WO2008075455A1

WO2008075455A1 - トロンビン含有溶液中のα－トロンビンの安定化方法

Info

Publication number: WO2008075455A1
Application number: PCT/JP2007/001367
Authority: WO
Inventors: Remi Ikeda; Chizuru Morikawa; Hirokazu Yago
Original assignee: Sekisui Medical Co., Ltd.
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2008-06-26
Also published as: JPWO2008075455A1; ATE554397T1; ES2382758T3; US8580532B2; US20100047834A1; EP2096440A1; JP5121725B2; CN101558310A; EP2096440B1; EP2096440A4; CN101558310B

Abstract

　トロンビン溶液における、不安定なα－トロンビンの安定化方法、安定化されたα－トロンビンを含有する溶液及びこれを含む液状のフィブリノゲン測定用試薬を提供すること。　トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα－トロンビン含量を少なくとも７０％以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のα－トロンビンの安定化方法。

Description

明細書

トロンビン含有溶液中の一トロンビンの安定化方法

技術分野

[0001 ] 本発明は、トロンビン含有溶液中の不安定なひ一トロンビンの安定化方法

、ひ一トロンビンを安定化したトロンビン含有溶液、及びそれを含む液状フイブリノゲン測定用試薬に関する。

背景技術

[0002] フイブリノゲンは、血餅の主要タンパク質であるフイブリンの前駆物質であり、肝実質細胞で産生される。生体中のフイブリノゲンの約 8 0 %は血漿中（健常成人で約 2 0 0〜 4 0 O m g / d L ) に、残りは組織に分布している。フイブリノゲンは、ジスルフイドによって結合された 3対のポリべプチド（Aひ、 Β β、及び r ) 鎖を含む糖タンパク質であり、 Aひ及び B ;3鎖がトロンビンにより分解されフイブリンとなることで血栓生成や止血血栓の主役を担っている。臨床的には炎症で増加し、高度な肝機能障害、 D I C等では減少する。

[0003] フイブリノゲンの測定法としては、クラウス法（トロンビン添加法）、 P T d e r i V e d法（凝固時間法）、 T I A (免疫比濁）法、ラテックス法等があり、一般的にはトロンビン添加法、すなわちクェン酸 N a加血漿検体にトロンビンと塩化カルシウムを添加し、凝固する時間を測定し、既知濃度のフイブリノゲンを用いて作成した検量線から検体のフイブリノゲン濃度 ( m g / d L ) を計算により求める方法が行われている。

[0004] フイブリノゲン測定に用いられるトロンビンは、その前駆体であるプロトロンビンからぺプチドが切り出されて凝固活性を有するひ一トロンビンとなる。この a—トロンビンは低分子量の凝固活性を有さない; S _トロンビン、更に: Γ _トロンビンに自己分解を起こすことが知られており、長期間保存する場合は、通常、凍結乾燥されていた。

[0005] そこで、トロンビンを溶液中で安定化する幾つかの試みも行われており、例えば、トロンビンに（1 ) 高濃度グリセロール、ポリオ一ル（スクロース、マンニトール、ソルビトール等）を添加する方法（特許文献 1 ) 、（2) 糖、アミノ酸などを添加する方法（特許文献 2) 等が知られている。

し力、し、これらは、液状のフイブリノゲン測定用試薬中のトロンビンの安定化方法としては効果が不十分であった。

[0006] フイブリノゲン測定用試薬におけるトロンビンの安定化方法としては、トロンビン含有溶液にトロンビンの拮抗阻害剤を添加する方法（特許文献 3) が知られている。

し力、し、この方法は、トロンビンの活性を阻害することを機序とするものである。そのため、この方法を用いた場合、フイブリノゲン測定検査において重要な測定意義を持つフイブリノゲン低濃度検体では、凝固時間が極端に遅延し、場合によっては測定不能となる。このことは時間当たりの検体処理数の低下だけでなく、フイブリノゲン低濃度検体の測定不能による再検の增加につながるため、この方法は緊急検査には不向きなものであった。

[0007] それ故、低濃度のフイブリノゲン検体においても測定不能とならず、測定時間の極端な遅延が少なく、また、低濃度検体の測定値への影響が少ない液状のフィブリノゲン測定用試薬に適用可能なひ一トロンビン含有溶液中のひ -トロンビンの安定化方法の開発が望まれていた。

