JP2002526557A - トロンボプラスチン試薬ならびにそのような試薬の製造および使用方法 - Google Patents
トロンボプラスチン試薬ならびにそのような試薬の製造および使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
哺乳動物トロンボプラスチン試薬およびそのような試薬の製造方法を開示する。該トロンボプラスチン試薬はプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイに用いるのに適しており、許容されるＰＴ正常時間での感度の改良をもたらす。夾雑タンパク質、特に血漿凝固因子は、トロンボプラスチン溶液を半透膜に曝露し、凝固因子はトロンボプラスチン溶液から膜を通過するが、組織因子はトロンボプラスチン溶液中に保持される、膜透過プロトコールによりトロンボプラスチン溶液から分離される。好ましい方法では、１またはそれ以上の夾雑凝固因子を、ディアフィルトレーションにより哺乳動物組織のＮａＣｌ／クエン酸Ｎａ３トロンボプラスチン抽出物から分離し、精製トロンボプラスチン抽出物をＣａ＋＋イオンと混合し、トロンボプラスチン試薬を形成する。
Description
【０００１】 （発明の背景） 本発明は、一般的には診断的凝固アッセイ、詳細にはトロンボプラスチンベー
スの凝固アッセイに用いるのに適したトロンボプラスチン試薬に関する。具体的
には、好ましい態様において本発明は、哺乳動物のトロンボプラスチン抽出物、
そのような抽出物の製造方法、それから製造したトロンボプラスチン試薬、およ
びそのような試薬のプロトロンビン時間アッセイにおける使用に関する。 トロンボプラスチン試薬には、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）の存在下で血漿
試料に曝露したとき血管凝固の外部経路を活性化する活性組織因子が含まれる。
より詳細には、組織因子は、Ｃａ＋＋存在下で第ＶII因子を活性化し、次いで第
Ｘ因子および第Ｖ因子を活性化してプロトロンビン（第II因子）からトロンビン
の形成を開始する。トロンビンは、フィブリノーゲンを開裂させてフィブリンを
形成するセリンエンドペプチダーゼである。単量体として可溶性であるフィブリ
ンは、重合して軟らかい血餅を形成し、次いで架橋して硬い血餅を形成する。ト
ロンボプラスチン試薬と血漿試料を混合して血餅を形成するのに要する時間が、
血漿のプロコアグラント活性の尺度となる。
スの凝固アッセイに用いるのに適したトロンボプラスチン試薬に関する。具体的
には、好ましい態様において本発明は、哺乳動物のトロンボプラスチン抽出物、
そのような抽出物の製造方法、それから製造したトロンボプラスチン試薬、およ
びそのような試薬のプロトロンビン時間アッセイにおける使用に関する。 トロンボプラスチン試薬には、カルシウムイオン（Ｃａ＋＋）の存在下で血漿
試料に曝露したとき血管凝固の外部経路を活性化する活性組織因子が含まれる。
より詳細には、組織因子は、Ｃａ＋＋存在下で第ＶII因子を活性化し、次いで第
Ｘ因子および第Ｖ因子を活性化してプロトロンビン（第II因子）からトロンビン
の形成を開始する。トロンビンは、フィブリノーゲンを開裂させてフィブリンを
形成するセリンエンドペプチダーゼである。単量体として可溶性であるフィブリ
ンは、重合して軟らかい血餅を形成し、次いで架橋して硬い血餅を形成する。ト
ロンボプラスチン試薬と血漿試料を混合して血餅を形成するのに要する時間が、
血漿のプロコアグラント活性の尺度となる。
【０００２】 トロンボプラスチン試薬を用いる凝固時間に基づく診断的アッセイ（典型的に
はプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイと呼ばれる）は、外部凝固経路と関連し
た血液凝固不全を確定するのに広く用いられてきた。Quick,Am.J.Med.Soc. 190:
501(1935)参照。ＰＴアッセイは、例えば、外科手術前の患者の血漿をスクリー
ニングするのに用いられる。ＰＴアッセイは、外部凝固経路に影響を及ぼす医薬
品、例えばクマリン（Warfarint（登録商標）、Coumadin（登録商標））による
抗凝固治療をモニターするのにも用いられる。
はプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイと呼ばれる）は、外部凝固経路と関連し
た血液凝固不全を確定するのに広く用いられてきた。Quick,Am.J.Med.Soc. 190:
501(1935)参照。ＰＴアッセイは、例えば、外科手術前の患者の血漿をスクリー
ニングするのに用いられる。ＰＴアッセイは、外部凝固経路に影響を及ぼす医薬
品、例えばクマリン（Warfarint（登録商標）、Coumadin（登録商標））による
抗凝固治療をモニターするのにも用いられる。
【０００３】 ＰＴアッセイに用いるトロンボプラスチン試薬の主要な性能基準は、「正常」
血漿試料に対する凝固時間、該試薬の感度、および該試薬のロット間(lot-to-lo
t)の再現性である。Quickにより測定されたＰＴアッセイにおける正常血漿の凝
固時間は約１２秒間であり、次いで、該１２秒間の「正常ＰＴ」は米国における
トロンボプラスチン試薬の期待基準になる。トロンボプラスチン試薬は、ＰＴ正
常時間が約１２．０秒間であることが好ましいが、ある環境下では約９．０〜約
２０．０秒間の範囲の時間で十分であり、約９．０〜約１４．０秒間、好ましく
は約９．０〜約１３．０秒間の範囲の時間が一般に許容される。トロンボプラス
チン試薬の感度とは、一般に、「標準的異常」血漿試料と比較した「正常」血漿
試料について得られるＰＴアッセイ時間の動的範囲をいう。該トロンボプラスチ
ン試薬の感度を特徴付ける「標準的異常」血漿試料には、例えば、クマリン化血
漿試料（例えば、Coumarin（登録商標）処理された、国際標準比(International
Normalized Ratio)（ＩＮＲ）約３．０の血漿）血漿試料、および９９％＋第VI
I因子欠損血漿試料が含まれる。プール正常血漿（ＰＮＰ）、希釈ＰＮＰ（例え
ば、５０％希釈ＰＮＰ）に関連した凝固時間、またはそのような時間の差もトロ
ンボプラスチン試薬を評価するパラメータとして有用である。種々のトロンボプ
ラスチン試薬を用いるアッセイ間でより有意義な比較ができる比によるかもしく
は標準比として感度を数量化してよい。
血漿試料に対する凝固時間、該試薬の感度、および該試薬のロット間(lot-to-lo
t)の再現性である。Quickにより測定されたＰＴアッセイにおける正常血漿の凝
固時間は約１２秒間であり、次いで、該１２秒間の「正常ＰＴ」は米国における
トロンボプラスチン試薬の期待基準になる。トロンボプラスチン試薬は、ＰＴ正
常時間が約１２．０秒間であることが好ましいが、ある環境下では約９．０〜約
２０．０秒間の範囲の時間で十分であり、約９．０〜約１４．０秒間、好ましく
は約９．０〜約１３．０秒間の範囲の時間が一般に許容される。トロンボプラス
チン試薬の感度とは、一般に、「標準的異常」血漿試料と比較した「正常」血漿
試料について得られるＰＴアッセイ時間の動的範囲をいう。該トロンボプラスチ
ン試薬の感度を特徴付ける「標準的異常」血漿試料には、例えば、クマリン化血
漿試料（例えば、Coumarin（登録商標）処理された、国際標準比(International
Normalized Ratio)（ＩＮＲ）約３．０の血漿）血漿試料、および９９％＋第VI
I因子欠損血漿試料が含まれる。プール正常血漿（ＰＮＰ）、希釈ＰＮＰ（例え
ば、５０％希釈ＰＮＰ）に関連した凝固時間、またはそのような時間の差もトロ
ンボプラスチン試薬を評価するパラメータとして有用である。種々のトロンボプ
ラスチン試薬を用いるアッセイ間でより有意義な比較ができる比によるかもしく
は標準比として感度を数量化してよい。
【０００４】 トロンボプラスチン試薬の活性組織因子は、典型的にはホモゲナイズした哺乳
動物組織またはそのアセトン粉末を塩溶液で抽出することにより得られる。トロ
ンボプラスチン抽出物（例えば、ウサギ脳、ヒト脳、またはヒト胎盤のアセトン
粉末由来の）をカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）、緩衝剤、および安定化剤と混合
して、ＰＴアッセイに使用可能な状態の活性トロンボプラスチン試薬を形成する
。しかしながら、このようにしてトロンボプラスチン抽出物から調製したトロン
ボプラスチン試薬は感度が限定される。トロンボプラスチンベースのアッセイの
感度の悪さ（insensitivity）は、トロンボプラスチン溶液中に供給源−動物夾
雑タンパク質（特にビタミンＫ依存性タンパク質、例えば第VII因子、第IX因子
、第Ｘ因子、第II因子、プロテインＣ、およびプロテインＳ）が存在することが
一因である。これら夾雑タンパク質は、トロンボプラスチン抽出物が調製される
哺乳動物組織に残存する内因性血液に由来する。
動物組織またはそのアセトン粉末を塩溶液で抽出することにより得られる。トロ
ンボプラスチン抽出物（例えば、ウサギ脳、ヒト脳、またはヒト胎盤のアセトン
粉末由来の）をカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）、緩衝剤、および安定化剤と混合
して、ＰＴアッセイに使用可能な状態の活性トロンボプラスチン試薬を形成する
。しかしながら、このようにしてトロンボプラスチン抽出物から調製したトロン
ボプラスチン試薬は感度が限定される。トロンボプラスチンベースのアッセイの
感度の悪さ（insensitivity）は、トロンボプラスチン溶液中に供給源−動物夾
雑タンパク質（特にビタミンＫ依存性タンパク質、例えば第VII因子、第IX因子
、第Ｘ因子、第II因子、プロテインＣ、およびプロテインＳ）が存在することが
一因である。これら夾雑タンパク質は、トロンボプラスチン抽出物が調製される
哺乳動物組織に残存する内因性血液に由来する。
【０００５】 トロンボプラスチン試薬の感度を改良するための１つのアプローチには、ビタ
ミンＫ依存性凝固因子の部分的吸着、次いでその、トロンボプラスチン抽出物か
らの分離が含まれる。例えば、Hawkinsら、米国特許第５２７０４５１号は、Ｂ
ａＳＯ４処理によりビタミンＫ依存性凝固因子を吸着し、次いで遠心により除去
することを含むトロンボプラスチン抽出物の製造方法を開示している。界面活性
剤およびカオトロピック物質をＢａＳＯ４と一緒に用いて夾雑物の吸着および／
または分離を増強することができる。トロンボプラスチン試薬の感度を改良する
他の方法は、試薬組成物中の抽出物、緩衝剤、安定化剤、保存剤、Ｃａ＋＋、お
よび他の物質の相対量を最適化することに集中している。そのような方法は、ト
ロンボプラスチン試薬感度の改良をもたらすが、医療従事者が期待する１２秒間
より許容できないほど長い正常ＰＴアッセイ時間をもたらす。
ミンＫ依存性凝固因子の部分的吸着、次いでその、トロンボプラスチン抽出物か
らの分離が含まれる。例えば、Hawkinsら、米国特許第５２７０４５１号は、Ｂ
ａＳＯ４処理によりビタミンＫ依存性凝固因子を吸着し、次いで遠心により除去
することを含むトロンボプラスチン抽出物の製造方法を開示している。界面活性
剤およびカオトロピック物質をＢａＳＯ４と一緒に用いて夾雑物の吸着および／
または分離を増強することができる。トロンボプラスチン試薬の感度を改良する
他の方法は、試薬組成物中の抽出物、緩衝剤、安定化剤、保存剤、Ｃａ＋＋、お
よび他の物質の相対量を最適化することに集中している。そのような方法は、ト
ロンボプラスチン試薬感度の改良をもたらすが、医療従事者が期待する１２秒間
より許容できないほど長い正常ＰＴアッセイ時間をもたらす。
【０００６】 したがって、特に米国では感度の改善をもたらすが、約１２秒間の許容される
値の正常血漿に関するＰＴアッセイ時間を維持するトロンボプラスチン試薬が求
められている。 （発明の要約） したがって、本発明の目的は、ＰＴ正常時間、感受性、ロット間の再現性に関
して関連する各性能（performance)基準を同時に満たすトロンボプラスチン試薬
を製造することである。商業的に実行可能な方法を用いてそのような試薬を製造
することも本発明の目的である。 したがって、簡単には、本発明は、組織因子と血漿凝固因子を含むトロンボプ
ラスチン溶液を半透膜の第一表面に曝露し、該膜で、該凝固因子を該トロンボプ
ラスチン溶液からろ過し、該トロンボプラスチン溶液中に組織因子が保持される
ことを含むトロンボプラスチン溶液から血漿凝固因子を分離する方法を指向する
ものである。
値の正常血漿に関するＰＴアッセイ時間を維持するトロンボプラスチン試薬が求
められている。 （発明の要約） したがって、本発明の目的は、ＰＴ正常時間、感受性、ロット間の再現性に関
して関連する各性能（performance)基準を同時に満たすトロンボプラスチン試薬
を製造することである。商業的に実行可能な方法を用いてそのような試薬を製造
することも本発明の目的である。 したがって、簡単には、本発明は、組織因子と血漿凝固因子を含むトロンボプ
ラスチン溶液を半透膜の第一表面に曝露し、該膜で、該凝固因子を該トロンボプ
ラスチン溶液からろ過し、該トロンボプラスチン溶液中に組織因子が保持される
ことを含むトロンボプラスチン溶液から血漿凝固因子を分離する方法を指向する
ものである。
【０００７】 さらに本発明は、哺乳動物組織を抽出溶液で抽出してトロンボプラスチン抽出
物を形成し、膜透過によりトロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を分離す
ることによりトロンボプラスチン抽出物組成物を製造する方法を指向する。さら
に本発明は、本方法に従って製造されるトロンボプラスチン抽出物を指向する。 さらに本発明は、膜透過によりトロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を
分離し、該トロンボプラスチン抽出物をＣａ＋＋イオンと混合することによりト
ロンボプラスチン試薬を製造する方法を指向する。さらに本発明は、本方法に従
