KR20020042622A - 전혈내 응고 인자 활성을 측정하는 방법 - Google Patents

전혈내 응고 인자 활성을 측정하는 방법 Download PDF

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KR20020042622A
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코애귤레이션 다이어그노스틱스, 인크.
빙검 더글라스 에이.
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Abstract

본 발명은 프로응고제 또는 항응고제에 대한 저해제의 존재시 및 부재시 응고 시간을 측정하고 비교함으로써 환자의 혈액 샘플의 전체 응고 인자 성질을 신속하게 측정하는 방법에 관한 것이다. 샘플이 전혈일 경우, 얻어진 응고 시간은 혈액의 혈장 및 세포 성분의 전체 응고제 활성을 나타낸다. 이는 비정상 응고성에서 야기되는 질병의 존재 및 발병의 지표이다. 본 발명은 또한 전혈내 하나 이상의 프로응고제 또는 항응고제의 현재 수준을 기능적으로 측정함으로써 혈전성 질환의 발병에 대한 환자의 위험을 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 항응고제 요법의 효능을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 수행하는 키트를 또한 제공한다.

Description

전혈내 응고 인자 활성을 측정하는 방법{METHOD FOR MEASURING COAGULANT FACTOR ACTIVITY IN WHOLE BLOOD}
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 의학적 진단 및 질병 예방의 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 프로응고제(procoagulant) 또는 항응고제(anticoagalant)의 저해제중 적어도 하나의 존재시 및 부재 전혈 샘플을 사용하여 혈액 응고 속도를 측정함으로써 혈액의 응고 활성을 신속하게 측정하기 위한 진단 방법 및 시험 키트에 관한 것이다. 개체 혈액의 샘플중 응고 활성 및 샘플간 활성의 차이는 특정 병리 조건의 존재 또는 발전가능성에 대한 지표이다.
배경기술
너무 빨리 응고하는 혈액의 성향은 다수의 심각한 병리적 상태에서 발전, 진행 및 회복에 대한 중요한 예측인자이다. 이러한 질병은 응고 과정으로부터 직접 발생하거나 또는 응고 과정에 의하여 조절된다. 상기 질병의 예로서 심장마비, 발작, 관상동맥질환, 심부정맥혈전증 및 폐색전증 등이 있다. 이들 질병중, 관상동맥질환은 미국에서 주요 사망 원인이다.
또한, 일정한 임상 질환, 예를 들면 혈관질환, 수술, 외상, 악성종양, 인공혈관기구, 일반적 무감증, 임신, 경구피임약의 사용, 전신 홍반성 루푸스, 및 감염은 개체가 역응고 반응을 경험하게 한다. 종종, 응고 이상으로 인한 급성 질병을 앓는 환자를 응급실에서 볼 수 있다. 전혈 샘플에서 응고 형성에 대한 환자의 현재 위험을 신속하게 검출하는 방법은 혈전 현상 및 응고 질환을 고려하거나 고려하지 않는데 도움을 줄 수 있다. 또한 이러한 방법을 통하여 잠재적으로 치명적인 응고 질환으로 진행할 수 있는 환자를 초기 식별할 수 있으며, 응급 환자에게 응급 처치를 효과적으로 할 수 있다.
혈액은 또한 너무 느리게 응고하거나 전혀 응고하지 않을 수 있다. 이는 출혈 또는 기타 혈액 응고 질환을 야기할 수 있다. 혈우병은 유전성 혈액 질환의 예이다. 또한, 간 관련 질환, 예를 들면 알코올경변 및 급성 및 만성 간염은 다수의 응고 이상과 관련이 있다. 왜냐하면 이러한 기관은 응고 인자 다수를 합성하기 때문이다.
유전성 응고 질환으로 가장 잘 알려진 것은 제8 응고인자 및 제9 응고인자 각각의 활성 감소와 관련된 혈우병 A 및 B이다. 질환의 경중도는 각 응고 인자의 결핍 정도에 따라 달라진다. 심각한 경우 생애 초기에 발현되고, 혈우병을 가진 아이들은 통상 무릎과 같은 큰 관절에서 쉽게 출혈이 일어나며 응고 형성시 뚜렷한 결핍을 보여준다. 더 온화한 형태로 혈우병은 생애 후반까지 분명하지 않을 수 있다.
혈우병의 치료는 일반적으로 제8 응고인자 또는 제9 응고인자가 대량 존재하는 혈액 생성물의 농축물을 수혈하는 단계로 구성된다. 다수의 혈우병 환자는 상대적으로 정상적인 생활을 할 수 있지만, 운동 및 수술 또는 치과적 치료시 특별한 예방조치가 요구된다. 불행하게도, 혈우병을 가진 사람들 중 10 퍼센트가 제8 응고인자에 대한 항체가 발달되어 있어 치료하기 어렵다.
또한 혈액이 너무 신속하게 응고하는 질병(즉, 응고항진)도 병리적 질환이다. 파종성 혈관내 응고(DIC)는 병리적으로 신속한 혈액 응고를 특징으로 하는 후천성 응고 질환의 예이다.
혈액 응고는 다중 개시제, 활성화 인자의 캐스케이드, 효소 및 조절인자가 관여하는 복합적 과정으로서, 궁극적으로는 피브린의 형성을 야기하며 불용성 응괴로 중합화한다. 내인성 및 외인성 혈액 응고 경로는 예를 들면 Davie 등의 문헌[The Coagulation Cascade: Initiation, Maintenanace, and Regulation, Biochemistry, vol. 30(43):10363-70(1991), 본원에서 참고로 인용됨]에 기재되어 있다.
통상적으로, 혈액의 응고 성질은 혈장 또는 혈액 샘플이 불용성 피브린 가닥 또는 응괴를 형성하기에 필요한 시간을 측정함으로써 수동적 또는 자동적으로 결정된다. 예를 들면, 응괴 형성은 피브린 가닥의 형성을 관찰함으로써 시각적으로 또는 자동화된 방법에 의하여, 예를 들면 기계적 또는 전기적 저항에 의한, 밀도 측정 또는 광학적 검색에 의하여 측정할 수 있다.
응고 시간의 측정은 항응고제의 첨가없이 신선하게 추출된 혈액에 직접 행해질 것이다. 이외의 다른 방법으로서, 시트레이트와 같은 칼슘 이온-결합 항응고제를 함유하는 혈액을 사용할 수 있다. 이 경우, 응고 시간 측정은 항응고제의 영향을 상충하기 위하여 칼슘염을 첨가함으로써 개시한다. 상기 측정 방법은 재석회화 시간이라고 한다. 혈액 응고 시간을 측정하는 통상적 방법은 프로트롬빈 시간(PT)의 측정, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)의 측정, 트롬빈 시간의 측정, 및 피브리노겐 수준 테스트에 따라 달라지는 것을 포함한다. 혈전성 질환 발병의 검색은 순환계에서 가용성 피브린 또는 피브린 분해 생성물의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다.
응고 시간의 측정은 혈우병, 본 윌레브란드(Von Willebrand) 질병, 크리스마스(Christmas) 질병 및 특정 간질환과 같은 질병의 진단에 매우 통상적으로 사용된다. 여기서 비정상적으로 지연된 응고 시간은 통상 진단적 유용성을 갖는다. 비정상적으로 빠른 혈액 응고를 포함하는 다수의 심각한 질환이 존재하지만, 현재 측정 방법은 상기 대다수 비정상적으로 빠른 응고성 병리적 질환만을 식별하는데 진단학적으로 가치있을 정도로 민감한 것은 아니다.
PT 및 APTT 시험은 임상적으로 병리적 응고항진성 상태를 검색하는데 유용하지 않다. 일반적으로, 이러한 시험은 지연된 응고 시간을 갖는 상태, 즉, 응고저하(hypocoagulability) 상태를 검색하는데 사용된다. 이러한 시험은 변형된 응고 상태에 상당히 기여할 수 있는 활성화된 혈소판 및 단핵구를 포함하지 않는 혈장에서 통상 수행된다. 나아가, 상기 시험은 그 자체가 프로응고제이며, 각각 PT 및 APTT에 대한 혈장의 응고 시간을 약 6 분에서 약 10-13 초 및 25-39초로 저하시키는 시약을 샘플에 첨가하여 이용한다[연구소 테스트 핸드북, 4판, Lexi-Comp Inc., 1996, pp. 227(APTT) 및 262(PT)]. 단핵구와 같은 전혈의 세포 성분의 영향을 배제함으로써, 상기 인기있는 혈장에 기초한 응고 시간 측정 방법은 혈액의 세포 성분에 의하여 조절되는 혈전성 질환 발병에 대한 최대 예측지 및 진단치를 충분히 제공하지 못한다.
