CN110133304A

CN110133304A - 组合物、含有该组合物的试剂及其应用

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Publication number: CN110133304A
Application number: CN201910423534.8A
Authority: CN
Inventors: 丁重辉; 张丽君
Original assignee: Beijing Sicceeder Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Sicceeder Technology Co Ltd
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2039-05-21
Also published as: CN110133304B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及组合物、含有该组合物的试剂及其应用。本发明试剂广泛适用于医院临床实验室常规检验用凝固法全自动凝血测试仪。其优点在于该试剂的肝素敏感系数(1.67‑2.23)适中可控，有效地保证了临床肝素用药治疗监测的可靠性；该试剂对狼疮抗凝物响应较好，可用于临床狼疮抗凝物筛查检测；该试剂对极度异常临床样本的测试值准确度高、重复性好；该试剂储存时间长，复溶后的稳定性能好。因此，本发明为临床诊断治疗血栓与止血类疾病提供可靠的检测数据，有利于在市场上进一步推广使用。

Description

组合物、含有该组合物的试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及组合物、含有该组合物的试剂及其应用。

背景技术

活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，简称APTT)，是内源凝血系统较敏感和最为常用的筛选实验，活化部分凝血活酶时间(APTT)测定是临床上最常用的反映内源性凝血系统凝血活性的敏感筛选试验，对于内源性凝血因子缺陷及相关抑制物的检测和活化蛋白C抵抗现象的筛检、肝素治疗的监测、弥散性血管内凝血(DIC)的早期诊断、术前检查等方面有着广泛的用途。

活化部分凝血活酶时间(APTT)是反映内源凝血途径特别是第一阶段的凝血因子综合活性的一项凝血功能检查指标，广泛用于过筛测定内源途径凝血因子的缺陷，如因子Ⅶ、XI、Ⅷ、Ⅸ，同时也可用于出血疾病的初筛诊断以及肝素抗凝治疗的实验室监测。

活化部分凝血活酶时间主要反映内源性凝血是否正常。活化部分凝血活酶时间延长：(1)血浆因子Ⅷ、因子Ⅸ和因子XI水平减低：如血友病A、血友病B及因子XI缺乏症；(2)严重的凝血酶原(因子Ⅱ)、因子Ⅴ、因子X和纤维蛋白原缺乏：肝脏疾病、阻塞性黄疽、新生儿出血症。肠道灭菌综合征、吸收不良综合征、口服抗凝剂及低(无)纤维蛋白血症等；(3)纤维蛋白溶解活力增强:如继发性、原发性纤维蛋白溶解功能亢进等；(4)血液循环中有抗凝物质:如抗凝因子Ⅷ或因子Ⅸ抗体等；(5)系统性红斑狼疮及一些免疫性疾病。活化部分凝血活酶时间缩短：(1)于高凝状态：如促凝物质进人血液及凝血因子的活性增高等情况；(2)血栓性疾病:如心肌梗死、不稳定型心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成；(3)妊娠高血压综合征和肾病综合征等。需要检查的人群:胸部不适，气短，异常虚弱，身体疼痛。

根据活化物的不同，市场上用来检测APTT的试剂盒大致可分为硅藻土剂型、白陶土剂型及鞣花酸剂型三大类，其中，白陶土剂型浑浊容易产生沉淀，检测时需要不断地搅拌，给临床检验操作带来不便；鞣花酸剂型是液体试剂，简化临床检测操作，但易被氧化、稳定期短，对肝素用药监测也较不敏感；硅藻土剂型可以制成冻干品，延长试剂贮存期，复溶后为清亮的混悬液、不易被氧化，常被用于临床监测肝素用药情况，该剂型通常也可用于狼疮抗凝物筛查检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种组合物、含有该组合物的试剂及其应用。该冻干型APTT激活试剂，其能具有合适的肝素敏感系数、对异常临床样本检测重复性高、可用于狼疮抗凝物的筛查检测及其基本性能稳定期长等特点。本发明试剂适用于临床实验室常规APTT检测系统。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种组合物，包括硅藻土、磷脂、蔗糖、甘露醇、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(Chaps)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)和硫柳汞钠。

在本发明的一些具体实施方案中，所述磷脂为兔脑磷脂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物包括如下组分：

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物的pH值为7.35～7.45。

本发明还提供了所述的组合物在制备检测活化部分凝血活酶时间、监测肝素用药或检测狼疮抗凝物的试剂中的应用。

在上述研究的基础上，本发明还提供了试剂，包括所述的组合物及可接受的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂包括如下组分：

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂的pH值为7.35～7.45。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂为冻干制剂。

本发明还提供了所述试剂的制备方法，取所述组分与溶剂混合后真空干燥。作为优选，所述真空干燥的真空度为8～12Pa，所述真空干燥的温度为-35～25℃，所述真空干燥的时间为30～70h。作为优选，所述溶剂为水。