って製造されるトロンボプラスチン試薬を指向する。 さらに本発明は、トロンボプラスチン抽出物を含むフィード溶液を、約７５，
０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有
する半透膜の第一表面に曝露し、曝露したフィード溶液を濃縮物として回収し、
該濃縮物をＣａ＋＋イオンと混合することによりトロンボプラスチン試薬を製造
する方法を指向する。さらに本発明は、本方法に従って製造されるトロンボプラ
スチン試薬を指向する。
物を形成し、膜透過によりトロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を分離す
ることによりトロンボプラスチン抽出物組成物を製造する方法を指向する。さら
に本発明は、本方法に従って製造されるトロンボプラスチン抽出物を指向する。 さらに本発明は、膜透過によりトロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を
分離し、該トロンボプラスチン抽出物をＣａ＋＋イオンと混合することによりト
ロンボプラスチン試薬を製造する方法を指向する。さらに本発明は、本方法に従
って製造されるトロンボプラスチン試薬を指向する。 さらに本発明は、トロンボプラスチン抽出物を含むフィード溶液を、約７５，
０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有
する半透膜の第一表面に曝露し、曝露したフィード溶液を濃縮物として回収し、
該濃縮物をＣａ＋＋イオンと混合することによりトロンボプラスチン試薬を製造
する方法を指向する。さらに本発明は、本方法に従って製造されるトロンボプラ
スチン試薬を指向する。
【０００８】 さらに本発明は、哺乳動物組織から抽出した組織因子とＣａ＋＋イオンを含む
トロンボプラスチン試薬を指向する。プロトロンビン時間アッセイにより決定さ
れるプロコアグラント活性を有する、ヘモグロビン濃度が約２．０ｍｇ／ｄｌ以
下のトロンボプラスチン試薬。 さらに本発明は、トロンボプラスチン試薬を得るかもしくは製造し、該トロン
ボプラスチン試薬と血漿試料を混合してアッセイ溶液を形成し、該アッセイ溶液
の形成から該アッセイ溶液中の血餅形成が検出されるまでの経過時間を測定する
ことにより血漿試料の凝固時間を測定する方法も指向する。さらに本発明は、種
々の既知レベルの血漿凝固因子を有する標準血漿の凝固時間を決定し、標準血漿
の凝固時間と標準血漿中の血漿凝固因子レベルの標準相関を求め、被検血漿の凝
固時間を測定し、標準偏差に基づく血漿凝固因子レベルに測定した被検血漿の凝
固時間を相関させることにより被検血漿中に存在する血漿凝固因子レベルを測定
する方法を提供する。
トロンボプラスチン試薬を指向する。プロトロンビン時間アッセイにより決定さ
れるプロコアグラント活性を有する、ヘモグロビン濃度が約２．０ｍｇ／ｄｌ以
下のトロンボプラスチン試薬。 さらに本発明は、トロンボプラスチン試薬を得るかもしくは製造し、該トロン
ボプラスチン試薬と血漿試料を混合してアッセイ溶液を形成し、該アッセイ溶液
の形成から該アッセイ溶液中の血餅形成が検出されるまでの経過時間を測定する
ことにより血漿試料の凝固時間を測定する方法も指向する。さらに本発明は、種
々の既知レベルの血漿凝固因子を有する標準血漿の凝固時間を決定し、標準血漿
の凝固時間と標準血漿中の血漿凝固因子レベルの標準相関を求め、被検血漿の凝
固時間を測定し、標準偏差に基づく血漿凝固因子レベルに測定した被検血漿の凝
固時間を相関させることにより被検血漿中に存在する血漿凝固因子レベルを測定
する方法を提供する。
【０００９】 さらに本発明は、哺乳動物組織を、少なくとも約７ｍＭの濃度のクエン酸ナト
リウムを含む抽出溶液と接触させることにより組織因子を該組織から抽出溶液中
に抽出し、抽出された組織から該抽出溶液を分離することによりトロンボプラス
チン抽出物を製造する方法を指向する。 さらに本発明は、カルシウム緩衝物質を用いてトロンボプラスチン試薬の遊離
カルシウムイオン含有量を調節することを含むトロンボプラスチン試薬の感度を
調節する方法を指向する。さらに本発明は、カルシウム緩衝剤（物質）を含むト
ロンボプラスチン抽出物を調製し、該トロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因
子を分離して精製トロンボプラスチン抽出物を形成し、該精製トロンボプラスチ
ン抽出物にカルシウム緩衝剤を加えることによりトロンボプラスチン試薬を製造
する方法を指向する。
リウムを含む抽出溶液と接触させることにより組織因子を該組織から抽出溶液中
に抽出し、抽出された組織から該抽出溶液を分離することによりトロンボプラス
チン抽出物を製造する方法を指向する。 さらに本発明は、カルシウム緩衝物質を用いてトロンボプラスチン試薬の遊離
カルシウムイオン含有量を調節することを含むトロンボプラスチン試薬の感度を
調節する方法を指向する。さらに本発明は、カルシウム緩衝剤（物質）を含むト
ロンボプラスチン抽出物を調製し、該トロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因
子を分離して精製トロンボプラスチン抽出物を形成し、該精製トロンボプラスチ
ン抽出物にカルシウム緩衝剤を加えることによりトロンボプラスチン試薬を製造
する方法を指向する。
【００１０】 さらに本発明は、哺乳動物組織を、ホスホリパーゼインヒビターを含む抽出溶
液で抽出することによりトロンボプラスチン抽出物を製造する方法を指向する。
本発明は、トロンボプラスチン抽出物とホスホリパーゼインヒビターを混合する
ことによりトロンボプラスチン抽出物を安定化する方法を提供する。さらに本発
明は、ホスホリパーゼインヒビターを含むトロンボプラスチン抽出物を指向する
。 本発明のトロンボプラスチン試薬は、好ましい態様において、（１）９．０〜
１３．０秒間の許容範囲内の正常ＰＴ時間、および（２）以下の各特徴づけ基準
について許容される感度を同時に提供することにより種々の先行技術のトロンボ
プラスチン試薬に対する実質的な長所をもたらす。少なくとも約４０秒間の、国
際標準化比（ＩＮＲ）が約３．０であるクマリン化血漿の動的範囲（dynamic ra
nge)、本診断的および／または治療的範囲（好ましくは少なくとも約４０秒間）
をカバーするに充分な長さの９９％＋第VII因子欠損血漿の動的範囲、約３秒間
〜約６秒間の範囲の５０％プール正常血清（対１００％ＰＮＰ）の動的範囲、お
よび約１．４以下の国際感度指数（ＩＳＩ）。実際にトロンボプラスチン試薬は
、広範囲の診断に応用するＰＴアッセイに有効に用いることができる。さらに、
本明細書に開示した、トロンボプラスチン抽出物および試薬を製造する方法は有
効で再現性がある。実際にこれらの方法は、改良されたトロンボプラスチン試薬
を製造するための商業的に実行可能な手段を提供する。
液で抽出することによりトロンボプラスチン抽出物を製造する方法を指向する。
本発明は、トロンボプラスチン抽出物とホスホリパーゼインヒビターを混合する
ことによりトロンボプラスチン抽出物を安定化する方法を提供する。さらに本発
明は、ホスホリパーゼインヒビターを含むトロンボプラスチン抽出物を指向する
。 本発明のトロンボプラスチン試薬は、好ましい態様において、（１）９．０〜
１３．０秒間の許容範囲内の正常ＰＴ時間、および（２）以下の各特徴づけ基準
について許容される感度を同時に提供することにより種々の先行技術のトロンボ
プラスチン試薬に対する実質的な長所をもたらす。少なくとも約４０秒間の、国
際標準化比（ＩＮＲ）が約３．０であるクマリン化血漿の動的範囲（dynamic ra
nge)、本診断的および／または治療的範囲（好ましくは少なくとも約４０秒間）
をカバーするに充分な長さの９９％＋第VII因子欠損血漿の動的範囲、約３秒間
〜約６秒間の範囲の５０％プール正常血清（対１００％ＰＮＰ）の動的範囲、お
よび約１．４以下の国際感度指数（ＩＳＩ）。実際にトロンボプラスチン試薬は
、広範囲の診断に応用するＰＴアッセイに有効に用いることができる。さらに、
本明細書に開示した、トロンボプラスチン抽出物および試薬を製造する方法は有
効で再現性がある。実際にこれらの方法は、改良されたトロンボプラスチン試薬
を製造するための商業的に実行可能な手段を提供する。
【００１１】 本発明の他の特徴、目的、および利点の一部は当業者に明らかであろうし、そ
の一部を以下に示す。本明細書に引用した全ての参考文献は本明細書の一部を構
成する。さらに本明細書に開示および／またはクレームした対象物に関する特許
および非特許文献は重要であり、そのような対象物についてさらなる教示をもた
らす多くの関連参考文献は当業者が利用できる。
の一部を以下に示す。本明細書に引用した全ての参考文献は本明細書の一部を構
成する。さらに本明細書に開示および／またはクレームした対象物に関する特許
および非特許文献は重要であり、そのような対象物についてさらなる教示をもた
らす多くの関連参考文献は当業者が利用できる。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明では、夾雑タンパク質、例えば凝固因子は、膜透過によりトロンボプラ
スチン溶液から分離される。該トロンボプラスチン溶液を半透膜に曝露すること
により、夾雑タンパク質は該膜で該トロンボプラスチン溶液からろ過されるが、
生物学的に活性な組織因子はトロンボプラスチン溶液中に保持される。好ましい
方法では、１またはそれ以上の夾雑凝固因子を透析により哺乳動物組織のトロン
ボプラスチン抽出物から分離し、精製したトロンボプラスチン抽出物をＣａ＋＋ イオンと混合し、トロンボプラスチン試薬を形成する。
スチン溶液から分離される。該トロンボプラスチン溶液を半透膜に曝露すること
により、夾雑タンパク質は該膜で該トロンボプラスチン溶液からろ過されるが、
生物学的に活性な組織因子はトロンボプラスチン溶液中に保持される。好ましい
方法では、１またはそれ以上の夾雑凝固因子を透析により哺乳動物組織のトロン
ボプラスチン抽出物から分離し、精製したトロンボプラスチン抽出物をＣａ＋＋ イオンと混合し、トロンボプラスチン試薬を形成する。
【００１３】 本明細書で用いている用語「組織因子」は、外部経路を通して血液凝固を開始
する生物活性を有する完全膜糖タンパク質を表す。組織因子は、タンパク質成分
（本明細書では「組織因子タンパク質」と呼ぶ）および脂質成分を含む。組織因
子の脂質成分は主としてリン脂質を含む。組織因子は天然の組織因子、例えば哺
乳動物抽出物に含まれるものであるか、または例えば、単離されるかまたは組換
えにより製造された組織因子タンパク質とリン脂質を適切な比で混合することに
より合成的に製造することができる。米国特許第５０１７５５６号およびその中
で引用された参考文献参照。
する生物活性を有する完全膜糖タンパク質を表す。組織因子は、タンパク質成分
（本明細書では「組織因子タンパク質」と呼ぶ）および脂質成分を含む。組織因
子の脂質成分は主としてリン脂質を含む。組織因子は天然の組織因子、例えば哺
乳動物抽出物に含まれるものであるか、または例えば、単離されるかまたは組換
えにより製造された組織因子タンパク質とリン脂質を適切な比で混合することに
より合成的に製造することができる。米国特許第５０１７５５６号およびその中
で引用された参考文献参照。
【００１４】 本明細書で用いている用語「トロンボプラスチン溶液」は、溶液を作製する方
法や溶液中に他の成分が存在するか否かに関わらず、生物学的に活性な組織因子
と１またはそれ以上の血漿凝固因子を含む溶液である。実際に、用語「トロンボ
プラスチン溶液」はその範囲内に、以下で定義する「トロンボプラスチン抽出物
」および「トロンボプラスチン試薬」を含む。本明細書で用いている「トロンボ
プラスチン抽出物」は、哺乳動物組織からの抽出物として得られる、生物学的に
活性な組織因子と１またはそれ以上の結晶凝固因子を含むトロンボプラスチン溶
液を表す。本明細書で用いている「トロンボプラスチン試薬」は、組織因子の供
給源や製造方法に関わらず、生物学的に活性な組織因子、１またはそれ以上の血
漿凝固因子、およびカルシウムイオン、Ｃａ＋＋を含むトロンボプラスチン溶液
を表す。
法や溶液中に他の成分が存在するか否かに関わらず、生物学的に活性な組織因子
と１またはそれ以上の血漿凝固因子を含む溶液である。実際に、用語「トロンボ
プラスチン溶液」はその範囲内に、以下で定義する「トロンボプラスチン抽出物
」および「トロンボプラスチン試薬」を含む。本明細書で用いている「トロンボ
プラスチン抽出物」は、哺乳動物組織からの抽出物として得られる、生物学的に
活性な組織因子と１またはそれ以上の結晶凝固因子を含むトロンボプラスチン溶
液を表す。本明細書で用いている「トロンボプラスチン試薬」は、組織因子の供
給源や製造方法に関わらず、生物学的に活性な組織因子、１またはそれ以上の血
漿凝固因子、およびカルシウムイオン、Ｃａ＋＋を含むトロンボプラスチン溶液
を表す。
【００１５】 本明細書に開示した分離法はあらゆるトロンボプラスチン溶液に応用可能であ
るが、血漿凝固因子はトロンボプラスチン抽出物から分離するのが好ましい（Ｃ
ａ＋＋含有トロンボプラスチン試薬を形成する前に）。トロンボプラスチン抽出
物は、当該分野で知られ、そして／または後に開発されるあらゆる多くのプロト
コールにより調製することができる。トロンボプラスチン抽出物は新たに調製す
るか、調製し、凍結保存し、次いで解凍するか、または他の方法でそのプロコア
グラント活性を保存することができる。
るが、血漿凝固因子はトロンボプラスチン抽出物から分離するのが好ましい（Ｃ
ａ＋＋含有トロンボプラスチン試薬を形成する前に）。トロンボプラスチン抽出
物は、当該分野で知られ、そして／または後に開発されるあらゆる多くのプロト
コールにより調製することができる。トロンボプラスチン抽出物は新たに調製す
るか、調製し、凍結保存し、次いで解凍するか、または他の方法でそのプロコア
グラント活性を保存することができる。
【００１６】 トロンボプラスチン抽出物は哺乳動物組織から組織因子を抽出することにより