또한, 헤파린 및 와파린과 같은 항응고제 요법의 모니터는 혈장 단독보다는 전혈의 응고성을 측정하면 향상될 것이다. 이러한 치료적으로 투여된 항응고제의 존재는 세포성 및 가용성(혈장) 혈액 구성분을 통하여 응고성을 조절한다.
혈액 응고 과정에서 다수의 중요한 개시인자 및 조절인자가 전혈내에 존재한다. 상기 한 분자는 제3 응고인자로 알려진 조직 인자로 불리는 프로응고제 단백질이다. 이것은 단핵구로서 알려진 순환성 세포의 표면위에 존재하는 경막 당단백질이다. 또한 조직 인자는 혈액 혈장내 인지질 비히클에서 발견된다. 순환성 조직 인자의 수준 상승은 다수의 혈전성 질환 및 병리적 상태와 연결되어 있다. 예를 들면, 조직 인자는 암, 감염 및 심장 마비 및 발작과 같은 혈전성 질환을 가진 환자의 혈장내 비히클 및 순환성 세포상에서 발견된다. 전혈내 조직 인자 활성의 수준은 혈전성 질환 발병 위험이 있는 환자를 식별하기 위한 진단학적으로 유용한 매개변수이다.
조직 인자(TF)는 혈장 응고 인자, 제7 응고인자 또는 이것의 활성형, 제7a 응고인자와의 활성 복합체를 형성해야 한다. 이어서 TF:제7a 응고인자 복합체는 지모겐 제9 응고인자 및 제10 응고인자를 이들의 효소적 활성형 제9a 응고인자 및제10a 응고인자로 각각 활성화시킨다. 제10a 응고인자는 제5a 응고인자와 결합하여 프로트롬비나아제 복합체(활성 프로응고제)를 생산하며, 이어서 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단한다. 이어서, 트롬빈은 피브리노겐을 절단하여 피브린을 생성하고, 이것은 응괴를 형성한다.
조직 인자를 직접적으로 측정하는 방법이 기술되어 있다. 면역분석 과정[미국 특허 5,403,716 에 기술]에 더하여, 전혈을 엔도톡신에 노출시키면 수시간내에 TF 수준의 측정이 가능하다[참조: 미국 특허 4,814,247, Spillert 및 Lazaro, 1993, J. Nat. Med. Assoc 85:611-616]. 엔도톡신을 사용하는 방법에서, 변형된 재석회화 시간은 혈액 샘플에 대하여 측정한다. 이러한 측정은 엔도톡신 또는 기타 면역조절제가 질환 또는 외상을 모방하는 상태를 창조하는 경우에 존재하는 조직 인자 발현을 나타내며, 따라서, 이러한 상태를 경험하는 경우 환자의 응괴 성향을 측정한다. 본 발명은 전혈내 순환성 조직 인자 활성의 현재 실제치를 측정하여 환자의 현재 응괴 형성 위험을 측정하는 단순한 방법을 제공함으로써 조직 인자의 또다른 중요한 산정 방법을 제공한다.
예를 들면, Snoclot 응고 및 혈소판 기능 분석기(시엔코, 휘트 리지, CO)를 사용하여 피브린 형성을 측정할 수 있다. 상기 분석기는 전혈내 침지된 일회용 진동 탐침을 사용하여 피브린 가닥의 점성 끌림(drag)을 측정한다. 또다른 방법으로, HEMOCHRONTM시스템(인터내셔널 테크니딘 코프.)을 사용할 수 있다. 상기 시스템은 시험관내 정밀 배열된 자석 및 기구내 배치된 자기 탐색기를 사용하여 응괴 형성을검색한다.
현재, 조직 인자(TF) 또는 조직 인자 경로 저해인자(TFPI) 기능 활성을 측정하기 위한 표준 임상 분석은 존재하지 않는다. 그러나, 연구소 설비에서 특정 프로응고제 또는 항응고제의 활성을 측정하는 분석은 존재한다. 예컨대, 혈장내 존재하는 제12 응고인자 활성의 백분율은 혈장을 제12 응고인자가 상당히 결핍된 혈장에 첨가하는 경우 획득되는 보정의 정도에 의하여 측정할 수 있다. 이러한 분석은 APTT 시험의 변형이며, 제12 응고인자를 1% 미만 함유하는 혈장의 APTT를 "보정"하는 환자의 혈장 능력을 측정한다. 환자의 혈장을 희석함으로써 달성되는 보정의 양은 인자 XII의 공지 농도에 의하여 획득되는 보정에 비교된다. 정상 혈장은 100% 보정을 나타내는 것으로 생각된다.
또한, 혈장에 존재하는 트롬빈(제2 응고인자) 활성의 백분율은 제2 응고인자가 상당히 결핍된 혈장에 상기 혈장을 첨가하는 경우에 획득되는 보정의 정도에 의하여 측정된다. 상기 분석은 프로트롬빈 시간 시험의 변형이며, 제2 응고인자를 1% 이하 함유하는 혈장의 PT를 "보정"하는 환자의 혈장 능력을 측정한다. 환자의 혈장을 희석함으로써 달성되는 보정의 양은 제2 응고인자의 공지 농도에 의하여 획득되는 보정과 비교된다. 정상 혈장은 100% 보정을 나타내는 것으로 생각된다. 그러나, 논의되는 유형의 최근 응집 인자 분석은 응고저하 질환(즉, 병리적으로 느린 혈액 응고)을 검색하는 임상적 설비에서만 유용하다.
F1.2 프로트롬빈 단편, D-이량체, 가용성 피브린 및 트롬빈/항트롬빈 III 복합체와 같은 혈액 응고 캐스케이드 활성화의 일부 마커에 대한 면역분석법이 존재한다. 일반적으로, 이러한 응고 면역분석법은 상기 키트가 느리고 상대적으로 노동집약적인 ELISA 방법을 포함하기 때문에 연구 설비 이외에서 제한적으로 수용된다.
따라서, 프로응고제 또는 항응고제가 응고에 미치는 특정한 영향의 기여적 영향뿐 아니라 생체내 혈액 응고의 위험과 상관관계가 있는 혈액의 전체 응고성의 신속하고 단순한 시험관내 측정 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 이것은 건강 전문가에게 하기를 위해 진단적 및 임상적으로 유용한 데이타를 제공하게 된다: (1) 환자의 상태를 측정; (2) 요법의 적절한 방법 선택; 및 (3) 외과적 및 비외과적 요법의 속도 및 효능의 모니터. 조직 인자 및 기타 프로응고제 및 항응고제의 기여를 특이적으로 측정하는 전혈 응고성의 신속한 측정 방법은 기존에는 용이하지 않았다. 프로응고제 및 항응고제의 수준 상승을 측정함으로써 조기 요법이 가능하게 되고 따라서 예후를 향상시킬 수 있다. 현재, 이러한 응고항진 상태 또는 응고저하 상태를 정확히 측정하는 전혈 응고 분석은 존재하지 않는다. 본 방법은 프로응고제 또는 항응고제 활성에 대한 하나 이상의 저해제의 존재 및 부재시 환자의 전혈 응고 시간을 비교함으로써 응고항진 상태 또는 응고저하 상태를 측정한다.
본 발명은 국립 건강 기구가 수여한 인가 번호 HL 48872로 정부 보조를 받았다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
도1은 전혈내 피브린 응고 형성의 개시중 단핵구 TF의 중심 역할을 보여주는 그림이다. TF:제7a 응고인자 복합체는 제10 응고인자를 제10a 응고인자로 또한 제9 응고인자를 제9a 응고인자로 활성화시킨다. 트롬빈(제2 응고인자)은 혈소판을 활성화시킨다. 상기 혈소판은 프로트롬비나제 복합체(10a:5a)에 대한 트롬빈 생성 표면을 형성한다. 피브리노겐은 절단되어 피브린 응괴를 생성한다. 이러한 그림은 Kjalke 등의 문헌[Active site-inactivated 인자s VIIa, Xa 및 IXa inhibit individual steps in a cell-based model of tissue 인자-initicated coagulation,Thromb. Haemost., 80:578-84 (1998)]으로부터 응용하였다.