特許文献 1 ：特開昭 62— 1 06028

特許文献 2：特開昭 64— 040433

特許文献 3：特開 2004 _ 1 91 367

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明の目的は、トロンビン含有溶液における、不安定なひ一トロンビンの安定化方法、ひ一トロンビンを安定化したトロンビン含有溶液及びこれを含む液状のフィブリノゲン測定用試薬を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、従来、 β—トロンビンや r_トロンビンは、単なるひ一トロンビンの自己分解産物としか考えられていなかつたが、ひ一トロンビンがひ一トロンビンに作用する自己分解よりも、 β - び —トロンビンがひ一トロンビンに作用する分解活性がより強いことを見出した。そして、全トロンビンに対する; S—及び/又は r—トロンビンの含量を一定範囲に低く抑えることにより、全く意外にも従来は自己分解を起こすために不安定と考えられていたひ一トロンビンの溶液中での安定化が可能であることを見出し、本発明を完成した。

[0010] すなわち本発明は、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するひ一トロンビン含量を少なくとも 7 0 %以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のひ一トロンビンの安定化方法を提供するものである。

発明の効果

[001 1 ] 本発明によれば、トロンビン含有溶液中のひ一トロンビンの残存率の低下や活性の低下を抑制し、トロンビン含有溶液の保存安定性や品質を向上することができる。さらに、緊急検査に適した液状のフイブリノゲン測定用試薬の保存安定性や品質を向上することができる。

図面の簡単な説明

[0012] [図 1 ]精製トロンビンの 1 0— 2 0 % S D S— P A G E像である。図の左は精製ひ一トロンビン、図の右は精製; S—及び _トロンビンの混合物の像である。尚、 Aはひ一トロンビンに相当するもの、 BはS—及び r—トロンビンに相当するものである。

[図 2] 3 7 °C加速試験後のひ—トロンビン含量残存率。 0週目の凝固時間を 1 0 0 %とした。

[図 3] 3 7 °C加速試験後のトロンビン活性。 0週目の凝固時間を 1 0 0 %とした。

[図 4] 3 7 °C加速試験後の試料 1の凝固時間の遅延。 0週目の凝固時間を 1 0 0 %とした。

[図 5] 3 7 °C加速試験後の試料 2の凝固時間の遅延。 0週目の凝固時間を 1 0 0 %とした。発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明におけるトロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するひ一トロンビン含量は、 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上である。そして、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対する、ひ一トロンビン含量は 70%以上且つS _及び/又は r _トロンビン含量は 30% 未満が更に好ましく、ひ一トロンビン含量は 80%以上且つ; S _及び/又は Ύ-トロンビン含量は 20%未満がより更に好ましく、ひ一トロンビン含量は 90%以上且つS _及び/又は r _トロンビン含量は 1 0%未満が特に好ましい。

[0014] 本発明は、後記実施例に示すとおり、全トロンビンに対する; S_及びトロンビン含量が高まるにつれて; S—及び r_トロンビンが溶液中のひ一トロンビンの残存率の低下や活性を低下させるため、全トロンビンに対するひ -トロンビン含量を高め、一方で全トロンビンに対する; S—及び r_トロンビン含量を抑えることで、溶液中のひ一トロンビンの保存安定性、品質を高めることができる。

[0015] 本発明におけるトロンビンとは、ひ一トロンビンを含むものをいい、全トロンビンとはひ一トロンビン、 β—トロンビン及び r_トロンビンの全てをいう。

[0016] 本発明における全トロンビンに対するひ一トロンビン含量は、トロンビンを定量的に測定することができる公知の方法にて、ひ一トロンビン、；3—トロンビン及び —トロンビンの各測定値を求め、下記式（1 ) により求めることができる。

[0017] 全トロンビンに対するひ一トロンビン含量（％) = (ひ一トロンビン測定値/全トロンビン測定値の総和） X 1 00 ■ ■ ■式（ 1 )

[0018] また、同様にして、全トロンビンに対する; S—及び/又は r—トロンビン含量を下記式（2) により求めることができる。

[0019] 全トロンビンに対する; S_及び/又は r—トロンビン含量（％) = (β - 及び Ζ又は r—トロンビン測定値/全トロンビン測定値の総和） X 1 00 ■ …式（2 )

[0020] トロンビンを定量的に測定する方法としては、例えば、活性測定法ゃデンシトメトリ一による蛋白定量等が挙げられ、いずれの測定方法であってもよし、。また、適宜測定前に公知の方法にてひ一トロンビン及びその分解物を分離■精製してもよい。

