CN107942063A - 一种血浆纤维蛋白原的检测试剂、其检测方法及应用 - Google Patents

一种血浆纤维蛋白原的检测试剂、其检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于临床医学检测技术，具体涉及一种血浆纤维蛋白原的检测试剂、其检测方法及应用，所述检测试剂包括血浆稀释液R1和凝血酶缓冲体系R2组成；其中，所述血浆稀释液R1包括咪唑、NaCl和聚乙二醇；所述凝血酶缓冲体系R2包括咪唑、Triton‑X 100、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、牛血清蛋白、Proclin‑300和凝血酶。本发明方法检测精准，操作简单，为临床医学上对血浆纤维蛋白原的检测提供了安全、可靠、重复性好的体外诊断试剂。

Description

一种血浆纤维蛋白原的检测试剂、其检测方法及应用
技术领域
本发明属于临床医学检测技术，具体涉及一种血浆纤维蛋白原的检测试剂、其检测方法及应用。
背景技术
凝血实验对临床各科的疾病诊断具有重要的意义，除了对出血疾病的筛选与诊断外，还用于血栓前状态的检查；弥漫性血管内凝血出血疾病(DIC)的实验诊断以及对各种抗凝治疗者的用药指导和预后估计等。目前临床上常用的检测出凝血机制的试验有凝血四项(含凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间APTT、凝血酶时间TT、纤维蛋白原FIB含量)测定。
血栓与止血不仅涉及基础医学，且与多个临床学科(包括血液科呼吸消化科心血管科神经科妇产科普通外科)的疾病密切相关：1)所有手术前检查：外科手术(普外、骨外、妇产、五官、心脏等手术)检查病人的出凝血机能，以免术中发生危险；2)监测抗凝及溶栓治疗：如换瓣手术后、肝素治疗、口服抗凝剂(华发令、香豆素等)减少临床治疗出血发生率；3)血栓前状态监测：心肌梗塞、静脉血栓；4)弥漫性血管内凝血；5)先天及后天性凝血因子缺乏；6)各类肝脏疾病及纤维蛋白原缺乏所致的出血倾向；7)凝血酶原及纤维蛋白原缺乏所致的出血倾向；8)动脉粥样硬化；9)中医活血化淤的诊疗研究。
临床上，1)纤维蛋白原含量增高：纤维蛋白原属急性时相反应物，是心脑血管疾病的重要危险因子，与纤维蛋白原含量呈正向增长关系，无性别差异，有年龄差异，常见于急性炎症、手术后、尿毒症、动脉硬化、放疗后、糖尿病等症状；2)纤维蛋白原含量减低：常见于先天性低(无)FIB血症、肝硬化、原/继发性纤溶、异常FIB血症、重度贫血等。
人体内存在着正常的止血、凝血和抗凝系统，此系统一直保持着动态的生理平衡。若止凝血活性增强或抗凝血活性减弱，便会导致血栓前状态或血栓形成；相反，会引起低凝状态或出血倾向。纤维蛋白即凝血因子I主要由肝脏合成，其参与凝血过程。当纤维蛋白原超过正常范围，即表示凝血功能异常，严重时有出血倾向。
目前，纤维蛋白原的常见检测方法有：1)Class法(凝血酶法)：在被检血浆中加入凝血酶，血浆即凝固，其所需的时间长短与FIB含量的多少呈负相关。被检血浆的FIB实际含量可以从国际标准品FIB参比血浆测定的标准曲线中获得；2)免疫法：免疫火箭电泳法(Laurell法)和酶联免疫法；3)比浊法：血浆被KH2PO3-NaOH缓冲液稀释后，加热至56℃，使FIB凝集，比浊测定其含量；4)化学法(双缩脲法)：用Na2SO3将血浆中的FIB沉淀分离，然后以双缩脲试剂显色测定；其中以Clauss法最为通用，该法为功能检测，操作简单、结果可靠，故被WHO推荐为测定FIB的参考方法，当凝血仪通过检测PT方法来换算FIB浓度时，如结果可疑，则应用Clauss法复核确定。
CN 101221184A公开了一种用Clauss法检验血浆纤维蛋白原含量的体外诊断试剂盒，该试剂盒包括FIB凝血酶、FIB缓冲液、FIB定值血浆，但所述试剂盒的重复性和稳定性还有待提高。
发明内容
本发明提供一种血浆纤维蛋白原的检测试剂及其检测方法，所述检测方法试剂简单，检测试剂稳定，而且反应体系稳定，影响因素少，且检测精准，操作简单，为临床医学提供了安全、可靠、重复性好的体外诊断试剂。
第一方面，本发明提供了一种血浆纤维蛋白原的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括血浆稀释液R1和凝血酶缓冲体系R2组成；
其中，所述血浆稀释液R1包括咪唑、NaCl和聚乙二醇；
所述凝血酶缓冲体系R2包括咪唑、Triton-X 100、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、牛血清蛋白、Proclin-300(硫柳汞)和凝血酶。
本发明中，配制凝血酶缓冲体系R2时，所述Proclin-300最后添加，且逐滴加入并进行搅拌，Proclin-300作为一种粘稠状液体，遇水会结团聚集而沉淀，不容易溶解，所以需边添加边搅拌。