도2는 37 ℃에서 항온처리 10분후 항-TF 항체의 존재 및 부재시 응고 시간의 비교를 통하여 전혈내 외부적으로 첨가된 TF의 검출을 보여준다.
도3은 재석회화된 전혈 응고 시간에 대한 항-TF 항체의 영향을 나타낸다. 37℃에서 2시간동안 LPS(10 μg/mL)로 전혈을 항온처리하면 TF 발현의 유도에 기인한 응고 시간을 단축시킬 수 있었다. 항-TF 항체의 첨가는 재석회화된 전혈 응고 시간중 LPS-매개된 감소를 차단하였다. 반대로, 비-저해성 대조 항체의 첨가는 LPS 응고 시간에 영향을 미치지 않는다.
도4는 재조합체 TF가 재석회화된 전혈 응고 시간에 미치는 영향을 나타낸다.전혈에 첨가된 TF 지질화 재조합체는 0 내지 80 pg/mL 범위에 걸쳐 용량-의존적 방식으로 재석회화된 전혈 응고 시간을 단축시켰다(평균 ±95% 평균 신뢰도, n=11 각 포이트에서 복제).
도5a는 혈액에서 분리되고 다양한 혈장과 혼합된 세포에 대한 응고 시간을 나타낸다.
도5b는 10분동안 37℃에서 항온처리하기 이전에 혈액에 첨가된 저해성 항-제11 응고인자 항체(100 ug/mL)의 효과를 나타낸다(평균±표준편차, n=3). 항-제11a 응고인자 항체의 첨가는 응고 시간을 지연시켰다. 반대로, 상응하는 양의 대조 항체의 첨가는 응고 시간에 영향을 미치지 않는다.
도5c는 LPS 자극의 존재 및 부재시 2시간동안 37 ℃에서 항온처리하기 이전에 혈액에 첨가된 콘 트립신 저해인자(CTI)(32 ug/ml)의 효과를 나타낸다(평균±표준편차, n=3).
도6a는 LPS-자극된 혈액의 응고 시간에 미치는 비분획화된 헤파린(0-0.1 U/mL)의 영향을 나타낸다.
도6b는 LPS-자극된 혈액의 응고시간에 미치는 저분자량 헤파린(LMWH; 0-0.25 U/mL)의 영향을 나타낸다.
도6c는 LPS-자극된 혈액의 응고 시간에 미치는 히루딘(0-0.1 U/ml)의 영향을 나타낸다.
도7은 불안정형 협심증를 가진 환자(n=8)와 건강한 정상인(n=37)의 재석회화된 전혈 응고 시간을 비교한다. 원은 응고 시간의 5번째 백분위수 및 95번째 백분위수 이외의 개체를 나타낸다.
본 발명의 요약
본 발명은 프로응고제 또는 항응고제의 저해제의 첨가 및 비첨가시 응고 시간을 측정하고 비교함으로써 환자의 혈액 샘플의 전체 응고인자 성질을 신속하게 측정하는 방법을 제공한다. 샘플이 전혈인 경우, 얻어진 응고 시간은 혈액의 혈장 및 세포 성분의 전체 응고인자 활성을 나타낸다. 이것은 비정상적 응고성으로부터야기되는 병리의 존재 및 발병에 대한 지표이다.
본 발명의 제1 목적은 전혈내 하나 또는 그 이상의 프로응고제 또는 항응고제의 현재 수준을 기능적으로 측정함으로써 혈전성 질환 발병에 대한 환자의 위험을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2 목적은 먼저 전혈 샘플을 저해제에 노출시킨 후 표준 방법에 의하여 전혈 샘플의 응고 시간을 측정함으로써 전혈 샘플내 응고인자 활성을 측정함으로써, 와파린 또는 저분자량 헤파린과 같은 항응고제 효법의 효능을 측정하는 방법을 제공하는 것이다. 응고 시간의 값 또는 대조구 값과 저해제-처리된 샘플의 값간의 차이는 항응고 요법을 모니터하는데 유용하다.
본 발명의 제3 목적은 본원에서 개시된 방법에 따라 혈액의 응고를 모니터함으로써 역 혈액 응고와 관련된 질환으로부터 환자의 회복을 모니터하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제4 목적은 프로응고제 또는 항응고제에 대한 적어도 하나의 저해제의 존재시 및 부재시에 전혈 및 혈장의 응고 시간을 측정하는 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기와 같은 목적은 다음의 상세한 설명에 의하여 더 잘 설명될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
비정상적 혈액 응고성은 다양한 질병을 유발한다. 특히, 혈액의 응고성 또는 프로트롬빈성을 증가시키는 인자는 대부분 매우 바람직하지 않으며, 이는 심장마비, 발작, 관상동맥질환, 심부정맥혈전증 및 폐색혈증을 야기할 수 있다. 또한, 혈관 질환, 수술, 외상, 악성종양, 인공혈관기구, 일반적 무감증, 임신, 경구피임약의 사용, 전신 홍반성 루푸스 및 감염과 같은 특정한 임상적 질환은 환자가 역 응고 현상을 경험하게 만든다. 이러한 질환은 혈액의 응고 상태를 변형시켜, 보호적 항응고제 경로에 비하여 프로트롬빈 경로를 우세하고 강화시킨다.
혈액의 전체 응고성은 세포 부분에 의하여 제공되는 인자뿐 아니라 혈액의 가용성(혈장) 부분에 의하여 제공되는 인자에 의하여 조정된다. 그중 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성 부분 프로트롬빈 시간(APTT)과 같은 혈액 응고성 또는 응고를 측정하는 통상적 방법은 일반적으로 혈액 응고성을 측정하기 위하여 혈장을 사용한다. 그러나, 이러한 혈장-기초한 방법은 세포성 성분에 의하여 제공되는 혈액 응고성에 대한 기여를 생략한다. 한 예로 혈액 응고성에 대한 조직 인자의 기여가 있다. 상술한 바와 같이, 조직 인자는 혈액 응고의 개시인자 및 조절인자이며, 혈액내 존재한다. 농도의 상승은 병리적 상태와 관련된다. 조직 인자에 더하여, 혈액의 세포 성분중 또는 성분상에 존재하는 기타 성분은 혈액 응고성을 조절할 수 있으며 또한 생체내 혈액 응고 성향에 기여한다.
한 구체예로서, 본 발명의 방법은 프로응고제 또는 항응고제의 저해제의 존재 및 부재시에 전혈 응고를 측정하는 단계를 포함한다. 저해제의 존재와 부재시 응고 시간의 차이의 크기는 샘플내 존재하는 프로응고제 또는 항응고제의 양에 비례한다. 즉, 차이가 클수록 더 많은 양의 인자가 측정된다. 응고 시간의 차이뿐 아니라, 절대적 응고 시간도 중요하다. 왜냐하면 환자가 프로응고제 수준 상승 이외의 비정상성에 기인하여 응고항진성일 수 있기 때문이다.
조직 인자의 저해제로 본 발명의 분석을 수행하는 경우, 상술된 변형된 재석회화 시간 시험과는 반대로, 본 발명의 방법은 혈액 응고성에 미치는 조직 인자 합성의 효과를 측정하지 않는다. Spillert 및 Lazaro의 문헌에 기술된 바와 같이, 상기 변형된 재석회화 시간 시험은 전혈 샘플과 항온처리한 엔도톡신은 혈액 샘플의 응고인자 성질에 교대로 영향을 주는 조직 인자의 합성을 유도한다. 대신, 본 발명은 혈액 응고성에 미치는 전혈 샘플에 존재하는 기존의 조직 인자의 영향을 측정한다[예, Santucci 등, Measurement of Tissue 인자 Activity in Whole Blood, Thromb. Haemost., vol. 83(3): 445-54(2000), 본원에서 참고로 인용].