[0021 ] より具体的には、合成基質 S— 2 2 3 8 (第一化学薬品製）を用いた活性測定法（合成基質法）によってひ一トロンビン含量を求める場合、公知のィオン交換樹脂にてひ—、；3 _及び r _トロンビンを分画後、各画分の S— 2 2 3 8に対する分解活性をそれぞれ測定し、全トロンビン活性に対するひ - トロンビン活性の活性比率（％) として求めることができる。

また、デンシトメトリーを用いた場合、公知のタンパク質分析用の電気泳動にてひ一、；3 _及び r—トロンビン画分に分け、デンシトメトリ一によりそれぞれのタンパク質含量を求めた後、全トロンビンのタンパク質含量に対するひ一トロンビンのタンパク質含量の比率（％) として求めることができる。

[0022] 本発明に用いるトロンビンは、ヒト等の動物由来、遺伝子工学的手法で調製されたもの、又は市販の医薬品のいずれであってもよい。

[0023] 本発明に用いるトロンビンの調製法としては、公知のタンパク質の分離 - 精製法、例えば、濾過、洗浄、乾燥、再結晶、各種カラムクロマトグラフィ ―、 H P L C、液々分配等が挙げられる。より具体的には、陽イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂、ベンザミジン樹脂等のァフィ二ティー樹脂、限界濾過膜やゲルろ過等が挙げられる。

そして、これらを適宜組み合わせて全トロンビンに対するひ一トロンビン含量が高まるよう調整する。

[0024] 本発明のトロンビン含有溶液は、トロンビンを水及び/又は有機溶媒に懸濁又は溶解させた水溶液、有機溶媒溶液又は水■有機溶媒の混合溶液であり、好ましくは水溶液又は水■有機溶媒混合溶液である。当該有機溶媒としては、ひ一トロンビンの分解や活性阻害等、フイブリノゲン測定への影響を有するものでなければ特に限定されず、例えば、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリピレングリコ一ル等が挙げられる。これらを 1種類もしくは 2種類以上を組み合わせて用いることもできる。

[0025] 本発明のトロンビン含有溶液の p Hは、特に調整しなくともよいが、ひ一

トロンビンの分解や活性阻害を抑制するため好ましくは 4〜 9であり、より好ましくは 5. 5〜7であり、更に好ましくは 6〜6. 5である。

[0026] 当該 p Hを 4〜9に調整するには、 p H 4〜 9の範囲に緩衝能をもつ緩衝剤を適宜選択して使用することができ、例えば、クェン酸、リン酸、酢酸、ィミダゾ一ル、 H E P ES、 MO P S、 B I S— T R I S、 T R I S、 MO P SO、 ADA, MES等から 1種類もしくは 2種類以上を適宜組み合わせることができる。

また、当該 p Hを 5. 5〜 7に調整する場合や、 6〜6. 5に調整する場合には、例えばクェン酸、リン酸、イミダゾ一ル、 B I S_T R I S、 MO P SO、 ADA, MES等から 1種類もしくは 2種類以上を適宜組み合わせることができる。

これらの緩衝剤の添加量は、緩衝能を有する量であれば特に限定されない力例えばトロンビン含有溶液中の緩衝剤の濃度が 5〜 1 000 mM、特に 20〜30 OmMであるのが好ましい。

[0027] また、本発明のトロンビン含有溶液におけるひ一トロンビンの活性量は、上記全トロンビンに対するひ一トロンビン含量に応じて目的とする活性値に調整されていればよく、特に限定されない。例えば、フイブリノゲン測定用試薬に適用する場合にはひ—トロンビンの活性が、公知の合成基質法にて 2 0〜 1 000単位/ m L、更に 50〜 500単位/ m L、特に 1 00〜 30 0単位/ m Lであるのが好ましい。

[0028] 本発明のトロンビン含有溶液は、以下のような公知の化合物をフイブリノゲン測定に影響のない範囲で適宜配合し、公知の製造方法にて製造することができる。

[0029] 当該トロンビン含有溶液には、フイブリノゲン測定に影響のない範囲でひ一トロンビンの安定化や保存安定性向上等のために用いる公知の化合物を適宜配合してもよく、例えば、カルシウムイオン、有機酸、界面活性剤、タンパク質等を挙げることができる。

