CN104630325A - 一种液体型纤维蛋白原检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种液体型纤维蛋白原检测试剂及其制备方法,制备方法包括1)保护液配制:将缓冲剂、含氨基酸、表面活性剂、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇、防腐剂溶解于水中搅拌溶解,并调节pH值为6.0~8.0;2)凝血酶试剂配制:用步骤2)得到的保护液溶解凝血酶冻干粉得到凝血酶试剂。一种液体型纤维蛋白原检测试剂,包括:凝血酶试剂,其包括凝血酶、缓冲剂、氨基酸、表面活性剂、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇、防腐剂和水。本发明试剂生产过程简化,生产设备简单,生产成本低;即开即用型,瓶间差异小;试剂稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,具体涉及一种稳定的液体型纤维蛋白原检测试剂及其制备方法。
背景技术
纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)是肝脏合成的一种血浆球蛋白,是体内重要的凝血因子,其主要的生理功能是作为凝血因子I参与体内凝血过程。血浆中的纤维蛋白原在过量纤维蛋白原的作用下,它会由可溶的蛋白转变为不可溶的聚合物,从而形成纤维蛋白凝块。血浆的凝集时间和纤维蛋白质量分数成反比,在纤维蛋白原过量的情况下,测定的血浆的凝集时间,通过纤维蛋白原标准曲线计算公式便可得到待测纤维蛋白原质量分数。
随着血栓与止血检测在临床上的广泛应用,纤维蛋白原(FIB)检测已成为出血和血栓检验的常规检测项目,具有重要的临床诊断意义。
纤维蛋白原的测定过程受多种因素的影响,其中试剂的质量是最关键因素,由于目前国产的纤维蛋白原检测试剂普遍存在产品质量不稳定、敏感性差的问题,致使检测结果不稳定,不同的临床检验实验室之间测得的结果难以比较,因此目前临床实验室所使用的试剂绝大部分为进口产品,价格昂贵。另一方面,由于试剂的稳定性问题,目前国内外的纤维蛋白原检测试剂几乎均为冻干粉剂型,使用前需要进行复溶,操作麻烦、瓶间差异大,且试剂复溶后质量稳定性差。
发明内容
基于此,为了克服上述现有技术的缺陷,本发明提供了一种液体型纤维蛋白原检测试剂及其制备方法。
为了实现上述发明目的,本发明采取了以下技术方案:
一种液体型纤维蛋白原检测试剂,包括:
凝血酶试剂,其包括凝血酶、氨基酸、表面活性剂、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇和水;
样本稀释液,其包括咪唑、氯化钠和水。
所述凝血酶试剂的pH值为6.0~8.0。
所述凝血酶试剂的凝血酶酶活力2000~35000IU/mL。
所述氨基酸的质量分数为3%~10%;
所述表面活性剂的体积分数为0.1%~0.5%;
所述牛血清白蛋白的质量分数为6%~15%;
所述明胶的质量分数为0.1%~0.5%;
所述甘露醇的质量分数为3%~10%。
还包括缓冲盐,且其浓度为40~500mmol/L。
还包括防腐剂,且其质量分数为0.1%。
所述样本稀释溶液的pH值为6.0~8.0。
所述咪唑质量分数为0.15%~0.5%;
所述氯化钠质量分数为0.5%~2%;
所述氨基酸为甘氨酸;
所述表面活性剂为吐温60或吐温80。
一种液体型纤维蛋白原检测试剂的制备方法,包括:
保护液配制:将甘氨酸、吐温60或吐温80、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇溶解于水中搅拌溶解,并调节pH值为6.0~8.0;
凝血酶试剂配制:用保护液溶解凝血酶冻干粉得到凝血酶试剂。
样本稀释液配制:称取咪唑和氯化钠,加入纯化水,搅拌进行溶解,调节pH值为6.0~8.0,得到样本稀释液。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1)试剂生产过程简化,生产设备简单,无冻干过程,生产成本低;
2)使用为即开即用型,不需复溶,操作方便;
3)不存在因所用水的质量或体积差异造成的差异,瓶间差异在3%以内;
试剂稳定性高,瓶间一致性好,37℃热稳定在30天以上,2~8℃密封储存可稳定18个月以上。
附图说明
图1为本发明一种液体型纤维蛋白原检测试剂的制备方法流程示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体图示进一步阐述本发明。
如图1所示,一种液体型纤维蛋白原检测试剂制备方法,包括凝血酶试剂的配制包括:
保护液配制:将缓冲剂、含氨基酸、表面活性剂、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇、防腐剂溶解于水中搅拌溶解,并调节pH值为6.0~8.0;
凝血酶试剂配制:用保护液溶解凝血酶冻干粉得到凝血酶试剂。
样本稀释液配制:称取咪唑和氯化钠,加入纯化水,搅拌进行溶解,调节pH值为6.0~8.0,得到样本稀释液。
