CN110346357B - 一种用于抗凝血酶ⅲ测定试剂 - Google Patents
一种用于抗凝血酶ⅲ测定试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,包括试剂1、试剂2;所述试剂1包括浓度为2‑10IU/mL的牛凝血酶、浓度为1‑10IU/mL的肝素、浓度6.3g/L—8.3g/L的Tris生物缓冲液和浓度为5w%的牛血清白蛋白、氯化钠、防腐剂;所述试剂2包括浓度为2—4w%的发色底物、Tris生物缓冲液、5w%甘露醇、防腐剂,采用0.3w%柚皮提取物、0.5w%大黄提取物、0.5w%大蒜素三种成分的防腐剂协同作用,能起到较好的杀菌抑菌的作用,且天然生物防腐剂无毒性、无污染、无腐蚀性,对使用者及环境均无潜在危险,且能够起到保护剂的作用,提升试剂盒性能指标。无论37℃还是2‑8℃存储,其杀菌、抑菌性能都较好,试剂都具有较高的稳定性。故本发明具有很高的临床应用价值,及潜在的市场效益。
Description
技术领域
本发明属于生物医药检测技术领域,具体涉及含复合型防腐剂的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂。
背景技术
抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)是由肝脏和血管内皮细胞合成的一种单链糖蛋白,能与肝素、凝血酶结合,发挥其抗凝血作用。抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)主要反应机体抗凝系统的功能,是临床上评估高凝状态良好的指标。
临床上测定AT-Ⅲ活性的方法主要有凝固法、免疫法和发色底物法三种。本发明中选用的是发色底物法,与其它方法相比,该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短,能够适用于多种自动化分析仪器,大幅降低了临床检测费用,在临床应用中应用也越加广泛
但是该法也存在一定的缺陷,该法通过加入外源性凝血酶来分析样本中AT-Ⅲ活性,凝血酶本质为蛋白质,如若缓冲液浓度、pH不适宜,亦容易降解,故维持试剂的稳定性尤为重要。市场上该种试剂盒有冻干粉和液体型两种试剂,冻干粉试剂的制备需要冻干工序,生产步骤繁琐,周期较长,且在使用时需要复溶,复溶后试剂比较不稳定。且由于冻干过程中冻干效果的差异,容易造成各瓶冻干粉试剂的批内瓶间差以及批间差较大,导致试剂测定结果的不稳定性增加。
对于液体型体外诊断试剂,防腐剂则是必不可缺少的成份,它能防止试剂盒因微生物的生长引起的腐败变质,使试剂盒在规定的环境中具有一定的有效性。目前国内外试剂盒大多数采用化学试剂,而采用的这些防腐剂中大部分都具有毒性,部分具有腐蚀性,对使用者及环境都潜在很大的危险性及污染。
现有诊断试剂盒中常用的防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、抗生素等。硫柳汞在ELISA(酶联免疫反应)试剂中曾普遍使用,但因其有毒,现较少或几乎不使用。抗生素只是可以对抗细菌,但是不能对抗除细菌外的其它微生物,且长时间不能达到完全防腐的作用。叠氮钠是目前体外诊断试剂盒最常用的防腐剂,虽然其防腐效果尚好,但其对过氧化物酶、抗体的活性都有一定的抑制作用。在使用过程中对人体、环境均具有较大的潜在危险性。ProClin系列防腐剂是SUPELCO公司推出新一代高效生物防腐剂,可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长。同时,它又能保持体系中酶的活性,但因其价格昂贵,现在只少量用于临床研究。
因此,目前寻找一种价格合适、有效且无毒害作用的一种防腐剂对本液体型试剂盒是非常必要的。
发明内容
根据上述阐述,本发明的目的在于提供一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,可以达到安全稳定,各成分协同效应好,抑菌性能高效、广谱的天然防腐剂的作用。
本发明提供的技术方案:
一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,包括试剂1、试剂2;
所述试剂1包括浓度为2-10IU/mL的牛凝血酶、浓度为1-10IU/mL的肝素、浓度6.3g/L—8.3g/L的Tris生物缓冲液和浓度为5w%的牛血清白蛋白、氯化钠、防腐剂;
按顺序投组分原料,确保每种组分原料完全溶解后再加下一种,称取Tris生物缓冲液0.24228g,加入90mL纯化水,调节pH到pH7.4;加入无机盐0.73g;牛血清蛋白2g;肝素500IU;牛凝血酶500IU,加入防腐剂0.3w%柚皮提取物、0.5w%大黄提取物、0.5w%大蒜素,缓慢混匀,用纯化水定容至100mL;