[0030] 前記カルシウムイオンの具体例としては、水溶性のカルシウム化合物が好ましく、例えば塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルクロン酸カルシウム、酒石酸カルシウム等が挙げられる。これらのカルシゥム化合物は 1種類もしくは 2種以上を組み合わせて使用することもできる。該カルシウム化合物のひ一トロンビンに対する安定化有効量は、安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中のカルシウムの濃度は、好ましくは 5mM〜 1 O OmMであり、より好ましくは 1 0mM〜50mMである。

[0031] 前記有機酸の具体例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、グルクロン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クェン酸、グルタル酸、ァミノ酢酸、ァミノカブロン酸等が挙げられ、遊離酸又はその塩のどちらを用いても良い。また、これらの有機酸は 1種類もしくは 2種以上を組み合わせて使用することができる。

当該有機酸の添加量はひ一トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の当該有機酸の濃度は、好ましくは 1 0mM〜50 OmMであり、より好ましくは 50 mM〜200mMである。

[0032] 前記界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤のいずれでもよく、その具体例としては、次のものが挙げられる。

陰イオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル— N—サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デォキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、例えばセチルトリメチルアンモニゥムブ口ミド、テトラデシルアンモニゥムブロミド、ドデシルピリジニゥムクロリド等が挙げられる。

両ィォン性界面活性剤としては、例えば 3 _ [ ( 3—コラミドプロピル）ジメチルアンモニォ] _ 1 _プロパンスルホン酸（CHAPS) 、 3 - [ ( 3—コラミドプロピル）ジメチルアンモニォ] _ 2—ヒドロキシ一 1 _プロパンスルホン酸（CHAP SO) 、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル一 N—ベタイン、ドデシル一; S—ァラニン等が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えばォクチルグルコシド、ぺプチルチォグルコシド、デカノィル一N—メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルェ一テル、ポリオキシエチレンヘプタメチルへキシルエーテル、ポリォキシエチレンイソォクチルフヱニルエーテル（T r i t o n (登録商標） Xシリーズ）、ポリオキシエチレンノニルフエ二ルェ一テル、ポリオキシェチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル（Twe e n (登録商標）シリーズ）等が挙げられる。これらの界面活性剤のうち、非イオン性界面活性剤が特に好ましく用いられる。また、これらの界面活性剤は 1種類もしくは 2種類以上を組み合わせて用いることもできる。

当該界面活性剤の添加量は、 α _トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばひ一トロンビン含有溶液中の当該界面活性剤の濃度は、好ましくは 0. 001〜 1 w/ V %であり、より好ましくは 0. 005〜0. 1 w/v%である。

前記タンパク質の具体例としては、アルブミン、ゼラチン、グロブリン等を挙げることができるが、これらのタンパク質は 1種類もしくは 2種類以上を組み合わせて用いることもできる。

当該タンパク質の添加量は、ひ一トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばひ一トロンビン含有溶液中の当該タンパク質の濃度は、好ましくは 0. 05〜 1 0 w/v%であり、より好ましくは 0. 1〜5w/v%である。

[0034] さらに、本発明のひ一トロンビン含有溶液には、上記以外に測定再現性を向上させるためフイブリノゲン測定に影響のない範囲で高分子多糖類及び/ 又は合成高分子類を配合してもよい。

[0035] 当該高分子多糖類の具体例としては、デキストラン 40、デキストラン 7

0、デキストラン 200, 000、デキストラン 500, 000、フイコール等が挙げられる。これらの高分子多糖類は 1種類もしくは 2種類以上を組み合わせて用いることができる。

当該高分子多糖類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の高分子多糖類の濃度は、好ましくは 0. 1〜 1 Ow/v%であり、より好ましくは 0. 3〜3w/v%である

[0036] 当該合成高分子類の具体例としては、ポリビニルアルコール 500、ポリビニルアルコール 1 500、ポリビニルアルコール 2000、ポリエチレングリコ一ル 1 500、ポリエチレングリコ一ル 2000、ポリエチレングリコール 4000、ポリエチレングリコール 6000、ポリエチレングリコ一ル 8000、ポリエチレングリコ一ル 20000及びポリビニルピロリドン等が挙げられる。これらの合成高分子類は 1種類もしくは 2種類以上を組み合わせて用いることができる。

当該合成高分子類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の合成高分子類の濃度は 0. 1〜 1 Ow/v%であり、好ましくは 0. 3〜3w/v%である。