본 발명의 방법은 신선한 전혈을 가지고 수행할 수 있다. 여기에 저해제를 첨가한 후 표준 방법에 의하여 저해제 부재의 샘플 및 혈액 샘플의 응고성을 측정하다.
또다른 방법으로서, 혈액 샘플은 항응고제, 예를 들면 시트레이트, 옥살레이트, EDTA 등의 존재시 수집될 수 있다. 이것은 응괴 형성의 내인성 경로를 차단하는 항응고제를 포함하지 않는다. 즉, 항응고제는 외인적 또는 통상적 경로를 차단할 것이다. 후속적으로, 저해제를 첨가하고 이후 혈액의 응고성은 표준 방법에 의하여 측정할 수 있다. 혈액 응고성을 측정하기 위한 임의의 공지 방법은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
혈액을 항응고제와 함께 수집하는 경우에, 혈액 샘플내 항응고제의 영향은 혈액 응고성 또는 응고 시간을 측정하는 시간에 바뀌어져야 한다. 이것은 염화칼슘과 같은 칼슘염의 첨가에 의하여 이루어진다. 응고 과정을 재활성화하기 위한 칼슘염의 첨가에 의하여 항응고화된 혈액의 샘플에서 응고 시간의 측정은 재석회화 시간으로 명명한다.
프로응고제 또는 항응고제의 임의의 저해제는 특정 프로응고제 또는 항응고제에 특이적인 한, 본 발명의 용도에 적합하다. 적절한 저해제는 다른 것 중에서 프로응고제 또는 항응고제에 대한 기질의 항체 또는 유사체를 포함한다. 한 바람직한 양태로서, 유사체는 펩티드이다. 적절한 저해제는 당업자에게 공지되어 있으며 상업적 원료로서 시판된다.
바람직한 구체예로서, 저해성 항체 또는 조직 인자에 대한 충분한 친화성을 나타내는 항체의 복합물은 TF:제7a 응고인자 복합체의 저해제로서 사용될 수 있다. 한 구체예로서, VD10 및 VIC12로 표시되는 2개 항체는 배합하여 사용할 수 있다. 시약내 항체 또는 항체 배합물의 농도는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 적절한 최종 농도를 제공하기 위하여 혈액 샘플에 용이하게 첨가될 수 있도록 제공한다. 또다른 구체예로서, 제7ai 응고인자의 저해제는 제7a 응고인자의 효소적 불활성형이다.
본 발명의 방법에 의한 응고 시간의 측정은 특정의 추가적 화합물의 존재하에서 수행될 수도 있다. 이는 혈전증과 관련된 특정 질환의 식별 및 모니터시 진단적 및 임상적 유용성을 위하여 유용한 정보를 제공한다. 호모시스테인, 조직 인자, 러셀 바이퍼 베놈 및 기타 프로응고제 베놈과 같은 화합물이 고려된다. 본 발명에 유용한 것으로 생각되는 응고 과정의 기타 조절인자는 트롬빈, 혈소판 활성 인자,피브리노겐, 카올린, 셀라이트, 아데노신 디포스페이트, 아라키돈산, 콜라겐 및 리스토세틴과 같은 프로응고제를 포함한다. 본 발명의 응고 과정의 조절제로서 유용한 항응고제 활성을 가진 인자는 프로틴 C, 프로틴 S, 항트롬빈 III, 트롬보모듈린, 조직 플라스미노겐 활성인자, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, 조직 인자 경로 저해제 및 본 윌레브랜드 인자를 포함한다. 혈액의 응고인자 활성을 조절할 수 있는 치료적 약물의 추가는 본 발명에서 조절인자로 사용될 수 있다. 또한, 암 세포 추출물 및 양막 유체는 조절제로 작용할 수 있다.
본 발명은 응고를 측정하는 임의의 특정 방법으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 혈액 응고를 측정하는 다수의 임의적 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 수동, 반자동 및 자동 방법, 및 이들에 상응하는 기구 및 장치를 포함한다. 이러한 목적에 적절한 기구는 예컨대 응괴의 개시에 의하여 야기되는 기계적 저항을 측정하는 모든 기계를 포함한다. 응고 시간에 영향을 주거나 응고를 개시하는 시약은 다양한 형태로 제시되며, 용액, 동결건조형 또는 공기건조형 또는 건조 카드 포맷을 포함하나 이것에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 시엔코, 인크.에서 시판되는 SONOCLOTTM응고 분석기는 시험되는 샘플의 기계적 저항의 작용으로서 점탄성(viscoelastic property)을 측정한다. 이러한 분석기는 피브린 형성에 매우 민감하므로, 감수성 및 재생성이 향상된 결과를 제공한다.
또다른 기계로서, 트롬보엘라스토그래프(TEG)는 또한 점탄성을 측정하는데사용될 수 있다. 이러한 유형의 기계의 예는 헤모스코프 코프.에서 시판하는 컴퓨터화된 트롬브엘라스토그래프(CTEG)이다. SONOCLOTTM및 CTEG는 혈액 점성 또는 탄성 각각의 변화를 측정함으로써 응고 과정의 변화를 기록할 수 있다. 전체 과정의 완전한 그래프를 얻는다.
HEMOCHRONTM과 같은 기타 기계는 응고 시간을 측정하지만 시간 함수로서 응고 매개변수에서 변형 그래프를 제공하지는 않는다. HEMOCHRONTM시스템(인터내셔널 테크니딘 코프.)은 시험관내에 정밀 배열된 자석 및 기계내 위치한 자기 검색기를 사용하여 응고 형성을 검색한다.
본 발명의 한 구체예로서, 분석이 응급시 수행되는 경우, 예컨대 응급실에서 심장마비나 발작과 같은 급성 혈전성 질환을 가진 것으로 의심되는 환자에 있어서, 항응고제를 사용할 필요가 없이 신선한 혈액 샘플내에서 직접 분석을 수행할 수 있다. 항체와 같이 필요한 시약은 응고 분석기내에 미리 장전하고 항체의 첨가없는 대조 샘플의 것과 함께 응고 시간을 측정한다. 이와는 다른 방법으로서, 혈액은 칼슘 이온과 결합하는 항응고제, 예를 들면 시트레이트, 옥살레이트, EDTA 등과 함께 먼저 수집하고, 이후 통상적 실험실 조건하에서 응고 시간을 측정한다. 상기 항응고제중 하나 이상을 포함하는 샘플내 응고를 개시하기 위하여, 칼슘염을 첨가해야 한다. 이 경우 피브린 중합체의 형성에 필요한 시간은 재석회화 시간으로서 명명한다. 본 발명의 또다른 구체예로서, 프로응고제 또는 항응고제의 검색시 감수성 및 특이성의 향상은 혈액 수집이 내인성 접촉 활성 응고 경로의 특이적 저해제(예, 콘트립신 저해제)의 존재시 수행되는 경우에 일어난다.
항응고화된 혈액에 대한 분석 수행의 실시예로서, 시트레이트화 혈액의 1 mL는 저해성 모노클로날 항-조직 인자 항체(최종 농도 10 mg/mL)와 결합된다. 시트레이트화 혈액의 또다른 분획 1 mL는 대조 항체 또는 단백질 대조구로 제조된다. 샘플을 혼합한 후에, 37 ℃ 항온배양기내에 방치한다. 기지의 항온처리 시간후, 각 샘플 300 ul를 0.1 M 염화칼슘 40 ul와 혼합하고, 재석회화 시간(피브린 형성에 필요한 시간)을 자동화된 기계를 사용하여 측정한다. 대조구 대 저해제(항체)를 포함한 샘플의 재석회화 시간 간의 차이는 진단학적으로 사용되어, 환자가 조직 인자의 상승에 (의학적 매개에) 기인한 비정상 혈액 응고성을 갖는지 여부 및 의학적 관여의 필요성을 표시한다.
본 발명의 또다른 구체예로서, 시험 키트는 본 발명의 방법에 따라 응고시간 또는 재석회화 시간을 측정하기 위하여 적절한 농도에서 저해제가 제공되어 응고성을 측정하는 시험 키트를 제공한다.