所述试剂2包括浓度为2—4w%的发色底物、Tris生物缓冲液、5w%甘露醇、防腐剂;
按顺序投组分原料,确保每种组分原料完全溶解后再加下一种,称取Tris生物缓冲液0.24228g,加入90mL纯化水,调节pH到pH7.4,取0.2g凝血酶发色底物,称取5g甘露醇,加入防腐剂0.3w%柚皮提取物、0.5w%大黄提取物、0.5w%大蒜素,缓慢混匀,用纯化水定容至100mL。
上述技术方案中,所述Tris生物缓冲液为pH7.4±0.2的三羟甲基氨基甲烷,优选工作液浓度为20mM。
上述技术方案中,所述试剂1中无机盐为氯化钙或氯化钠中的一种。
上述技术方案中,所述牛凝血酶浓度为5IU/mL。
上述技术方案中,所述肝素为肝素钠,浓度为5IU/mL。
上述技术方案中,所述发色底物为D-苯丙氨酰基-L-2-哌啶羰基-N-4-硝基苯-L-精氨酰胺(S-2238)。
上述技术方案中,所述发色底物浓度为2w%。
有益效果:本发明首次将柚皮提取物、大黄提取物、大蒜素复合成分作为防腐剂应用到液体型抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒中,所述防腐剂为天然生物来源,除作为防腐剂外,还起到稳定剂的作用。
柚皮提取物中的黄酮等成分对常见污染菌有广谱的抑菌作用,对多种细菌、霉菌等都具有显著的抑制作用。其中主要成分柚皮苷还能起到良好的抗氧化作用,对试剂中易氧化的成分起到保护作用。
大黄提取物对多种耐药细菌、流感病毒、真菌等也具有较强的抑制作用。此外,大黄提取物中的大黄素和大黄酸结晶较为稳定,耐热性好,对试剂的储存稳定性具有一定的保护作用。
大蒜素对多种细菌、真菌、病毒均具有杀灭和抑制作用,被称为“天然广谱植物杀菌素”。大蒜素不仅具有防腐功能,其富含的氨基酸是最常用的蛋白保护剂,试剂主要成分牛凝血酶本身就是蛋白质,所以大蒜素对牛凝血酶的活性起到保护作用,使测定结果准确且与病情相符。
三种成分作为防腐剂协同作用,能起到较好的杀菌抑菌的作用,且天然生物防腐剂无毒性、无污染、无腐蚀性,对使用者及环境均无潜在危险,且能够起到保护剂的作用,提升试剂盒性能指标。无论37℃还是2-8℃存储,其杀菌、抑菌性能都较好,试剂都具有较高的稳定性。故本发明具有很高的临床应用价值,及潜在的市场效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试剂在0~150.0%范围内线性图。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明所述液体型抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒,包括包装盒和试剂1、试剂2,采用发色底物原理:过量的凝血酶加入待测样本,与样本中的抗凝血酶Ⅲ作用,形成无活性的复合物,剩余凝血酶作用于发色底物,裂解出产色基团,显色的深浅与抗凝血酶Ⅲ活性成负相关,最后利用吸光度的变化就可以制作标准曲线并推算出样品中抗凝血酶Ⅲ的活性。
实施例1:
试剂1和试剂2的制备
防腐剂1:0.5mg/mL叠氮纳。
防腐剂2:0.02%硫柳汞。
防腐剂3:0.02%ProClin300。
防腐剂4:0.3w%柚皮提取物、0.5w%大黄提取物、0.5w%大蒜素。
试剂1的配制:
所述试剂1按顺序投组分原料,确保每种组分原料完全溶解后再加下一种,称取Tris生物缓冲液0.24228g,加入90mL纯化水,调节pH到pH7.4;加入无机盐0.73g;牛血清蛋白2g;肝素500IU;牛凝血酶500IU,加入防腐剂,缓慢混匀,用纯化水定容至100mL;
所述试剂2,按顺序投组分原料,确保每种组分原料完全溶解后再加下一种,称取Tris生物缓冲液0.24228g,加入90mL纯化水,调节pH到pH7.4,取0.2g凝血酶发色底物,称取5g甘露醇,加入防腐剂,缓慢混匀,用纯化水定容至100mL。
防腐剂对比:将含不同防腐剂的试剂,分别放置于37℃和2-8℃,每天取175μL的试剂,33μL的试剂,利用希森美康凝血分析仪CA-1500测定其405nm处吸光度,结果如下表1和表2所示。
表1 37℃存储吸光度变化
表2 2-8℃存储吸光度变化
结果显示,防腐剂剂1、2、3在37℃放置1天后均不同程度上出现活性损失;防腐剂4在37℃放置4天后出现活性损失。防腐剂1、2在2-8℃放置5天具有较好的稳定性,防腐剂3在2-8℃放置7天具有较好的稳定性,防腐剂4在2-8℃放置11天具有较好的稳定性。综上所述,在2-8℃和37℃条件下,防腐剂4均能更好的能起到保护试剂稳定性的作用。
实施例2本发明试剂盒的分析性能评估
(1)分析灵敏度
