートナーはむしろペイロードと考えられ得る、換言すれば、結合体の目的は、標的細胞、例えば癌細胞または免疫細胞への目的の多重特異性抗体による結合パートナーの標的送達である。したがって、例えば、目的の多重特異性抗体へのトキシンの結合は、標的抗原を発現する細胞に当該トキシンの送達を標的化する。当業者であれば理解するであろうが、実際には、融合及び結合の概念及び定義は重複している。融合体または結合体の指定は、本明細書に開示のいかなる実施形態にもそれを限定しようと意図するものではない。むしろ、本明細書に開示する任意の目的の多重特異性抗体が、何らかの望ましい特性をもたらすために、遺伝子的、化学的、または別様に１つ以上のポリペプチドまたは分子に連結され得るという広い概念を伝えるためにこれらの用語を用いる。
好適な結合体としては、下記のような標識、薬剤及び限定はしないが細胞傷害薬（例えば化学療法剤）またはトキシンもしくはそのようなトキシンの活性断片をはじめとする細胞傷害剤が挙げられるが、これらに限定されない。好適なトキシン及びその対応する断片としては、ジフテリアＡ鎖、エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが挙げられる。細胞傷害剤には、本発明の目的の多重特異性抗体への放射性同位体の結合、または本発明の目的の多重特異性抗体に共有結合しているキレート化剤への放射性核種の結合によって作製される放射性化学物質も含まれる。さらなる実施形態では、カリケアマイシン、オーリスタチン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、及びデュオカルマイシンならびにアナログを利用する。抗体−薬剤結合体については、Ａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １４［４］：５２９−３７に記載されている。
ある実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体はサイトカインと融合または結合している。「サイトカイン」は、本明細書で用いる場合、ある細胞集団によって放出され、細胞間媒介物として別の細胞に作用するタンパク質の総称を意味する。例えば、Ｐｅｎｉｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：９１−１０１に記載されているように、多数の望ましい特性をもたらすために、サイトカインが本発明の目的の多重特異性抗体に融合され得る。そのようなサイトカインの例はリンフォカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなど；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）など；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子α及びβ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−βなど；血小板成長因子；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなど；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、及びγなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５など；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなど；Ｃ５ａ；ならびにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）をはじめとする他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語サイトカインは、天然起源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物活性均等物を含む。
さらなる実施形態において、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、腫瘍前標的化に用いるための「受容体」（例えばストレプトアビジンなど）に結合させられ得るが、このアナログ−受容体結合体が患者に投与された後、除去剤を用いて血液循環から未結合の結合体を除去してから、細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド）に結合している「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。代替的実施形態において、抗体依存的酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を採用するために、本発明の目的の多重特異性抗体を酵素に結合させるか、または作用可能に連結させる。プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤）を変換するプロドラッグ活性化酵素に本発明の目的の多重特異性抗体を結合させるか、または作用可能に連結させることによって、ＡＤＥＰＴが用いられ得る。
本発明の目的の多重特異性抗体を産生し、実験的に試験する方法も本明細書で開示する。本開示の方法は、実施形態をいかなる特定の用途または作用理論にも限定することを意図していない。むしろ、提供する方法は、本発明の目的の多重特異性抗体を得るために、１つ以上の本発明の目的の多重特異性抗体が産生され、実験的に試験され得ると全般的に例示することを意図する。抗体分子生物学、発現、精製、及びスクリーニングの全般的な方法は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ２００１；及びＨａｙｈｕｒｓｔ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ， ２００１， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５：６８３−６８９；Ｍａｙｎａｒｄ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ， ２０００， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２：３３９−７６に記載されている。
本明細書に開示の一実施形態において、本発明の目的の多重特異性抗体をコードする核酸が作製され、その後、この核酸は宿主細胞、例えば酵母細胞または哺乳類細胞などにクローニングされ、発現され、所望であれば、アッセイされ得る。したがって、各タンパク質配列をコードする核酸、及び特にＤＮＡが作製され得る。これらは公知の手順を用いて実施される。例えば、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の生成に有用となり得る様々な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ―Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に記載されている。本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体をコードするＤＮＡを効率的に生成するために用いられ得る様々な技術が存在する。そのような方法としては、遺伝子アセンブリ法、ＰＣＲベースの方法及びＰＣＲの変形形態を用いる方法、リガーゼ連鎖反応ベースの方法、プール化オリゴ法、例えば合成シャッフリング、誤りがちな増幅法及びランダム変異でオリゴを用いる方法に用いられるものなど、古典的部位特異的変異誘発法、カセット変異誘発、ならびに他の増幅及び遺伝子合成法が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知のように、遺伝子アセンブリ、変異誘発、ベクターサブクローニングなどのための様々な市販のキット及び方法が存在し、そのような市販品は本発明の目的の多重特異性抗体をコードする核酸の生成に有用となる。
本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体は、核酸、例えば、本発明の目的の多重特異性抗体の第１及び第２ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を誘発または引き起こす適切な条件の下で培養することによって産生され得る。発現に適切な条件は発現ベクター及び宿主細胞の選択によって異なり、当業者であれば定型的な実験を通して容易に見極められるであろう。多様な適切な宿主細胞が用いられ得るが、これには哺乳類細胞、細菌、昆虫細胞、酵母細胞、及び植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の生成に有用となり得る様々な細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＡＴＣＣ（登録商標）細胞株カタログに記載されている。
ある実施形態において、本発明の目的の多重特異性抗体は、発現コンストラクトがウイルス、例えばレトロウイルスまたはアデノウイルスなどを用いて哺乳類細胞中に導入される系をはじめとする哺乳類発現系で発現される。任意の哺乳類細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、及び霊長類細胞が用いられ得る。好適な細胞には、公知の研究用細胞も含まれ、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ Ｃ．６、ＨｅＬａ、Ｓｐ２／０、ＮＳ０細胞及びこれらのバリアントが挙げられるがこれらに限定されない。代替的実施形態において、細菌細胞でライブラリータンパク質が発現される。細菌発現系は当該技術分野において公知であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。代替的実施形態において、本発明の目的の多重特異性抗体は、昆虫細胞（例えばＳｆ２１／Ｓｆ９、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ Ｂｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）または酵母細胞（例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａなど）で産生される。代替的実施形態において、本発明の目的の多重特異性抗体は無細胞翻訳系を用いてインビトロで発現される。原核（例えばＥ．ｃｏｌｉ）及び真核（例えば小麦胚、ウサギ網状赤血球）細胞の両方に由来するインビト翻訳系が利用可能であり、目的のタンパク質の発現レベル及び機能特性に応じて選択され得る。例えば、当業者に認識されているように、いくつかのディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイには、インビトロ翻訳が必要とされる。さらに、本発明の目的の多重特異性抗体は化学合成法によって生成され得る。動物（例えば、ウシ、ヒツジ、またはヤギ乳、孵化鶏卵、完全な昆虫幼虫など）及び植物（例えば、トウモロコシ、タバコ、ウキクサなど）の両方の形質転換発現系も同様。
本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体の第１及び第２ポリペプチドをコードする核酸は、コードされたポリペプチドを発現するために、１つ以上の発現ベクター中に適宜組み込まれ得る。様々な発現ベクターがタンパク質発現に用いられ得る。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノム中に組み込まれるベクターを含み得る。発現ベクターは宿主細胞型に適合するように構築される。したがって、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体を生成するのに有用となる発現ベクターとしては、哺乳類細胞、細菌、昆虫細胞、酵母細胞、及びインビトロ系でのタンパク質発現を可能とするものが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知のように、本明細書に開示する本発明の目的の多重特異性抗体を発現するのに有用となり得る様々な発現ベクターが、商業的にまたは別様に入手可能である。
発現ベクターは典型的に、発現させるタンパク質またはポリペプチドを含み、これは制御もしくは調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナー、及び／または追加の要素と作用可能に連結している。「作用可能に連結」とは、本明細書では、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれていることを意味する。一般に、これらの発現ベクターは、本発明の目的の多重特異性抗体をコードする核酸に作用可能に連結した転写及び翻訳調節核酸を含み、典型的にはタンパク質を発現するために用いられる宿主細胞に対して適切である。一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクティベーター配列を含み得る。当該技術分野においても公知のように、発現ベクターは典型的に、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選別を可能とする選択遺伝子またはマーカーを含有する。選択遺伝子は、当該技術分野において公知であり、用いられる宿主細胞によって異なる。
本発明の第１及び第２ポリペプチドは、それぞれ独立して、発現されるポリペプチド及び／または目的の多重特異性抗体の標的化、精製、スクリーニング、ディスプレイなどを可能にするための融合パートナーに作用可能に連結され得る。融合パートナーは、リンカー配列を介して本発明の目的の多重特異性抗体配列に連結され得る。リンカー配列は一般に少数の、典型的には１０未満のアミノ酸を含むことになるであろうが、より長いリンカーも用いられ得る。典型的には、リンカー配列は、柔軟であり、かつ、分解に耐性があるように選択される。当業者であれば理解するであろうが、多様な配列のいずれもリンカーとして用いられ得る。例えば、一般的なリンカー配列はアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３７）を含む。融合パートナーは、本発明の目的の多重特異性抗体及び付随する融合パートナーを所望の細胞部位または細胞外媒質に誘導する標的化またはシグナル配列であり得る。当該技術分野において公知のように、あるシグナル伝達配列は、タンパク質を成長培地中にまたは細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔中に分泌させるように標的化し得る。融合パートナーは、精製及び／またはスクリーニングを可能にするペプチドまたはタンパク質をコードする配列でもあり得る。そのような融合パートナーとしては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えばＨ６（配列番号３８）及びＨ１０（配列番号３９）または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システム（例えばＮｉ＋２アフィニティーカラム）で用いるための他のタグ）、ＧＳＴ融合体、ＭＢＰ融合体、Ｓｔｒｅｐタグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、ならびに抗体によって標的化されるエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグなど）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば理解するであろうが、そのようなタグは、精製、スクリーニング、またはこの両方に有用であり得る。例えば、本発明の目的の多重特異性抗体は、Ｈｉｓタグを用いてＮｉ＋２アフィニティーカラムに固定化することによって精製され、そして精製後に、同じＨｉｓタグを用いて抗体がＮｉ＋２コーティングプレートに固定化されて、ＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイ（下記のような）が実施され得る。融合パートナーは、本発明の目的の多重特異性抗体をスクリーニングする選別法の使用を可能にし得る（下記参照）。様々な選別法を可能にする融合パートナーが当該技術分野において公知である。