本发明还提供了所述的试剂在制备检测活化部分凝血活酶时间、监测肝素用药或检测狼疮抗凝物的试剂盒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，待测样本(待测成分的质量体积浓度为90％)与所述试剂制得的激活制剂(本发明提供的试剂的质量体积浓度为4.98％)的体积比为1:1。

在上述研究的基础上，本发明还提供了试剂盒，包括所述的组合物及可接受的助剂。

此外，本发明还提供了基于本发明提供的组合物、本发明提供的试剂或本发明提供的试剂盒检测活化部分凝血活酶时间的方法。

在本发明的一些具体实施方案中，所述检测活化部分凝血活酶时间的方法包括如下步骤：

制备待测样本溶液；

制备APTT激活试剂：取本发明提供的组合物或本发明提供的试剂或本发明提供的试剂盒中的所述组合物或试剂与水混合，静置。

取所述待测样本与所述APTT激活试剂按照1:1的体积比混合，于37℃预温180s，再与等体积的25mMCaCl₂试剂混合，检测。

本发明还提供了基于本发明提供的组合物、本发明提供的试剂或本发明提供的试剂盒监测肝素用药的方法。

在本发明的一些具体实施方案中，所述监测肝素用药的方法包括如下步骤：

制备待测样本溶液；

取所述待测样本溶液与所述APTT激活试剂按照1:1的体积比混合，于37℃预温180s，再与等体积的25mM CaCl₂试剂混合，检测。

本发明还提供了基于本发明提供的组合物、本发明提供的试剂或本发明提供的试剂盒检测狼疮抗凝物的方法。

在本发明的一些具体实施方案中，所述检测狼疮抗凝物的方法包括如下步骤：

制备待测样本溶液；

本发明提供了一种冻干型APTT激活试剂，其能具有合适的肝素敏感系数、对异常临床样本检测重复性高、可用于狼疮抗凝物的筛查检测及其基本性能稳定期长等特点。本发明试剂适用于临床实验室常规APTT检测系统。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明试剂与市售同类试剂复溶后冷藏稳定性相关曲线示意图；

图2示本发明试剂与市售同类试剂复溶后在机稳定性相关曲线示意图。

具体实施方式

本发明公开了组合物、含有该组合物的试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明旨在提供一种检测活化部分凝血活酶时间的冻干型激活试剂，其操作安全简便、稳定性佳、重复性好、准确度高，并能与行业内认可度高的进口试剂盒有较好一致性，从而在市场上进一步推广使用。

为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

一种检测活化部分凝血活酶时间的冻干型体外诊断试剂，所述试剂是由硅藻土、兔脑磷脂、蔗糖、甘露醇、Chaps、Hepes和硫柳汞钠组成。

本发明冻干试剂中各成分的推荐浓度为：

0.5％～10％(w/w)硅藻土，0.5％～1％磷脂，1％～6％(w/w)蔗糖，1％～5％(w/w)甘露醇，0.5‰～1‰(w/w)Chaps，0.2‰～2‰(w/w)Hepes，0.5‰～5‰(w/w)硫柳汞钠，pH为7.35～7.45，余量为水。

其中，该试剂最适工作浓度为：3％(w/w)硅藻土，0.8％磷脂，2.5％(w/w)蔗糖，3.5％(w/w)甘露醇，0.5‰(w/w)Chaps，0.3‰(w/w)Hepes，0.8‰(w/w)硫柳汞钠，余量为水。

本发明具备以下优点：

1、本发明通过分析活化部分凝血活酶时间检测原理，确定了合适的激活剂的配制方案，研制出可用于医院临床检测人血浆APTT的体外诊断试剂。

2、本发明试剂的肝素敏感系数适中，即肝素用药后APTT测试值控制在正常对照或肝素治疗前的1.67～2.23倍的范围内，该肝素敏感系数可控性好。

3、本发明试剂可用于狼疮抗凝物临床筛查。

4、本发明试剂对极度异常(八分之一稀释)临床样本的测试值准确度高、重复性好，保证了临床数据报告的一致性。

5、本发明中的APTT体外诊断试剂为冻干剂型，其临床检测性能良好，稳定期长。

综上，本发明试剂广泛适用于医院临床实验室常规检验用凝固法全自动凝血测试仪。其优点在于该试剂的肝素敏感系数(1.67-2.23)适中可控，有效地保证了临床肝素用药治疗监测的可靠性；该试剂对狼疮抗凝物响应较好，可用于临床狼疮抗凝物筛查检测；该试剂对极度异常临床样本的测试值准确度高、重复性好；该试剂储存时间长，复溶后的稳定性能好。因此，本发明为临床诊断治疗血栓与止血类疾病提供可靠的检测数据，有利于在市场上进一步推广使用。