調製することができる。哺乳動物組織は、例えばヒト、ウサギ、ウシ、ブタ、お
よび／またはヒト以外の霊長類の脳、肺、および／または胎盤を含む、抽出可能
な生物学的に活性な組織因子を有するあらゆる哺乳動物の組織であり得る。ウサ
ギ脳、ヒト脳、およびヒト胎盤がトロンボプラスチン抽出物の好ましい組織供給
源である。該組織を抽出前に洗浄し、残留血液を除去してよい。抽出すべき組織
は、全組織またはホモゲナイズした組織、および所望により、脱水した組織であ
り得る。脱水組織の形の例には、組織または凍結乾燥組織の溶媒粉末（例えばア
セトン粉末）が含まれる。そのような脱水組織は、例えばSigma Chemical, St.L
ouis, MOから市販されている。最も好ましい組織供給源はウサギ脳アセトン粉末
（ＲＢＡＰ）である。
調製することができる。哺乳動物組織は、例えばヒト、ウサギ、ウシ、ブタ、お
よび／またはヒト以外の霊長類の脳、肺、および／または胎盤を含む、抽出可能
な生物学的に活性な組織因子を有するあらゆる哺乳動物の組織であり得る。ウサ
ギ脳、ヒト脳、およびヒト胎盤がトロンボプラスチン抽出物の好ましい組織供給
源である。該組織を抽出前に洗浄し、残留血液を除去してよい。抽出すべき組織
は、全組織またはホモゲナイズした組織、および所望により、脱水した組織であ
り得る。脱水組織の形の例には、組織または凍結乾燥組織の溶媒粉末（例えばア
セトン粉末）が含まれる。そのような脱水組織は、例えばSigma Chemical, St.L
ouis, MOから市販されている。最も好ましい組織供給源はウサギ脳アセトン粉末
（ＲＢＡＰ）である。
【００１７】 哺乳動物組織を、溶液、好ましくは塩溶液、最も好ましくは無機および／また
は有機塩の水性溶液と接触させて該組織から組織因子を抽出する。抽出溶液は実
質的にカルシウムイオンを含まないことが好ましい。好ましい水性抽出溶液には
塩素塩および／または乳酸塩、酢酸塩もしくはクエン酸塩が含まれる。塩化ナト
リウムおよびクエン酸ナトリウムを含む水性溶液が最も好ましい抽出溶液である
。例えば、実施例１および２参照。好ましい抽出溶液中のクエン酸ナトリウム濃
度の範囲は５ｍＭ以上〜約５０ｍＭ、より好ましくは約７ｍＭ〜約１５ｍＭ、最
も好ましくは約１３ｍＭである。無機酸（例えばＮａＣｌ）と混合して用いる時
のクエン酸ナトリウムと無機酸のモル比の範囲は約１：１０〜約１：１、好まし
くは約１：５である。ナトリウムと違ってカルシウムはある種の血漿凝固因子（
例えば第VII因子）と組織因子の複合体形成を促進するため、クエン酸ナトリウ
ムを含む抽出溶液による抽出が、クエン酸カルシウムまたは他のカルシウム塩を
用いるより有利である。
は有機塩の水性溶液と接触させて該組織から組織因子を抽出する。抽出溶液は実
質的にカルシウムイオンを含まないことが好ましい。好ましい水性抽出溶液には
塩素塩および／または乳酸塩、酢酸塩もしくはクエン酸塩が含まれる。塩化ナト
リウムおよびクエン酸ナトリウムを含む水性溶液が最も好ましい抽出溶液である
。例えば、実施例１および２参照。好ましい抽出溶液中のクエン酸ナトリウム濃
度の範囲は５ｍＭ以上〜約５０ｍＭ、より好ましくは約７ｍＭ〜約１５ｍＭ、最
も好ましくは約１３ｍＭである。無機酸（例えばＮａＣｌ）と混合して用いる時
のクエン酸ナトリウムと無機酸のモル比の範囲は約１：１０〜約１：１、好まし
くは約１：５である。ナトリウムと違ってカルシウムはある種の血漿凝固因子（
例えば第VII因子）と組織因子の複合体形成を促進するため、クエン酸ナトリウ
ムを含む抽出溶液による抽出が、クエン酸カルシウムまたは他のカルシウム塩を
用いるより有利である。
【００１８】 所望により該組織の抽出は、Hawkinsらの、米国特許第５，２７０，４５１号
に記載のごとく界面活性剤（例えば、Triton（登録商標）X-100のような非イオ
ン性界面活性剤）、カオトロピック物質（例えばチオシアネート）、および／ま
たは吸着剤（例えばＢａＳＯ４）の存在下で行うこともできる。例えば実施例３
Ｄ参照。抽出溶液は、例えばBarrowsらの米国特許第５，３９１，３８０号に記
載のごとく金属キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含
むかまたは該金属キレート剤と混合することもできる。例えば実施例３Ｄ参照。
しかしながら、以下に述べるように、そのようなキレート剤は、抽出後の膜分離
前にトロンボプラスチン抽出物に加えることが好ましく、さらにBarrowsらの記
載より高い濃度で用いることが好ましい。
に記載のごとく界面活性剤（例えば、Triton（登録商標）X-100のような非イオ
ン性界面活性剤）、カオトロピック物質（例えばチオシアネート）、および／ま
たは吸着剤（例えばＢａＳＯ４）の存在下で行うこともできる。例えば実施例３
Ｄ参照。抽出溶液は、例えばBarrowsらの米国特許第５，３９１，３８０号に記
載のごとく金属キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含
むかまたは該金属キレート剤と混合することもできる。例えば実施例３Ｄ参照。
しかしながら、以下に述べるように、そのようなキレート剤は、抽出後の膜分離
前にトロンボプラスチン抽出物に加えることが好ましく、さらにBarrowsらの記
載より高い濃度で用いることが好ましい。
【００１９】 抽出ｐＨ、温度、および持続時間に決定的重要性はなく、当該分野の一般的技
能内であるが、該抽出は約６．５〜約８．５の範囲、好ましくは約８．０のｐＨ
、および約３０℃〜約５０℃の範囲、好ましくは約４５℃で、約１０分〜約１時
間の範囲、好ましくは約１５分間行うのが好ましい。抽出混合物は、抽出中攪拌
し（stir)、そして／または他の方法で攪拌する(agitate)のが好ましい。抽出後
、好ましくは遠心分離によりトロンボプラスチン抽出物溶液を残りの抽出組織か
ら分離する。 トロンボプラスチン抽出物の安定性は、抽出溶液または得られたトロンボプラ
スチン抽出物をホスホリパーゼインヒビターと混合することにより改良すること
ができる。請求の範囲に具体的に示していない理論による結びつけなしに、トロ
ンボプラスチン抽出物に存在するホスホリパーゼ夾雑物は、該抽出物調製後の時
間経過につれ、該抽出物のプロコアグラント活性に対して悪影響を及ぼすと考え
られる。好ましいホスホリパーゼインヒビターはＤ６０９である。ホスホリパー
ゼインヒビターに関する実験データに関する実施例５参照。
能内であるが、該抽出は約６．５〜約８．５の範囲、好ましくは約８．０のｐＨ
、および約３０℃〜約５０℃の範囲、好ましくは約４５℃で、約１０分〜約１時
間の範囲、好ましくは約１５分間行うのが好ましい。抽出混合物は、抽出中攪拌
し（stir)、そして／または他の方法で攪拌する(agitate)のが好ましい。抽出後
、好ましくは遠心分離によりトロンボプラスチン抽出物溶液を残りの抽出組織か
ら分離する。 トロンボプラスチン抽出物の安定性は、抽出溶液または得られたトロンボプラ
スチン抽出物をホスホリパーゼインヒビターと混合することにより改良すること
ができる。請求の範囲に具体的に示していない理論による結びつけなしに、トロ
ンボプラスチン抽出物に存在するホスホリパーゼ夾雑物は、該抽出物調製後の時
間経過につれ、該抽出物のプロコアグラント活性に対して悪影響を及ぼすと考え
られる。好ましいホスホリパーゼインヒビターはＤ６０９である。ホスホリパー
ゼインヒビターに関する実験データに関する実施例５参照。
【００２０】 ある態様では、トロンボプラスチン溶液をタンパク質分解酵素で処理後に、夾
雑タンパク質をトロンボプラスチン溶液、好ましくはトロンボプラスチン抽出物
から分離する。タンパク質分解酵素は夾雑タンパク質に対するタンパク質分解活
性を有するが組織因子に対しては実質的に活性でないことが好ましく、実際に、
組織因子のプロコアグラント活性に実質的に影響を及ぼさない。キモトリプシン
が好ましいタンパク質分解酵素である。トロンボプラスチン抽出物中の夾雑タン
パク質を酵素的に消化して夾雑タンパク質断片を形成させる。キモトリプシン（
１０１８Ｕ／ｍｇ）を用いる好ましいアプローチにおいて、濃度範囲約１μｇ／
ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、最も好
ましくは約３μｇ／ｍｌのキモトリプシンをトロンボプラスチン抽出物に加え、
室温で一夜インキュベートする。しかしながら、他の濃度、温度およびインキュ
ベーションを適切に用いてよい。次に、消化した夾雑タンパク質断片をトロンボ
プラスチン抽出物から分離して精製されたトロンボプラスチン抽出物を形成する
ことができる。そのような分離は下記の膜透過により行うのが好ましい。夾雑タ
ンパク質の酵素的消化に関する実験データに関する実施例５参照。
雑タンパク質をトロンボプラスチン溶液、好ましくはトロンボプラスチン抽出物
から分離する。タンパク質分解酵素は夾雑タンパク質に対するタンパク質分解活
性を有するが組織因子に対しては実質的に活性でないことが好ましく、実際に、
組織因子のプロコアグラント活性に実質的に影響を及ぼさない。キモトリプシン
が好ましいタンパク質分解酵素である。トロンボプラスチン抽出物中の夾雑タン
パク質を酵素的に消化して夾雑タンパク質断片を形成させる。キモトリプシン（
１０１８Ｕ／ｍｇ）を用いる好ましいアプローチにおいて、濃度範囲約１μｇ／
ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、最も好
ましくは約３μｇ／ｍｌのキモトリプシンをトロンボプラスチン抽出物に加え、
室温で一夜インキュベートする。しかしながら、他の濃度、温度およびインキュ
ベーションを適切に用いてよい。次に、消化した夾雑タンパク質断片をトロンボ
プラスチン抽出物から分離して精製されたトロンボプラスチン抽出物を形成する
ことができる。そのような分離は下記の膜透過により行うのが好ましい。夾雑タ
ンパク質の酵素的消化に関する実験データに関する実施例５参照。
【００２１】 消化夾雑タンパク質断片と非消化夾雑タンパク質を含む夾雑タンパク質を、ト
ロンボプラスチン溶液から、好ましくはトロンボプラスチン抽出物から膜透過に
より分離することができる。例えば、実施例３Ａ〜３Ｆ参照。本明細書で用いて
いる用語「膜透過」は、フィード溶液中の第一分子種（例えば凝固因子）が膜を
挟む濃度および／または圧の差により半透膜を通して輸送されるが、フィード溶
液中の第二分子種（例えば組織因子）は該膜を通して輸送されないかまたは遅い
速度で輸送されることにより第一分子種と第二分子種の分離が行われる分離方法
をいう。一般的にはPerry's Chemical Engineers' Handbook、第六版、17/14-17
/33頁、McGraw-Hill(1984)参照。溶媒は、フィード溶液から半透膜を通して凝固
因子に付随してよい。
ロンボプラスチン溶液から、好ましくはトロンボプラスチン抽出物から膜透過に
より分離することができる。例えば、実施例３Ａ〜３Ｆ参照。本明細書で用いて
いる用語「膜透過」は、フィード溶液中の第一分子種（例えば凝固因子）が膜を
挟む濃度および／または圧の差により半透膜を通して輸送されるが、フィード溶
液中の第二分子種（例えば組織因子）は該膜を通して輸送されないかまたは遅い
速度で輸送されることにより第一分子種と第二分子種の分離が行われる分離方法
をいう。一般的にはPerry's Chemical Engineers' Handbook、第六版、17/14-17
/33頁、McGraw-Hill(1984)参照。溶媒は、フィード溶液から半透膜を通して凝固
因子に付随してよい。
【００２２】 トロンボプラスチン溶液から分離されるタンパク質は好ましくは血漿凝固因子
である。特に、外部凝固経路に影響を及ぼす１またはそれ以上の血漿凝固因子（
主としてビタミンＫ依存性凝固因子（例えば第VII因子、第II因子、第Ｘ因子、
第IX因子、第XI因子、および第XII因子）、プロテインＣ、プロテインＳ、およ
びプロテインＺを含む）を分離するのに有利である。特に、少なくとも第VII因
子をトロンボプラスチン溶液から分離するのが望ましい。ヘモグロビン（Ｈｂ）
のような他の夾雑タンパク質も本発明の方法に従って効果的に分離することがで
きる。好ましくは、前記各血漿凝固因子はトロンボプラスチン溶液から単一操作
で同時に分離される。しかしながら、所望により一連の工程操作を用いてそのよ
うな夾雑タンパク質を選択的に分離することができる。さらに、すべての特定の
凝固因子を完全に分離することは本発明の利益を得るのに必須ではない。どちら
かといえば、特定凝固因子（例えば第VII因子）の部分的分離／除去でもトロン
ボプラスチン試薬の感度を商業的に意味がある程度に改良することができる。
である。特に、外部凝固経路に影響を及ぼす１またはそれ以上の血漿凝固因子（
主としてビタミンＫ依存性凝固因子（例えば第VII因子、第II因子、第Ｘ因子、
第IX因子、第XI因子、および第XII因子）、プロテインＣ、プロテインＳ、およ
びプロテインＺを含む）を分離するのに有利である。特に、少なくとも第VII因
子をトロンボプラスチン溶液から分離するのが望ましい。ヘモグロビン（Ｈｂ）
のような他の夾雑タンパク質も本発明の方法に従って効果的に分離することがで
きる。好ましくは、前記各血漿凝固因子はトロンボプラスチン溶液から単一操作
で同時に分離される。しかしながら、所望により一連の工程操作を用いてそのよ
うな夾雑タンパク質を選択的に分離することができる。さらに、すべての特定の
凝固因子を完全に分離することは本発明の利益を得るのに必須ではない。どちら
かといえば、特定凝固因子（例えば第VII因子）の部分的分離／除去でもトロン
ボプラスチン試薬の感度を商業的に意味がある程度に改良することができる。
【００２３】 トロンボプラスチン溶液に加え、フィード溶液はトロンボプラスチン溶液、特
に組織因子からの１またはそれ以上の血漿凝固因子の分離を促進する分離増強添
加剤も含むことができる。理論による結びつけはないが、抽出組織因子と結合し
ている夾雑血漿凝固因子は抽出溶液に溶解している遊離凝固因子、または比較的
大きい組織因子結合小胞との複合凝固因子であると考えることができる。実際に