例えば、本発明の目的の多重特異性抗体ライブラリーを遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合させることによって、ファージディスプレイを採用することができる。融合パートナーは本発明の目的の多重特異性抗体の標識化を可能にし得る。あるいは、融合パートナーが発現ベクター上の特異的配列に結合し、融合パートナー及び付随する本発明の目的の多重特異性抗体がそれらをコードする核酸に共有結合または非共有結合されるのを可能にし得る。外来性核酸を宿主細胞内に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、用いられる宿主細胞によって異なる。技術としては、デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈降、塩化カルシウム処理、ポリブレン媒介形質移入、原形質融合、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム中へのカプセル化、及びＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが挙げられるがこれらに限定されない。哺乳類細胞の場合、形質移入は一過的または安定的のいずれかであり得る。
追加の非限定的な例示的実施形態を以下に示す。
実施形態１．目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、前記ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１重鎖ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２重鎖ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、前記第１及び前記第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、
ｉ）前記ＭＡＩ、前記第１重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのコピーまたは前記第１重鎖ポリペプチドの少なくとも２つのコピーのいずれかを含む第１親ホモ二量体抗体種、及び前記第２重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのコピーまたは前記第２重鎖ポリペプチドの少なくとも２つのコピーのいずれかを含む第２親ホモ二量体抗体種を含む組成物を入手すること；ならびに
ｉｉ）前記ＭＡＩを前記第１及び前記第２親ホモ二量体抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施すること；
を含み、
それによって前記ＭＡＩを精製する前記方法。
実施形態２．前記実施ステップｉｉ）が
前記組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびに
ｐＨ依存的に前記ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルと前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施すること；
を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．前記溶離液がそれぞれ異なる負対数酸解離定数（ｐＫａ）を有する少なくとも２種の緩衝剤を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態４．前記溶出ステップを実施する前に前記溶離液の第１サンプル中、望ましい開始ｐＨで
前記組成物；または
前記組成物−クロマトグラフィー材料複合物；
のいずれかを調製または平衡化することをさらに含む、実施形態２または実施形態３に記載の方法。
実施形態５．望ましい終了ｐＨに調製された大量の前記溶離液の第２サンプルを前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物に流すことをさらに含む、実施形態２〜４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６．前記溶離液が前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生する、実施形態２〜５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７．前記溶離液が前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生し、前記ｐＨ勾配が
（ｉ）リニアｐＨ勾配段階の前のステップｐＨ勾配段階；
（ｉｉ）リニア勾配段階の後のステップｐＨ勾配段階；
（ｉｉｉ）ステップｐＨ勾配段階を伴わないリニアｐＨ勾配段階、少なくとも１つのリニアｐＨ勾配段階；または
（ｉｖ）実質的にリニアなｐＨ勾配段階；
を含む、実施形態２〜６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８．前記ＭＡＩ、前記第１親ホモ二量体抗体種、及び前記第２親ホモ二量体抗体種が実質的に区別可能な溶出体積で前記クロマトグラフィー材料から溶出する、実施形態２〜７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態９．前記溶離液が
次の緩衝剤：Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、及びギ酸の
少なくとも２つ；
少なくとも３つ；
少なくとも４つ；
少なくとも５つ；
少なくとも６つ；
少なくとも７つ；もしくは
８つ；または
次の緩衝剤：メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンの
少なくとも２つ；
少なくとも３つ；
少なくとも４つ；
少なくとも５つ；もしくは
少なくとも６つ；
のいずれかを含む、実施形態２〜８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１０．前記溶離液が（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、及びギ酸；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンのいずれかを含む、実施形態２〜９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１１．前記溶離液が
次の緩衝剤：Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、及びギ酸の
少なくとも２つ；
少なくとも３つ；
少なくとも４つ；
少なくとも５つ；
少なくとも６つ；
少なくとも７つ；もしくは
８つ；
を含むが、
ただし、前記溶離液が次のイミダゾール；ピペラジン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）のいずれも含まない、実施形態２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１２．前記溶離液が（ｉ）ＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに任意により少なくとも１つの塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩から本質的になる、実施形態２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１３．前記溶離液が（ｉ）ＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに少なくとも１つの塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩ならびに任意により少なくとも１つの塩からなる、実施形態２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１４．前記溶離液がＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む、実施形態２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１５．前記溶離液の各サンプルが０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択される濃度範囲で少なくとも１つの塩を含む、実施形態２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１６．前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度で少なくとも１つの塩を含む、実施形態２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１７．前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、実施形態２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１８．ａ．前記第１重鎖ポリペプチドの実際の等電点及び前記第２重鎖ポリペプチドの実際の等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；
ｂ．前記第１親ホモ二量体種の実際の等電点及び前記第２親ホモ二量体種の実際の等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；
ｃ．前記第１重鎖ポリペプチドの計算等電点及び前記第２重鎖ポリペプチドの計算等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；または
ｄ．前記第１親ホモ二量体種の計算等電点及び前記第２親ホモ二量体種の計算等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；
のいずれかである、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１９．前記望ましい開始ｐＨが、９．０未満；８．５未満；８．０未満；７．５未満；７．０未満；６．５未満；６．０未満；５．５未満；５．０未満；４．５未満；４．０未満；３．５未満；もしくは３．０未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である、実施形態４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２０．前記望ましい終了ｐＨが、７．０超；７．５超；８．０超；８．５超；９．０超；９．５超；１０．０超；１０．５超；もしくは１１．０超；１１．５超；１２．０超；１２．５超；１３．０超；１３．５超；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である、実施形態５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２１．前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が約３〜１１である、実施形態２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２２．前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される範囲にある、実施形態２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２３．前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される異なる範囲にある、実施形態２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２４．前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が、約３．７５；約４．７６；約６．１０；約６．９０；約８．０４；約８．４４；約９．３９；及び約１０．５０からなる群から選択される、実施形態２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２５．前記ＭＡＩが第１軽鎖可変領域を含む第３ポリペプチドをさらに含む、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２６．前記ＭＡＩが第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドをさらに含み、前記第３ポリペプチド及び前記第４ポリペプチドのそれぞれが第２軽鎖可変領域を含む、実施形態１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２７．前記第１軽鎖可変領域及び前記第２軽鎖可変領域が同一である、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８．前記第３ポリペプチド及び前記第４ポリペプチドが同一である、実施形態２６または実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれがＦｃ領域をさらに含む、実施形態１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３０．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれが野生型Ｆｃ領域をさらに含む、実施形態１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３１．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれがＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域、ＩｇＧ３アイソタイプＦｃ領域、ＩｇＧ３アイソタイプＦｃ領域、またはＩｇＧ４アイソタイプＦｃ領域をさらに含む、実施形態１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３２．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれがＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域をさらに含む、実施形態１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３３．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれが、前記第１親ホモ二量体抗体種、前記第２親ホモ二量体種、または前記ＭＡＩのｐＩを変化させるために改変されてはいないＦｃ領域をさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３４．