제3 응고인자로 알려진 조직 인자(TF)는 외인성 응고 경로를 개시하는 역할을 한다. 조직 인자는 순환하는 혈액의 단핵구에 주로 존재한다. 특정 질환 상태는 개체의 단핵구를 미리 노출시켜 조직 인자가 주어지도록 할 것이다. 따라서 비정상적으로 빠른 전혈 응고 시간을 갖는다. 상기 환자는 혈전증 또는 기타 발병의 위험이 있을 것이다.
현재 이러한 응고항진 질환을 정확히 측정하는 방법은 없다. 본 발명은 항-TF 항체의 존재 및 부재시 비자극된 응고 시간의 비교를 통하여 순환하는 TF 수준을 측정함으로써 응고항진을 평가하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 또다른 형태로, 항 TF 항체의 존재 및 부재시 환자의 LPS-자극된 전혈 응고 시간을 비교함으로써 응고항진에 대한 생리적 가능성을 측정할 수 있다.
실시예 1
본 실시예에 기술된 조직 인자 전혈 분석은 헤모크론 기구에서 수행되는 시험과정을 포함한다. 이는 항-TF 항체 저해 시험을 사용하여 전혈내 순환하는 내인성 조직 인자 수준을 측정한다.
혈액 순환에서 TF 를 측정하는데 필요한 재료 및 시약
헤모크론 P213 샘플 튜브
0.01 M 염화칼슘 스톡 용액
비-저해성 항체를 함유하는 대조 시약 바이알
건조 항-조직 인자 항체를 함유하는 시약 바이알
분석 품질 조절 시약
헤모리안스 레콤비플라스틴 스톡 용액(Hemoliance RecombiPlasTin Stock Solution; 지질화된 재조합체 조직 인자)
TF 희석 용액(20 mM HEPES 150 mM 염화나트륨, 0.10mg/mL 소혈청 알부민 함유 PH7.4)
지질 시트레이트 항응고제 및 콘 트립신 저해제 (CTI) 함유 혈액 수집관
헤모크론 P213 튜브 제조
비자극화된 응고 시간 시험을 수행하기 전에, 0.10 M 염화칼슘 용액 50 ul로 헤모크론 P213 튜브를 미리 장전한다. 마개를 닫고서 실온에서 튜브를 저장한다.
비자극 전혈 응고 시간을 위한 품질 조절 샘플 제조
음성 대조구 = TF 희석용액
고도의 양성 TF 대조구:
지질화된 재조합체 TF 스톡 용액을 1:100 으로 희석한다. 즉, 지질화된 재조합체 TF 스톡 용액 10 uL를 TF 희석용액 0.99 mL에 첨가한다.
저도의 양성 TF 대조구:
고도의 양성 TF 대조구 용액을 1:7로 희석한다. 즉, 고도의 양성 TF 대조구 100 uL를 TF 희석용액 0.60 mL에 첨가한다.
채혈
처음 수 mL의 채혈을 버린후, 5 mL 시트레이트/CTI 혈액 수집관에 혈액을 채취한다. 혈액은 채혈 4 시간내에 분석해야 한다.
순환성 TF에 대한 비자극화된 응고 시간(10 분 항온처리)
비자극된 응고 시간 시험을 위하여 8개의 시험 바이알당 하나의 시트레이트/CTI 혈액 수집관을 구비한다.
다음에 기재된 4개 시험 바이알내 음성 또는 양성 TF 대조 시약 10 ul를 넣었다:
대조 바이알 + 음성 TF 대조구
항-TF 항체 바이알 + 음성 TF 대조구
대조구 바이알 + 양성 TF 대조구
항-TF 바이알 + 양성 TF 대조구
각 시험 바이알에 0.50 ml의 시트레이트/CTI 항응고된 혈액을 이전한다. 관을 부드럽게 수회 역위하면서 수회 혼합한다.
10분동안 37℃수조에 방치한다.
10분간 항온처리를 완료한후, 혈액 0.40 ml를 각 시험 바이알로부터 50 ul 염화칼슘을 함유하는 헤모크론 P213 샘플 관에 옮긴다.
헤모크론 8000에서, 시험="ACT" 및 튜브="P214/5"를 선택한다. "시작"을 눌러서 응괴 타이머를 작동시킨다. 헤모크론 관을 부드럽게 돌려서 염화칼슘 용액과 혈액을 혼합한다. 헤모크론 샘플 웰내에 튜브를 놓는다. 녹색광에 불이 켜질때까지 샘플 웰에서 튜브를 회전한다.
통상적 비자극된 응고 시간
대조구 바이알 + 음성 TF 대조구: > 850 초
TF 항체 바이알 + 음성 TF 대조구: >850 초
대조구 바이알 + 고도의 양성 TF 대조구: 250 내지 350 초
대조구 바이알 + 저도의 양성 TF 대조구 : 650 내지 750 초
TF 항체 바이알 + 저도 또는 고도의 양성 대조구: > 850 초
응고항진을 측정하기 위한 순환성 TF의 검색에서 본 발명의 용도를 예시하기 위하여, 도2는 37℃에서 10분간 항온처리후 항-TF 항체의 존재 및 부재에서 응고 시간의 비교를 통하여 전혈내 외부에서 첨가된 TF의 검색을 보여준다.
실시예 2
이 실시예는 엔도톡신(리포폴리사카라이드) 자극에 대한 반응으로 전혈내 TF의 생성을 측정하는 헤모크론 기계에서 리포폴리사카라이드-자극 시험 방법을 설명한다.
LPS 자극에 대한 반응에서 전혈내 TF의 생성을 측정하는데 필요한 재료 및 시약
헤모크론 P213 샘플 튜브
0.10 M의 염화칼슘 스톡 용액
건조 LPS를 함유하는 시약 바이알
건조 LPS 및 건조 항-조직 인자 항체를 함유하는 시약 바이알
액체 시트레이트 항응고제 및 콘 트립신 저해제(CTI)를 함유하는 혈액 수집관
헤모크론 P213 튜브 제조
자극된 조직 인자 응고 시간 시험을 수행하기 전에, 0.10 M의 염화칼슘용액 50 uL를 헤모크론 P213 튜브에 미리-장전한다. 마개를 닫은채로 튜브를 실온에서 저장한다.
채혈
수 ml의 채혈을 버린후, 혈액을 키트에 구비된 5 ml 시트레이트/CTI 혈액 수집관에 넣는다. 채혈후 4 시간내에 혈액을 분석해야 한다.
LPS-자극된 응고 시간 시험(2 시간 항온처리)
시트레이트/CTI 항응고된 표본 혈액 0.50 ml를 다음에 제시된 각 시험 바이알에 이전한다:
건조 LPS 및 대조 시약을 함유한 바이알
건조 LPS 및 건조 항-TF 항체를 함유하는 바이알
시험 바이알을 부드럽게 수회 역위시켜 표본을 혼합한다. 37도 수조에 2시간동안 넣는다.
2시간 항온처리를 완료한 후, 튜브를 부드럽게 역위시켜 시험 바이알을 혼합한다. 혈액 0.40 ml를 각 시험 바이알에서 50 ul 염화칼슘을 함유한 헤모크론 P213 샘플 튜브로 이전한다.
헤모크론 8000에서, 시험="ACT" 및 튜브="P214/5"를 선택한다. "시작"을 눌러서 응괴 타이머를 작동시킨다. 헤모크론 관을 부드럽게 돌린다. 헤모크론 상에 놓는다. 녹색광에 불이 켜질때까지 샘플 웰에서 튜브를 회전한다.
2시간 LPS 자극후의 통상적 응고 시간
LPS 바이알: 200 내지 350 초
항-TF 항체 바이알을 갖는 LPS: > 850 초
실시예 3
이 실시예에 기재된 조직 인자 전혈 분석은 SonoclotTM기계에서 수행된 시험 방법을 포함한다. 이것은 항-TF 항체 저해 시험을 이용하여 LPS-자극된 전혈내 조직 인자 수준을 평가한다.