本发明中，ProClin300防腐剂的活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)，这两种成分抑制细胞的生长以及促使细胞凋亡的原理相同，活性成分在与细胞膜接触几分钟后，立即可以渗透到膜内并抑制细胞内酶的活性，目标酶处于细胞代谢KREBS循环的中心位置，Proclin 300防腐剂作用KREBS循环的四个不同位置：丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)，α-酮戊二酸脱氢酶(ketoglutarate dehydrogenase)，琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)和NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)，从而抑制细胞生长代谢，大分子的合成，引起细胞内能量水平迅速下降，由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物，所有的细菌及真菌至少拥有部分KREBS循环，所以Proclin 300防腐剂的适用的范围非常广泛；其次，Proclin300防腐剂具有多标靶作用位点，因此大大降低了因变异产生的微生物的耐药性。所以，Proclin 300是通过抑制酶代谢和抑菌作用来增加凝血酶稳定性的。
不仅如此，所述Proclin-300和海藻糖两者协同作用，互相配合，提高了检测试剂的稳定性。
优选地，所述血浆稀释液R1按质量体积百分含量包括咪唑1-15％、NaCl0.1-5％和聚乙二醇0.01-1％。
所述质量体积百分含量指的是1体积(L)的液体中含有固体的质量(g)。
所述咪唑例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％；
所述NaCl例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.45％、0.48％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％；
所述聚乙二醇例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.18％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。
优选地，所述咪唑的质量体积百分含量为4-8％，优选为3.8％。
优选地，所述NaCl的质量体积百分含量为0.4-0.8％，优选为0.48％。
优选地，所述聚乙二醇的质量体积百分含量为0.05-0.2％，优选为0.12％。
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为5000-15000，例如可以是5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000，优选为6000-10000，进一步优选为8000。
本发明中，不同聚乙二醇的分子量其性质是不同的，聚乙二醇8000在医药、试剂、农药中广泛用作基质，起到分散剂、乳化剂等作用，保证试剂各做份的均一性。
优选地，所述凝血酶缓冲体系R2按质量体积百分含量包括咪唑1-15％、Triton-X100 0.01-1％、甘露醇1-15％、甘氨酸1-15％、海藻糖1-10％、牛血清蛋白0.1-10％、Proclin-300 0.01-1％和凝血酶50-400IU/mL。
所述咪唑例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％；
所述Triton-X 100例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％；
所述甘露醇例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％；
所述甘氨酸例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％；
所述海藻糖例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；
所述牛血清蛋白例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；
所述Proclin-300例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％；
所述凝血酶例如可以是50IU/mL、51IU/mL、52IU/mL、53IU/mL、54IU/mL、55IU/mL、56IU/mL、58IU/mL、60IU/mL、62IU/mL、65IU/mL、68IU/mL、70IU/mL、75IU/mL、80IU/mL、85IU/mL、90IU/mL、95IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、150IU/mL、180IU/mL、200IU/mL、210IU/mL、230IU/mL、250IU/mL、280IU/mL、300IU/mL、320IU/mL、380IU/mL、390IU/mL或400IU/mL。
优选地，所述咪唑的质量体积百分含量为4-8％，优选为3.8％。
