CN107942080A - 一种活化部分凝血活酶时间检测试剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于临床医学检测技术,具体涉及一种活化部分凝血活酶时间检测试剂及其检测方法,所述检测试剂包括新鲜兔脑浸液。本发明方法检测精准,操作简单,为临床医学上内源性凝血因子缺乏和肝素治疗,提供了安全、可靠、重复性好的体外诊断试剂。
Description
技术领域
本发明属于临床医学检测技术,具体涉及一种活化部分凝血活酶时间检测试剂及其检测方法。
背景技术
凝血实验对临床各科的疾病诊断具有重要的意义,除了对出血疾病的筛选与诊断外,还用于血栓前状态的检查;弥漫性血管内凝血出血疾病(DIC)的实验诊断以及对各种抗凝治疗者的用药指导和预后估计等。目前临床上常用的检测出凝血机制的试验有凝血四项(含凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间APTT、凝血酶时间TT、纤维蛋白原FIB含量)测定。
血栓与止血不仅涉及基础医学,且与多个临床学科(包括血液科呼吸消化科心血管科神经科妇产科普通外科)的疾病密切相关:1)所有手术前检查:外科手术(普外、骨外、妇产、五官、心脏等手术)检查病人的出凝血机能,以免术中发生危险;2)监测抗凝及溶栓治疗:如换瓣手术后、肝素治疗、口服抗凝剂(华发令、香豆素等)减少临床治疗出血发生率;3)血栓前状态监测:心肌梗塞、静脉血栓;4)弥漫性血管内凝血;5)先天及后天性凝血因子缺乏;6)各类肝脏疾病及纤维蛋白原缺乏所致的出血倾向;7)凝血酶原及纤维蛋白原缺乏所致的出血倾向;8)动脉粥样硬化;9)中医活血化淤的诊疗研究。
人体内存在着正常的止血、凝血和抗凝系统,此系统一直保持着动态的生理平衡。若止凝血活性增强或抗凝血活性减弱,便会导致血栓前状态或血栓形成;相反,会引起低凝状态或出血倾向。活化部分凝血活酶时间是凝血系统的一个较为敏感的筛选试验。凝血酶原时间主要反映内源性凝血途径是否正常,也可用于肝素治疗的监控,它对凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和激肽释放原敏感。
活化部分凝血酶时间(APPT)作为血凝四项的重要指标之一,是监测普通抗凝剂肝素的首选指标,是内源性凝血系统过筛试验,并且是APCR筛选与确认的首选手段。由于APTT操作简单、迅速、敏感性高、重现性好而得到广泛的应用,然而迄今为止,国内APTT测定或试剂尚无标准化方案。与之有关的问题如不同的APTT试剂对凝血因子、肝素、狼疮抗凝因子敏感性相差甚大等。同时,由于不同实验室使用APTT质量上的不同,使得同一个患者在不同的医院测定的结果不一致,影响对疾病的正确、及时诊断。
CN 101226201B公开了一种可用于测定血浆中活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂,该试剂由下述的原料配置而成:试剂固体激活剂0.05~0.5g/l;磷酯20~200mg/l;二价金属离子盐0.1~10mmol/l;稳定剂0.1-0.5g/l;聚乙二醇PEG0.1~10g/l;缓冲剂0.05~4.0g/l;复兴剂2.0~5.0g/l;其余是水。该测定试剂的测定时间长,稳定性不佳。
因此,APTT试剂的质量成为获得准确结果及提供临床医生准备判断的关键,同时,由于复溶后的试剂稳定性差,增加浪费,导致医疗单位成本增加,患者负担加重。所以,研制一种安全、稳定、可靠、准确的液体|APTT,对于医疗机构的使用及临床结果的准确判断有着极为重要的意义。
发明内容
本发明提供一种活化部分凝血活酶时间检测试剂及其检测方法,所述检测方法试剂简单,检测试剂稳定,而且反应体系稳定,影响因素少,且检测精准,操作简单,为临床医学上内源性凝血因子缺乏和肝素治疗,提供了安全、可靠、重复性好的体外诊断试剂。
第一方面,本发明提供了一种活化部分凝血活酶时间检测试剂,所述检测试剂包括新鲜兔脑浸液。
本发明中,所述新鲜兔脑浸液保证了兔脑复合磷脂中磷酯酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的活性及最佳比例,而市售产品加入的都是兔脑粉或是其他兔脑制品,其在制备过程中加入了丙酮及四氯甲烷等物质,除了对复合磷脂的活性有影响同时其残留也对成品的品质有影响。
优选地,所述新鲜兔脑浸液按重量百分比计占所述检测试剂的5-30%,例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%,优选为10-15%,进一步优选为12%。
优选地,所述新鲜兔脑浸液的制备方法包括如下步骤:将新鲜兔头剥开脑壳,去除表层物质,称重研磨,加入生理盐水后水浴静置,离心取上清得到新鲜兔脑浸液。
优选地,所述研磨后的兔脑与生理盐水的体积比为1:(2-8),例如可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7或1:8,优选为1:(4-6),进一步优选为1:4。
优选地,所述水浴的温度为40-65℃,例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、63℃或65℃,优选为50-60℃,进一步优选为54℃。
优选地,所述水浴的时间为45-80min,例如可以是45min、46min、47min、48min、50min、52min、53min、55min、58min、60min、63min、65min、68min、70min、73min、75min、78min或80min,优选为55-70min,进一步优选为60min。