[0037] また、本発明のトロンビン含有溶液には、フイブリノゲン測定に影響のない範囲で適当な防腐剤を添加してもよい。当該防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、プロクリン（登録商標） 300、シプロフロキサシン、プロピオン酸もしくは安息香酸ナトリゥム等が挙げられ、これらの中から 1種類もしくは 2種類以上を組み合わせて用いることができる。また、必要に応じて塩化ナトリウム等の塩や、アミノ酸、糖等の一般的な安定化剤等を含ませるしと

当該防腐剤の添加量は、所定の範囲内であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中のプロクリン（登録商標） 300の濃度は 0. 00 1〜 "！ w/v%であり、好ましくは 0. 0 1〜0. 1 w/v%である。尚、上記に記載の濃度は、市販のプロクリン（登録商標） 300を 1 O Ow/v %とした場合の濃度を記載している。

[0038] 本発明の液状フイブリノゲン測定用試薬は、上記ひ一トロンビン含有溶液を含み、更にフイブリノゲン測定に影響のない範囲でフイブリノゲンを測定するため通常用いる化合物を適宜配合してもよい。

[0039] 当該液状のフイブリノゲン測定用試薬は、凝固能検査試薬、特にフイブリノゲンの定量用試薬に使用することができる。具体的には、フイブリノゲン標準液を検体希釈用緩衝液で所定の濃度に希釈後、希釈フイブリノゲン標準液と液状のフイブリノゲン測定用試薬を添加し、 37°Cにて凝固時間を測定する。本フイブリノゲン濃度と凝固時間の測定値を基に検量線を作成し、被検検体の凝固時間の測定値を本検量線から換算して、被検検体中のフイブリノゲン濃度を求めることができる。

また、本発明のトロンビン含有溶液を含む液状フイブリノゲン測定用試薬は、トロンビン活性阻害物質の活性、例えば、アンチトロンビン活性、ヒルジン活性、化学合成阻害剤の活性を測定することができる。

[0040] また、本発明の液状のフイブリノゲン測定用試薬は、測定用試薬キッ卜としてもよく、斯かる場合には検体及び標準液を希釈するための検体希釈用緩衝液を含んでもよい。

検体希釈用緩衝液としては、 MES、 B i s -T r i s、 ADA、 P I P ES、 AC ES, MO P SO、 B ES、 MO P S、 T ES、 H E P ES、 D I P SO, TA P SO、 PO P SO、 H E P P SO、 E P P S、 T r i c i n e、 B i c i n e、 TA P S, CH ES、 CA P SO、 CA P Sなどのグッド緩衝液、バルビタール緩衝液を挙げることができる。当該検体希釈用緩衝液は、上記トロンビン含有溶液に加えた際に、上記トロンビン含有溶液の P Hや濃度の範囲と成るように使用すればよい。

実施例

[0041] 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

[0042] (製造例 1 ) ひ一トロンビン及び; S ■ r—トロンビンの分離■精製

5 OmM リン酸緩衝液 p H 7. 0で溶解した 5万単位のトロンビン溶液を S _ S e p h a r o s e (2. 5 x 1 1 cm、フアルマシア）に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、 0. 4M N a C I を含む同緩衝液を用いた 0〜0 . 4M N a C I (各 30 OmL) のリニアグラジェントにて溶出した。トロンビン活性を合成基質法で測定し、低いイオン強度で溶出される; S_及び r—トロンビン混合物（以下、 β ■ ： r—トロンビンとする。）画分と高いィオン強度で溶出されるひ一トロンビン画分を回収した。

さらに、各画分のトロンビン溶液を B e n z am i d i n e-S e p h a r o s e (2. 1 x 6 cm、フアルマシア）に吸着させ、 0. 5M N a C I を含む同緩衝液で洗浄後、 0. 1 M B e n z am i d i n e 0. 5M