、複合凝固因子を崩壊させてより分離しやすくすることができる分離増強添加剤
を有利に用いることができる。例えば第VII因子はカルシウム依存性に組織因子
と複合化することが知られている。実際に、第VII因子と組織因子の親和性を減
らすためにフィード溶液中にカルシウムキレート剤、例えばエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはその塩を含むことが好ましい。例えば実施例３Ｂ参照
。他のカルシウムキレート剤、例えばシトレート、クエン酸塩、およびエチレン
ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸も同様に用いてよい。ＥＤＴＡが好まし
いカルシウムキレート剤であり、フィード溶液に濃度範囲約１ｍＭ〜約５０ｍＭ
、より好ましくは約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭで含まれる
のが好ましい。トロンボプラスチン溶液がトロンボプラスチン抽出物であり、Ｅ
ＤＴＡのような金属イオンキレート剤が抽出溶液に含まれる場合は、第VII因子
と組織因子の親和性を減らすのにさらにＥＤＴＡは必要ないであろう。他の分離
剤、例えば界面活性剤、カオトロピック剤、緩衝剤などもフィード溶液に含まれ
ていてよい。非イオン性界面活性剤、例えばTriton X-100（登録商標）および／
またはＣＨＡＰＳを適切に用いることができる。例えば実施例３Ｄ参照。
に組織因子からの１またはそれ以上の血漿凝固因子の分離を促進する分離増強添
加剤も含むことができる。理論による結びつけはないが、抽出組織因子と結合し
ている夾雑血漿凝固因子は抽出溶液に溶解している遊離凝固因子、または比較的
大きい組織因子結合小胞との複合凝固因子であると考えることができる。実際に
、複合凝固因子を崩壊させてより分離しやすくすることができる分離増強添加剤
を有利に用いることができる。例えば第VII因子はカルシウム依存性に組織因子
と複合化することが知られている。実際に、第VII因子と組織因子の親和性を減
らすためにフィード溶液中にカルシウムキレート剤、例えばエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはその塩を含むことが好ましい。例えば実施例３Ｂ参照
。他のカルシウムキレート剤、例えばシトレート、クエン酸塩、およびエチレン
ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸も同様に用いてよい。ＥＤＴＡが好まし
いカルシウムキレート剤であり、フィード溶液に濃度範囲約１ｍＭ〜約５０ｍＭ
、より好ましくは約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭで含まれる
のが好ましい。トロンボプラスチン溶液がトロンボプラスチン抽出物であり、Ｅ
ＤＴＡのような金属イオンキレート剤が抽出溶液に含まれる場合は、第VII因子
と組織因子の親和性を減らすのにさらにＥＤＴＡは必要ないであろう。他の分離
剤、例えば界面活性剤、カオトロピック剤、緩衝剤などもフィード溶液に含まれ
ていてよい。非イオン性界面活性剤、例えばTriton X-100（登録商標）および／
またはＣＨＡＰＳを適切に用いることができる。例えば実施例３Ｄ参照。
【００２４】 所望により、膜透過操作は希釈溶液および／または担体溶液を含んでいてもよ
い。希釈溶液は、フィード溶液由来の溶媒を凝固因子と共に該膜を通して移動さ
せるプロセスに用いられる。希釈剤を用いて溶媒がフィード溶液から除去される
ようにフィード溶液を構成もしくは再希釈する。担体溶液を、フィード溶液に対
して膜の反対側に用いる。担体溶液は、典型的には濃度差により生じる拡散に基
づくマス−トランスファー操作に用いられ、フィード溶液由来の溶媒を膜を通し
て凝固因子と共に移動させる圧操作プロセスには必要ではない。それにも関わら
ず、そのようなプロセスにも所望により担体溶液を用いることができる。担体溶
液を用いる場合は、フィード溶液中の濃度以下の濃度の夾雑タンパク質（例えば
血漿凝固因子）を有することができ（濃度操作マストランスファーを許す）、そ
して／またはフィード溶液の圧に対してより低い圧で維持することができる（溶
媒−フロー・マストランスファーを許す）。あらゆる場合において、希釈溶液お
よび／または担体溶液は半透膜を通過するので、それぞれ凝固因子を一緒に運び
（entrain)、そして／または受け取るのに適したあらゆる液体であり得る。水お
よび水性溶液が好ましい希釈および／または担体溶液である。希釈溶液および／
または担体溶液は、該プロセスで分離すべき、含まれる溶質（組織因子および１
またはそれ以上の血漿凝固因子）を除き、フィード溶液とできるだけ密接に適合
させるのが好ましい。したがって、精製されたトロンボプラスチン溶液がトロン
ボプラスチン抽出物（好ましい）である場合は、希釈／担体溶液は抽出溶液（抽
出前）として用いたのと同じ種類の溶液であり得る。分離に用いる特定の膜分離
プロトコールは、厳密に決定的ではなく、例えば、透析、浸透、逆浸透、限外ろ
過、ディアフィルトレーション（diafiltration）、電気透析などが含まれる。
以下に示すように、大溶質分画プロトコール、例えば限外ろ過またはディアフィ
ルトレーションが好ましい膜分離プロセスである。そのような各膜分離プロトコ
ールには、一般に、トロンボプラスチンフィード溶液を半透膜の第一表面に曝露
し、曝露したフィード溶液を濃縮物として回収することが含まれる。濃縮物中の
該夾雑タンパク質の濃度はフィード溶液中より低い。さらに、膜の第二表面を、
典型的には担体溶液もしくはフィード溶液由来の溶媒に曝露し、夾雑タンパク質
と共に膜でろ過する（膜を通過させる）。いずれの場合も、膜の第二表面に曝露
した液体を浸透物（permeate）と呼ぶ。担体溶液を用いる場合は、浸透物は、担
体溶液に対して分離される夾雑タンパク質で豊富化される。
い。希釈溶液は、フィード溶液由来の溶媒を凝固因子と共に該膜を通して移動さ
せるプロセスに用いられる。希釈剤を用いて溶媒がフィード溶液から除去される
ようにフィード溶液を構成もしくは再希釈する。担体溶液を、フィード溶液に対
して膜の反対側に用いる。担体溶液は、典型的には濃度差により生じる拡散に基
づくマス−トランスファー操作に用いられ、フィード溶液由来の溶媒を膜を通し
て凝固因子と共に移動させる圧操作プロセスには必要ではない。それにも関わら
ず、そのようなプロセスにも所望により担体溶液を用いることができる。担体溶
液を用いる場合は、フィード溶液中の濃度以下の濃度の夾雑タンパク質（例えば
血漿凝固因子）を有することができ（濃度操作マストランスファーを許す）、そ
して／またはフィード溶液の圧に対してより低い圧で維持することができる（溶
媒−フロー・マストランスファーを許す）。あらゆる場合において、希釈溶液お
よび／または担体溶液は半透膜を通過するので、それぞれ凝固因子を一緒に運び
（entrain)、そして／または受け取るのに適したあらゆる液体であり得る。水お
よび水性溶液が好ましい希釈および／または担体溶液である。希釈溶液および／
または担体溶液は、該プロセスで分離すべき、含まれる溶質（組織因子および１
またはそれ以上の血漿凝固因子）を除き、フィード溶液とできるだけ密接に適合
させるのが好ましい。したがって、精製されたトロンボプラスチン溶液がトロン
ボプラスチン抽出物（好ましい）である場合は、希釈／担体溶液は抽出溶液（抽
出前）として用いたのと同じ種類の溶液であり得る。分離に用いる特定の膜分離
プロトコールは、厳密に決定的ではなく、例えば、透析、浸透、逆浸透、限外ろ
過、ディアフィルトレーション（diafiltration）、電気透析などが含まれる。
以下に示すように、大溶質分画プロトコール、例えば限外ろ過またはディアフィ
ルトレーションが好ましい膜分離プロセスである。そのような各膜分離プロトコ
ールには、一般に、トロンボプラスチンフィード溶液を半透膜の第一表面に曝露
し、曝露したフィード溶液を濃縮物として回収することが含まれる。濃縮物中の
該夾雑タンパク質の濃度はフィード溶液中より低い。さらに、膜の第二表面を、
典型的には担体溶液もしくはフィード溶液由来の溶媒に曝露し、夾雑タンパク質
と共に膜でろ過する（膜を通過させる）。いずれの場合も、膜の第二表面に曝露
した液体を浸透物（permeate）と呼ぶ。担体溶液を用いる場合は、浸透物は、担
体溶液に対して分離される夾雑タンパク質で豊富化される。
【００２５】 半透膜は、１またはそれ以上の凝固因子を組織因子に対して優先的にろ過する
あらゆる物質を含むことができる。血漿凝固因子の分子量は約６０，０００ダル
トン（６０ｋＤ）である。組織因子は分子量に関して幾分不均質であり、１００
ｋＤおよび２０００ｋＤ膜を用いる膜分離試験に基づき、それぞれ組織因子の約
９０％は分子量１０００，０００ダルトン（１０００ｋＤ）以上であり、組織因
子の８０％は分子量約２０００，０００ダルトン（２０００ｋＤ）以下である。
したがって、用いる半透膜は、産業標準グロブリン様タンパク質を用いて特徴づ
けた、少なくとも約７５，０００ダルトン（７５ｋＤ）〜約２０００，０００ダ
ルトン（２０００ｋＤ）、より好ましくは少なくとも約１００，０００ダルトン
（１００ｋＤ）〜約１０００，０００ダルトン（１０００ｋＤ）、さらにより好
ましくは少なくとも約１００，０００ダルトン（１００ｋＤ）〜約５００，００
０ダルトン（５００ｋＤ）、最も好ましくは約２００，０００ダルトン（２００
ｋＤ）〜約４００，０００ダルトン（４００ｋＤ）の範囲の表示分子量カットオ
フ（ＭＷＣＯ）を有するべきである。最も好ましくは、該半透膜は、産業標準グ
ロブリン様タンパク質を用いて特徴づけた、約３００，０００ダルトン（３００
ｋＤ）の表示分子量カットオフを有するべきである。しかしながら、他の溶液の
膜分離に関する既知の産業的応用には、膜でろ過する溶液の分子量の１０倍また
はそれ以上の表示分子量カットオフを有する膜を含むことができるので、本発明
の特定の応用のために当業者が最適化試験を行った後に、約６００，０００ダル
トン（６００ｋＤ）またはそれ以上のＭＷＣＯ値がより有用であることが確定す
るかもしれない。該溶液の通過および濃縮(retention)を考慮すると、本発明の
半透膜は、目的の検出可能な血漿凝固因子の少なくとも約２５％、好ましくは少
なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは
少なくとも約９０％、なおより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは
少なくとも約９９％が膜を通過するが、検出可能な生物学的に活性な組織因子の
少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくと
も約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは
少なくとも約９０％、なおより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは
少なくとも約９９％が同時に保持されるサイズのＭＷＣＯを持つべきである。最
も好ましい半透膜は目的の検出可能な血漿凝固因子１００％を通過させるが検出
可能な組織因子１００％を保持するであろう。
あらゆる物質を含むことができる。血漿凝固因子の分子量は約６０，０００ダル
トン（６０ｋＤ）である。組織因子は分子量に関して幾分不均質であり、１００
ｋＤおよび２０００ｋＤ膜を用いる膜分離試験に基づき、それぞれ組織因子の約
９０％は分子量１０００，０００ダルトン（１０００ｋＤ）以上であり、組織因
子の８０％は分子量約２０００，０００ダルトン（２０００ｋＤ）以下である。
したがって、用いる半透膜は、産業標準グロブリン様タンパク質を用いて特徴づ
けた、少なくとも約７５，０００ダルトン（７５ｋＤ）〜約２０００，０００ダ
ルトン（２０００ｋＤ）、より好ましくは少なくとも約１００，０００ダルトン
（１００ｋＤ）〜約１０００，０００ダルトン（１０００ｋＤ）、さらにより好
ましくは少なくとも約１００，０００ダルトン（１００ｋＤ）〜約５００，００
０ダルトン（５００ｋＤ）、最も好ましくは約２００，０００ダルトン（２００
ｋＤ）〜約４００，０００ダルトン（４００ｋＤ）の範囲の表示分子量カットオ
フ（ＭＷＣＯ）を有するべきである。最も好ましくは、該半透膜は、産業標準グ
ロブリン様タンパク質を用いて特徴づけた、約３００，０００ダルトン（３００
ｋＤ）の表示分子量カットオフを有するべきである。しかしながら、他の溶液の
膜分離に関する既知の産業的応用には、膜でろ過する溶液の分子量の１０倍また
はそれ以上の表示分子量カットオフを有する膜を含むことができるので、本発明
の特定の応用のために当業者が最適化試験を行った後に、約６００，０００ダル
トン（６００ｋＤ）またはそれ以上のＭＷＣＯ値がより有用であることが確定す
るかもしれない。該溶液の通過および濃縮(retention)を考慮すると、本発明の
半透膜は、目的の検出可能な血漿凝固因子の少なくとも約２５％、好ましくは少
なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは
少なくとも約９０％、なおより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは
少なくとも約９９％が膜を通過するが、検出可能な生物学的に活性な組織因子の
少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくと
も約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは
少なくとも約９０％、なおより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは
少なくとも約９９％が同時に保持されるサイズのＭＷＣＯを持つべきである。最
も好ましい半透膜は目的の検出可能な血漿凝固因子１００％を通過させるが検出