优选地,所述离心的转速为2000-4000rpm,例如可以是2000rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm、2500rpm、2600rpm、2800rpm、3000rpm、3100rpm、3200rpm、3300rpm、3500rpm、3800rpm或4000rpm,优选为2500-3200rpm,进一步优选为3000rpm。
优选地,所述离心的时间为8-20min,例如可以是8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min,优选为10-18min,进一步优选为15min。
优选地,所述检测试剂包括R1和R2组成的缓冲体系;
其中,所述R1按体积百分比包括如下原料:Tris 2-12%、4-氨基安替比林0.01-0.8%、氯化钠0.1-1.5%、聚乙二醇0.01-0.8%、牛血清蛋白(BSA)0.1-1%、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)0.01-0.8%、甘露醇1-12%、甘氨酸1-12%、硫柳汞0.01-0.1%、鞣花酸0.01-0.1%和新鲜兔脑浸液5-30%,余量为水;
所述R2包括浓度为15-40mM的氯化钙。
所述Tris例如可以是2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%或12%;
所述4-氨基安替比林例如可以是0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%或0.8%;
所述氯化钠例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%或1.5%;
所述聚乙二醇例如可以是0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%或0.8%;
所述BSA例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%;
所述Triton X-100例如可以是0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.08%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%或0.8%;
所述甘露醇例如可以是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%或12%;
所述甘氨酸例如可以是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%或12%;
所述硫柳汞例如可以是0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%;
所述鞣花酸例如可以是0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%;
所述氯化钙例如可以是15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM或40mM。
本发明中,所述4-氨基安替比林使得试剂的光敏性更好,更均一,所述甘露醇和甘氨酸的相互作用使得试剂的稳定性更好。
优选地,所述R1按体积百分比包括如下原料:Tris 4-8%、4-氨基安替比林0.05-0.1%、氯化钠0.4-0.8%、聚乙二醇0.05-0.2%、牛血清蛋白0.2-0.5%、聚乙二醇辛基苯基醚0.05-0.1%、甘露醇3-6%、甘氨酸3-6%、硫柳汞0.02-0.06%、鞣花酸0.02-0.06%和新鲜兔脑浸液10-15%,余量为水。
优选地,所述R1按体积百分比包括如下原料;Tris 6%、4-氨基安替比林0.06%、氯化钠0.48%、聚乙二醇0.12%、牛血清蛋白0.4%、聚乙二醇辛基苯基醚0.08%、甘露醇4%、甘氨酸4%、硫柳汞0.05%、鞣花酸0.03%和新鲜兔脑浸液12%,余量为水。
优选地,所述R2包括浓度为20-30mM的氯化钙,优选为25mM的氯化钙。
优选地,所述聚乙二醇的平均分子量为1000-3000,优选为1200-1800,进一步优选为1500。
优选地,所述R1的pH为7-8.5,优选为7.2-7.8。
本发明中,所述鞣花酸为碱溶性物质,需要在R1调节完pH后加入,且加入前需要用5M的氢氧化钠溶解。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的检测试剂在非诊断和治疗的检测内源性凝血因子缺乏的的使用方法,包括如下步骤:向待检测样品中加入R1孵育后再加入R2反应,即可得到所要检测的凝血活酶时间。
优选地,所述待测样品:R1:R2的体积比为1:1:1。
优选地,所述待检测样品与R1孵育的温度为35-40℃,优选为37℃。
优选地,所述待检测样品与R1孵育的时间为40-100s,优选为60s。
第三方面,本发明提供一种活化部分凝血活酶时间检测试剂盒,所述试剂盒包括如第一方面所述的检测试剂。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果:
(1)本发明检测试剂相比于现有的检测试剂重复性和稳定性都更好,多次检测后的变异系数仅为1.01,且放置于37℃下,7天后试剂才开始发生变化;
(2)本发明试剂简单,影响因素少,在确保检验结果准确的前提下,减少浪费,降低成本;
(3)本发明方法检测精准,操作简单,为临床医学上内源性凝血因子缺乏和肝素治疗,提供了安全、可靠、重复性好的体外诊断试剂。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
仪器:全自动血凝仪:众驰伟业XL3200.