缓冲剂为Tris,浓度为40~500mmol/L,氨基酸为甘氨酸,质量分数为3%~10%,表面活性剂为Tween-60(吐温60)或Tween-80,用量(v/v)为0.1%~0.5%;BSA质量分数为6%~15%,明胶质量分数为0.1%~0.5%,甘露醇质量分数为3%~10%,防腐剂为叠氮钠,质量分数0.1%。
凝血酶试剂配制:用保护液溶解凝血酶冻干粉得到凝血酶试剂;
凝血酶为商品化的牛源凝血酶冻干粉,终浓度为2000IU~3500IU/mL。
样本稀释液配制:称取咪唑和氯化钠,加入纯化水,搅拌进行溶解,pH值为6.0~8.0,
得到样本稀释液;样本稀释液咪唑的质量分数为0.15%~0.5%,氯化钠的质量分数为0.5%~2%。
凝血酶试剂的配制可先于或晚于样本稀释液配制进行,也可以同时进行。
本申请还公开了一种液体型纤维蛋白原检测试剂,包括凝血酶试剂和样本稀释液,该凝血酶试剂中含有凝血酶、氨基酸、表面活性剂、牛血清白蛋白、明胶和甘露醇,溶剂为水,pH为6.0-8.0。其中,氨基酸优选甘氨酸,表面活性剂优选吐温60或吐温80。该样本稀释液含有咪唑和氯化钠,溶剂为水。
本申请中甘氨酸、甘露醇与其他试剂组分配合能够很好地保持凝血酶在液体试剂中的稳定性,制备的液体型试剂在2~8℃密封储存18个月后,用该试剂进行纤维蛋白原检测,检测结果偏移在10%以内。另外,该凝血酶试剂还可以含有缓冲盐更好地维持试剂的pH值,以更好地保持凝血酶的活性。该凝血酶试剂还可以含有防腐剂,以可以抑制试剂中维生物的生长,有利于试剂长期保存。常用的诊断试剂的防腐剂均可使用,例如叠氮钠。
下面以一个具体实施例具体介绍一个液体型纤维蛋白原检测试剂的组成、制备方法,以及稳定性性能。
实施例1液体型纤维蛋白原检测试剂的制备方法
1保护液配制:称取Tris6.06g(50mmol/L)、甘氨酸50g(质量分数为5%)、BSA 100g(质量分数为10%)、明胶2g(质量分数为0.2%)、甘露醇40g(质量分数为4%)、Tween-60 2mL(v/v为0.2%)、叠氮钠1g(质量分数为0.1%),加入1L纯化水,搅拌使其充分溶解,用0.1mol/L的NaOH调pH为7.0。
2过滤除菌:用水润湿0.45μm的三醋酸纤维素,紧贴放在抽滤过滤器砂芯上对保护液进行抽滤,收集滤液得到滤清的保护液,去除配制过程中的少量不溶物。
3凝血酶试剂配制:取10支1mL规格、200000IU/mL的凝血酶冻干品,分别用1mL保护液溶解10分钟后,转移至盛保护液的容器中,清洗3次,也全部转移至盛保护液的容器中,合并得到约1L凝血酶试剂。
4样本稀释液配制:称取2g咪唑、10g氯化钠,用1L纯化水进行溶解,用0.1mo l/L的盐酸调整pH值为7.4,得到样本稀释液。
5纤维蛋白原(FIB)检测试剂性能检测:
检测方法为:待测血浆或质控品用样本稀释液先以1:10稀释,然后取200μL作为样本,37℃育温3分钟后加入100μL凝血酶试剂,以Sysmex CA-1500血凝仪凝固法进行检测。
1)准确性检测
上述凝血酶试剂及样本稀释液按上述检测方法在Sysmex CA-1500血凝仪上用SiemensFI B试剂校准按说明书操作进行校准,检测WHO纤维蛋白原标准物Blood Coagulat ionFibrinogen Plasma(09/264),结果如下表1:
表1试剂的校准及准确性检测结果(单位:mg/dL)
上述结果显示,本试剂校准曲线相关性良好,检测WHO标准物质偏差为0.93%,远优于行业标准不超过15%的要求。
2)线性范围检测
从医院收集临床报告纤维蛋白原结果异常升高的新鲜血浆样本,使用生理盐水进行梯度稀释为4个浓度点,在Sysmex CA-1500血凝仪用上述校准后的FIB检测试剂对各点以及生理盐水共5个点进行检测,结果如下表2:
表2试剂的线性范围检测结果(单位:mg/dL)
上述结果本发明中所配制的本试剂线性范围在0~1200mg/dL内相关性良好,大于正常样本范围(200~400mg/dL)。
3)瓶间一致性检测
将配制的凝血酶试剂和样本稀释液按4mL每支分装于7mL洁净玻璃瓶中,随机抽取5支用上述的检测方法上Sysmex CA-1500血凝仪对Siemens血凝正常水平质控品Ci-Trol 1和新鲜正常血浆、异常血浆各1例样本进行测试,结果如表2:
表2凝血酶试剂瓶间一致性测试结果(单位:mg/dL)
样品(s) | 瓶1 | 瓶2 | 瓶3 | 瓶4 | 瓶5 | CV |
Ci-Trol 1 | 262.8 | 268.9 | 262.8 | 268.9 | 268.9 | 1.25% |
正常血浆 | 273.4 | 274.3 | 274.4 | 274.1 | 274.1 | 0.14% |
异常血浆 | 147.9 | 150.9 | 148.1 | 149.2 | 150.2 | 0.87% |
上述结果显示5瓶试剂测试各样本的一致性均较好,瓶间差异在2%以内。
实施例2液体型纤维蛋白原检测试剂的热稳定性检测
1试剂配制:按下表3的组合配制各种凝血酶试剂及样本稀释液,得到各F I B检测试剂。