可能な組織因子１００％を保持するであろう。
【００２６】 上記の好ましい範囲内のＭＷＣＯを有する、本発明に用いるのに適した多くの
半透膜が当該分野で知られており、市販されている。そのような半透膜は好まし
くは固体膜であり、典型的には事実上重合しているが、本発明の目的にはそのよ
うなものに限定されない。重合膜は天然ポリマーもしくは合成ポリマーであり得
、結晶および／または非晶質構造であってよい。重合膜物質の例には、とりわけ
、セルロースポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポ
リフラン、ポリアルケン、ポリアセテート、ポリビニル、およびそれらのコポリ
マーが含まれる。ポリエーテルスルホン膜が適切な膜物質である。膜は種々の形
またはデザイン、例えば「シート」、「中空線維」、「シン−チャンネル（thin
-channel)」および「パラレル−リーフ」デザインであってよく、対称もしくは
非対称であってよい。本明細書に記載の応用で用いる物質、形、対称、ポアサイ
ズ、ポア密度（多孔性）、透過性、化学安定性、熱安定性、および機械的安定性
（例えば、クリーニングに対する）の選択を含む特定の膜の選択は、当該分野の
通常技能内である。望ましくは、膜を膨潤剤で前処理し、そして／または「イン
ライン」で処理し、伸張させ、熱処理し、および／または化学的に反応させるこ
とにより、例えば多孔性およびポアサイズ（全移動速度に影響するパラメーター
）を制御することができる。好ましくは半透膜には、好ましい３００ｋＤ ＭＷ
ＣＯサイズおよび他のＭＷＣＯサイズが利用可能なDispoDialyzer（登録商標）
（Spectrum）およびPellicon XL（登録商標）（Millipore)が含まれる。
半透膜が当該分野で知られており、市販されている。そのような半透膜は好まし
くは固体膜であり、典型的には事実上重合しているが、本発明の目的にはそのよ
うなものに限定されない。重合膜は天然ポリマーもしくは合成ポリマーであり得
、結晶および／または非晶質構造であってよい。重合膜物質の例には、とりわけ
、セルロースポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ポ
リフラン、ポリアルケン、ポリアセテート、ポリビニル、およびそれらのコポリ
マーが含まれる。ポリエーテルスルホン膜が適切な膜物質である。膜は種々の形
またはデザイン、例えば「シート」、「中空線維」、「シン−チャンネル（thin
-channel)」および「パラレル−リーフ」デザインであってよく、対称もしくは
非対称であってよい。本明細書に記載の応用で用いる物質、形、対称、ポアサイ
ズ、ポア密度（多孔性）、透過性、化学安定性、熱安定性、および機械的安定性
（例えば、クリーニングに対する）の選択を含む特定の膜の選択は、当該分野の
通常技能内である。望ましくは、膜を膨潤剤で前処理し、そして／または「イン
ライン」で処理し、伸張させ、熱処理し、および／または化学的に反応させるこ
とにより、例えば多孔性およびポアサイズ（全移動速度に影響するパラメーター
）を制御することができる。好ましくは半透膜には、好ましい３００ｋＤ ＭＷ
ＣＯサイズおよび他のＭＷＣＯサイズが利用可能なDispoDialyzer（登録商標）
（Spectrum）およびPellicon XL（登録商標）（Millipore)が含まれる。
【００２７】 半透膜の特定の物理的構成は厳密に決定的ではない。半透膜は、種々のデザイ
ン、例えば「シェル・アンド・チューブ」、「プレート・アンド・フレーム」、
「スタック」、「バイフロースタック」、および「スパイラル−ワウンド（woun
d)」のモジュールとして組み立てることができる。Perry's Chemical Engineer'
s Handbook、上記参照。より大規模の商業用デザインは、典型的には、担体溶液
を含む平らな半透膜バッグのまわりにフィード溶液をタンクを通して循環させる
「タンク」形、垂直な膜が、フィード溶液と担体溶液の交互構造でサンドイッチ
状になった「フィルター−プレス」形、またはチューブ状膜（例えば中空線維膜
）がチューブを通るフィード溶液およびもし用いる場合はチューブを通る担体溶
液と共にシェル内に配置されている「シェル・アンド・チューブ」形である。 である。
ン、例えば「シェル・アンド・チューブ」、「プレート・アンド・フレーム」、
「スタック」、「バイフロースタック」、および「スパイラル−ワウンド（woun
d)」のモジュールとして組み立てることができる。Perry's Chemical Engineer'
s Handbook、上記参照。より大規模の商業用デザインは、典型的には、担体溶液
を含む平らな半透膜バッグのまわりにフィード溶液をタンクを通して循環させる
「タンク」形、垂直な膜が、フィード溶液と担体溶液の交互構造でサンドイッチ
状になった「フィルター−プレス」形、またはチューブ状膜（例えば中空線維膜
）がチューブを通るフィード溶液およびもし用いる場合はチューブを通る担体溶
液と共にシェル内に配置されている「シェル・アンド・チューブ」形である。 である。
【００２８】 半透膜は種々の分離プロトコール、種々のフロー型、および種々の操作法のた
めに適切に設計された形および配置であり得る。より詳細には、該膜および／ま
たは膜モジュールデザインは、主として膜を横切る濃度差に基づくか（例えば透
析型浸透プロセスにおいて）、または膜を横切る圧差に基づいて（例えば限外ろ
過型浸透プロセスにおいて）行われる分離に適し得る。膜およびまたは膜モジュ
ールデザインは、例えば直接もしくは衝突流（フロー）またはタンジェンシャル
フロー型を含む膜表面に対するトロンボプラスチン溶液の種々のフロー型を考慮
することができる。フィード溶液に半透膜表面を接線方向に流れさせるデザイン
は、フィード溶液の「スィーピング（sweeping)」作用により膜ポアのプラギン
グ（plugging)の程度を減らすので一般的に好ましい。担体溶液を用いる場合は
、該膜および／または膜モジュールデザインは、パラレルフロー、クロスフロー
、またはカウンターフロー型を含む膜表面に対するトロンボプラスチン溶液の種
々のフロー型を考慮することができる。操作的考慮において、該膜および／また
は膜モジュールデザインはバッチ、半連続（例えばフィード・アンド・ブリード
）、または連続操作に適し得る。
めに適切に設計された形および配置であり得る。より詳細には、該膜および／ま
たは膜モジュールデザインは、主として膜を横切る濃度差に基づくか（例えば透
析型浸透プロセスにおいて）、または膜を横切る圧差に基づいて（例えば限外ろ
過型浸透プロセスにおいて）行われる分離に適し得る。膜およびまたは膜モジュ
ールデザインは、例えば直接もしくは衝突流（フロー）またはタンジェンシャル
フロー型を含む膜表面に対するトロンボプラスチン溶液の種々のフロー型を考慮
することができる。フィード溶液に半透膜表面を接線方向に流れさせるデザイン
は、フィード溶液の「スィーピング（sweeping)」作用により膜ポアのプラギン
グ（plugging)の程度を減らすので一般的に好ましい。担体溶液を用いる場合は
、該膜および／または膜モジュールデザインは、パラレルフロー、クロスフロー
、またはカウンターフロー型を含む膜表面に対するトロンボプラスチン溶液の種
々のフロー型を考慮することができる。操作的考慮において、該膜および／また
は膜モジュールデザインはバッチ、半連続（例えばフィード・アンド・ブリード
）、または連続操作に適し得る。
【００２９】 タンジェンシャル・フロー半透膜モジュールの例には（図１を参照）、エント
ランス・エンド（入り口端）ベル３０、ミッド・セクション４０、およびイグジ
ット・エンド（出口端）ベル５０を有するタンジェンシャル・フロー型分離装置
２０中に配置された２枚の膜シート１０を含む。プレート６０は、ミッド・セク
ション４０とエントランス・エンドベル３０およびイグジット・エンドベル５０
を分離する。各膜シート１０は第一表面１１と第二表面１２を有する。トロンボ
プラスチン溶液を含むフィード溶液１００は該装置２０の該エントランスベル３
０から供給され、プレート６０中の孔６２を通してミッド・セクション４０に流
れる。ミッド・セクション４０で、フィード溶液１００は各膜シート１０の第一
表面１１と接触する。図１には示していないが、膜シート１０の第二表面１２に
曝露するために、該装置２０の担体流入口２２から同時に担体溶液を供給するこ
とができる。担体溶液が該装置２０に供給されるか否かに関わらず、フィード溶
液１００、および好ましい態様ではフィード溶液１００由来の溶媒中の１または
それ以上の凝固因子が膜シート１０から膜シート１０の間の空間７０に通過する
が、組織因子はフィード溶液中に保持される。凝固因子除去フィード溶液（濃縮
物１１０と呼ぶ）は、該装置２０の出口端ベル５０と通してミッド・セクション
４０から排出される。排出した濃縮物１１０はフィード溶液１００に対して凝固
因子が除去されている。凝固因子保持溶媒（透過物２１０と呼ぶ）は透過物出口
２４から該装置２０のミッド・セクション４０から排出される。
ランス・エンド（入り口端）ベル３０、ミッド・セクション４０、およびイグジ
ット・エンド（出口端）ベル５０を有するタンジェンシャル・フロー型分離装置
２０中に配置された２枚の膜シート１０を含む。プレート６０は、ミッド・セク
ション４０とエントランス・エンドベル３０およびイグジット・エンドベル５０
を分離する。各膜シート１０は第一表面１１と第二表面１２を有する。トロンボ
プラスチン溶液を含むフィード溶液１００は該装置２０の該エントランスベル３
０から供給され、プレート６０中の孔６２を通してミッド・セクション４０に流
れる。ミッド・セクション４０で、フィード溶液１００は各膜シート１０の第一
表面１１と接触する。図１には示していないが、膜シート１０の第二表面１２に
曝露するために、該装置２０の担体流入口２２から同時に担体溶液を供給するこ
とができる。担体溶液が該装置２０に供給されるか否かに関わらず、フィード溶
液１００、および好ましい態様ではフィード溶液１００由来の溶媒中の１または
それ以上の凝固因子が膜シート１０から膜シート１０の間の空間７０に通過する
が、組織因子はフィード溶液中に保持される。凝固因子除去フィード溶液（濃縮
物１１０と呼ぶ）は、該装置２０の出口端ベル５０と通してミッド・セクション
４０から排出される。排出した濃縮物１１０はフィード溶液１００に対して凝固
因子が除去されている。凝固因子保持溶媒（透過物２１０と呼ぶ）は透過物出口
２４から該装置２０のミッド・セクション４０から排出される。
【００３０】 別の構成例において（図２を参照）、半透膜は、入り口端ベル３０、ミッド・
セクション４０、および出口端ベル５０を有するシェル・アンド・チューブ型分
離装置２０中に構成される。チューブプレート６０は入り口端ベル３０および出
口端ベル５０とミッド・セクション４０を分離する。各膜１０は、第一内部表面
１１および第二外部表面１２を有する。トロンボプラスチン溶液を含むフィード
溶液１００は該装置２０の入り口ベル３０から膜１０の内部表面１１に供給され
る。所望により、担体溶液２００は同時に、装置２０のミッド・セクション４０
から膜１０の外部表面１２に供給される。フィード溶液１００中の１またはそれ
以上の凝固因子は、典型的にはフィード溶液１００由来の溶媒と共に、担体溶液
２００へと膜を通過するが、組織因子はフィード溶液１００中に保持される。凝
固因子除去フィード溶液（濃縮物１１０と呼ぶ）は、装置２０の出口端ベル５０
を通して膜１０から排出される。凝固因子豊富化担体溶液（透過物２１０と呼ぶ
）は装置２０のミッド・セクション４０から排出される。排出された透過物２１
０は担体溶液２００に対して凝固因子が豊富化されている。 膜分離装置、例えば上記例装置を（単独で、または他の装置と組み合わせて）
バッチ、半連続的（一段階連続もしくは一段階「フィード・アンド・ブリード」
）、または多段階連続プロセスに用い、組織因子から凝固因子を分離することが
できる。
セクション４０、および出口端ベル５０を有するシェル・アンド・チューブ型分
離装置２０中に構成される。チューブプレート６０は入り口端ベル３０および出
口端ベル５０とミッド・セクション４０を分離する。各膜１０は、第一内部表面
１１および第二外部表面１２を有する。トロンボプラスチン溶液を含むフィード
溶液１００は該装置２０の入り口ベル３０から膜１０の内部表面１１に供給され
る。所望により、担体溶液２００は同時に、装置２０のミッド・セクション４０
から膜１０の外部表面１２に供給される。フィード溶液１００中の１またはそれ
以上の凝固因子は、典型的にはフィード溶液１００由来の溶媒と共に、担体溶液
２００へと膜を通過するが、組織因子はフィード溶液１００中に保持される。凝
固因子除去フィード溶液（濃縮物１１０と呼ぶ）は、装置２０の出口端ベル５０
を通して膜１０から排出される。凝固因子豊富化担体溶液（透過物２１０と呼ぶ
）は装置２０のミッド・セクション４０から排出される。排出された透過物２１
０は担体溶液２００に対して凝固因子が豊富化されている。 膜分離装置、例えば上記例装置を（単独で、または他の装置と組み合わせて）
バッチ、半連続的（一段階連続もしくは一段階「フィード・アンド・ブリード」
）、または多段階連続プロセスに用い、組織因子から凝固因子を分離することが
できる。
【００３１】 好ましいバッチプロセスでは、トロンボプラスチン抽出物はタンジェンシャル
−フロー・ディアフィルトレーションで処理される。図３に示すように、非処理
トロンボプラスチン抽出物を含むフィード溶液１００をフィードタンク３００か
ら連続的に再循環させ、膜分離装置４００（所望により担体溶液２００に対して
）を通し、次いでポンプ５００によりフィードタンク３００に戻す。膜分離装置
４００は、フィード溶液１００を曝露する第一表面１１と担体溶液２００を曝露
する第二表面１２を有する半透膜１０を含む。各第一および第二表面１１、１２
は表面面積Ａを有する。インレット圧ゲージ５１０で決定されるフィード溶液１
００の圧は膜１０の担体溶液／透過物側の圧より大きく、膜分離装置４００をそ