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1:制备活化部分凝血活酶时间检测试剂(APTT)
所述活化部分凝血活酶时间检测试剂的制备方法包括如下步骤:
(1)将新鲜兔头剥开脑壳,去除表层物质如脑膜、毛细血管等,称重(成年的兔脑重量为5-8g),用研钵匀浆,加入与研磨后的兔脑与生理盐水的体积比为1:4的生理盐水后54℃水浴静置60min,3000rpm离心15min,取上清得到新鲜兔脑浸液;
(2)将体积比Tris 6%、4-氨基安替比林0.06%、氯化钠0.48%、平均分子量1500的聚乙二醇0.12%、BSA 0.4%、Triton-X 0.08%、甘露醇4%、甘氨酸4%、硫柳汞0.05%和12%新鲜图脑浸液混合后调节pH至7.5,用5M的氢氧化钠溶解鞣酸后加入0.03%的鞣酸,余量用水补齐制备成缓冲体系R1;
(3)配制氯化钙浓度为25mM的缓冲体系R2;
所述R1和R2为本发明制备的APTT试剂。
实施例2:制备活化部分凝血活酶时间检测试剂(APTT)
所述活化部分凝血活酶时间检测试剂的制备方法包括如下步骤:
(1)将新鲜兔头剥开脑壳,去除表层物质如脑膜、毛细血管等,称重(成年的兔脑重量为5-8g),用研钵匀浆,加入与研磨后的兔脑与生理盐水的体积比为1:2的生理盐水后65℃水浴静置45min,2000rpm离心8min,取上清得到新鲜兔脑浸液;
(2)将体积比Tris 2%、4-氨基安替比林0.01%、氯化钠0.1%、平均分子量3000的聚乙二醇0.01%、BSA 0.1%、Triton-X 0.01%、甘露醇1%、甘氨酸1%、硫柳汞0.01%和30%新鲜图脑浸液混合后调节pH至7.2,用5M的氢氧化钠溶解鞣酸后加入0.01%的鞣酸,余量用水补齐制备成缓冲体系R1;
(3)配制氯化钙浓度为15mM的缓冲体系R2;
所述R1和R2为本发明制备的APTT试剂。
实施例3:制备活化部分凝血活酶时间检测试剂(APTT)
所述活化部分凝血活酶时间检测试剂的制备方法包括如下步骤:
(1)将新鲜兔头剥开脑壳,去除表层物质如脑膜、毛细血管等,称重(成年的兔脑重量为5-8g),用研钵匀浆,加入与研磨后的兔脑与生理盐水的体积比为1:8的生理盐水后40℃水浴静置80min,4000rpm离心20min,取上清得到新鲜兔脑浸液;
(2)将体积比Tris 12%、4-氨基安替比林0.8%、氯化钠1.5%、平均分子量3000的聚乙二醇0.8%、BSA 1%、Triton-X 0.8%、甘露醇12%、甘氨酸12%、硫柳汞0.1%和5%新鲜图脑浸液混合后调节pH至7.8,用5M的氢氧化钠溶解鞣酸后加入0.1%的鞣酸,余量用水补齐制备成缓冲体系R1;
(3)配制氯化钙浓度为40mM的缓冲体系R2;
所述R1和R2为本发明制备的APTT试剂。
实施例4:重复性的测定
将实施例1制备的APTT试剂和市售的APTT试剂同时测定正常质控血浆活化部分凝血活酶时间,包括以下步骤:将50μL的缓冲体系R1和50μL的正常质控血浆混合后在37℃孵育60s,再加入50μL R2缓冲试剂后在全自动凝血以上测定,所述重复性比较的结果如下表1所示:
表1
注:CV为变异系数。
从表1可以看出,10次实验中本发明APTT试剂重复性好,变异系数仅为1.01,而市售发明重复性较差,变异系数为2.89。
实施例5:稳定性的测定
将实施例1制备的APTT试剂及市售的APTT试剂放置于37℃恒温箱中,每天取相应的体积按照实施例2所述的检测方法进行检测,所述稳定性比较的结果如表2所示:
表2