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれが、前記第１親ホモ二量体抗体種、前記第２親ホモ二量体種、または前記ＭＡＩのｐＩを変化させるために改変されてはいないＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域をさらに含む、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３５．ＭＡＩが天然抗体型であるか；少なくとも前記第１親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；少なくとも前記第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；前記第１親ホモ二量体抗体種が天然型であり、かつ、前記第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；または前記ＭＡＩが天然抗体型であり、前記第１親ホモ二量体抗体種が天然型であり、かつ、前記第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるかのいずれかである、実施形態１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３６．前記ＭＡＩ；前記第１親ホモ二量体抗体種；前記第２親ホモ二量体抗体種；前記第１親ホモ二量体抗体種及び前記第２親ホモ二量体抗体種；または前記ＭＡＩ、前記第１親ホモ二量体抗体種及び前記第２親ホモ二量体抗体種が、ＩｇＧ１型、及びＩｇＧ２型、及びＩｇＧ３型、もしくはＩｇＧ４型であるか；またはハイブリッド型であるかのいずれかである、実施形態１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３７．前記クロマトグラフィーが実質的に同じイオン強度で実施される、実施形態１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３８．前記溶離液のイオン強度が前記溶出ステップの間中実質的に同じままである、実施形態２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３９．前記溶離液の第１サンプル及び前記溶離液の前記第２サンプルがそれぞれ実質的に同じイオン強度を有する、実施形態４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４０．前記クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである、実施形態１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４１．前記クロマトグラフィーが、カチオン交換クロマトグラフィー；アニオン交換クロマトグラフィー；多モードクロマトグラフィー；及び混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４２．前記クロマトグラフィーがＭｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、Ｐｏｒｏｒｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＵＮＯｓｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択されるクロマトグラフィー材料を用いることをさらに含む、実施形態１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４３．前記クロマトグラフィーが、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬからなる群から選択されるクロマトグラフィー材料を用いることをさらに含む、実施形態１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４４．前記クロマトグラフィー材料がイオン交換クロマトグラフィー材料である、実施形態２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４５．前記クロマトグラフィー材料が、カチオン交換クロマトグラフィー材料；アニオン交換クロマトグラフィー材料；多モードクロマトグラフィー材料；及び混合モードクロマトグラフィー材料からなる群から選択される、実施形態２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４６．前記イオン交換クロマトグラフィー材料がＭｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、Ｐｏｒｏｒｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＵＮＯｓｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択されるか；または
Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬからなる群から選択される、実施形態２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４７．前記第１重鎖可変領域または前記第２重鎖可変領域のいずれかが、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる、実施形態１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４８．前記第１重鎖可変領域及び前記第２重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる、実施形態１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４９．前記第１重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、前記第２重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる、実施形態１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５０．前記第１重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、前記第２重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる、実施形態１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５１．前記ライブラリーの少なくとも１つが、少なくとも１つの軽鎖をさらに含む、実施形態１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５２．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって前記組成物が発現される、実施形態１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５３．前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって前記組成物が発現される、実施形態２５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５４．前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド、及び前記第４ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって前記組成物が発現される、実施形態２６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５５．各コードされたポリペプチドが前記宿主細胞によって発現される、実施形態５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５６．前記組成物が前記宿主細胞によって発現される、実施形態５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５７．実質的にすべての宿主細胞が、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド、及び第４ポリペプチドで形質転換または形質移入されている、実施形態５２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５８．実質的にすべての宿主細胞が、前記ＭＡＩ、前記第１親抗体種及び前記第２親抗体種を発現する、実施形態５２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５９．前記宿主細胞が、真核細胞；真菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳類細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞；哺乳類細胞；ＣＯＳ細胞；ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞；及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、実施形態５２〜５８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６０．（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
のいずれかを含むイオン交換溶離液。
実施形態６１．ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及びＮａＣｌを含むイオン交換溶離液。
実施形態６２．ＴＲＩＳ、ピペラジン、またはイミダゾールを含まないという条件の、実施形態６０または実施形態６１に記載のイオン交換溶離液。
実施形態６３．（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸；及び塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
のいずれかから本質的になるイオン交換溶離液。
実施形態６４．（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸；及び塩；または
（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
のいずれかからなるイオン交換溶離液。
実施形態６５．前記塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される、実施形態６１〜６４のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
実施形態６６．ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を含む組成物から前記ＭＡＩを精製するために用いられる、実施形態６０〜６５のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
実施形態６７．０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択される濃度範囲で少なくとも１つの塩を含む、実施形態６１〜６６のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
実施形態６８．前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度で少なくとも１つの塩を含む、実施形態６１〜６７のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
実施形態６９．前記塩がＮａＣｌである、実施形態６１〜６８のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
実施形態７０．前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、実施形態６１〜６９のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
材料及び方法
実施例で提供するすべてのクロマトグラフィー分離は、各クロマトグラフィー実験中のインラインｐＨモニタリングを可能とする一体型ｐＨ電極を備えたコンピュータ制御ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ １５０調製用クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムはそれぞれＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。すべての他のカラムは、図２６Ａ及び２６Ｂのそれぞれの「樹脂」という表題の列に記載の提供業者から購入した。酢酸及び塩化ナトリウムはＶＷＲから入手し、ＣＡＰＳ、ＭＯＰＳＯ、及びＴＡＰＳはＳｉｇｍａから入手し、ＣＨＥＳ及びギ酸はＥＭＤから入手し、ＨＥＰＰＳＯはＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから入手し、ＭＥＳはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。メチルアミン（Ｈ２Ｏ中４０％）、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、及びヒドロキシルアミン（Ｈ２Ｏ中５０％）はＳｉｇｍａから購入し、ビス−トリスはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入し、塩化ナトリウムはＶＷＲから購入した。ｐＨ勾配形成溶液は、緩衝剤を水に溶解させ、溶液を二等分することによって、各実験の前に新たに調製した。別途注記のない限り、溶離液組成物は図１に記載した通りとした。次に、水酸化ナトリウムを用いて半分をｐＨ４（バッファーＡ）に調整し、一方で、もう半分は同様に水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１（バッファーＢ）に調整した。
特に断らない限り、以下の手順を用いて実施例に記載のすべての精製を実施した。分離しようとするＭＡＩ−親ホモ二量体抗体種組成物の約０．２ｍｇ〜２ｍｇ（Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、及び下記の実施例で用いたすべての他の同様のサイズのカラムに対して）または約５ｍｇ〜１０ｍｇ（Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００カラム及び下記の実施例で用いたすべての他の同様のサイズのカラムに対して）を開始ｐＨバッファー中にバッファー交換し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。各分離の前に、カラムを１０カラム体積の開始バッファー（バッファーＡ、バッファーＢ、またはバッファーＡ及びバッファーＢの適切な混合物のいずれか）で平衡化した。その後、キャピラリーループを介してカラム上にタンパク質組成物を添加し、カラムを別の１０カラム体積の開始バッファーで洗浄して未結合物質を除去した。続いて、バッファーＡ及びバッファーＢの適切な混合物でできた２０カラム体積のリニアｐＨ勾配を、共通軽鎖二重特異性抗体混合物の分離に用いた。あるいは、１５カラム体積のステップ溶出を実施した後、バッファーＡ及びＢの浅めの勾配を用いて溶出した。