れぞれ通過することによりフィード溶液１００から膜１０の他の側に凝結因子を
通過させ、フィードタンク３００に再循環してもどる濃縮物１１０にはフィード
溶液１００に対して凝固因子が除去され、組織因子がより濃縮される。フィード
タンク３００のフィード溶液１００のレベルは、溶媒が膜１０を通して浸透によ
り除去されるため、初期レベル、Ｌ１から低レベル、Ｌ２に低下する。フィード
タンク３００中の該レベルがＬ２に低下した後、濃縮フィード溶液１００を希釈
溶液で再希釈し、該レベルを初期レベル、Ｌ１に上昇させることができる。フィ
ードタンク３００が空になり、再度満たされる各サイクルが、本明細書に記載の
目的では１希釈サイクルと考える。所望により、所望の分離レベルを達成するの
に必要なだけの希釈サイクルのために再循環を続けることができる。他のバッチ
プロセス構成は当業者に明らかであろう。
−フロー・ディアフィルトレーションで処理される。図３に示すように、非処理
トロンボプラスチン抽出物を含むフィード溶液１００をフィードタンク３００か
ら連続的に再循環させ、膜分離装置４００（所望により担体溶液２００に対して
）を通し、次いでポンプ５００によりフィードタンク３００に戻す。膜分離装置
４００は、フィード溶液１００を曝露する第一表面１１と担体溶液２００を曝露
する第二表面１２を有する半透膜１０を含む。各第一および第二表面１１、１２
は表面面積Ａを有する。インレット圧ゲージ５１０で決定されるフィード溶液１
００の圧は膜１０の担体溶液／透過物側の圧より大きく、膜分離装置４００をそ
れぞれ通過することによりフィード溶液１００から膜１０の他の側に凝結因子を
通過させ、フィードタンク３００に再循環してもどる濃縮物１１０にはフィード
溶液１００に対して凝固因子が除去され、組織因子がより濃縮される。フィード
タンク３００のフィード溶液１００のレベルは、溶媒が膜１０を通して浸透によ
り除去されるため、初期レベル、Ｌ１から低レベル、Ｌ２に低下する。フィード
タンク３００中の該レベルがＬ２に低下した後、濃縮フィード溶液１００を希釈
溶液で再希釈し、該レベルを初期レベル、Ｌ１に上昇させることができる。フィ
ードタンク３００が空になり、再度満たされる各サイクルが、本明細書に記載の
目的では１希釈サイクルと考える。所望により、所望の分離レベルを達成するの
に必要なだけの希釈サイクルのために再循環を続けることができる。他のバッチ
プロセス構成は当業者に明らかであろう。
【００３２】 そのような好ましいバッチ分離スキーム中の設計パラメータは分離装置４００
を通過する単位容量のフィード溶液１００について達成される分離レベルである
。そのような単位容量のインクレメンタル分離は、一般に装置４００に用いる半
透膜１０（またはモジュール）の種類の機能であり、重要な設計考慮事項は上記
したようにＭＷＣＯ、透過性、総面積Ａ、フロー型、および構造である。該分離
装置４００に関して、一定時間に達成できるインクレメンタル分離および全分離
は、ベンチスケールの試験を用いて評価できる。そのような好ましいバッチプロ
セスについてベンチスケールの試験で考慮すべきパラメータは、同様に膜１０を
横切る圧格差に依存する透過物の流速（単位時間あたりの膜の単位表面面積を通
過する透過物の容量）である。該圧格差はポンプ５００と再循環フィード溶液１
００の対応する容量流速を調整することにより制御することができる。全分離を
評価するには、処理するフィード溶液の容量、サイクルあたりのフィードタンク
３００の容量格差（すなわち希釈容量）、サイクル数、サイクルあたりの時間、
特定の分離度を達成するための総時間も測定すべきパラメータである。プロセス
制御パラメータは、分離プロセスを最適化するため必要に応じて当業者が変更す
ることができる。
を通過する単位容量のフィード溶液１００について達成される分離レベルである
。そのような単位容量のインクレメンタル分離は、一般に装置４００に用いる半
透膜１０（またはモジュール）の種類の機能であり、重要な設計考慮事項は上記
したようにＭＷＣＯ、透過性、総面積Ａ、フロー型、および構造である。該分離
装置４００に関して、一定時間に達成できるインクレメンタル分離および全分離
は、ベンチスケールの試験を用いて評価できる。そのような好ましいバッチプロ
セスについてベンチスケールの試験で考慮すべきパラメータは、同様に膜１０を
横切る圧格差に依存する透過物の流速（単位時間あたりの膜の単位表面面積を通
過する透過物の容量）である。該圧格差はポンプ５００と再循環フィード溶液１
００の対応する容量流速を調整することにより制御することができる。全分離を
評価するには、処理するフィード溶液の容量、サイクルあたりのフィードタンク
３００の容量格差（すなわち希釈容量）、サイクル数、サイクルあたりの時間、
特定の分離度を達成するための総時間も測定すべきパラメータである。プロセス
制御パラメータは、分離プロセスを最適化するため必要に応じて当業者が変更す
ることができる。
【００３３】 上記好ましいバッチプロセスを含む典型的ベンチスケール試験では、クエン酸
Ｎａ３／ＮａＣｌトロンボプラスチン抽出物１００ｍＬを、クエン酸Ｎａ３／Ｎ
ａＣｌ希釈溶液を用い、３００ｋＤ ＭＷＣＯにてタンジェンシャル−フローPel
licon XL（登録商標）（Millipore）によりディアフィルトレーションした。最
初の試験では、再循環流速を調整して約１０ｐｓｉｇのインレット圧を得た（膜
流速約１００ｍｌ／ｈｒ（膜流量約４ｍｌ／ｃｍ２・ｈｒに相当）を生じる）。
最初のフィード溶液を５希釈サイクル（各サイクルがフィード溶液を約２．５倍
希釈する）を用い総時間約５時間で約１００倍に希釈した。例えば実施例３Ｂ参
照。再循環流速を変化させて約２０ｐｓｉｇのインレット圧を得た（膜流速約１
００ｍｌ／ｈｒ（膜流量約８ｍｌ／ｃｍ２・ｈｒに相当）第二の試験では、フィ
ード溶液の１００倍希釈を、各サイクルがフィード溶液を５倍希釈する３希釈サ
イクルを用い、総時間約３時間で達成した。例えば実施例３Ｂ参照。２つのベン
チスケール実験の操作パラメータの比較は、より高い膜流速で低速に匹敵する結
果を達成できること（（１）同じ膜表面面積を用いる処理時間が５０％減少する
（およびそれに対応して操作コストが減少）か、または（２）同じ時間では膜表
面面積が５０％減少（およびそれに対応して資本コストが減少））を示唆する。
バッチパイロットプラント試験を、これらベンチスケール試験に基づきスケール
アップした。
Ｎａ３／ＮａＣｌトロンボプラスチン抽出物１００ｍＬを、クエン酸Ｎａ３／Ｎ
ａＣｌ希釈溶液を用い、３００ｋＤ ＭＷＣＯにてタンジェンシャル−フローPel
licon XL（登録商標）（Millipore）によりディアフィルトレーションした。最
初の試験では、再循環流速を調整して約１０ｐｓｉｇのインレット圧を得た（膜
流速約１００ｍｌ／ｈｒ（膜流量約４ｍｌ／ｃｍ２・ｈｒに相当）を生じる）。
最初のフィード溶液を５希釈サイクル（各サイクルがフィード溶液を約２．５倍
希釈する）を用い総時間約５時間で約１００倍に希釈した。例えば実施例３Ｂ参
照。再循環流速を変化させて約２０ｐｓｉｇのインレット圧を得た（膜流速約１
００ｍｌ／ｈｒ（膜流量約８ｍｌ／ｃｍ２・ｈｒに相当）第二の試験では、フィ
ード溶液の１００倍希釈を、各サイクルがフィード溶液を５倍希釈する３希釈サ
イクルを用い、総時間約３時間で達成した。例えば実施例３Ｂ参照。２つのベン
チスケール実験の操作パラメータの比較は、より高い膜流速で低速に匹敵する結
果を達成できること（（１）同じ膜表面面積を用いる処理時間が５０％減少する
（およびそれに対応して操作コストが減少）か、または（２）同じ時間では膜表
面面積が５０％減少（およびそれに対応して資本コストが減少））を示唆する。
バッチパイロットプラント試験を、これらベンチスケール試験に基づきスケール
アップした。
【００３４】 先の記載はバッチプロセス法を含むが、本発明は半連続または連続プロセスに
も使用可能である。図３に示すバッチプロセスに基づく典型的半連続プロセスで
は、半透膜１０を通る溶媒の流速と等しい速度でフィードタンク２０に希釈溶液
を連続的に加えることによりフィードタンク３００中の該レベルを一定に（例え
ばＬ１に）維持することができる。図４に模式的に示す典型的「フィード・アン
ド・ブリード」連続プロセスでは、フィードポンプ３１０によりフィードタンク
３００から第一段階再循環ループ６００フィード溶液１００を送り込む。第一再
循環ポンプ６１０は第一分離装置６２０を通して第一の流れを再循環し、透過物
２１０を連結流出ヘッダーから排出させ、濃縮物１１０のバルクをループ６００
を通して再循環させ、濃縮物１１０の比較的小部分を流出させ第二再循環ループ
７００に供給する。第二再循環ポンプ７１０は第二分離装置７２０を通して第二
の流れを再循環させ、透過物２２０を連結排出ヘッダーを通して排出させ、濃縮
物１２０のバルクをループ７００を通して再循環させ、濃縮物１２０の比較的小
部分を排出させて第三再循環ループ８００に供給する。第三再循環ポンプ８１０
を第三分離装置８２０を通して第三流を再循環させ、透過物２３０を連結排出ヘ
ッダーを通して排出させ、濃縮物１３０のバルクをループ８００を通して再循環
し、濃縮物１３０の比較的小部分を精製トロンボプラスチン抽出物として排出さ
せる。各段階はほぼ一定濃度の保持された溶質、組織因子で操作される（後の段
階の組織因子濃度は初期段階より幾分高い）。他の半連続および連続プロセス構
成は当業者に明らかであろう。
も使用可能である。図３に示すバッチプロセスに基づく典型的半連続プロセスで
は、半透膜１０を通る溶媒の流速と等しい速度でフィードタンク２０に希釈溶液
を連続的に加えることによりフィードタンク３００中の該レベルを一定に（例え
ばＬ１に）維持することができる。図４に模式的に示す典型的「フィード・アン
ド・ブリード」連続プロセスでは、フィードポンプ３１０によりフィードタンク
３００から第一段階再循環ループ６００フィード溶液１００を送り込む。第一再
循環ポンプ６１０は第一分離装置６２０を通して第一の流れを再循環し、透過物
２１０を連結流出ヘッダーから排出させ、濃縮物１１０のバルクをループ６００
を通して再循環させ、濃縮物１１０の比較的小部分を流出させ第二再循環ループ
７００に供給する。第二再循環ポンプ７１０は第二分離装置７２０を通して第二
の流れを再循環させ、透過物２２０を連結排出ヘッダーを通して排出させ、濃縮
物１２０のバルクをループ７００を通して再循環させ、濃縮物１２０の比較的小
部分を排出させて第三再循環ループ８００に供給する。第三再循環ポンプ８１０
を第三分離装置８２０を通して第三流を再循環させ、透過物２３０を連結排出ヘ
ッダーを通して排出させ、濃縮物１３０のバルクをループ８００を通して再循環
し、濃縮物１３０の比較的小部分を精製トロンボプラスチン抽出物として排出さ
せる。各段階はほぼ一定濃度の保持された溶質、組織因子で操作される（後の段
階の組織因子濃度は初期段階より幾分高い）。他の半連続および連続プロセス構
成は当業者に明らかであろう。
【００３５】 膜透過により精製されるトロンボプラスチン溶液がトロンボプラスチン試薬で
ある場合は、該試薬を、直接またはトロンボプラスチン抽出物からの試薬の製造
について以下に記載のさらなる成分を加えてＰＴアッセイに用いることができる
。膜透過により製造されるトロンボプラスチン溶液がトロンボプラスチン抽出物
である場合は、トロンボプラスチン試薬を以下のごとく精製トロンボプラスチン
抽出物から製造してよい。 トロンボプラスチン試薬は、精製トロンボプラスチン抽出物（本明細書では処
理抽出物ともいう）から、該処理抽出物をカルシウムイオンＣａ＋＋と混合する
ことにより製造することができる。該試薬組成物中の処理抽出物の量は、該試薬
組成物の総容量に対して約１０容量％〜約５０容量％、より好ましくは約１５容
量％〜約４５容量％、最も好ましくは約２５容量％〜約３５％容量％の範囲であ
ることが好ましい。好ましい試薬組成物の処理抽出物の量は約３０容量％である
。カルシウムイオンは、カルシウム塩、例えば塩化カルシウム、ＣａＣｌ２、ま
たは有機酸のカルシウム塩、例えば酒石酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、
クエン酸カルシウム、および乳酸カルシウムとして該試薬組成物に供給すること
ができる。カルシウムはＣａＣｌ２として供給し、試薬組成物に濃度範囲約１０
ｍＭ〜約１５ｍＭ、より好ましくは濃度範囲約１０ｍＭ〜約１２ｍＭ、最もこの
ましくは約１１ｍＭで用いることが好ましい。
ある場合は、該試薬を、直接またはトロンボプラスチン抽出物からの試薬の製造
について以下に記載のさらなる成分を加えてＰＴアッセイに用いることができる
。膜透過により製造されるトロンボプラスチン溶液がトロンボプラスチン抽出物
である場合は、トロンボプラスチン試薬を以下のごとく精製トロンボプラスチン
抽出物から製造してよい。 トロンボプラスチン試薬は、精製トロンボプラスチン抽出物（本明細書では処
理抽出物ともいう）から、該処理抽出物をカルシウムイオンＣａ＋＋と混合する
ことにより製造することができる。該試薬組成物中の処理抽出物の量は、該試薬
組成物の総容量に対して約１０容量％〜約５０容量％、より好ましくは約１５容
量％〜約４５容量％、最も好ましくは約２５容量％〜約３５％容量％の範囲であ
ることが好ましい。好ましい試薬組成物の処理抽出物の量は約３０容量％である
。カルシウムイオンは、カルシウム塩、例えば塩化カルシウム、ＣａＣｌ２、ま
たは有機酸のカルシウム塩、例えば酒石酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、
クエン酸カルシウム、および乳酸カルシウムとして該試薬組成物に供給すること
ができる。カルシウムはＣａＣｌ２として供給し、試薬組成物に濃度範囲約１０
ｍＭ〜約１５ｍＭ、より好ましくは濃度範囲約１０ｍＭ〜約１２ｍＭ、最もこの
ましくは約１１ｍＭで用いることが好ましい。
【００３６】 他の試薬成分、例えば緩衝剤、安定化剤、保存剤、活性化（sensitizing）剤
、および充填剤も該トロンボプラスチン試薬組成物に含むことができる。緩衝剤