按实例1的方法配制试剂1和试剂2,选取防腐剂4。配制的抗凝血酶Ⅲ(发色底物法)试剂盒测试浓度为90-100%的样本,重复测试3次,计算3次测试所得dOD值的平均值,结果均大于0.600。如表3所示:
表3分析灵敏度测定结果
(2)线形范围
用接近抗凝血酶Ⅲ线性范围上限的高浓度样品(AT-Ⅲ活性为145%)和稀释液稀释成6个稀释浓度,如下表;每个稀释浓度测试3次,分别求出测定结果的均值。以稀释浓度为自变量,测定结果的均值为因变量求出线性回归方程。计算线性回归方程的相关系数,结果显示相关系数r=9988,线性回归方程为y=147.24x+2.3363。见表四和图1,表明本发明试剂盒在0~150.0%范围内线性范围内线性相关性较好。
稀释液(mL) | 0 | 0.33 | 0.67 | 0.83 | 0.917 | 1 |
高浓度样品(mL) | 1 | 0.67 | 0.33 | 0.17 | 0.083 | 0 |
表4线性范围测定结果
(3)准确性
用标示值为95%抗凝血酶国际标准物质对本试剂盒进行测试,重复测试3次,计算得出均值与参考物质标示值的相对偏差为1.75%,偏差较小。如表5所示:
表5准确性测定结果
实施例3稳定性考察
以CN107153043A实施例1公开的方法配制的试剂作为对比试剂,(试剂:0.2U/mLFXa,0.3mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH6.5,1%mol/L氯化钠和2%BSA、2%PEG6000、10%甘露醇,0.05%Proclin300。试剂:将发色底物N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl复溶,用醋酸调pH至6.5,加入甘露醇和叠氮钠,用水调至浓度为1.5mmol/L,甘露醇浓度为5%,叠氮钠浓度为0.05%。)以及本发明所述试剂分别放置于2-8℃和37℃,每隔7天取样,分别对质控品(靶值范围92-112%,靶值102%)进行测定。测试结果如表4所示
表4
试验结果显示,本发明所述液体即用型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂相比现有技术的液体试剂,在2-8℃和37℃均具有更高的稳定性,本发明试剂在37℃可稳定49天,说明稳定性很好。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:包括试剂1、试剂2;
所述试剂1包括浓度为2-10IU/mL的牛凝血酶、浓度为1-10IU/mL的肝素、浓度6.3g/L—8.3g/L的Tris生物缓冲液和浓度为5w%的牛血清白蛋白、无机盐、防腐剂;
按顺序投组分原料,确保每种组分原料完全溶解后再加下一种,称取Tris生物缓冲液0.24228g,加入90mL纯化水,调节pH到pH7.4;加入无机盐0.73g;牛血清蛋白2g;肝素500IU;牛凝血酶500IU,加入防腐剂0.3w%柚皮提取物、0.5w%大黄提取物、0.5w%大蒜素,缓慢混匀,用纯化水定容至100mL;
所述试剂2包括浓度为2—4w%的发色底物、Tris生物缓冲液、5w%甘露醇、防腐剂,按顺序投组分原料,确保每种组分原料完全溶解后再加下一种,称取Tris生物缓冲液0.24228g,加入90mL纯化水,调节pH到pH7.4,取0.2g凝血酶发色底物,称取5g甘露醇,加入防腐剂0.3w%柚皮提取物、0.5w%大黄提取物、0.5w%大蒜素,缓慢混匀,用纯化水定容至100mL。
2.根据权利要求1所述的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:所述Tris生物缓冲液为pH7.4±0.2的三羟甲基氨基甲烷,工作液浓度为20mM。
3.根据权利要求1所述的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:所述试剂1中无机盐为氯化钙或氯化钠中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:所述牛凝血酶浓度为5IU/mL。
5.根据权利要求1所述的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:所述肝素为肝素钠,浓度为5IU/mL。
6.根据权利要求1所述的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:所述发色底物为D-苯丙氨酰基-L-2-哌啶羰基-N-4-硝基苯-L-精氨酰胺。
7.根据权利要求1所述的一种用于抗凝血酶Ⅲ测定试剂,其特征在于:所述发色底物浓度为2w%。
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