本发明提供的组合物、含有该组合物的试剂及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明冻干试剂各成分浓度的不同实验组：

用质控血浆检测不同浓度配比下试剂对应的APTT值，每个浓度的试剂分别检测三次后取平均值，对比不同浓度配比下试剂的APTT基础值情况。相关实验数据如下表1所示：

表1本发明试剂各成分的浓度

表1结果表明，本实验提供的试剂中各成分的浓度分别为：0.5～10％硅藻土，0.5％～1％磷脂，1％～6％蔗糖，1％～5％甘露醇，0.5‰～1‰Chaps，0.2‰～2‰Hepes，0.5‰～5‰硫柳汞钠，pH为7.35～7.45，余量为水。

以上数据显示，本试剂最适工作浓度为：3％硅藻土，0.8％磷脂，2.5％蔗糖，3.5％甘露醇，0.5‰Chaps，0.3‰Hepes，0.8‰硫柳汞钠，试剂在此配比情况下，APTT基础值可以更好的落在质控血浆相应的APTT质控靶值范围(31.0～33.0)内。

实施例2本发明试剂的制备

准确称取3％硅藻土，0.8％磷脂，2.5％蔗糖，3.5％甘露醇，0.5‰Chaps，0.3‰Hepes，0.8‰硫柳汞钠，余量为水，混合。(其中，％为质量百分含量)。

取上述组分与水混合后于真空度为8Pa、温度为-35℃的条件下真空干燥12h，温度为0℃的条件下真空干燥7h，温度为25℃的条件下真空干燥9h。

用配制好的该试剂检测质控血浆相应的APTT值，其APTT值为32.5s,即落在了质控靶值范围(31.0～33.0)内，说明采用该配比关系的试剂可达到预期用途。

实施例3本发明试剂的制备

准确称取0.5％硅藻土，1％磷脂，1％蔗糖，5％甘露醇，1‰Chaps，0.25‰Hepes，5‰硫柳汞钠，余量为水，混合。(其中，％为质量百分含量)。

取上述组分与水混合后于真空度为12Pa、温度为-35℃的条件下真空干燥10h，温度为0℃的条件下真空干燥5h，温度为25℃的条件下真空干燥10h。

用配制好的该试剂检测质控血浆相应的APTT值，其APTT值为34.7s,即不能落在质控靶值范围(31.0～33.0)内，说明采用该配比关系的试剂不能达到预期用途。

实施例4本发明试剂的制备

准确称取10％硅藻土，0.5％磷脂，6％蔗糖，1％甘露醇，0.8‰Chaps，0.2‰Hepes，0.5‰硫柳汞钠，余量为水，混合。(其中，％为质量百分含量)。

取上述组分与水混合后于真空度为10Pa、温度为-35℃的条件下真空干燥12h，温度为0℃的条件下真空干燥8h，温度为25℃的条件下真空干燥10h。

用配制好的该试剂检测质控血浆相应的APTT值，其APTT值为29.2s,即不能落在质控靶值范围(31.0～33.0)内，说明采用该配比关系的试剂不能达到预期用途。

实施例5本发明试剂盒的使用方法

本发明试剂盒适用于凝固法全自动凝血测试仪，其具体使用方法为：

1、样品及试剂的准备：

(1)制备待测血浆样品：静脉采血，109mmol/L枸橼酸钠与全血按1:9比例混合均匀。以2500g离心15分钟，用塑料移液管取出血浆，血浆样品必须在4小时内进行测试。

(2)APTT激活试剂：每瓶试剂(实施例2制得)按瓶签标称量精确加入蒸馏水，轻轻混匀，放置10分钟平衡至室温后备用。

(3)如需配制参考血浆(或正常质控血浆、异常质控血浆)，请参照相关说明书操作方法。

3、表2为本发明试剂测试APTT的操作步骤

表2

分别取实施例3、实施例4制得的试剂按照上述制备方法制得相应的试剂盒。

实施例6本发明试剂与市售试剂肝素敏感系数比较实验：

本实验分组为市售试剂和本发明试剂(实施例2制得)组，每组随机选取5个试剂进行相关APTT检测，每个试剂重复检测两次，分别计算每组检测值均值及其取对数后的对应值，进而分别算出本发明试剂和市售试剂的肝素敏感系数，相关实验数据如下表3所示：

表3本发明试剂与市售试剂的肝素敏感系数

以上数据显示，市售试剂的肝素敏感系数是1.91～2.53，本发明试剂的肝素敏感系数是1.67～2.23。临床上在监测肝素用药情况时，通常将APTT值控制在正常对照或肝素治疗前的1.5-2.5倍的范围。上表数据说明，本发明试剂的肝素敏感系数适中，在肝素用药监测上具有更好的可控性。