は、該試薬組成物を約６．８〜約８．０の範囲のｐＨ、好ましくはｐＨ約７．５
に維持するのに用いることができる。典型的緩衝剤には、とりわけ、例えばトリ
ス、ホスフェート、バルビタール、グリシルグリシン、３−（Ｎ−モルホリノ）
−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２
−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−メ
チル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−[Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルアミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ
）、および３−[Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル−メチルアミノ]−プロパンス
ルホン酸（ＴＡＰＳ）が含まれる。ＨＥＰＥＳが好ましい緩衝剤である。トロン
ボプラスチン試薬のプロコアグラント活性を維持するのに有用な安定化剤は当該
分野で知られており、例えば、Goods緩衝剤、トリス、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、ピペラジン−Ｎ−，Ｎ−ビス（２−エタンスルホン酸、１．５ナトリウ
ム塩（ＰＩＰＥＳ）、イミダゾール、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシ
プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、
ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、３−[Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ]−２−ヒド
ロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−
ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ'−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、トリシン、お
よびビシンが含まれる。ＨＥＰＥＳおよびＢＳＡが好ましい安定化剤である。微
生物の増殖を防止する保存剤、例えば抗真菌、抗菌、および抗酵母組成物を試薬
組成物中に含んでいてよい。典型的組成物には、アジ化ナトリウム、チメロサー
ル、ＢＨＡ、ＢＨＴ、および予め製剤化された多活性製剤、例えばProClin（登
録商標）(Supelco)が含まれる。ProClin（登録商標）が好ましい保存剤である。
種々の活性化剤が当該分野で知られている。該試薬の感度を、例えば、塩化ナト
リウムのような塩を、典型的にはノーマル−シフティング（normal-shifting）
試薬、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共に用いて改良することがで
きる。他の活性化試薬、例えばヘキサジメトリン（hexadimethrine）ブロミドも
しくはプロタミンを用いて潜在的干渉活性、例えばヘパリン活性を阻害すること
ができる。該試薬組成物に含ませることができる充填剤には、アルコール（例え
ばグルシトール、マンニトール、ソルビトール）、グリシン、デキストロースな
どが含まれる。該試薬組成物は、界面活性剤（例えばTween 80またはTriton X-1
00）、および血漿アッセイに通常用いられる他の物質も含むことができる。これ
ら添加試薬成分の濃度は当業者が決定し、最適化することができる。
、および充填剤も該トロンボプラスチン試薬組成物に含むことができる。緩衝剤
は、該試薬組成物を約６．８〜約８．０の範囲のｐＨ、好ましくはｐＨ約７．５
に維持するのに用いることができる。典型的緩衝剤には、とりわけ、例えばトリ
ス、ホスフェート、バルビタール、グリシルグリシン、３−（Ｎ−モルホリノ）
−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２
−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−メ
チル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−[Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルアミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ
）、および３−[Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル−メチルアミノ]−プロパンス
ルホン酸（ＴＡＰＳ）が含まれる。ＨＥＰＥＳが好ましい緩衝剤である。トロン
ボプラスチン試薬のプロコアグラント活性を維持するのに有用な安定化剤は当該
分野で知られており、例えば、Goods緩衝剤、トリス、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、ピペラジン−Ｎ−，Ｎ−ビス（２−エタンスルホン酸、１．５ナトリウ
ム塩（ＰＩＰＥＳ）、イミダゾール、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシ
プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、
ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、３−[Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ]−２−ヒド
ロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−
ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ'−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、トリシン、お
よびビシンが含まれる。ＨＥＰＥＳおよびＢＳＡが好ましい安定化剤である。微
生物の増殖を防止する保存剤、例えば抗真菌、抗菌、および抗酵母組成物を試薬
組成物中に含んでいてよい。典型的組成物には、アジ化ナトリウム、チメロサー
ル、ＢＨＡ、ＢＨＴ、および予め製剤化された多活性製剤、例えばProClin（登
録商標）(Supelco)が含まれる。ProClin（登録商標）が好ましい保存剤である。
種々の活性化剤が当該分野で知られている。該試薬の感度を、例えば、塩化ナト
リウムのような塩を、典型的にはノーマル−シフティング（normal-shifting）
試薬、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共に用いて改良することがで
きる。他の活性化試薬、例えばヘキサジメトリン（hexadimethrine）ブロミドも
しくはプロタミンを用いて潜在的干渉活性、例えばヘパリン活性を阻害すること
ができる。該試薬組成物に含ませることができる充填剤には、アルコール（例え
ばグルシトール、マンニトール、ソルビトール）、グリシン、デキストロースな
どが含まれる。該試薬組成物は、界面活性剤（例えばTween 80またはTriton X-1
00）、および血漿アッセイに通常用いられる他の物質も含むことができる。これ
ら添加試薬成分の濃度は当業者が決定し、最適化することができる。
【００３７】 カルシウム緩衝剤をトロンボプラスチン試薬組成物に加えることも好ましい。
トロンボプラスチン試薬にそのようなカルシウム緩衝剤を用いることによりトロ
ンボプラスチン試薬の感度を制御することができる。さらに、そのような制御は
正常血漿の凝固時間に対する影響が最小限で達成される。請求の範囲に具体的に
示していない理論による結びつけなしに、緩衝剤はトロンボプラスチン試薬中の
遊離カルシウム濃度を調節する。適切なカルシウム緩衝剤には、有機酸塩、例え
ばクエン酸塩もしくは酒石酸塩、カルシウムキレート剤、例えばＥＤＴＡもしく
はＥＧＴＡ、およびカルシウム結合緩衝剤、例えばＮ−２−アセタミドール−２
−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（
ビシン）、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、トリシン、およびグリシルグリシンが含まれる。
当該分野で知られた、または後に開発される他のカルシウム緩衝剤も同様に用い
ることができよう。クエン酸ナトリウム、ＡＤＡ、およびビシンが好ましいカル
シウム緩衝剤であり、クエン酸ナトリウムが最も好ましい。トロンボプラスチン
試薬組成物中のカルシウム緩衝剤濃度は、用いる特定のカルシウム緩衝剤、特に
抽出物の濃度およびＣａ＋＋イオン濃度を含む他の試薬成分の濃度、および所望
の感度に応じて変化させることができる。しかしながら、好ましくはカルシウム
緩衝剤濃度は、約０．２５ｍＭから約１５ｍＭ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜
約１０ｍＭ、最も好ましくは約０．５ｍＭ〜約７ｍＭの範囲であり得る。クエン
酸ナトリウムをカルシウム緩衝剤として用いる好ましい態様では、クエン酸ナト
リウム濃度は、好ましくは約０．５ｍＭ〜約７ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜
約５ｍＭ、最も好ましくは約２．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである。そのようなカル
シウム緩衝剤については試験例６の実験データを参照する。
トロンボプラスチン試薬にそのようなカルシウム緩衝剤を用いることによりトロ
ンボプラスチン試薬の感度を制御することができる。さらに、そのような制御は
正常血漿の凝固時間に対する影響が最小限で達成される。請求の範囲に具体的に
示していない理論による結びつけなしに、緩衝剤はトロンボプラスチン試薬中の
遊離カルシウム濃度を調節する。適切なカルシウム緩衝剤には、有機酸塩、例え
ばクエン酸塩もしくは酒石酸塩、カルシウムキレート剤、例えばＥＤＴＡもしく
はＥＧＴＡ、およびカルシウム結合緩衝剤、例えばＮ−２−アセタミドール−２
−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（
ビシン）、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、トリシン、およびグリシルグリシンが含まれる。
当該分野で知られた、または後に開発される他のカルシウム緩衝剤も同様に用い
ることができよう。クエン酸ナトリウム、ＡＤＡ、およびビシンが好ましいカル
シウム緩衝剤であり、クエン酸ナトリウムが最も好ましい。トロンボプラスチン
試薬組成物中のカルシウム緩衝剤濃度は、用いる特定のカルシウム緩衝剤、特に
抽出物の濃度およびＣａ＋＋イオン濃度を含む他の試薬成分の濃度、および所望
の感度に応じて変化させることができる。しかしながら、好ましくはカルシウム
緩衝剤濃度は、約０．２５ｍＭから約１５ｍＭ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜
約１０ｍＭ、最も好ましくは約０．５ｍＭ〜約７ｍＭの範囲であり得る。クエン
酸ナトリウムをカルシウム緩衝剤として用いる好ましい態様では、クエン酸ナト
リウム濃度は、好ましくは約０．５ｍＭ〜約７ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜
約５ｍＭ、最も好ましくは約２．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである。そのようなカル
シウム緩衝剤については試験例６の実験データを参照する。
【００３８】 トロンボプラスチン試薬は、それがプロコアグラント活性を保持するであろう
あらゆる形で維持することができる。例えば、トロンボプラスチン試薬は、溶液
として、または脱水形（例えば凍結乾燥形）で販売することができる。所望によ
り、トロンボプラスチン試薬は−２０℃で約６ヶ月間まで凍結保存するか、また
は当該分野で知られた別の適切な方法で保存することができる。 本発明に従って製造されるトロンボプラスチン試薬は、好ましくは、処理Ｎａ
Ｃｌ／クエン酸Ｎａ３トロンボプラスチン抽出物（３０容量％〜４５容量％、最
も好ましくは３５容量％）、ＣａＣｌ（１０ｍＭ〜１３ｍＭ、最も好ましくは１
１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ〜５０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ）、ＮａＣ
ｌ（７０ｍＭ〜１２０ｍＭ、最も好ましくは８０ｍＭ）、ＰＥＧ８０００（０．
５％〜１．０％、最も好ましくは０．７５％（重量／容量）（溶液密度１ｇ／ｍ
ｌとみなす）、さらなるクエン酸Ｎａ３（２．５ｍＭ〜４．５ｍＭ、最も好まし
くは３．５ｍＭ）、ヘキサジメトリンブロミド（５ｍｇ／ｌ〜２０ｍｇ／ｌ、最
も好ましくは１２．５ｍｇ／ｌ）、マンニトール（０．５％〜５％、最も好まし
くは２％（重量／容量）、グリシン（０．５％〜５％、最も好ましくは４％（重
量／容量）、ＢＳＡ（０．１％〜３％、最も好ましくは１％（重量／容量）、お
よびProClin（登録商標）300（０．０１％〜０．０７％（重量／容量））を含む
。例えば実施例４および実施例６参照。次いで該試薬溶液を凍結乾燥する場合は
ProClinを揮発させることに注意せよ。実施例４に示すように、そのようなトロ
ンボプラスチン試薬は、商業的に許容される範囲内の正常なＰＴ時間を有する。
あらゆる形で維持することができる。例えば、トロンボプラスチン試薬は、溶液