インビトロ酵母選別系及び関連する方法を用いて、共通軽鎖抗体（すなわち親ホモ二量体抗体種）を全長ヒトＩｇＧ１抗体ライブラリーから単離した（例えば、ＷＯ ２００９／０３６３７９；ＷＯ ２０１０／１０５２５６；及びＷＯ ２０１２／００９５６８を参照）。ビオチン標識化抗原を抗体発現酵母細胞とともに異なる濃度でインキュベートし、その後、複数回の連続する選別においてストレプトアビジン二次試薬を用いる磁気ビーズ選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， Ｂｉｏｔｅｃ）及びＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での蛍光活性化細胞ソーティングを行うことによって、標的結合ｍＡｂを富化した。富化の最終回の後、酵母細胞をソーティングして寒天プレート上に播種し、クローンをＤＮＡシーケンシングによって分析してＩｇＧ産生に用いた。選別回の連続サイクルにおいて、軽鎖シャッフリング、重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の標的変異誘発及び重鎖または軽鎖の可変領域のｅＰＣＲによって精製されたサブライブラリーに、より低濃度のおとり抗原を用いて、抗体のより高いアフィニティーへの最適化を実施した。ＩｇＧ１アイソタイプ型以外のＩｇＧアイソタイプ型を用いた実施例について、上記のようにライブラリーから単離した可変ドメインを、指定の他の選択可能なＩｇＧアイソタイプ型（例えばＩｇＧ４など）に再編成した。
各実施例で記載及び試験した各抗体（重鎖ヘテロ二量体ＭＡＩ及び２つの親重鎖ホモ二量体種）を含む組成物は、第１重鎖ポリペプチド、第２重鎖ポリペプチド、及び第３軽鎖ポリペプチドのそれぞれをコードする核酸配列を含有し、一過性発現する哺乳類宿主細胞（ＨＥＫ細胞）から得た。形質移入細胞を当該技術分野において公知の標準的な条件の下で培養し、抗体を含む上清を収集して、上清中に存在するすべての抗体種を含む組成物を得るためにプロテインＡベースのアフィニティー精製を施した。下記の各実施例の核酸によってコードされる抗体のアイソタイプ型に応じて、その抗体種（ＭＡＩ及び／または親ホモ二量体抗体）は、ＩｇＧ１型（例えば実施例１〜９ならびに実施例１４及び１５に記載）、ＩｇＧ４型（例えば実施例１０〜１３に記載）またはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４アイソタイプ型（例えば実施例１１に記載）のいずれかであった。
実施例で試験した組成物及び型
実施例１〜９及び実施例１４で試験した組成物は以下の抗体種を含んでいた。
スキームＡ：
ＩｇＧ１アイソタイプ型の第１重鎖ポリペプチド、ＩｇＧ１アイソタイプ型の第２重鎖ポリペプチド、及びアミノ酸配列が同一の２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、第１重鎖ポリペプチド及び第２重鎖ポリペプチドの可変領域が、異なるアミノ酸配列及び異なる抗原特異性を有していた（そのため、第１及び第２重鎖ポリペプチド可変領域のそれぞれと軽鎖ポリペプチド（すなわち「共通軽鎖」）の２つのコピーのうちの１つとの各対合によって形成された抗原結合領域が、２つの異なる抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ１アイソタイプ型のＭＡＩ；
２コピーの第１重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第１重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ１アイソタイプ型の第１親重鎖ホモ二量体抗体種；ならびに
２コピーの第２重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第２重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、第２重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ１アイソタイプ型の第２親重鎖ホモ二量体抗体種。
実施例１０で試験した組成物は以下の抗体種を含んでいた。
スキームＢ：
ＩｇＧ４アイソタイプ型の第１重鎖ポリペプチド、ＩｇＧ４アイソタイプ型の第２重鎖ポリペプチド、及びアミノ酸配列が同一の２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、第１重鎖ポリペプチド及び第２重鎖ポリペプチドの可変領域が、異なるアミノ酸配列及び異なる抗原特異性を有していた（そのため、第１及び第２重鎖ポリペプチド可変領域のそれぞれと軽鎖ポリペプチド（すなわち「共通軽鎖」）の２つのコピーのうちの１つとの各対合によって形成された抗原結合領域が、２つの異なる抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型のＭＡＩ；
２コピーの第１重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第１重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型の第１親重鎖ホモ二量体抗体種；ならびに
２コピーの第２重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第２重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、第２重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型の第２親重鎖ホモ二量体抗体種。
実施例１１で試験した組成物は以下の抗体種を含んでいた。
スキームＣ：
ＩｇＧ１アイソタイプ型の第１重鎖ポリペプチド、ＩｇＧ４アイソタイプ型の第２重鎖ポリペプチド、及びアミノ酸配列が同一の２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、第１重鎖ポリペプチド及び第２重鎖ポリペプチドの可変領域が、異なるアミノ酸配列及び異なる抗原特異性を有していた（そのため、第１及び第２重鎖ポリペプチド重鎖可変領域のそれぞれと軽鎖ポリペプチド（すなわち「共通軽鎖」）の２つのコピーのうちの１つとの各対合によって形成された抗原結合領域が、２つの異なる抗原特異性を有していた）ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４型のＭＡＩ（天然ヒトＩｇＧ１アイソタイプ型／ヒト天然ＩｇＧ４アイソタイプ型）；
２コピーの第１重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第１重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ１アイソタイプ型の第１親重鎖ホモ二量体抗体種；ならびに
２コピーの第２重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第２重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、第２重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型の第２親重鎖ホモ二量体抗体種。
実施例１２及び実施例１３で試験した組成物は以下の抗体種を含んでいた。
スキームＤ：
ＩｇＧ４アイソタイプ型の第１重鎖ポリペプチド、ＩｇＧ４アイソタイプ型の第２重鎖ポリペプチド、第２重鎖ポリペプチドとの二量体化と比較して第１重鎖ポリペプチドとの優先的な二量体化に有利となるように、第１組換えヘテロ二量体化モチーフが導入された１コピーの第１軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列、及び第１重鎖ポリペプチドとの二量体化と比較して第２重鎖ポリペプチドとの優先的な二量体化に有利となるように、第２組換えヘテロ二量体化モチーフが導入された１コピーの第２軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列を含み、第１重ポリペプチド及び第２重ポリペプチドの可変領域が異なるアミノ酸配列及び異なる抗原特異性を有していた（そのため、第１重鎖ポリペプチド重鎖可変領域と第１軽鎖ポリペプチドとの各対合によって形成された抗原結合領域が、第２重鎖ポリペプチド重鎖可変領域と第２軽鎖ポリペプチドとの対合によって形成された抗原結合領域とは異なる特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型のＭＡＩ；
２コピーの第１重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型の第１親重鎖ホモ二量体抗体種；ならびに
２コピーの第２重鎖ポリペプチド及び上記の１）と同様な２コピーの軽鎖ポリペプチドを含み、１コピーの第２重鎖ポリペプチド及び１コピーの軽鎖ポリペプチドの対合によって形成された抗原結合領域が単一抗原特異性を有する（そのため、第２重鎖ポリペプチドの各コピーと軽鎖ポリペプチドの各コピーとの対合によって形成された抗原結合領域がそれぞれ同じ単一抗原特異性を有していた）天然ヒトＩｇＧ４アイソタイプ型の第２親重鎖ホモ二量体抗体種。
実施例１
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムでリニアｐＨ勾配を用いた、重鎖ｐＩ計算値の差が０．６８ｐＨ単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．７３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．０５；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）、共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離。開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファーＢ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、０％Ｂ〜１００％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。
図２に示した結果は、比較的急なｐＨ勾配及び小スケールカラムにもかかわらず、２つの重鎖のｐＩの差（及びＭＡＩの２つの異なる重鎖が由来する２つの対応する親ホモ二量体種のｐＩの差）が、２つのホモ二量体種と所望のヘテロ二量体との間のベースライン分離、ひいてはヘテロ二量体（ＭＡＩ）の精製をもたらすのに十分であることを実証している（図２）。
実施例２
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムまたは強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムで様々なリニアｐＨ勾配を用いた、重鎖ｐＩ計算値の差が０．２５ｐＨ単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４６；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．２１；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．５９ｐＨ単位異なっていた）、共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離。図４Ａ：Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（カラム体積：１ｍＬ）での０．２２８ｍｇの全材料の分離：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、０％Ｂ〜１００％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。図４Ｂ：Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（カラムサイズ：１ｍＬ）での１．５７ｍｇの全材料の分離：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、３２．５％Ｂ〜５５％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。図４Ｃ：Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム（カラムサイズ：８ｍｌ）での８．８８ｍｇの全材料の分離：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、３２．５％Ｂ〜５５％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。
図４Ａ〜４Ｃの溶出ダイアグラムは、図４Ａに示すように生成したものに対してリニア勾配をより浅くすること（すなわち図４Ｂ及び４Ｃに示すようにより狭いｐＨ範囲を含むｐＨ勾配範囲を生成すること）、及びサンプル材料の量（質量）を増加させ、それによりカラム上でのサンプルの滞留時間を増加させることの両方が分離度の増加につながることを実証している。さらに、１ｍｌ Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムで２０カラム体積の間に０％Ｂ〜１００％Ｂとする完全勾配では部分的な分離しか示さなかったサンプルは、カラム体積をＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムの８ｍｌに増加させること及び勾配をより浅くすること（２０カラム体積の間に３２．５％Ｂ〜５５％Ｂ）によって分離された。したがって、これらの結果は、ｐＩ計算値の差が約０．５９ｐＨ単位であった２つの異なる親ホモ二量体抗体種からＭＡＩが精製されたことを示す。加えて、これらの結果は、親ホモ二量体種の重鎖のｐＩ計算値の差が約０．２５ｐＨ単位であった２つの異なる親ホモ二量体抗体種からＭＡＩが精製されたことを示す。
実施例３