分别取实施例3、实施例4制得的试剂进行上述试验，试验结果与实施例2制得的试剂无显著差异(P＞0.05)。

实施例7本发明试剂与市售同类试剂对狼疮抗凝物筛查的比较实验：

此实验将本发明试剂(实施例2制得)与市售同类试剂对狼疮抗凝物异常临床样本进行对比分析，评估了对应试剂体系对狼疮抗凝物的响应情况。本实验分为市售试剂组和本发明试剂组，分别对6个狼疮抗凝物异常临床样本进行相关APTT检测，每个样本重复检测两次，分别记录每组检测的均值，相关实验数据如下表4所示：

表4本发明试剂与市售同类试剂体系抗狼疮抗凝物干扰比较

以上实验数据显示，本发明试剂对临床上狼疮抗凝物异常样本的检测值较好，比市售同类试剂的检测值更接近于临床检测原值，说明本发明试剂体系对狼疮抗凝物的响应好，可用于临床狼疮抗凝物筛查检测。

实施例8本发明试剂与市售同类试剂对临床极度异常标本重复性的比较实验：

实验分为市售同类试剂组和本发明试剂(实施例2制得)组，进行了相应试剂体系对极度异常临床样本的重复性检测。实验将临床样本进行八分之一稀释，每组试剂重复检测10次，分别计算每组检测均值(AVE)和标准偏差(SD)，进而分别算出变异系数(CV)，评估市售试剂和本发明试剂对临床极度异常样本检测的重复性情况。同时利用Graphpad Prism5统计软件，采用one-way ANOVA和Newman-Keuls多重比较检验进行统计学分析，P<0.05时认为差异具有显著性。相关实验数据如下表5所示：

表5本发明试剂与市售同类试剂体系对极度异常临床样本的重复性检测

以上实验数据显示，本发明试剂APTT检测变异系数明显(***P<0.0001.)小于市售同类试剂的APTT检测变异系数，即本发明试剂对极度异常临床标本检测的重复性好于市售同类试剂检测的重复性，并达到行业标准要求(≤5％)。本发明试剂有利于检验报告输出，为临床诊断提供可靠的参考依据。

实施例9本发明试剂与市售同类试剂稳定性的比较实验：

本实验根据临床检测实际情况，测试了本发明试剂(实施例2制得)和市售试剂复溶后2℃～8℃冷藏稳定性及复溶后16℃在机稳定性，每个检测重复两次取平均值，模拟试剂复溶后处于冷藏储存及在机检测的情况，进而比较本发明试剂和市售同类试剂的稳定性能。企业标准要求试剂在监测期内的测试值偏差不超过±2s，可判定为合格。详细数据如表6及表7所示：

1、模拟试剂复溶后冷藏的稳定性情况：

表6试剂复溶后置于2℃～8℃/5天的APTT测试值

2、模拟试剂复溶后在机检测的稳定性情况：

表7试剂复溶后置于16℃/5天的APTT测试值

以上检测结果显示：本发明试剂在监测期内的检测结果均达到企业标准要求(APTT检测值前后不超过2.0s)，综合判定为合格，并且本发明试剂在复溶5天后的APTT检测值偏差小于市售试剂的APTT检测值偏差，即本发明试剂复溶后的稳定性优于市售同类试剂。本发明试剂复溶后放于2℃～8℃冷藏及在机16℃检测环境中，可稳定至少5d，试剂均为澄清透明的均匀混悬溶液。

综合以上分析，本发明研制的用于检测活化部分凝血活酶时间的冻干型激活试剂的基本性能达到行业标准要求，最大特点在于其肝素敏感系数适中可控、狼疮抗凝物响应好、对临床极度异常样本检测的重复性好、试剂稳定期长。本发明试剂盒可在市场上推广使用，为临床诊断治疗血栓与止血类疾病提供可靠的检测数据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.组合物，其特征在于，包括硅藻土、磷脂、蔗糖、甘露醇、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和硫柳汞钠。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括如下组分：

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括如下组分：

4.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，其pH值为7.35～7.45。

5.如权利要求1至3任一项所述的组合物在制备检测活化部分凝血活酶时间、监测肝素用药或检测狼疮抗凝物的试剂中的应用。

6.试剂，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的组合物及可接受的辅料。

7.如权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述试剂为冻干制剂。

8.如权利要求7所述的试剂的制备方法，其特征在于，取所述组分与溶剂混合后真空干燥。

9.如权利要求6所述的试剂在制备检测活化部分凝血活酶时间、监测肝素用药或检测狼疮抗凝物的试剂盒中的应用。

10.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的组合物及可接受的助剂。