优选地，所述Triton-X 100的质量体积百分含量为0.05-0.1％，优选为0.08％。
优选地，所述甘露醇的质量体积百分含量为3-6％，优选为4％。
优选地，所述甘氨酸的质量体积百分含量为3-6％，优选为4％。
优选地，所述海藻糖的质量体积百分含量为1-2％，优选为1.5％。
优选地，所述牛血清蛋白的质量体积百分含量为0.5-2％，优选为0.4％。
优选地，所述Proclin-300的质量体积百分含量为0.02-0.06％，优选为0.05％。
优选地，所述凝血酶的质量体积百分含量为80-200IU/mL，优选为200IU/mL。
优选地，所述血浆稀释液R1的pH为6.8-8.5，例如可以是6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，优选为7-7.8。
优选地，所述凝血酶缓冲体系R2的pH为6.8-8.5，例如可以是6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，优选为7-7.8。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的检测试剂在非诊断和治疗的检测血浆纤维蛋白原的使用方法，包括如下步骤：向待检测样品中加入R1孵育后再加入R2反应，即可得到所要检测的血浆纤维蛋白原的含量。
优选地，所述待测样品：R1：R2的体积比为1:9:5。
优选地，所述待检测样品与R1孵育的温度为35-40℃，优选为37℃。
优选地，所述待检测样品与R1孵育的时间为40-100s，优选为60s。
第三方面，本发明提供一种血浆纤维蛋白原的检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的检测试剂。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明检测试剂相比于现有的检测试剂重复性和稳定性都更好，Proclin-300和海藻糖的提高了试剂的稳定性，多次检测后的变异系数仅为1.01，且放置于37℃下，10天后试剂才开始发生变化；
(2)本发明试剂简单，影响因素少，在确保检验结果准确的前提下，减少浪费，降低成本；
(3)本发明方法检测精准，操作简单，为临床医学上对血浆纤维蛋白原的检测提供了安全、可靠、重复性好的体外诊断试剂。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所
采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
仪器：全自动血凝仪：众驰伟业XL3200.
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：制备血浆纤维蛋白原的检测试剂
所述血浆纤维蛋白原的检测试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)配制血浆稀释液R1：将质量浓度为3.8％的咪唑、0.48％的NaCl和平均分子量为8000的聚乙二醇0.12％混合后调节pH7.2，余量用水补齐得到血浆稀释液R1；
(2)配制凝血酶缓冲体系R2：将质量浓度为3.8％的咪唑、0.4％的BSA、0.08％的Triton-X-100、4％的甘露醇、4％的甘氨酸、1.5％的海藻糖和200IU/mL的凝血酶混合后调节pH7.2，最后添加0.05％的proclin-300，余量用水补齐得到凝血酶缓冲体系R2；
所述R1和R2为本发明制备的血浆纤维蛋白原试剂。
实施例2：制备血浆纤维蛋白原的检测试剂
所述血浆纤维蛋白原的检测试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)配制血浆稀释液R1：将质量浓度为1％的咪唑、0.1％的NaCl和平均分子量为15000的聚乙二醇0.01％混合后调节pH7.2，余量用水补齐得到血浆稀释液R1；
(2)配制凝血酶缓冲体系R2：将质量浓度为1％的咪唑、0.1％的BSA、0.01％的Triton-X-100、1％的甘露醇、1％的甘氨酸、1％的海藻糖和50IU/mL的凝血酶混合后调节pH7.2，最后添加0.01％的proclin-300，余量用水补齐得到凝血酶缓冲体系R2；
所述R1和R2为本发明制备的血浆纤维蛋白原试剂。
实施例3：制备血浆纤维蛋白原的检测试剂
所述血浆纤维蛋白原的检测试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)配制血浆稀释液R1：将质量浓度为15％的咪唑、5％的NaCl和平均分子量为5000的聚乙二醇1％混合后调节pH7.2，余量用水补齐得到血浆稀释液R1；
(2)配制凝血酶缓冲体系R2：将质量浓度为15％的咪唑、10％的BSA、1％的Triton-X-100、15％的甘露醇、15％的甘氨酸、10％的海藻糖和400IU/mL的凝血酶混合后调节pH7.2，最后添加1％的proclin-300，余量用水补齐得到凝血酶缓冲体系R2；
所述R1和R2为本发明制备的血浆纤维蛋白原试剂。
实施例4：重复性的测定