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０での、重鎖ｐＩ計算値の差が様々な共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、３２．５％Ｂ〜５５％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。図５Ａ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．６８単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．７３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．０５；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図５Ｂ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．００；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図５Ｃ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．２５単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４６；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．２１；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．５９ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図５Ｄ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．２４である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算理論値＝９．１８；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．２６ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図５Ｅ：重鎖ｐＩ計算理論値の差が０．２１である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．５４；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３３；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．３８ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）が０．２６ｐＨ単位異なる共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体の混合物に対して、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムでのベースライン分離及び比較的浅いリニアｐＨ勾配が達成される。したがって、これらの結果は、ｐＩ計算値の差が約１．３３〜わずか約０．２６ｐＨ単位であった２つの異なる親ホモ二量体抗体種からＭＡＩが精製されたことを示す。加えて、これらの結果は、親ホモ二量体種の重鎖のｐＩ計算値の差が約０．７ｐＨ単位〜わずか約０．２６ｐＨ単位であった２つの異なる親ホモ二量体抗体種からＭＡＩが精製されたことを示す。
実施例４
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムまたは強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムで様々なリニアｐＨ勾配を用いた、重鎖ｐＩ計算値の差が０．０９である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３３；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１０ｐＨ単位異なっていた）、共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離。図８Ａ：Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムでの０．４２１ｍｇの全材料の分離：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、０％Ｂ〜１００％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。図８Ｂ：Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムでの７．５７ｍｇの全材料の分離：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、３５％Ｂ〜５３％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。図８Ｃ：Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラムでの６．６９ｍｇの全材料の分離：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、３７％Ｂ〜４３％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。図８Ｃに示す実験で観察されたＭＡＩ回収率は図８Ｂで観察された回収率と比較して６４％増加した。
これらの結果は、ｐＩ計算値の差がわずか約０．１０ｐＨ単位であった２つの異なる親ホモ二量体抗体種から許容可能な程度でＭＡＩが精製されたことを示す（すなわち、このため、収率の減少がわずかであるにもかかわらず実質的に均質にＭＡＩが精製されるように画分体積を選択することができる）。加えて、これらの結果は、親ホモ二量体種の重鎖のｐＩ計算値の差が約０．９ｐＨ単位であった２つの異なる親ホモ二量体抗体種からＭＡＩが精製されたことを示す。さらに、これらの結果は、より浅いｐＨ勾配を用いること（すなわち、ｐＨ勾配のｐＨ範囲を狭くすること）、及びカラム体積（ひいては、カラムに添加されるタンパク質組成物の滞留時間）を増加させることにより、親ホモ二量体種からのＭＡＩの分離度及びＭＡＩの回収率の両方を増加させることができることを示している。
実施例５
Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ強カチオン交換樹脂及び図３の上部の表に概要を示したバッファー組成物を用いて、共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離を、リニア塩勾配を用いた同じ組成物の分離と比較した。簡潔に述べると、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。最終バッファーＢ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、０％Ｂ〜１００％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。
ｐＨ勾配実験及び塩勾配実験の両方について、以下の計算値の差を有する共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体を比較した：重鎖ｐＩ計算値の差が０．６８単位（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．７３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．０５；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）；重鎖ｐＩ計算値の差が０．２４単位（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．１８；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．２６ｐＨ単位異なっていた）；重鎖ｐＩ計算値の差が０．１１単位（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３２；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１１ｐＨ単位異なっていた）；及び重鎖ｐＩ計算値の差が０．０９単位（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３４；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１ｐＨ単位異なっていた）。
結果は、塩勾配溶出と比較してｐＨ勾配溶出を行った場合に、対応する親ホモ二量体抗体種試験組成物からＭＡＩがより良好に分離されたことを実証している。
実施例６
ＭＡＩ及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種を含む組成物からＭＡＩを分離する能力に、異なる親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差が影響を及ぼした程度をさらに調査することが望まれた。
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０での、重鎖ｐＩ計算値の差が様々な共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離。流量１ｍｌ／ｍｉｎ、０％Ｂ〜１００％Ｂのリニア勾配形成の長さ２０カラム体積。
図６Ａ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．６８単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．７３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．０５；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図６Ｂ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．４３ｐＨ単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．００；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．４８ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図６Ｃ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．２５単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４６；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．２１；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．５９ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図６Ｄ：重鎖ｐＩ計算値の差が０．２１である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．５４；ＨＣ２のｐＩ計算理論値＝９．３３；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．３８ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図６Ｅ：重鎖ｐＩ計算理論値の差が０．２４である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．１８；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．２６ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図６Ｆ：重鎖ｐＩ計算理論値の差が０．１１である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３２；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１１ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図６Ｇ：重鎖ｐＩ計算理論値の差が０．０９である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３３；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１０ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。
結果は、ＭＡＩ及びその親ホモ二量体抗体種を含む組成物中に含まれるＭＡＩのそれぞれの分離の成功は、そのような親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差とよく相関し、ＭＡＩの重鎖ポリペプチドが由来する親ホモ二量体抗体種に含まれる重鎖ポリペプチドのｐＩ計算値の差とまずまずの相関があることを示す。
結果はまた、図７に示すように、異なる親ホモ二量体種の重鎖配列が互いにわずか１アミノ酸だけ異なる場合にも、対応する親ホモ二量体抗体種からＭＡＩを許容可能な程度で分離するのに、本発明で実施した方法が好適であることも実証している。
実施例７
ＭＡＩ及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種を含む組成物からＭＡＩを分離するアニオン交換樹脂の能力を調査することが望まれた。したがって、以下に記載するように分離を実施して、例示的なカチオン交換樹脂の性能を例示的なアニオン交換樹脂の性能と比較した。
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０での、または強アニオン交換体Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＢ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０での、重鎖ｐＩ計算値の差が様々な共通軽鎖ＩｇＧ１二重特異性ヘテロ二量体（「ＭＡＩ」）及び２つの異なる親ホモ二量体抗体種のそれぞれ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載の型）を含む組成物のリニアｐＨ勾配分離。図９Ａ：ＭＯＮＯ Ｓ ５／５０ ＧＬで分離した、重鎖ｐＩ計算値の差が０．６８単位である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．７３；ＨＣ２のｐＩ計算理論値＝９．０５；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図９Ｂ：ＭＯＮＯ Ｓ ５／５０ ＧＬで分離した、重鎖ｐＩ計算理論値の差が０．２４である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．１８；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．２６ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図９Ｃ：ＭＯＮＯ Ｓ ５／５０ ＧＬで分離した、重鎖ｐＩ計算理論値の差が０．１１である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３２；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１１ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図９Ｄ：ＭＯＮＯ Ｑ ５／５０ ＧＬで分離した、重鎖ｐＩ計算値の差が０．６８である（ＨＣ１のｐＩ計算理論値＝９．７３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．０５；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は１．３３ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図９Ｅ：ＭＯＮＯ Ｑ ５／５０ ＧＬで分離した、重鎖ｐＩ計算値の差が０．２４である（ＨＣ１のｐＩ計算理論値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．１８；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．２６ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。図９Ｆ：ＭＯＮＯ Ｑ ５／５０ ＧＬで分離した、重鎖ｐＩ計算値の差が０．１１である（ＨＣ１のｐＩ計算値＝９．４３；ＨＣ２のｐＩ計算値＝９．３２；２つの対応する親ホモ二量体抗体種の計算等電点（ｐＩ）は０．１１ｐＨ単位異なっていた）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体。