从表2可以看出,本发明的APTT试剂在37℃条件下7天内测试结果稳定,到第八天才开始变化,而市售试剂在第三天就开始变化,这一结果对临床检验科来说,尤其是中小医院来说非常重要,在确保检验结果准确的前提下,可以减少浪费,从而降低成本。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种活化部分凝血活酶时间检测试剂,其特征在于,所述检测试剂包括新鲜兔脑浸液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述新鲜兔脑浸液按重量百分比计占所述检测试剂的5-30%,优选为10-15%,进一步优选为12%。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂,其特征在于,所述新鲜兔脑浸液的制备方法包括如下步骤:将新鲜兔头剥开脑壳,去除表层物质,称重研磨,加入生理盐水后水浴静置,离心取上清得到新鲜兔脑浸液;
优选地,所述研磨后的兔脑与生理盐水的体积比为1:(2-8),优选为1:(4-6),进一步优选为1:4;
优选地,所述水浴的温度为40-65℃,优选为50-60℃,进一步优选为54℃;
优选地,所述水浴的时间为45-80min,优选为55-70min,进一步优选为60min;
优选地,所述离心的转速为2000-4000rpm,优选为2500-3200rpm,进一步优选为3000rpm;
优选地,所述离心的时间为8-20min,优选为10-18min,进一步优选为15min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测试剂,其特征在于,所述检测试剂包括R1和R2组成的缓冲体系;
其中,所述R1按体积百分比包括如下原料:Tris 2-12%、4-氨基安替比林0.01-0.8%、氯化钠0.1-1.5%、聚乙二醇0.01-0.8%、牛血清蛋白0.1-1%、聚乙二醇辛基苯基醚0.01-0.8%、甘露醇1-12%、甘氨酸1-12%、硫柳汞0.01-0.1%、鞣花酸0.01-0.1%和新鲜兔脑浸液5-30%,余量为水;
所述R2包括浓度为15-40mM的氯化钙。
5.根据权利要求4所述的检测试剂,其特征在于,所述R1按体积百分比包括如下原料:Tris 4-8%、4-氨基安替比林0.05-0.1%、氯化钠0.4-0.8%、聚乙二醇0.05-0.2%、牛血清蛋白0.2-0.5%、聚乙二醇辛基苯基醚0.05-0.1%、甘露醇3-6%、甘氨酸3-6%、硫柳汞0.02-0.06%、鞣花酸0.02-0.06%和新鲜兔脑浸液10-15%,余量为水;
优选地,所述R1按体积百分比包括如下原料;Tris 6%、4-氨基安替比林0.06%、氯化钠0.48%、聚乙二醇0.12%、牛血清蛋白0.4%、聚乙二醇辛基苯基醚0.08%、甘露醇4%、甘氨酸4%、硫柳汞0.05%、鞣花酸0.03%和新鲜兔脑浸液12%,余量为水;
优选地,所述R2包括浓度为20-30mM的氯化钙,优选为25mM的氯化钙。
6.根据权利要求4或5所述的检测试剂,其特征在于,所述聚乙二醇的平均分子量为1000-3000,优选为1200-1800,进一步优选为1500;
优选地,所述R1的pH为7-8.5,优选为7.2-7.8。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的检测试剂在非诊断和治疗的检测内源性凝血因子缺乏的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:向待检测样品中加入R1孵育后再加入R2反应,即可得到所要检测的凝血活酶时间。
8.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,所述待测样品:R1:R2的体积比为1:1:1。
9.根据权利要求7或8所述的使用方法,其特征在于,所述待检测样品与R1孵育的温度为35-40℃,优选为37℃;
优选地,所述待检测样品与R1孵育的时间为40-100s,优选为60s。
10.一种活化部分凝血活酶时间检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求1-6中任一项所述的检测试剂。
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