表3各FIB试剂成分组合
2 37℃热稳定性检测
将上述配制的各FIB试剂(试剂1~试剂4)与对比试剂1和2进行平行试验,凝血酶试剂和样本稀释液各按4mL每支分装于7mL洁净玻璃瓶中,加盖密封,各30支置37℃烘箱中进行热破坏,每天各取一支对新复溶的同批号的Siemens血凝正常水平质控品Ci-Trol 1进行检测,检测方法同上。结果如下表4:
表4各FIB试剂37℃热稳定性检测结果(单位:mg/dL)
上表结果显示,在37℃热破坏30天内,本发明中的液体型纤维蛋白原检测试剂对样本的检测结果偏移在18mg/dL(约6%)以内,而对比试剂1和试剂2在同样条件下偏移接近30mg/dL(超出10%),说明本发明试剂在37℃高温下30天的稳定性优于对比试剂。
实施例3液体型纤维蛋白原检测试剂的长期稳定性检测
1,试剂配制:按组合150mmol/L Tris、7.5%甘氨酸、0.3%Tween-60、10%BSA、0.3%明胶、5%甘露醇、0.1%叠氮钠、凝血酶3000IU/mL、pH=7.4配制凝血酶试剂;按质量分数0.3%咪唑、1.2%氯化钠配制样本稀释液,得到液体型纤维蛋白原检测试剂。
2长期稳定性检测:将上述FIB试剂各按4mL每支分装于7mL洁净玻璃瓶中,加盖密封,20支置冰箱2~8℃储存,每月15日各取一支对新复溶的同批号Siemens血凝正常水平质控品Ci-Trol1进行检测,检测方法同上。结果如下表5:
表5FIB试剂长期稳定性检测结果(单位:mg/dL)
上表结果显示,在2~8℃储存18个月内,本发明中的液体型纤维蛋白原检测试剂对样本的检测结果偏移在20mg/dL(约7%)以内,说明试剂储存有效期可达18个月以上。
现有的纤维蛋白原检测试剂多为冻干型的试剂,试剂配制好后,冻干为干粉,以便保持凝血酶的活性,用于检测前需要加水复溶。申请人为了开发液体型的纤维蛋白原检测试剂,通过大量的研究发现,氨基酸,特别是甘氨酸;吐温60或80;甘露醇;牛血清白蛋白和明胶,这几个组分配伍,可以很好地保持凝血酶在液体FIB试剂中的稳定性。通过实施例2和实施例3的对比可知,加入甘氨酸与其他组分配伍可以提高试剂稳定性,甘氨酸和甘露醇联合使用,效果更好,并且质量体积百分比为3%~5%甘氨酸;质量体积百分比为0.1%~0.5%的吐温60或吐温80;质量体积百分比为3%~10%的甘露醇;质量体积百分比为6%~15%的牛血清白蛋白;质量体积百分比为0.1%~0.5%的明胶,pH为6-8的液体型FI B试剂的性能完全可以满足商品化的要求。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,包括:
凝血酶试剂,其包括凝血酶、氨基酸、表面活性剂、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇,溶剂为水;
样本稀释液,其包括咪唑、氯化钠,溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,所述凝血酶试剂的pH值为6.0~8.0。
3.根据权利要求2所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,所述凝血酶试剂的凝血酶酶活力2000~35000IU/mL。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,所述氨基酸的质量分数为3%~10%;
所述表面活性剂的体积分数为0.1%~0.5%;
所述牛血清白蛋白的质量分数为6%~15%;
所述明胶的质量分数为0.1%~0.5%;
所述甘露醇的质量分数为3%~10%。
5.根据权利要求4所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,所述氨基酸为甘氨酸。
6.根据权利要求5所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,所述表面活性剂为吐温60或吐温80。
7.根据权利要求1所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,所述样本稀释溶液的pH值为6.0~8.0。
8.根据权利要求1或7所述的液体型纤维蛋白原检测试剂,其特征在于,
所述咪唑质量分数为0.15%~0.5%;
所述氯化钠质量分数为0.5%~2%。
9.一种液体型纤维蛋白原检测试剂的制备方法,其特征在于,包括:
保护液配制:将甘氨酸、吐温60或吐温80、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇溶解于水中搅拌溶解,并调节pH值为6.0~8.0;
凝血酶试剂配制:用保护液溶解凝血酶冻干粉得到凝血酶试剂。
10.根据权利要求9所述的液体型纤维蛋白原检测试剂制备方法,其特征在于,样本稀释液配制:称取咪唑和氯化钠,加入纯化水,搅拌进行溶解,调节pH值为6.0~8.0,得到样本稀释液。
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