표본 요건
19 mm 게이지 바늘을 사용하여, 문헌[참조예; Collection, Transport andProcessing of Blood Specimens for Coagulation Testing and Performance of Coagulation Assays, National Committee for Clinical Laboratory Standards document #H21-A-2, Volume XI, No. 23]에 자세히 기재된 정맥절개술을 수행한다. 먼저 디스카드 튜브(블루-탑 바큐테이너)를 수집하고, 50 ug/ml 콘 트립신 저해제(CTI) 및 0.5 ml 3.2 % 소디움 시트레이트를 함유하는 플라스틱 바큐테이너 튜브에 넣어서 실제 시험 표본으로서 사용한다. 바큐테이너 튜브는 혈액 4.5 ml 이상을 함유해야 한다. 함유하지 않으면 시험이 수행되지 않는다. 표본 수집동안 혈액이 양호하게 유동되지 못한다면 표본을 버리고 환자의 다른 팔에서 또다른 정맥천자를 시도한다. 채혈후 바큐테이너를 5-7회 부드럽게 역위시킨다. 주의: 표본은 수집후 실온에서 보관해야 한다.
시약 제조 및 저장
1. 뚜껑이 있는 바이알(2.0-ml 폴리프로필렌) 및 시엔코에서 제공하는 동결건조된 시약. 바이알은 이들의 뚜껑을 색상으로 코드화한다: 투명 뚜껑(대조구 mAb ), 백색 삽입(TF mAb 칵테일), 황색 삽입(무시약) 또는 청색 삽입(0.5 mg/ml의 동결건조된 Difco 엔도톡신 20 마이크로리터 함유). 각 환자 샘플은 각 색상당 하나인 4개 튜브를 필요로 할 것이다. 2-8℃에서 저장한다.
2. 염화칼슘 0.1 M(Anylytical Control Systems, Inc., Fishers, Ind.). 2-8℃에서 저장한다.
1. 트리스 완충된 식염수(pH 7.4) 1 mg/ml BSA 중 항-오스테오칼신 모노클로날 항체. 2-8℃에서 저장한다.
2. 트리스 완충된 식염수(pH 7.4) 1 mg/ml BSA 중 조직 인자 모노클로날 항체. 2-8℃에서 저장한다.
필요한 기구
1. SonoclotTM분석기
2. 지시 안내책
3. 시엔코에서 제공되는 큐베트. 각 환자 샘플에 대하여, 5개의 큐베트가 필요하다(4개는 혈액 샘플을 보관하고, 하나는 염화칼슘을 가온하기 위한 것).
4. 시엔코에서 제공되는 자기 교반 바
5. 시엔코에서 제공되는 프로브.
6. 시엔코에서 제공되는 프로브 추출기.
7. 열 가열 블록 또는 37℃로 세팅된 수조
8. 타이머
9. 에펜도르프 피펫 및 피펫 팁(40 마이크로리터, 300 마이크로리터, 및 1000 마이크로리터)
10. 콘 트립신 저해제 50 ug/ml 및 3.2 % 완충된 시트레이트 0.5 ml를 함유하는 헤마토로직 테크놀로지 인크. 바큐테이너 13 X 100 ml
11. 19 mm 게이지 바늘
방법
1. 샘플 제조: 투명 바이알 한개, 백색 바이알 한개, 황색 바이알 한개 및청색 바이알 한개를 시험 튜브 랙에 위치시킨다. 손으로 6-10 회 바큐테이너를 혼합하여 균질화시킨다. 후드아래에서 또는 스플래쉬 가드 너머에서 바큐테이너를 개봉한다.
2. 혈액 1.0 ml를 투명 바이알 및 백색 바이알에 각각 피펫팅한다. 투명 바이알에 대조 항체를 5 마이크로리터 첨가한다. 백색 바이알에 TF mAb 칵테일 5 마이크로리터를 첨가한다. 각 바이알의 뚜껑을 닫고, 6-10 회 부드럽게 역위한 후, 수조에 바이알을 넣는다. 10분동안 타이머를 세팅한다.
3. 황색 바이알 및 청색 바이알 각각에 혈액 1.0 ml를 피펫팅한다.상기 바이알에 어떠한 시약도 첨가하지 않는다.각 바이알에 뚜껑을 닫고, 6-10 회 부드럽게 역위한 후, 수조에 바이알을 놓는다. 2시간동안 타이머를 세팅한다.
4. 샘플 테스트:
a) Sonoclot 분석기내 측부웰의 하나에 위치한 큐베트내로 300 마이크로리터를 피펫팅하여 37℃로 염화칼슘을 가온한다.
b) 약간 뒤틀린 운동을 사용하여 적절한 위치에서 SonoclotTM에 프로브를 위치시킨다. 또한 약간 뒤틀린 운동을 사용하여 용기내에 큐베트를 단단하게 밀어넣는다.
c) 자석 교반 바 하나를 큐베트내로 삽입한다.
d) 0.1 M 염화칼슘 40 ul을 큐베트에 첨가한다. 헤드를 닫는다.
e) 정확한 항온시간후에 수조에서 적절한 색상 바이알을 꺼내서 6-10회 부드럽게 역위한다. 뚜껑을 제거하고 SonoclotTM분석기에 큐베트내로 샘플 300 ul를 즉시 피펫팅한다. 버블의 형성을 피한다.
f) 샘플을 단한번 부드럽게 통기시켜(혈소판 활성화를 피하기 위하여) 큐베트내 염화칼슘과 이것을 잘 혼합한다. 일단 샘플을 큐베트내로 이동시켜 염화칼슘과 혼합하면, SonoclotTM분석기상의 금속 단추를 "시작"(아래) 위치로 눌러서 자석 교반기를 움직인다. 오디오 음성 및 스크린상의 문자 지시를 기다려 헤드를 닫는다. 포트 헤드를 닫는다. 이것은 샘플내로 프로브를 도입하는 것이며 시험이 시작된다.
g) 시험이 완결되면 오디오 음성이 들릴 것이다. 데이타 패널상 수치 및 SonoclotTM분석기의 챠트 기록를 판독한다. SonoclotTM분석기는 자동적으로 응고 시간을 계산한다. 음성이 일찍 들리더라도, 추가적인 비가공 데이타를 얻기 위하여, 시험은 20분 이상 작동되어야 할 것이다.
h) 바이알 유형(투명, 백색, 황색 또는 청색), 환자 식별 번호 및 시험이 수행된 일시를 포함한 식별 정보와 함께 전혈 응고 시간을 신속하게 기록한다.
i) 큐베트 및 프로브 추출기를 갖춘 프로브를 배치한다.
j) 적절한 시간 기간 동안 항온처리하면, 각 샘플 바이알에 대하여 단계 a-i를 반복한다.
3. 안전 예방 조치: 기술자는 혈액매개 병원체를 통하여 질병에 걸릴 확률을 제거하기 위하여 보편적인 예방 조치를 취해야 한다. 이러한 예방 조치는 최소한안경, 장갑 및 적절한 가운을 포함해야 한다. 피펫, 팁, 바이알 및 샘플 용기의 적절한 처분을 요구한다.
방법에 대한 주석
1. 시약 날짜를 체크한다. 시약은 이것의 유효 기간에 도달해서는 안된다.
2. 항온처리 시간 및 온도를 정확히 엄수한다. 이들 단계는 매우 중요하다.
3. 환자 샘플을 적절한 주의에 의하여 취급한다.
4. 모든 피펫 팁은 플라스틱 제품을 사용한다. 어떠한 상황에서도 유리를 혈액에 접촉시켜서는 안된다.
5. 유출된 혈액을 제거하기 위하여 적절한 소독 방법을 사용한다.
6. 2-8℃에서 시험 키트 재료를 저장한다. 유효 기간 후에는 사용하지 않는다. 상기 키트는 시험관내 진단 연구용이다.
품질 관리
1. SonoclotTM분석기에서 제공된 유(oil) 점도 관리는 지시 안내서에 기재된 바와 같이 수행해야 한다.
2. 기술자는 샘플의 주기적 이중 판독(각 교대마다 또는 매 25 판독시 마다 한번 이상, 어쨌든 매우 자주)을 실시해야 한다. 그래서, 동일한 항온처리 바이알로부터 2개의 300 ul 샘플을 꺼내 2개 기계에 위치시키고 전혈 응고 시간 판독을 동시에 기록한다. 바이알로부터 꺼낸 각 샘플에 대하여 새 피펫 팁을 사용한다. 이중 수치는 평균치의 10 퍼센트 이내이어야 한다.