これらの結果は、同様のサイズの強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラムでは分離されなかった場合に、強アニオン交換体Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬカラムが、親ホモ二量体抗体種からＭＡＩを許容可能なレベルで精製することができた（すなわち、このため、収率の減少がわずかであるにもかかわらず実質的に均質にＭＡＩが精製されるように画分体積を選択することができる）ことを実証している。
実施例８
親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差がより大きいサンプルで、所与のＭＡＩ及びその親ホモ二量体抗体種を含む組成物からＭＡＩを分離する能力についてカチオン交換樹脂の性能をアニオン交換樹脂とさらに比較することが望まれた。しかし、この場合、ｐＨ勾配は上記の実施例に記載のように調製したが、図１０Ａ及び図１０Ｂに示すようにより浅くなる（より狭いｐＨ範囲に及ぶ）ように生成した。したがって、図１０Ａでは８ｍＬ Ｍｏｎｏ Ｓカラムを用い、図１０Ｂでは８ｍＬ Ｍｏｎｏ Ｑカラムを用い、実施例６に記載のように調製され、特徴づけられる、親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差がそれぞれ１．３３、０．２６、０．１１、及び０．１であったＭＡＩ−親ホモ二量体抗体種組成物を、それぞれ２つの樹脂を用いて試験した。
図１０Ａ及び１０Ｂに示す結果は、試験したすべての組成物で、ＭｏｎｏＱアニオン交換樹脂がカチオンＭｏｎｏ Ｓ交換樹脂よりも高い程度で各ＭＡＩをその対応する親ホモ二量体抗体種から分離したことを実証している。
実施例９
本開示の方法がプロセススケールの樹脂で適用可能かどうかを判定することが望まれた。したがって、第１段階実験において、親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差が１．３３及び０．２６である組成物を分離する能力について、実施例６に記載のように調製され、特徴づけられる完全ｐＨ勾配（すなわちｐＨ４〜ｐＨ１１）をそれぞれで用いて、一連のカチオン及びアニオン交換樹脂を試験する一連の小スケール（１ｍＬカラム）スカウティング実験を行った。実験の第２段階において、次に第１段階からの３つの最も性能が優れたアニオン交換樹脂及びカチオン交換樹脂を採用し、より大きなカラム（８ｍＬ）及びより浅い勾配を用いて、親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差がわずか約０．１ｐＨ単位であった組成物を分離する３つの最も性能が優れた樹脂の能力を評価した。
図１１Ａ及び１１Ｂに示した、親ホモ二量体抗体種間に１．３３ｐＨ単位のｐＩ差を有する組成物に対する第１段階カチオン交換実験の結果は、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、及びＳＰ ＨＰカチオン交換樹脂が試験した組成物（すなわち「１．３３」組成物）を最も良好に分離したことを示していた。図１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、及び１３Ｂに示した、親ホモ二量体抗体種間にそれぞれ１．３３ｐＨ単位のｐＩ差及び０．２６ｐＨ単位の差を有する組成物に対する第１段階アニオン交換実験の結果は、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＱ ＨＰアニオン交換樹脂が試験した組成物（すなわち「１．３３」組成物及び「０．２６」組成物）を最も良好に分離したことを示していた。しかし、最も性能が優れたカチオン樹脂及びアニオン樹脂のそれぞれを用いてより良好な分離を達成するために、より浅いｐＨ勾配（すなわち、より狭いｐＨ範囲）を用いて、一連のさらなるスカウティング実験を実施した。図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、親ホモ二量体抗体種間に１．３３ｐＨ単位のｐＩ差を有する組成物からＭＡＩを分離する能力について、それぞれカチオン樹脂及びアニオン樹脂を小さいカラム（１ｍＬ）で図示したより浅い勾配によって試験した。
したがって、実験の第２段階では、大きなカラム（８ｍＬ）でより浅い勾配を用いて、親ホモ二量体抗体種のｐＩ計算値の差がそれぞれ０．２６、０．１１、及び０．１０ｐＨ単位であった組成物からＭＡＩを分離する能力について試験した。図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、親ホモ二量体抗体種間に０．２６ｐＨ単位のｐＩ差を有する組成物からＭＡＩを分離する能力について、それぞれカチオン樹脂及びアニオン樹脂を大きなカラム（８ｍＬ）で図示したより浅い勾配によって試験した。図１６Ａ及び１６Ｂに示すように、親ホモ二量体抗体種間に０．１１ｐＨ単位のｐＩ差を有する組成物からＭＡＩを分離する能力について、それぞれカチオン樹脂及びアニオン樹脂を大きなカラム（８ｍＬ）で図示したより浅い勾配によって試験した。図１７Ａ及び１７Ｂに示すように、親ホモ二量体抗体種間に０．１ｐＨ単位のｐＩ差を有する組成物からＭＡＩを分離する能力について、それぞれカチオン樹脂及びアニオン樹脂を大きなカラム（８ｍＬ）で図示したより浅い勾配によって試験した。
これらの結果は、最も性能が優れたカチオン及びアニオン樹脂の両セットとも、ほとんどの組成物を十分な程度〜並外れた程度で分離し、親ホモ二量体抗体種ｐＩ差が大きいほど良好な分離が生じることを実証している。一般に、アニオン交換樹脂はカチオン樹脂によって達成されるものよりも優れたＭＡＩ分離を達成した。
実施例１０
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０での、理論上の重鎖ｐＩの差が様々な共通軽鎖ＩｇＧ４二重特異性ヘテロ二量体及び親ホモ二量体抗体種（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＢに記載の型）の混合物のリニアｐＨ勾配分離。流量４ｍｌ／ｍｉｎ。図１８Ａ：３２％Ｂの１５カラム体積ステップ勾配、続いて３２％Ｂ〜７１％Ｂの２０カラム体積リニア勾配、続いて７１％Ｂの１５カラム体積ホールドを用いて、重鎖ｐＩ計算理論値の差が１．６８である（ｐＩ ＨＣ１計算理論値＝７．０５；ｐＩ ＨＣ２計算理論値＝８．７３）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体を精製した。図１８Ｂ：２２％Ｂの１５カラム体積ステップ勾配、続いて２２％Ｂ〜７５％Ｂの２０カラム体積リニア勾配、続いて７５％Ｂの１５カラム体積ホールドを用いて、重鎖ｐＩ計算理論値の差が１．９９である（ｐＩ ＨＣ１計算理論値＝６．７４；ｐＩ ＨＣ２計算理論値＝８．７３）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体を精製した。図１８Ｃ：２５％Ｂの１５カラム体積ステップ勾配、続いて２５％Ｂ〜８３％Ｂの２０カラム体積リニア勾配、続いて８３％Ｂの１５カラム体積ホールドを用いて、重鎖ｐＩ計算理論値の差が１．７７である（ｐＩ ＨＣ１計算理論値＝７．２７；ｐＩ ＨＣ２計算理論値＝９．０４）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体を精製した。図１８Ｄ：２１％Ｂの１５カラム体積ステップ勾配、続いて２１％Ｂ〜７５％Ｂの２０カラム体積リニア勾配、続いて７５％Ｂの１５カラム体積ホールドを用いて、重鎖ｐＩ計算理論値の差が１．９４である（ｐＩ ＨＣ１計算理論値＝６．７４；ｐＩ ＨＣ２計算理論値＝８．６８）共通軽鎖二重特異性ホモ二量体及びヘテロ二量体を精製した。
これらの結果は、ＩｇＧ４アイソタイプ型のＭＡＩが、試験したすべてのｐＩ差で親ホモ二量体ＩｇＧ４アイソタイプ種から容易に精製されたことを実証している。
実施例１１
強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０での、理論上の重鎖ｐＩの差が様々な共通軽鎖二重特異性ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ハイブリッドヘテロ二量体、ならびにＩｇＧ１及びＩｇＧ４ホモ二量体抗体種（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＣに記載の型）の混合物のリニアｐＨ勾配分離。流量４ｍｌ／ｍｉｎ。図１９Ａ：２４．５％Ｂの１５カラム体積ステップ勾配、続いて２４．５％Ｂ〜５１％Ｂの２０カラム体積リニア勾配、続いて５１％Ｂの１５カラム体積ホールドを用いて、重鎖ｐＩ計算理論値の差が２．２である（ｐＩ ＨＣ１（ＩｇＧ４）計算理論値＝７．０５；ｐＩ ＨＣ２（ＩｇＧ１）計算理論値＝９．２２）共通軽鎖二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ４ホモ二量体ならびにＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヘテロ二量体を精製した。図１９Ｂ：２４．５％Ｂの１５カラム体積ステップ勾配、続いて２４．５％Ｂ〜５８％Ｂの２０カラム体積リニア勾配、続いて５８％Ｂの１５カラム体積ホールドを用いて、重鎖ｐＩ計算理論値の差が２．４である（ｐＩ ＨＣ１（ＩｇＧ４）計算理論値＝７．０５；ｐＩ ＨＣ２（ＩｇＧ１）計算理論値＝９．４６）共通軽鎖二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ４ホモ二量体ならびにＩｇＧ１／ＩｇＧ４ヘテロ二量体を精製した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４主鎖間のｐＩの大きな差はヘテロ二量体からのＩｇＧ１及びＩｇＧ４ホモ二量体の優れた分離につながる。
これらの結果は、ハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４アイソタイプ型のＭＡＩが、試験したすべてのｐＩ差で親ホモ二量体ＩｇＧ４アイソタイプ種から容易に精製されたことを実証している。
実施例１２
ある場合において、親ホモ二量体種及び対応するＭＡＩ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＤに記載の型）の２つの異なる混合物のそれぞれの溶出プロファイルを図示する図２０Ａ及び２０Ｂに示すように、非常に広い溶出プロファイルが観察された。勾配及び溶離液組成物は実施例１〜９に記載の通りであった。図２０Ａに示す実験において、完全ＩｇＧのｐＩ計算理論値の差が１．８１である（ＩｇＧ４ホモ二量体親種ＡのｐＩ計算理論値＝７．４１；ＩｇＧ４ホモ二量体親種ＢのｐＩ計算理論値＝９．２２）２つの異なるＩｇＧ４ホモ二量体（ホモ二量体親種）及び完全ＩｇＧ４のｐＩ計算値が８．８７である対応するＭＡＩに、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０でのカチオン交換クロマトグラフィーを行った。図２０Ａにあるように第１混合物中の様々な種それぞれの溶出が観察されたｐＨは、７．３０（ホモ二量体親種Ａ）、９．７３（ホモ二量体親種Ｂ）、及び９．１４（ＭＡＩ（ヘテロ二量体親種））であった。図２０Ｂは、異なるＩｇＧ４ホモ二量体親種Ａ及びＢ（しかし、偶然にも、図２０Ａに示した親種について計算されたものと同じｐＩ計算理論値を有していた）を用いた同様の実験の結果を示す。図２０Ｂに示したＭＡＩはｐＩ計算値＝８．７６を有していた。図２０Ｂにあるように第１混合物中の様々な種それぞれの溶出が観察されたｐＨは、７．４３（ホモ二量体親種Ａ）、９．７７（ホモ二量体親種Ｂ）、及び９．１８（ＭＡＩ（ヘテロ二量体親種））であった。
前述の実施例と同様に、図２０Ａ及び２０Ｂに示した研究に用いたすべてのサンプル及びカラムはｐＨ４に調製及び平衡化した。そのため、特定の変更した溶出条件及び成分が、そのような広い溶出プロファイルが観察されるか、または所与の混合物中の種の性質に基づいて広い溶出プロファイルが予測される混合物中の種をより良好に分割または分離し得るかどうかを判定することが望まれた。
したがって、図２０Ａ及び２０Ｂに示したデータを作成するのに用いた同じホモ二量体親種及びＭＡＩを用いて実験を行ったが、ただしこの場合、ステップｐＨ勾配段階を溶出部分に含め、溶離液のｐＨを非常に小さい溶離液体積のうちに（すなわち、非常に少ない溶出画分のうちに）約ｐＨ４から約ｐＨ６．５に増加させた。加えて、ホモ二量体親種及びヘテロ二量体ＭＡＩ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＤに記載の型）の両方を含有するサンプル混合物を調製し、カラム上でｐＨ６に平衡化した後、ステップ勾配を生成したところ、最も低いｐＩのホモ二量体種が溶出された。これにより、次に、浅いリニア勾配段階（図２１ＡにおけるｐＨ７．８〜ｐＨ９．６５、及び図２１ＢにおけるｐＨ７．９４〜ｐＨ９．６８）を用いることによって、第２ホモ二量体種からの残りのＭＡＩの分割及び分離が可能となった。
図２２Ａ及び２２Ｂに示すように、図２１Ａ及び図２１Ｂのデータを作成するのに用いた同じ２つのサンプル混合物を、２つの同様の二段階（すなわち、ステップｐＨ勾配の後にリニアｐＨ勾配とするスキーム）溶出実験に用い、一方はｐＨ４で開始し、他方はｐＨ６で開始した。図２２Ａ及び２２Ｂに示す結果は、より穏やかなｐＨ（例えばｐＨ４に対してｐＨ６）で開始する溶出では、ＭＡＩのそれぞれ対応するホモ二量体親種からの分割、分離、及び溶出が、より極端なｐＨで開始する（すなわちｐＨ６に対してｐＨ４で開始する）溶出と比較して向上することを実証している。
実施例１３
次に、サンプル混合物のより穏やかな開始ｐＨ（例えばより低いｐＨに対してｐＨ６）及び浅いリニアｐＨ勾配（すなわち、比較的大きな溶離液体積（多数の画分／画分体積）にわたって加えられる勾配）を用いることで、互いに値が非常に近いｐＩ計算値及び／またはｐＩ実験値を有する対応するホモ二量体親種からのＭＡＩの分割及び分離が得られるかどうかを判定することが望まれた。
したがって、各ホモ二量体親種の完全ＩｇＧ４のｐＩ計算理論値がそれぞれ８．９７及び８．９９であり、ＭＡＩの完全ＩｇＧ４のｐＩ計算理論値が８．９８であった、ホモ二量体親種及びヘテロ二量体ＭＡＩ（上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＤに記載の型）の両方を含有するサンプル混合物を調製し、カラムをｐＨ６．０に平衡化してから、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３４及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．８６でのカチオン交換クロマトグラフィーを行った。図２０Ａにあるように第１混合物中の様々な種それぞれの溶出が観察されたｐＨは、７．３０（ホモ二量体親種Ａ）、９．７３（ホモ二量体親種Ｂ）、及び９．１４（ＭＡＩ（ヘテロ二量体親種は図２３に示した溶出条件を施した））であった。
結果は、本開示の方法を用いて、ｐＩが対応する親ホモ二量体種それぞれからわずか０．０１ｐＨ単位だけ異なるＭＡＩを、そのようなホモ二量体親種の両方から分割及び分離することができることを示していた。
実施例１４
あるサンプル混合物では、カチオン交換またはアニオン交換いずれも単独ではＭＡＩをホモ二量体親種から満足のいく純度に分離するのに十分でないことが観察された。そうすると、カチオン交換法のＭＡＩ溶出ピークに対応する画分をプールしたもの一式に、続けてアニオン交換法を行うことによって、そのようなＭＡＩの分割及び精製が満足いくほどに改善され得るかどうかを評価することが望まれた。各手法は実施例１〜９に記載し、図２４に示した通りである。