N a C I を含む同緩衝液を用いた 0 _ 0. 1 M B e n z am i d i n e (各 1 0 OmL) のリニアグラジェントにて溶出し、精製ひ一トロンビン（約 3万単位）と精製; S ■ r_トロンビン（約 1万単位）を得た。なお、回収した各精製トロンビン溶液は、 0. 1 M N a C I、 20mM T r i s— HC I p H 7. 4で透析した後、後記する検討に使用した。また、合成基質法によるトロンビン活性測定は、試薬 1 (1 00 mM T r i s、 50m M クェン酸 3 N a、 0. 05 % B S A , p H 7. 4) で 500倍希釈した各トロンビン含有溶液 200 Lと試薬 2 (S— 2283 ： 1 mg/mL) 200 Ι_を加え、 37°Cで 1 0分間反応させた後、 1 mLの 2%クェン酸を添加し、 405 n mの波長で測定した。さらに、合成基質法測定値からトロンビン活性への換算は、トロンビン標準品（日本薬局方）を基に行ない、精製ひ一トロンビンは 1 238単位/ mL、精製; S ■ γ-トロンビンは 67 7単位/ m Lであった。 [0043] (製造例 2) 各トロンビンの純度検定（デンシトメトリー）

精製ひ一トロンビン、並びに精製S ■ Ύ-トロンビンを L a emm I i法に従い非還元下の 1 0_20%S DS_ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ S DS— PAG E) にて分離した。 CBBによる蛋白染色後、充分に脱色した後、デンシトメ一タ一（コダック I S 440 C F) にて各バンドの染色度合い（ I n t e n s i t y) を測定した。

その結果、表 1、図 1に示すように精製ひ一トロンビンの純度は約 95% であり（約 5%は; s—及び r_トロンビンを含む）、精製; s■ r—トロンビンの純度は約 80%であった（約 20%はひ一トロンビンを含む）。尚、 A はひ一トロンビンに相当するもの、 Bは; S一及び γ—トロンビンに相当するものである。

[0044] [表 1]

[0045] (実施例 1 ) 条件 1〜 5のトロンビン含有溶液の調製

条件 1〜 5のトロンビン含有溶液は、 1 00単位/ 1_ ひ一トロンビン、 1 5 OmM 塩化ナトリウム、 0. 05% プロクリン（登録商標） 30 0、 β ■ —トロンビンを下記に記載の活性比率で含有する 5 OmM ME S緩衝液からなる p H 6. 3の溶液であり、精製ひ一トロンビン及び精製 ■ —トロンビンを用いて調製した。

[0046] 条件 1 ：全トロンビン活性に対する; S ■ ： r _トロンビンの活性比率： 5 %

条件 2 ：全トロンビン活性に対する; S ■ γ-トロンビンの活性比率： 1 0

%

条件 3 ：全トロンビン活性に対する; S ■ γ-トロンビンの活性比率： 1 5

% 条件 4 ：全トロンビン活性に対する; s ■ ： r _トロンビンの活性比率： 2 0

%

条件 5 ：全トロンビン活性に対する; s ■ ： r _トロンビンの活性比率： 5 0

%

[0047] (実施例 2 ) α _トロンビン含量の安定性

条件 1 〜 5のトロンビン含有溶液を 3 7 °Cで 0 , 1 , 2週間保存したときのひ一トロンビン含量の残存率を測定した。なお、ひ一トロンビンの含量の測定は製造例 2の純度検定にて行った。

[0048] その結果、表 2及び図 2に示したように、 3 7 °C加速試験後のひ一トロンビンの含量残存率は、 β ■ ： Γ _トロンビンの活性比率が増加するに従い低下した。 β ■ ： Γ—トロンビンの活性比率が 5 0 % (条件 5 ) のトロンビン含有溶液では 3 7 °C■ 2週間保存でひ—トロンビン含量残存率が 5 0 %であつたのに対し、条件 4のS ■ r—トロンビンの活性比率が 2 0 %のトロンビン含有溶液は、 3 7 °C■ 2週間保存でひ—トロンビン含量残存率が 8 1 %と良好な結果が得られ、共存する; S ■ ： Γ—トロンビンが少ない方が（すなわち、ひ —トロンビンの活性比率が大きい方が）、ひ—トロンビンの残存率が高かつた。

[0049] [表 2] 加速試験後の α—トロンビン含量残存率

ここで、図 2より、全トロンビンに対する; s ■ ： r—トロンビンの活性比率とひ一トロンビンの含量残存率が逆比例することから、 β■： r _トロンビンの活性比率が 3 0 % (すなわち、全トロンビン活性に対するひ一トロンビンの活性比率 70 %) では、 37 °C■ 2週間保存後のひ—トロンビン含量の残存率が 70%以上と予想される。また、この結果より、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するひ一トロンビン含量は、 70%以上、好ましくは 800/₀以上、より好ましくは 90<½以上であることが判る。そして、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対する、ひ一トロンビン含量は 70%以上且つ; S _及び/又は _トロンビン含量は 30%未満が更に好ましく、ひ一トロンビン含量は 80%以上且つS _及び/又は r _トロンビン含量は 20 %未満がより更に好ましく、ひ一トロンビン含量は 90%以上且つS _及び /又は _トロンビン含量は 1 0%未満が特に好ましいことが判る。