3. 기계는 SonoclotTM분석기 안내서 4장의 제조자의 설명에 따라 품질 관리를 위해 매일 평가해야 한다.
에러의 원인
분석기를 수행하는 동안 일어날 수 있는 에러는 기술자의 실수, 기계 또는 공급 문제 및 판독 에러에서 기인한다. 각 군에 대한 에러의 주요 원인은 다음과 같다.
1. 기술자의 에러 - 정맥천차의 불량 또는 외상, 샘플의 불충분 채취, 샘플의 부적절한 혼합 및 역위, 샘플 또는 칼슘의 부피 부적절, 항온배양 시간 에러, 기계 사용 에러, 데이타 전이 에러 또는 샘플 혼동
2. 기계 에러 - 지시 불응, 기계 제조자의 품질 관리 방법에 불응, 응고 품질 관리 방법에 불응, 온도 에러 및 이중 샘플간의 일치의 계속적 결손.
3. 판독 에러 - 정확하고 시기적절한 노트 실패, 데이타 전이 에러, 많은 수의 바이알 기록 실패.
피검자 집단
혈액 공여 피검자는 일반 임상 연구 센터(GCRC)(The Scripps Research Institute in La Jolla, Califormia)의 건강한 정상 집단에서 뽑았다. 피검자는 만성적인 투약을 받지 않았으며, 혈액 공여전 20일동안 비스테로이드 항-염증성 약물(NSAIDS)를 사용하지 않았다. 인간 혈액 샘플의 사용은 인간 피검자 연구 위원회에 의하여 승인되었다.
응고 시간의 측정
전혈 응고 시간은 SonoclotTM응고 및 혈소판 기능 분석기(시엔스, 인크., Wheat Ridge, CO)를 사용하여 상술한 바와 같이 측정하였다. 상기 분석기는 피브린 가닥의 점성 드래그를 측정하기 위하여 300 ul 전혈에 침지된 일회용 진동 프로브를 사용한다(1,2). 응고 시간은, 커스톰 온셋 알고리즘(Coagulation Diagnostics Inc., Bethesda, MD)을 사용하도록 변형된 소프트웨어(시엔코)를 사용하여 재석회화 샘플의 임피던스가 기본이상 6 유니트 상승할때까지 초 단위를 계산하여 도출한다. 언급한 바와 같이, 시험용 전혈 샘플은 0.5 ml 3.2 % 소디움 시트레이트를 함유하는 바큐테이너 유리 시험관 5 ml(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 자동적으로 수집하였다. 혈액 채취에서 분석의 실행까지 걸린 시간은 4 시간 이하 였다. 혈액을 함유하는 튜브는 수회 역위시켜 항온처리 튜브로 분배하기 전에 전혈을 재혼합한다. 혈액(1 ml)은 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)(10 ug/ml)(E.coli 055:B5 Westphal, Difco; Detroit, MI)의 존재시 및 부재시에 37 ℃에서 10분 또는 2시간 및 4시간동안 플라스틱 튜브에서 항온처리하였다. 37℃에서 항온처리하는 동안 교반하지 않았다. 항온처리후, 혈액을 재혼합하고, 이를 300 ul씩, CaCl20.1 M 40 마이크로리터 및 자석 교반 바가 미리 장전된 가온된 큐베트에 분배하였다. 응고 시간을 측정한 후, 10분간 교반을 연속한다.
응고 시간에 미치는 TF 활성의 저해 영향
저해성 항-TF 항체가 응고 시간에 미치는 영향을 최종 농도 10 g/ml에서 인간 조직 인자(3)(9C3, 5G9, 6B4)에 대한 저해성 뮤린 IgG1MAb의 칵테일을 첨가함으로써 측정하였다. 비저해성 뮤린 IgG1항체(10H10)를 대조구로 사용하였다.
전혈의 응고 시간에 대한 TF의 기여를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 저해성 항-TF 항체의 혼합물이 응고 시간에 미치는 영향을 조사하였다. 저해성 항-인간 TF 모노클로날 항체는 LPS-자극된 혈액의 응고 시간을 상당히 지연시키나, 건강한 피검자로부터 채취한 비자극된 혈액에서는 그러하지 아니하다(도3). 19명의 건강한 개체에 대한 추가적 연구는 저해성 항-TF 항체가 평균 기초 응고 시간(10분)(항체 존재시 478±78 대 항체 부재시 437±113, 평균±SD)에 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 이러한 데이타는 분석이 LPS-자극된 전혈내 TF-의존성 피브린 가닥 형성을 측정하였음을 보여주었다. 전혈에 첨가된 지질화된 재조합체 TF는 0 내지 80 pg/mL에 있어서 용량-의존적 방식으로 재석회화된 전혈 응고 시간을 단축시켰다(도4).
실시예 4
비자극된 혈액의 응고 시간에서 접촉 활성화 경로의 역할
전혈의 응고에서 접촉 활성화 경로의 영향을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 3가지 방법을 사용하였다: i) 본 발명자들은 제12, 11, 또는 7 응고인자 결핍성 혈장에서 재구성된 혈액을 응고시켰다; ii) 본 발명자들은 제12a 응고인자를 저해하는 콘 트립신 저해제를 사용하였다; 및 iii) 본 발명자들은 제11a 응고인자 활성을 저해하기 위하여 저해성 항-제11a 응고인자 항체를 사용하였다. 결핍성 혈장의 영향을 측정하기 위하여, 세포를 850 ×g에서 10분간 원심분리기에 의하여 혈장으로부터 분리하고, 세척한 후 다음 혈장에 재현탁시켰다: 자가성, 보통 풀화된 것, 제11 응고인자-결핍성, 제12 응고인자-결핍성 및 제7 응고인자-결핍성(시그마). 제12a 응고인자 저해를 분석하는 실험을 위하여, 본 발명자들은 콘 트립신 저해제(32 g/ml)(Haematologic Technology, Essex Juncion, VT)를 사용하였다. 제11a 응고인자 저해를 분석하는 실험을 위하여, 본 발명자들은 염소 항-인간 제11a 응고인자 항체(10 g/ml)(Dr.K.Mann에 의하여 제공됨) 또는 대조구 비면역 염소 항체를 전혈에 첨가한 후 37℃에서 항온처리하였다. 모든 경우에서, 혈액은 37℃에서 10분간 항온처리한 후, 전혈 응고 시간을 측정하였다.
전혈에서 분리한 세포를 다양한 혈장과 재구성화시킨 후, 응고 시간을 측정하였다. 자가성 혈장에서 재구성화된 세포는 비조작된 혈액의 응고 시간보다 약간 빠른 응고 시간을 나타냈다(도. 5A). 이는 세포의 분리동안 단핵구 및 혈소판의 부분적 활성화를 반영할 수 있다. 정상 혈장 또는 제7 응고인자-결핍성 혈장에서 재구성화된 세포는 자가성 혈장에서 관찰된 것과 유사한 응고 시간을 보여준다. 이는 비자극된 혈액에서 TF 활성을 나타내지 않는 항-TF 항체 연구와 일치한다. 자가성 혈장과 정상 또는 제7 응고인자-결핍성 혈장간의 근소한 차이는 신선한 혈장 대 동결/동결건조 혈장간의 차이에 기인할 수 있다. 제7 응고인자-결핍성 혈장과의 결과에 대조적으로, 세포가 제11 응고인자- 및 제12 응고인자-결핍성 혈장 모두와 재구성되는 경우, 응고 시간은 상당히 지연되었다. 이는 접촉 활성화 경로가 비자극된 혈액의 응고 시간에 영향을 줌을 시사한다. 유사하게, 저해성 항-제11a 응고인자 항체는 비자극된 전혈의 응고 시간을 상당히 지연시켰다(도. 5B).