より具体的には、上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載した型のＭＡＩ／ホモ二量体親種混合物の２つの異なる１０ｍｇのサンプルアリコートを、その後のアニオン交換法に十分な溶出液を生成するためにカチオン交換カラムに注入した。各ホモ二量体親種の完全ＩｇＧのｐＩ計算理論値はそれぞれ９．１９及び９．０９であり、ＭＡＩの完全ＩｇＧ１のｐＩ計算理論値は９．０９であった。ｐＨ６．０にサンプル混合物を調製し、カラムを平衡化してから、強カチオン交換体Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬカラム及びリニアｐＨ勾配を用いた、開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８７及び最終バッファー：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２７でのカチオン交換クロマトグラフィーを行った。図２４の左部に示したヘテロ二量体（ＭＡＩ）を含有すると推定される中央ピークを含有するプールを収集し、プールしてから、アニオン交換カラムに注入し、開始バッファーＡ：９．８ｍＭメチルアミン、９．１ｍＭ １，２−エタンジアミン、６．４ｍＭ １−メチルピペラジン、１３．７ｍＭ １，４−ジメチルピペラジン、５．８ｍＭビス−トリス、７．７ｍＭヒドロキシルアミン、及び１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝９．５７；ならびに最終バッファーＢ：９．８ｍＭメチルアミン、９．１ｍＭ １，２−エタンジアミン、６．４ｍＭ １−メチルピペラジン、１３．７ｍＭ １，４−ジメチルピペラジン、５．８ｍＭビス−トリス、７．７ｍＭヒドロキシルアミン、及び１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝８．０７でのリニアｐＨ勾配を用いて溶出した。最初のカチオン交換法からのＭＡＩを含有すると推定されるプールの試料の質量分析により、ピークはホモ二量体親種の一方を相当な量含んでいたことが明らかとなった。その後のアニオン交換カラムから溶出したＭＡＩを含有すると推定されるピークの質量分析により、このピークに対応する画分のプールはＭＡＩを含有しており、ホモ二量体親種をいずれも実質的に含んでいないことが明らかとなった。
これらの結果は、ある混合物では、カチオン交換及びアニオン交換の両方を続けて用いることで、対応するホモ二量体親種からのＭＡＩの分割及び分離を向上させることができることを実証している。
実施例１５
次に、特定のＭＡＩ及び対応するホモ二量体親種の混合物では、異なるバッファー系または溶離液、とりわけ、アニオン交換樹脂での使用のために設計されたものを用いることが有利であり得るかどうか判定することが望まれた。
したがって、上記の実施例で試験した組成物及び型のスキームＡに記載した型のＭＡＩ／ホモ二量体親種混合物に、以下のカチオン交換バッファー系を用いて、図２５Ａに示した条件の下でアニオン交換クロマトグラフィーを行う実験を設計した：開始バッファーＡ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．２０及び最終バッファーＢ：１５．６ｍＭ ＣＡＰＳ、９．４ｍＭ ＣＨＥＳ、４．６ｍＭ ＴＡＰＳ、９．９ｍＭ ＨＥＰＰＳＯ、８．７ｍＭ ＭＯＰＳＯ、１１ｍＭ ＭＥＳ、１３ｍＭ酢酸、９．９ｍＭギ酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２０。図２５Ａに示す３つのピークすべてを質量分析によって分析し、ピーク組成を確認したところ、図２５Ａに示した通りに観察された。次に、同じＭＡＩ／ホモ二量体親種混合物の別個のアリコートに、以下のアニオン交換バッファー系を用いて、図２５Ｂに示した条件の下でアニオン交換クロマトグラフィーを行った：開始バッファーＡ：９．８ｍＭメチルアミン、９．１ｍＭ １，２−エタンジアミン、６．４ｍＭ １−メチルピペラジン、１３．７ｍＭ １，４−ジメチルピペラジン、５．８ｍＭビス−トリス、７．７ｍＭヒドロキシルアミン、及び１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝９．３４；及び最終バッファーＢ：９．８ｍＭメチルアミン、９．１ｍＭ １，２−エタンジアミン、６．４ｍＭ １−メチルピペラジン、１３．７ｍＭ １，４−ジメチルピペラジン、５．８ｍＭビス−トリス、７．７ｍＭヒドロキシルアミン、及び１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．５３。図２５Ｂに示す３つのピークすべてを質量分析によって分析し、ピーク組成を確認したところ、図２５Ｂに示した通りに観察された。
これらの結果は、あるＭＡＩ／ホモ二量体親種の混合物では、アニオン交換クロマトグラフィー法を用いる際にアニオン交換バッファー系または溶離液を用いると、アニオン交換クロマトグラフィー法を用いる際にカチオン交換バッファー系または溶離液を用いる場合に観察されるものと比較して、著しく改善された純度でホモ二量体親種からＭＡＩが分割及び分離され得ることを示す。
上記の実施例で示したものと同様の結果で用いられ得る他のクロマトグラフィー材料を図２６Ａ及び図２６Ｂに提供する。
本発明の特定の実施形態を例示の目的で上記したが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、詳細に対する多数の変形形態が可能であることが当業者によって理解されよう。

Claims (70)

  1. 目的の多重特異性抗体（ＭＡＩ）の精製方法であって、前記ＭＡＩが第１重鎖（ＨＣ）可変領域を含む第１重鎖ポリペプチド及び第２ＨＣ可変領域を含む第２重鎖ポリペプチドを含むヘテロ二量体を含み、前記第１及び前記第２可変領域が異なる抗原特異性及び異なる等電点を有し、
    ｉ）前記ＭＡＩ、前記第１重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのコピーまたは前記第１重鎖ポリペプチドの少なくとも２つのコピーのいずれかを含む第１親ホモ二量体抗体種、及び前記第２重鎖ポリペプチドの少なくとも１つのコピーまたは前記第２重鎖ポリペプチドの少なくとも２つのコピーのいずれかを含む第２親ホモ二量体抗体種を含む組成物を入手すること；ならびに
    ｉｉ）前記ＭＡＩを前記第１及び前記第２親ホモ二量体抗体種から分離するクロマトグラフィーを実施すること；
    を含み、
    それによって前記ＭＡＩを精製する前記方法。
  2. 前記実施ステップｉｉ）が
    ａ．前記組成物をクロマトグラフィー材料と接触させて組成物−クロマトグラフィー材料複合物を形成すること；ならびに
    ｂ．ｐＨ依存的に前記ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を溶出可能な溶離液のサンプルと前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物を接触させる溶出ステップを実施すること；
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記溶離液がそれぞれ異なる負対数酸解離定数（ｐＫａ）を有する少なくとも２種の緩衝剤を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記溶出ステップを実施する前に前記溶離液の第１サンプル中、望ましい開始ｐＨで
    ｉ）前記組成物；または
    ｉｉ）前記組成物−クロマトグラフィー材料複合物；
    のいずれかを調製または平衡化することをさらに含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
  5. 望ましい終了ｐＨに調製された大量の前記溶離液の第２サンプルを前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物に流すことをさらに含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記溶離液が前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記溶離液が前記クロマトグラフィー材料−組成物複合物を流れるにつれてｐＨ勾配が発生し、前記ｐＨ勾配が
    （ｉ）リニアｐＨ勾配段階の前のステップｐＨ勾配段階；
    （ｉｉ）リニア勾配段階の後のステップｐＨ勾配段階；
    （ｉｉｉ）ステップｐＨ勾配段階を伴わないリニアｐＨ勾配段階、少なくとも１つのリニアｐＨ勾配段階；または
    （ｉｖ）実質的にリニアなｐＨ勾配段階；
    を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＭＡＩ、前記第１親ホモ二量体抗体種、及び前記第２親ホモ二量体抗体種が実質的に区別可能な溶出体積で前記クロマトグラフィー材料から溶出する、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記溶離液が
    次の緩衝剤：Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、及びギ酸の
    少なくとも２つ；
    少なくとも３つ；
    少なくとも４つ；
    少なくとも５つ；
    少なくとも６つ；
    少なくとも７つ；もしくは
    ８つ；または
    次の緩衝剤：メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンの
    少なくとも２つ；
    少なくとも３つ；
    少なくとも４つ；
    少なくとも５つ；もしくは
    少なくとも６つ；
    のいずれかを含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記溶離液が（ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、及びギ酸；または
    （ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンのいずれかを含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記溶離液が
    次の緩衝剤：Ｎシクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、及びギ酸の
    少なくとも２つ；
    少なくとも３つ；
    少なくとも４つ；
    少なくとも５つ；
    少なくとも６つ；
    少なくとも７つ；または
    ８つ；
    を含むが、
    ただし、前記溶離液が次のイミダゾール；ピペラジン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）のいずれも含まない、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記溶離液が（ｉ）ＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに任意により少なくとも１つの塩；または
    （ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩から本質的になる、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記溶離液が（ｉ）ＣＡＰＳ；ＣＨＥＳ；ＴＡＰＳ；ＨＥＰＰＳＯ；ＭＯＰＳＯ；ＭＥＳ；酢酸；及びギ酸；ならびに少なくとも１つの塩；または
    （ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩ならびに任意により少なくとも１つの塩からなる、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記溶離液がＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される少なくとも１つの塩を含む、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記溶離液の各サンプルが０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択される濃度範囲で少なくとも１つの塩を含む、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度で少なくとも１つの塩を含む、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. ａ．前記第１重鎖ポリペプチドの実際の等電点及び前記第２重鎖ポリペプチドの実際の等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；
    ｂ．前記第１親ホモ二量体種の実際の等電点及び前記第２親ホモ二量体種の実際の等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；
    ｃ．前記第１重鎖ポリペプチドの計算等電点及び前記第２重鎖ポリペプチドの計算等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；または
    ｄ．前記第１親ホモ二量体種の計算等電点及び前記第２親ホモ二量体種の計算等電点の差が、７．０ｐＨ単位未満；６．５ｐＨ単位未満；６．０ｐＨ単位未満；５．５ｐＨ単位未満；５．０ｐＨ単位未満；４．５ｐＨ単位未満；４．０単位未満；３．５ｐＨ単位未満；２．５ｐＨ単位未満；２．４ｐＨ単位未満；２．３ｐＨ単位未満；２．２ｐＨ単位未満；２．１ｐＨ単位未満；２．０ｐＨ単位未満；１．９ｐＨ単位未満；１．８ｐＨ単位未満；１．７ｐＨ単位未満；１．６ｐＨ単位未満；１．５ｐＨ単位未満；１．４ｐＨ単位未満；１．３ｐＨ単位未満、１．２ｐＨ単位未満；１．１ｐＨ単位未満；１．０ｐＨ単位未満；０．９５ｐＨ単位未満；０．９０ｐＨ単位未満；０．８５ｐＨ単位未満；０．８０ｐＨ単位未満；０．７５ｐＨ単位未満；０．７０ｐＨ単位未満；０．６５ｐＨ単位未満；０．６０ｐＨ単位未満；０．５５ｐＨ単位未満；０．５０ｐＨ単位未満；０．４５ｐＨ単位未満；０．４０ｐＨ単位未満；０．３５ｐＨ単位未満；０．３０ｐＨ単位未満；０．２５ｐＨ単位未満；０．２０ｐＨ単位未満；０．１５ｐＨ単位未満；０．１４ｐＨ単位未満；０．１３ｐＨ単位未満；０．１２ｐＨ単位未満；０．１１ｐＨ単位未満；０．１０ｐＨ単位未満；０．０９ｐＨ単位未満；０．０８ｐＨ単位未満；０．０７ｐＨ単位未満；０．０６ｐＨ単位未満；０．０４ｐＨ単位未満；０．０３ｐＨ単位未満；０．０２５ｐＨ単位未満；０．０２ｐＨ単位未満；もしくは前述の値のいずれかの間のｐＨ値であるか；