[0051] (実施例 3) トロンビン活性の安定性

実施例 1 と同様に条件 1〜 5の各トロンビン含有溶液を調製し、 37°Cで 0, 1 , 2週間保存したときの合成基質法での測定値よりトロンビン活性の残存率を求めた。

合成基質法による活性測定は、前記の製造例 1に記載の方法を用いた。

[0052] その結果、表 3及び図 3に示したように、条件 5の; S ■ ： r—トロンビンの活性比率が 50 %の含有溶液では、 37 °Cで 2週間保存後のトロンビン活性残存率は 20%以下であつたのに対し、条件 4のS ■ r—トロンビンの活性比率が 20 %のトロンビン含有溶液では 37 °Cで 2週間保存後のトロンビン活性残存率は約 60%と良好であり、初期の; S ■ —トロンビンの活性比率が小さいほど（すなわち、ひ一トロンビンの活性比率が大きいほど）、 37 °Cで 2週間保存後のトロンビン活性残存率は増大した。

[0053] [表 3]

37 °C加速試験後のトロンピン活性残存率

条件 1 条件 2 条件 3 条件 4 条件 5

(β · r卜ロンピン

/全トロンピン含量）（%) 5 10 15 20 50 ― 卜 π 保存期間（37°C)

ンビン含 37°C、 0日 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 量残存率 37。C、 1週間 86.8 79.2 73.4 62.1 39.2 (¾) 37°C、 2週間 79.2 74.4 68.8 60.2 18.6 [0054] (実施例 4 ) 各 α _トロンビン含有溶液の凝固活性の安定性

実施例 2で調製した条件 1〜5のひ一トロンビン含有溶液について、 3 7 °Cで 0 , 1 , 2週間保存したトロンビン含有溶液を用い、ヒト血漿（試料 1 及び試料 2 ) について凝固時間の測定を行った。本実験は、検体希釈液（T C緩衝液、シスメックス）で 1 0倍に希釈した血漿 1 0 0 Lに各トロンビン含有溶液を 5 0 L添加し、コアグレックス 8 0 0 (シスメックス）にて凝固時間を測定した。

試料 1に関する結果を表 4及び図 4に示し、試料 2に関する結果を表 5及び図 5に示し、図 4及び 5については 0週目の凝固時間を 1 0 0 %とした場合の相対％で示した。

[0055] [表 4] 試料 1 ： 3 7 °C加速試験後の試料 1の凝固時間（S e c )

(試料 1 ： 290mg/dL)

[0056] [表 5] 試料 2 ： 3 7で加速試験後の試料 2の凝固時間（S e c )

(試料 2 ： 145mg/dL)

図 4及び図 5より、 β ■ r—トロンビンの活性比率が 5 0 % (条件 5 ) のトロンビン含有溶液では、 3 7 °Cで 2週間保存後の凝固時間の初期凝固時間に対する相対⁰ /oは 1 20%を超えていたのに対し、 β ■ r—トロンビンの活性比率が 20%以下（条件 1 _4) の含有溶液では、 1 1 0%未満であった

。以上より、本発明のトロンビン含有溶液は溶液中で安定であり、液状のフイブリノゲン測定用試薬として有用なことが確認された。

Claims

請求の範囲

[1 ] トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するひ一トロンビン含量を少なくとも 7 0 %以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のひ一トロンビンの安定化方法。

[2] トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対する; S _及び/又は r _トロンビン含量が 3 0 %未満である請求項 1記載の安定化方法。

[3] トロンビン含有溶液の p Hが 4〜 9である請求項 1又は 2記載の安定化方法。

[4] 全トロンビンに対してひ一トロンビンを 7 0 %以上含有することを特徴とするトロンビン含有溶液。

[5] トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対する; S _及び/又は r _トロンビンの含有比率が 3 0 %未満である請求項 4記載の溶液。

[6] p Hが 4〜 9である請求項 4又は 5記載の溶液。

[7] 請求項 4〜 6の何れか 1項記載のトロンビン含有溶液を含む液状のフイブリノゲン測定用試薬。