본 발명자들은 제12a 응고인자 활성을 차단하기 위하여 콘 트립신 저해제를 사용하였다(4). 다시, 본 발명자들은 콘 트립신 저해제의 존재하에 비자극된 혈액의 응고 시간의 일관적 지연을 관찰하였다(도.5C). 콘 트립신 저해제의 존재시 및 부재시 응고 시간에서 평균 차이는 141±88 초였다(평균±SD, n=28).콘 트립신 저해제는 LPS-자극된 혈액의 응고 시간을 차단하지 않는 것이 중요하다(도. 5C). 본 발명자들이 제시한 것은 TF-의존성이다(도.3). 이와 함께, 상기 연구는 접촉 활성화 경로가 비자극된 혈액의 응고 시간에 영향을 주지만 LPS-자극된 혈액의 응고 시간 단축에는 별로 영향을 주지는 않음을 시사한다.
실시예 5
전혈 응고 시간에 미치는 저해성 항응고제의 영향
LPS-자극된 혈액의 응고 시간에 미치는 비분획된 헤파린, 저분자량 헤파린(LMWH) 및 히루딘 항응고제의 영향을 조사하였다. 결과는 도 6A-6C에 나타났다. 비분획된 헤파린 및 LMWH는 트롬빈 및 제10a인자 모두를 저해한다. 그러나, 비분획된 헤파린은 항-제10a인자 활성에 비하여 더 큰 항트롬빈 활성을 나타낸다(5). 대조적으로, LMWH는 항-제10a인자 활성에 비하여 낮은 항트롬빈 할성을 갖는다(5). 히루딘은 선택적으로 트롬빈을 저해한다.
임의의 상기 3개 항응고제를 LPS-자극된 혈액에 임상적으로 적절한 용량을 투여하면 용량-의존적 방식으로 응고 시간을 지연하였다.
이러한 데이타는 상기 응고 시간 분석이 항응고제 요법을 모니터하기 위한 임상적 세팅에 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 6
불안정형 협심증 환자로부터 채취된 혈액의 응고 시간
불안정형 협심증에 대한 연구를 위하여, 본 발명자들은 불안정형 협심증의 진단을 허용하기 위하여 존 홉킨스 호스피털(Baltimore)의 응급실에 수용된 환자로부터 채취한 혈액을 분석하였다(n=8). 항응고제를 투여받은 환자는 제외하였다. 동일한 위치에서 건강한 피검자 군(n=37)을 대조구로 사용하였다. 인간 혈액샘플의 사용은 인간 피검자 연구 위원회에 의하여 승인받았다. TF 단백질의 수준은 불안정형 협심증를 가진 환자로부터 채취한 혈액에서 상승되었음이 문헌에 보고되었다(7,8,9,10). 본 발명자들은 불안정형 협심증을 가진 응급실에 수용된 환자로부터 비자극된 혈액의 응고 시간을 조사하였다. 불안정형 협심증 환자로부터 채취한 비자극된 혈액의 응고 시간은 건강한 피검자 군에서 응고 시간보다 상당히 더 빠르다(도 7). 이러한 결과는 불안정형 협심증 환자가 순환성 TF 활성의 수준이 상승됨을 나타낸다.
상기 명세서는 예시의 목적으로 제공된 실시예와 함께 본 발명의 원칙을 교시하며, 당업자라면 발명의 본질을 벗어나지 않는 한도에서 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것입니다.
모든 인용된 특허 및 문헌은 본원에서 전체로서 참고로 인용됩니다.
참고문헌

Claims (29)

  1. (a) 전혈의 샘플을 수집하는 단계;
    (b) 전혈의 샘플을 2개 이상의 분취물로 분배하는 단계;
    (c) 하나의 분취물에 프로응고제의 저해제 하나 이상을 첨가하는 단계;
    (d) 분취물을 항온처리하는 단계;
    (e) 각각의 분취물에 대한 응고 시간을 측정하는 단계; 및
    (f) 분취물의 각 응고 시간을 비교하는 단계
    를 포함하는 전혈내 프로응고제의 존재를 기능적으로 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로응고제는 α-2-항플라스민, 피브리노겐, 고분자량 키니노겐, 칼레크레인, 프레칼레크레인, 조직 인자, 제2 응고인자, 제2a 응고인자, 제5a 응고인자, 제7a 응고인자, 제8a 응고인자, 제9a 응고인자, 제10a 응고인자, 제11a 응고인자, 제12a 응고인자, 및 제13a 응고인자로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 전혈의 샘플에 접촉 활성화 저해제를 첨가하는 단계 또는 접촉 활성화 저해제의 존재하에서 샘플 또는 전혈을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 접촉 활성화 저해제는 콘 트립신 저해제인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로응고제의 저해제가 항체 또는 프로응고제 기질의 유사체인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 저해제가 항체인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 유사체는 펩티드인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 프로응고제의 항체 저해제를 함유하지 않는 분취물에 대조구 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 이때 상기 대조구 항체는 프로응고제의 항체 저해제와 실질적으로 동등한 양으로 첨가하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 프로응고제는 조직 인자가 아닌 방법.
  10. (a) 전혈의 샘플을 수집하는 단계;
    (b) 전혈의 샘플을 2개 이상의 분취물로 분배하는 단계;
    (c) 하나의 분취물에 항응고제의 저해제를 첨가하는 단계;
    (d) 분취물을 항온처리하는 단계;
    (e) 각 분취물에 대한 응고 시간을 측정하는 단계; 및
    (f) 분취물의 각 응고 시간을 비교하는 단계
    를 포함하는 전혈내 항응고제의 존재를 기능적으로 측정하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항응고제는 α-1-항트립신, 활성화된 프로틴 C, 항트롬빈 III, C1 에스테라아제 저해제, 헤파린, 프로틴 C, 프로틴 S, 트롬보모듈린, 및 조직 인자 경로 저해제로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 전혈의 샘플에 접촉 활성화 저해제를 첨가하는 단계 또는 접촉 활성화 저해제의 존재하에서 샘플 또는 전혈을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 접촉 활성화 저해제는 콘 트립신 저해제인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 항응고제의 저해제가 항체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항응고제의 항체 저해제를 함유하지 않는 분취물에 대조구 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 이때 상기 대조구 항체는 항응고제의 항체 저해제와 실질적으로 동등한 양으로 첨가하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 전혈의 샘플은 시트레이트를 포함하는 용액으로 수집하고, 단계 (e) 이전에 혈액을 재석회화하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 전혈의 샘플은 시트레이트를 포함하는 용액으로 수집하고, 단계 (e) 이전에 혈액을 재석회화하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 전혈의 샘플은 시트레이트를 포함하는 용액으로 수집하고, 단계 (e) 이전에 혈액을 재석회화하는 방법.
  19. (a) 프로응고제의 저해제를 함유하는 바이알;
    (b) 비저해성 대조구 시약을 함유하는 바이알; 및
    (c) 액체 시트레이트 항응고제를 함유하는 바이알
    을 포함하는 전혈내 프로응고제의 존재를 기능적으로 측정하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 액체 시트레이트 항응고제를 함유하는 바이알은 콘 트립신 저해제를 추가로 포함하는 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프로응고제는 조직 인자인 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 저해제는 하나 이상의 항체인 키트.
  23. (a) 항응고제의 저해제를 함유하는 바이알;
    (b) 비저해성 대조구 시약을 함유하는 바이알; 및
    (c) 액체 시트레이트 항응고제를 함유하는 바이알
    을 포함하는 전혈내 항응고제의 존재를 기능적으로 측정하는 키트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 액체 시트레이트 항응고제를 함유하는 바이알은 콘 트립신 저해제를 추가로 포함하는 키트.
  25. 제24항에 있어서, 상기 저해제는 하나 이상의 항체인 키트.
  26. (a) 전혈의 샘플을 수집하는 단계;
    (b) 전혈의 샘플을 4개 이상의 분취물로 분배하는 단계;
    (c) 2개의 분취물에 면역조절제를 첨가하는 단계;
    (d) 면역조절제를 보유하지 않는 하나의 분취물 및 면역조절제를 보유한 하나의 분취물에 프로응고제의 저해제 하나 이상을 첨가하는 단계;
    (e) 분취물을 항온처리하는 단계;
    (f) 각 분취물에 대한 응고 시간을 측정하는 단계; 및
    (g) 분취물의 각 응고 시간을 비교하는 단계
    를 포함하는 전혈내 프로응고제의 존재를 기능적으로 측정하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 전혈 샘플은 항응고제 및 콘 트립신 저해제를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 면역조절제는 엔도톡신인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 저해제는 항체인 방법.
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