    のいずれかである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記望ましい開始ｐＨが、９．０未満；８．５未満；８．０未満；７．５未満；７．０未満；６．５未満；６．０未満；５．５未満；５．０未満；４．５未満；４．０未満；３．５未満；もしくは３．０未満；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である、請求項４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記望ましい終了ｐＨが、７．０超；７．５超；８．０超；８．５超；９．０超；９．５超；１０．０超；１０．５超；もしくは１１．０超；１１．５超；１２．０超；１２．５超；１３．０超；１３．５超；または前述の値のいずれかの間のｐＨ値である、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が約３〜１１である、請求項２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される範囲にある、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が、約３．２５〜約３．８５；約４．５〜約４．８５；約６．０〜約６．４５；約６．６０〜約７．０；約７．５〜約８．１５；約８．３５〜約８．５５；約９．２５〜約９．６５；及び約１０．００〜約１１．５からなる群から選択される異なる範囲にある、請求項２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記溶離液が少なくとも２種の緩衝剤を含み、各緩衝剤の酸解離定数（ｐＫａ）が、約３．７５；約４．７６；約６．１０；約６．９０；約８．０４；約８．４４；約９．３９；及び約１０．５０からなる群から選択される、請求項２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記ＭＡＩが第１軽鎖可変領域を含む第３ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ＭＡＩが第３ポリペプチド及び第４ポリペプチドをさらに含み、前記第３ポリペプチド及び前記第４ポリペプチドのそれぞれが第２軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第１軽鎖可変領域及び前記第２軽鎖可変領域が同一である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第３ポリペプチド及び前記第４ポリペプチドが同一である、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれがＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれが野生型Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれがＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域、ＩｇＧ３アイソタイプＦｃ領域、ＩｇＧ３アイソタイプＦｃ領域、またはＩｇＧ４アイソタイプＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれがＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれが、前記第１親ホモ二量体抗体種、前記第２親ホモ二量体種、または前記ＭＡＩのｐＩを変化させるために改変されてはいないＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドそれぞれが、前記第１親ホモ二量体抗体種、前記第２親ホモ二量体種、または前記ＭＡＩのｐＩを変化させるために改変されてはいないＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記ＭＡＩが天然抗体型であるか；少なくとも前記第１親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；少なくとも前記第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；前記第１親ホモ二量体抗体種が天然型であり、かつ、前記第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるか；または前記ＭＡＩが天然抗体型であり、前記第１親ホモ二量体抗体種が天然型であり、かつ、前記第２親ホモ二量体抗体種が天然型であるかのいずれかである、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記ＭＡＩ；前記第１親ホモ二量体抗体種；前記第２親ホモ二量体抗体種；前記第１親ホモ二量体抗体種及び前記第２親ホモ二量体抗体種；または前記ＭＡＩ、前記第１親ホモ二量体抗体種及び前記第２親ホモ二量体抗体種が、ＩｇＧ１型、及びＩｇＧ２型、及びＩｇＧ３型、もしくはＩｇＧ４型であるか；またはハイブリッド型であるかのいずれかである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記クロマトグラフィーが実質的に同じイオン強度で実施される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記溶離液のイオン強度が前記溶出ステップの間中実質的に同じままである、請求項２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記溶離液の前記第１サンプル及び前記溶離液の前記第２サンプルがそれぞれ実質的に同じイオン強度を有する、請求項４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記クロマトグラフィーが、カチオン交換クロマトグラフィー；アニオン交換クロマトグラフィー；多モードクロマトグラフィー；及び混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記クロマトグラフィーが請求項２〜４１からなる群から選択されるクロマトグラフィー材料を用いることをさらに含み、前記クロマトグラフィー材料が、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、Ｐｏｒｏｒｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＵＮＯｓｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記クロマトグラフィーが、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬからなる群から選択されるクロマトグラフィー材料を用いることをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記クロマトグラフィー材料がイオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記クロマトグラフィー材料が、カチオン交換クロマトグラフィー材料；アニオン交換クロマトグラフィー材料；多モードクロマトグラフィー材料；及び混合モードクロマトグラフィー材料からなる群から選択される、請求項２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記イオン交換クロマトグラフィー材料が
    Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ、Ｓ０３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ２０、ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、Ｐｏｒｏｒｓ ＧｏＰｕｒｅ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＧｏＰｕｒｅ ＸＳ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ （ＳＰＸＬ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓｅ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ０３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＵＮＯｓｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑからなる群から選択されるか；または
    Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｑ ＨＰ、及びＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、及びＭｏｎｏ Ｓ １０／１００ ＧＬからなる群から選択される、請求項２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記第１重鎖可変領域または前記第２重鎖可変領域のいずれかが、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記第１重鎖可変領域及び前記第２重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記第１重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、前記第２重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記第１重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第１ライブラリーから第１抗原に対して第１選別を実施することによって得られ、前記第２重鎖可変領域が、固有の重鎖可変領域を含む第２ライブラリーから第２抗原に対して第２選別を実施することによって得られる、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ライブラリーの少なくとも１つが、少なくとも１つの軽鎖をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって前記組成物が発現される、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって前記組成物が発現される、請求項２５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチド、及び前記第４ポリペプチドをコードする核酸配列それぞれが導入された原核宿主細胞または真核宿主細胞によって前記組成物が発現される、請求項２６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 各コードされたポリペプチドが前記宿主細胞によって発現される、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記組成物が前記宿主細胞によって発現される、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 実質的にすべての宿主細胞が、第１ポリペプチド、第２ポリペプチド、第３ポリペプチド、及び第４ポリペプチドで形質転換または形質移入されている、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 実質的にすべての宿主細胞が、前記ＭＡＩ、前記第１親抗体種及び前記第２親抗体種を発現する、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記宿主細胞が、真核細胞；真菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳類細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞；哺乳類細胞；ＣＯＳ細胞；ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞；及びＣＨＯ細胞からなる群から選択される、請求項５２〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. （ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩；または
    （ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
    のいずれかを含むイオン交換溶離液。
  61. ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及びＮａＣｌを含むイオン交換溶離液。
  62. ＴＲＩＳ、ピペラジン、またはイミダゾールを含まないという条件の、請求項６０または請求項６１に記載のイオン交換溶離液。
  63. （ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩；または
    （ｉｉ）（ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
    のいずれかから本質的になるイオン交換溶離液。
  64. （ｉ）ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、酢酸、ギ酸、及び塩；または
    （ｉｉ）メチルアミン、１，２−エタンジアミン、１−メチルピペラジン、１，４−ジメチルピペラジン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（ビス−トリス）、及びヒドロキシルアミンならびに任意により少なくとも１つの塩；
    のいずれかからなるイオン交換溶離液。
  65. 前記塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＮａ２ＳＯ４からなる群から選択される、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
  66. ＭＡＩ及び親ホモ二量体抗体種を含む組成物から前記ＭＡＩを精製するために用いられる、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
  67. ０ｍＭ〜約１００ｍＭ；０ｍＭ〜約６０ｍＭ；０ｍＭ〜約５０ｍＭ；０ｍＭ〜約４０ｍＭ；０ｍＭ〜約３０ｍＭ；０ｍＭ〜約２０ｍＭ；０ｍＭ〜約１０ｍＭ；０ｍＭ〜約５ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ；約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ；約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ；約３０ｍＭ〜約２００ｍＭ；約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ；及び約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ；ならびに約５ｍＭ〜約１５ｍＭからなる群から選択される濃度範囲で少なくとも１つの塩を含む、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
  68. 前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度で少なくとも１つの塩を含む、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
  69. 前記塩がＮａＣｌである、請求項６１〜６８のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
  70. 前記溶離液の各サンプルが約１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載のイオン交換溶離液。
JP2017553132A 2015-04-10 2016-04-08 親ホモ二量体抗体種からのヘテロ二量体多重特異性抗体の精製方法 Active JP6962819B2 (ja)

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