JP5121725B2 - トロンビン含有溶液中のα−トロンビンの安定化方法 - Google Patents
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Description
しかし、これらは、液状のフィブリノゲン測定用試薬中のトロンビンの安定化方法としては効果が不十分であった。
しかし、この方法は、トロンビンの活性を阻害することを機序とするものである。そのため、この方法を用いた場合、フィブリノゲン測定検査において重要な測定意義を持つフィブリノゲン低濃度検体では、凝固時間が極端に遅延し、場合によっては測定不能となる。このことは時間当たりの検体処理数の低下だけでなく、フィブリノゲン低濃度検体の測定不能による再検の増加につながるため、この方法は緊急検査には不向きなものであった。
また、デンシトメトリーを用いた場合、公知のタンパク質分析用の電気泳動にてα−、β−及びγ−トロンビン画分に分け、デンシトメトリーによりそれぞれのタンパク質含量を求めた後、全トロンビンのタンパク質含量に対するα−トロンビンのタンパク質含量の比率(%)として求めることができる。
そして、これらを適宜組み合わせて全トロンビンに対するα−トロンビン含量が高まるよう調整する。
また、当該pHを5.5〜7に調整する場合や、6〜6.5に調整する場合には、例えばクエン酸、リン酸、イミダゾール、BIS−TRIS、MOPSO、ADA、MES等から1種類もしくは2種類以上を適宜組み合わせることができる。
これらの緩衝剤の添加量は、緩衝能を有する量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の緩衝剤の濃度が5〜1000mM、特に20〜300mMであるのが好ましい。
当該有機酸の添加量はα−トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の当該有機酸の濃度は、好ましくは10mM〜500mMであり、より好ましくは50mM〜200mMである。
陰イオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−N−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
陽イオン性界面活性剤としては、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド等が挙げられる。
両イオン性界面活性剤としては、例えば3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸(CHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸(CHAPSO)、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−N−ベタイン、ドデシル−β−アラニン等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えばオクチルグルコシド、ペプチルチオグルコシド、デカノイル−N−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンへプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル(Triton(登録商標)Xシリーズ)、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル(Tween(登録商標)シリーズ)等が挙げられる。
これらの界面活性剤のうち、非イオン性界面活性剤が特に好ましく用いられる。また、これらの界面活性剤は1種類もしくは2種類以上を組み合わせて用いることもできる。
当該界面活性剤の添加量は、α−トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばα−トロンビン含有溶液中の当該界面活性剤の濃度は、好ましくは0.001〜1w/v%であり、より好ましくは0.005〜0.1w/v%である。
当該タンパク質の添加量は、α−トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばα−トロンビン含有溶液中の当該タンパク質の濃度は、好ましくは0.05〜10w/v%であり、より好ましくは0.1〜5w/v%である。
当該高分子多糖類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の高分子多糖類の濃度は、好ましくは0.1〜10w/v%であり、より好ましくは0.3〜3w/v%である。
当該合成高分子類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の合成高分子類の濃度は0.1〜10w/v%であり、好ましくは0.3〜3w/v%である。
当該防腐剤の添加量は、所定の範囲内であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中のプロクリン(登録商標)300の濃度は0.001〜1w/v%であり、好ましくは0.01〜0.1w/v%である。尚、上記に記載の濃度は、市販のプロクリン(登録商標)300を100w/v%とした場合の濃度を記載している。
また、本発明のトロンビン含有溶液を含む液状フィブリノゲン測定用試薬は、トロンビン活性阻害物質の活性、例えば、アンチトロンビン活性、ヒルジン活性、化学合成阻害剤の活性を測定することができる。