将实施例1制备的血浆纤维蛋白原的试剂和市售的血浆纤维蛋白原的试剂同时测定正常质控血浆纤维蛋白原，包括以下步骤：将90μL的血浆稀释液R1和10μL的正常质控血浆混合后在37℃孵育60s，再加入50μL R2凝血酶缓冲体系后在全自动凝血以上测定，所述重复性比较的结果如下表1所示：
表1
注：CV为变异系数。
从表1可以看出，10次实验中本发明血浆纤维蛋白原的试剂重复性好，变异系数仅为1.01，而市售试剂重复性较差，变异系数为2.89。
实施例5：稳定性的测定
将实施例1制备的血浆纤维蛋白原的试剂及市售的血浆纤维蛋白原的试剂放置于37℃恒温箱中，每天取相应的体积按照实施例2所述的检测方法进行检测，所述稳定性比较的结果如表2所示：
表2
从表2可以看出，本发明的血浆纤维蛋白原检测试剂在37℃条件下10天内测试结果稳定，到第11天才开始变化，而市售试剂在第三天就开始变化，这一结果对临床检验科来说，尤其是中小医院来说非常重要，在确保检验结果准确的前提下，可以减少浪费，从而降低成本。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种血浆纤维蛋白原的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括血浆稀释液R1和凝血酶缓冲体系R2组成；
其中，所述血浆稀释液R1包括咪唑、NaCl和聚乙二醇；
所述凝血酶缓冲体系R2包括咪唑、Triton-X 100、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、牛血清蛋白、Proclin-300和凝血酶。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述血浆稀释液R1按质量体积百分含量包括咪唑1-15％、NaCl 0.1-5％和聚乙二醇0.01-1％。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述咪唑的质量体积百分含量为4-8％，优选为3.8％；
优选地，所述NaCl的质量体积百分含量为0.4-0.8％，优选为0.48％；
优选地，所述聚乙二醇的质量体积百分含量为0.05-0.2％，优选为0.12％；
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为5000-15000，优选为6000-10000，进一步优选为8000。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述凝血酶缓冲体系R2按质量体积百分含量包括咪唑1-15％、Triton-X 100 0.01-1％、甘露醇1-15％、甘氨酸1-15％、海藻糖1-10％、牛血清蛋白0.1-10％、Proclin-3000.01-1％和凝血酶50-400IU/mL。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述咪唑的质量体积百分含量为4-8％，优选为3.8％；
优选地，所述Triton-X 100的质量体积百分含量为0.05-0.1％，优选为0.08％；
优选地，所述甘露醇的质量体积百分含量为3-6％，优选为4％；
优选地，所述甘氨酸的质量体积百分含量为3-6％，优选为4％；
优选地，所述海藻糖的质量体积百分含量为1-2％，优选为1.5％；
优选地，所述牛血清蛋白的质量体积百分含量为0.5-2％，优选为0.4％；
优选地，所述Proclin-300的质量体积百分含量为0.02-0.06％，优选为0.05％；
优选地，所述凝血酶的质量体积百分含量为80-200IU/mL，优选为200IU/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述血浆稀释液R1的pH为6.8-8.5，优选为7-7.8；
优选地，所述凝血酶缓冲体系R2的pH为6.8-8.5，优选为7-7.8。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的检测试剂在非诊断和治疗的检测血浆中纤维蛋白原含量的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：向待检测样品中加入R1孵育后再加入R2反应，即可得到所要检测的血浆纤维蛋白原的含量。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述待测样品：R1：R2的体积比为1:9:5。
9.根据权利要求7或8所述的使用方法，其特征在于，所述待检测样品与血浆稀释液R1孵育的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，所述待检测样品与血浆稀释液R1孵育的时间为40-100s，优选为60s。
10.一种血浆纤维蛋白原的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-6中任一项所述的检测试剂。
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