検体希釈用緩衝液としては、MES、Bis−Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPSなどのグッド緩衝液、バルビタール緩衝液を挙げることができる。当該検体希釈用緩衝液は、上記トロンビン含有溶液に加えた際に、上記トロンビン含有溶液のpHや濃度の範囲と成るように使用すればよい。
50mM リン酸緩衝液pH 7.0で溶解した5万単位のトロンビン溶液をS−Sepharose(2.5x11cm、ファルマシア)に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、0.4M NaClを含む同緩衝液を用いた0〜0.4M NaCl(各300mL)のリニアグラジエントにて溶出した。トロンビン活性を合成基質法で測定し、低いイオン強度で溶出されるβ−及びγ−トロンビン混合物(以下、β・γ−トロンビンとする。)画分と高いイオン強度で溶出されるα−トロンビン画分を回収した。
さらに、各画分のトロンビン溶液をBenzamidine−Sepharose(2.1x6cm、ファルマシア)に吸着させ、0.5M NaClを含む同緩衝液で洗浄後、0.1M Benzamidine、0.5M NaClを含む同緩衝液を用いた0−0.1M Benzamidine(各100mL)のリニアグラジエントにて溶出し、精製α−トロンビン(約3万単位)と精製β・γ−トロンビン(約1万単位)を得た。なお、回収した各精製トロンビン溶液は、0.1M NaCl、20mM Tris−HCl pH7.4で透析した後、後記する検討に使用した。また、合成基質法によるトロンビン活性測定は、試薬1(100mM Tris、50mM クエン酸3Na、0.05%BSA,pH7.4)で500倍希釈した各トロンビン含有溶液200μLと試薬2(S−2283:1mg/mL)200μLを加え、37℃で10分間反応させた後、1mLの2%クエン酸を添加し、405nmの波長で測定した。さらに、合成基質法測定値からトロンビン活性への換算は、トロンビン標準品(日本薬局方)を基に行ない、精製α−トロンビンは1238単位/mL、精製β・γ−トロンビンは677単位/mLであった。
精製α−トロンビン、並びに精製β・γ−トロンビンをLaemmli法に従い非還元下の10−20%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にて分離した。CBBによる蛋白染色後、充分に脱色した後、デンシトメーター(コダックIS440CF)にて各バンドの染色度合い(Intensity)を測定した。
その結果、表1、図1に示すように精製α−トロンビンの純度は約95%であり(約5%はβ−及びγ−トロンビンを含む)、精製β・γ−トロンビンの純度は約80%であった(約20%はα−トロンビンを含む)。尚、Aはα−トロンビンに相当するもの、Bはβ−及びγ−トロンビンに相当するものである。
条件1〜5のトロンビン含有溶液は、100単位/mL α−トロンビン、150mM 塩化ナトリウム、0.05% プロクリン(登録商標)300、β・γ−トロンビンを下記に記載の活性比率で含有する50mM MES緩衝液からなるpH6.3の溶液であり、精製α−トロンビン及び精製β・γ−トロンビンを用いて調製した。
条件2:全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率:10%
条件3:全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率:15%
条件4:全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率:20%
条件5:全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率:50%
条件1〜5のトロンビン含有溶液を37℃で0,1,2週間保存したときのα−トロンビン含量の残存率を測定した。なお、α−トロンビンの含量の測定は製造例2の純度検定にて行った。
実施例1と同様に条件1〜5の各トロンビン含有溶液を調製し、37℃で0,1,2週間保存したときの合成基質法での測定値よりトロンビン活性の残存率を求めた。
合成基質法による活性測定は、前記の製造例1に記載の方法を用いた。
実施例2で調製した条件1〜5のα−トロンビン含有溶液について、37℃で0,1,2週間保存したトロンビン含有溶液を用い、ヒト血漿(試料1及び試料2)について凝固時間の測定を行った。本実験は、検体希釈液(TC緩衝液、シスメックス)で10倍に希釈した血漿100μLに各トロンビン含有溶液を50μL添加し、コアグレックス800(シスメックス)にて凝固時間を測定した。
試料1に関する結果を表4及び図4に示し、試料2に関する結果を表5及び図5に示し、図4及び5については0週目の凝固時間を100%とした場合の相対%で示した。
Claims (3)
- トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα−トロンビン含量を少なくとも70%以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のα−トロンビンの安定化方法。
- トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するβ−及び/又はγ−トロンビン含量が30%未満である請求項1記載の安定化方法。
- トロンビン含有溶液のpHが4〜9である請求項1又は2記載の安定化方法。
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