として、または脱水形（例えば凍結乾燥形）で販売することができる。所望によ
り、トロンボプラスチン試薬は−２０℃で約６ヶ月間まで凍結保存するか、また
は当該分野で知られた別の適切な方法で保存することができる。 本発明に従って製造されるトロンボプラスチン試薬は、好ましくは、処理Ｎａ
Ｃｌ／クエン酸Ｎａ３トロンボプラスチン抽出物（３０容量％〜４５容量％、最
も好ましくは３５容量％）、ＣａＣｌ（１０ｍＭ〜１３ｍＭ、最も好ましくは１
１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ〜５０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ）、ＮａＣ
ｌ（７０ｍＭ〜１２０ｍＭ、最も好ましくは８０ｍＭ）、ＰＥＧ８０００（０．
５％〜１．０％、最も好ましくは０．７５％（重量／容量）（溶液密度１ｇ／ｍ
ｌとみなす）、さらなるクエン酸Ｎａ３（２．５ｍＭ〜４．５ｍＭ、最も好まし
くは３．５ｍＭ）、ヘキサジメトリンブロミド（５ｍｇ／ｌ〜２０ｍｇ／ｌ、最
も好ましくは１２．５ｍｇ／ｌ）、マンニトール（０．５％〜５％、最も好まし
くは２％（重量／容量）、グリシン（０．５％〜５％、最も好ましくは４％（重
量／容量）、ＢＳＡ（０．１％〜３％、最も好ましくは１％（重量／容量）、お
よびProClin（登録商標）300（０．０１％〜０．０７％（重量／容量））を含む
。例えば実施例４および実施例６参照。次いで該試薬溶液を凍結乾燥する場合は
ProClinを揮発させることに注意せよ。実施例４に示すように、そのようなトロ
ンボプラスチン試薬は、商業的に許容される範囲内の正常なＰＴ時間を有する。
【００３９】 トロンボプラスチン試薬の他の製剤は本発明の範囲内である。そのような製剤
は、現在の商業的要求の基づき、約９．０秒から約２０秒間、より好ましくは約
９．０秒〜約１３．０秒間、最も好ましくは約１０．０秒〜約１２．０秒間の範
囲の正常ＰＴ時間を有することが好ましい。そのような製剤は、独立してか、種
々の組み合わせで、もしくは累積的に考慮される種々の特徴付け基準に関して以
下の感度を有する。国際標準比約３．０を有するクマリン化血漿の動的範囲、少
なくとも約２０秒間、より好ましくは少なくとも約３０秒間、最も好ましくは少
なくとも約４０秒間；９９％＋第VII因子欠損（除去）血漿の動的範囲、少なく
とも約３０秒間、好ましくは少なくとも約３５秒間、最も好ましくは少なくとも
約４０秒間；５０％プール正常血清（ＰＮＰ）対１００％ＰＮＰの動的範囲、約
３秒間〜約６秒間、より好ましくは約４秒〜約５秒間の範囲；および国際感度指
数（ＩＳＩ）、約２．０以下、好ましくは約１．４以下、最も好ましくは少なく
とも約１．２５以下。さらにそのような試薬を再現性をもって製造する方法が商
業的に実行可能である。
は、現在の商業的要求の基づき、約９．０秒から約２０秒間、より好ましくは約
９．０秒〜約１３．０秒間、最も好ましくは約１０．０秒〜約１２．０秒間の範
囲の正常ＰＴ時間を有することが好ましい。そのような製剤は、独立してか、種
々の組み合わせで、もしくは累積的に考慮される種々の特徴付け基準に関して以
下の感度を有する。国際標準比約３．０を有するクマリン化血漿の動的範囲、少
なくとも約２０秒間、より好ましくは少なくとも約３０秒間、最も好ましくは少
なくとも約４０秒間；９９％＋第VII因子欠損（除去）血漿の動的範囲、少なく
とも約３０秒間、好ましくは少なくとも約３５秒間、最も好ましくは少なくとも
約４０秒間；５０％プール正常血清（ＰＮＰ）対１００％ＰＮＰの動的範囲、約
３秒間〜約６秒間、より好ましくは約４秒〜約５秒間の範囲；および国際感度指
数（ＩＳＩ）、約２．０以下、好ましくは約１．４以下、最も好ましくは少なく
とも約１．２５以下。さらにそのような試薬を再現性をもって製造する方法が商
業的に実行可能である。
【００４０】 本発明のトロンボプラスチン試薬の改良された感度は、請求の範囲に具体的に
示していない理論による結びつけなしに、夾雑凝固因子またはトロンボプラスチ
ン溶液由来の他の夾雑タンパク質を膜透過により除去することから生じる。実施
例３Ｃ参照。そのように除去しなければ、夾雑血漿凝固因子は試料中に高濃度で
存在し、凝固時間を早め、感度を低下させる一因となる。例えば、試薬溶液に存
在する第VII因子の夾雑は、夾雑第VII因子は事実上、ある種の該欠損を部分的に
補うので、患者血漿が第VII因子欠損であるか否かを決定する感度の低下を生じ
るであろう。凝固時間に対する夾雑凝固因子の寄与および得られる効果は、因子
欠損（deficient）血漿試料（例えば、感度を測定するのに用いる欠損患者血漿
もしくは標準異常血漿）で正常血漿試料より比例的により有意である。異常血漿
に対する処理トロンボプラスチン溶液の影響は、より長いＰＴ凝固時間をもたら
すが、正常血漿に対する影響は実質的なものでなく、正常ＰＴ凝固時間はほとん
どもしくは全く移動しない。
示していない理論による結びつけなしに、夾雑凝固因子またはトロンボプラスチ
ン溶液由来の他の夾雑タンパク質を膜透過により除去することから生じる。実施
例３Ｃ参照。そのように除去しなければ、夾雑血漿凝固因子は試料中に高濃度で
存在し、凝固時間を早め、感度を低下させる一因となる。例えば、試薬溶液に存
在する第VII因子の夾雑は、夾雑第VII因子は事実上、ある種の該欠損を部分的に
補うので、患者血漿が第VII因子欠損であるか否かを決定する感度の低下を生じ
るであろう。凝固時間に対する夾雑凝固因子の寄与および得られる効果は、因子
欠損（deficient）血漿試料（例えば、感度を測定するのに用いる欠損患者血漿
もしくは標準異常血漿）で正常血漿試料より比例的により有意である。異常血漿
に対する処理トロンボプラスチン溶液の影響は、より長いＰＴ凝固時間をもたら
すが、正常血漿に対する影響は実質的なものでなく、正常ＰＴ凝固時間はほとん
どもしくは全く移動しない。
【００４１】 許容できるＰＴ正常時間を維持しながら再現性のある感度の改良を達成するの
に加えて、そのような試薬は既知のトロンボプラスチン試薬に比べて外観が改善
されている。これら試薬は外観が灰白色乳状であると視覚的に特徴づけられる。
理論による結びつけはないが、より魅力的な試薬の外観は、上記精製プロセス時
の膜透過による残存ヘモグロビン（Ｈｂ）夾雑物のトロンボプラスチン溶液の分
離に基づいているようである。Ｈｂは分子量約６４，０００ダルトン（６４ｋＤ
）の四量体タンパク質であり、上記のごとく血漿凝固因子と同様に組織因子から
分離されよう。該試薬のＨｂレベルは、ヘモグロビンアッセイ（例えばSigma Di
agnostics Procedure No.527）により測定することができ、好ましくは約２．０
ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約１．０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約
０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくはSigma Diagnostics Procedure No.527アッセ
イを用いて検出不能である。例えば、実施例７に記載の実験データ参照。
に加えて、そのような試薬は既知のトロンボプラスチン試薬に比べて外観が改善
されている。これら試薬は外観が灰白色乳状であると視覚的に特徴づけられる。
理論による結びつけはないが、より魅力的な試薬の外観は、上記精製プロセス時
の膜透過による残存ヘモグロビン（Ｈｂ）夾雑物のトロンボプラスチン溶液の分
離に基づいているようである。Ｈｂは分子量約６４，０００ダルトン（６４ｋＤ
）の四量体タンパク質であり、上記のごとく血漿凝固因子と同様に組織因子から
分離されよう。該試薬のＨｂレベルは、ヘモグロビンアッセイ（例えばSigma Di
agnostics Procedure No.527）により測定することができ、好ましくは約２．０
ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約１．０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約
０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくはSigma Diagnostics Procedure No.527アッセ
イを用いて検出不能である。例えば、実施例７に記載の実験データ参照。
【００４２】 本発明のトロンボプラスチン試薬は当該分野で知られた種々の診断的用途に用
いることができる。好ましくは、トロンボプラスチン試薬は凝固時間に基づくア
ッセイ、例えばプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイに用いられる。そのような
アッセイには典型的には凝固時間の測定（すなわち、アッセイ溶液（トロンボプ
ラスチン試薬と血漿試料を混合することによる）の形成からアッセイ溶液中の血
餅形成が検出されるまでの経過時間の測定が含まれる。時間測定および／または
血餅検出は、当該分野で知られた種々の技術を用いて自動化するか、もしくは手
動で行うことができる。典型的な血餅形成の検出方法には、とりわけ「チルト（
tilt）チューブ」技術を用いる視覚的観察、電気化学的方法（例えばフィブロメ
ーター）、光学的方法（例えば吸光度もしくは吸光度の変化速度に基づく）が含
まれる。典型的な自動化分析器にはAmelung CS-190, MLA-900が含まれる。
いることができる。好ましくは、トロンボプラスチン試薬は凝固時間に基づくア
ッセイ、例えばプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイに用いられる。そのような
アッセイには典型的には凝固時間の測定（すなわち、アッセイ溶液（トロンボプ
ラスチン試薬と血漿試料を混合することによる）の形成からアッセイ溶液中の血
餅形成が検出されるまでの経過時間の測定が含まれる。時間測定および／または
血餅検出は、当該分野で知られた種々の技術を用いて自動化するか、もしくは手
動で行うことができる。典型的な血餅形成の検出方法には、とりわけ「チルト（
tilt）チューブ」技術を用いる視覚的観察、電気化学的方法（例えばフィブロメ
ーター）、光学的方法（例えば吸光度もしくは吸光度の変化速度に基づく）が含
まれる。典型的な自動化分析器にはAmelung CS-190, MLA-900が含まれる。
【００４３】 ＰＴアッセイは外部凝固経路に関連する血液凝固不全を決定するのに好都合に
用いることができる。例えば、第VII因子夾雑物がより少ないトロンボプラスチ
ン試薬は、第VII因子欠損の患者のより正確なスクリーニング法を提供するであ
ろう。プロトロンビン時間アッセイは、外部凝固経路に影響を及ぼすクマリンの
ような医薬品を用いる抗凝固治療をモニターするのにも用いることができる。そ
のような抗凝固療法の基礎は患者の機能的ビタミンＫ依存性タンパク質を制御し
て低下させることであるから、本発明の敏感なトロンボプラスチン試薬は、治療
管理のより正確なモニターと制御をもたらすであろう。本発明の試薬は被検血漿
中に存在する血漿凝固因子のレベルの定性的スクリーニングアッセイ、さらに定
量的測定に用いることができる。そのような定量的測定には、種々の既知レベル
の血漿凝固因子を有する標準血漿の凝固時間の測定、標準血漿の凝固時間と標準
血漿中の血漿凝固因子レベルの標準相関を作製することが含まれる。次に、被検
血漿の凝固時間を測定し、試料中の血漿凝固因子レベルを標準相関に基づいて決
定する。
用いることができる。例えば、第VII因子夾雑物がより少ないトロンボプラスチ
ン試薬は、第VII因子欠損の患者のより正確なスクリーニング法を提供するであ
ろう。プロトロンビン時間アッセイは、外部凝固経路に影響を及ぼすクマリンの
ような医薬品を用いる抗凝固治療をモニターするのにも用いることができる。そ
のような抗凝固療法の基礎は患者の機能的ビタミンＫ依存性タンパク質を制御し
て低下させることであるから、本発明の敏感なトロンボプラスチン試薬は、治療
管理のより正確なモニターと制御をもたらすであろう。本発明の試薬は被検血漿
中に存在する血漿凝固因子のレベルの定性的スクリーニングアッセイ、さらに定
量的測定に用いることができる。そのような定量的測定には、種々の既知レベル
の血漿凝固因子を有する標準血漿の凝固時間の測定、標準血漿の凝固時間と標準
血漿中の血漿凝固因子レベルの標準相関を作製することが含まれる。次に、被検
血漿の凝固時間を測定し、試料中の血漿凝固因子レベルを標準相関に基づいて決
定する。
【００４４】 以下の実施例に本発明の原理と利点を例示する。 （実施例） 実施例１：抽出／希釈／担体溶液の調製 ＮａＣｌ（２．９２ｇ）およびクエン酸Ｎａ３（３．９３ｇ）と水（１０００
ｍｌ）を混合して抽出溶液、希釈溶液、および／または担体溶液として用いる溶
液を調製し、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１３ｍＭ クエン酸Ｎａ３を含む抽出／希
釈／担体溶液を得た。
ｍｌ）を混合して抽出溶液、希釈溶液、および／または担体溶液として用いる溶
液を調製し、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１３ｍＭ クエン酸Ｎａ３を含む抽出／希
釈／担体溶液を得た。
【００４５】 実施例２：トロンボプラスチン抽出物の調製 ウサギ脳アセトン粉末５ｇと実施例１の抽出溶液１００ｍｌを４５℃で１５分
間、４００ｒｐｍで混合しながら接触させることにより活性組織因子を含むトロ
ンボプラスチン抽出物を調製した。組織因子を抽出溶液中に抽出し、次いで遠視
分離により抽出組織から上清を分離した。
間、４００ｒｐｍで混合しながら接触させることにより活性組織因子を含むトロ
ンボプラスチン抽出物を調製した。組織因子を抽出溶液中に抽出し、次いで遠視
分離により抽出組織から上清を分離した。
【００４６】 実施例３：トロンボプラスチン抽出物からの夾雑タンパク質の膜分離、トロンボ
プラスチン試薬の製造、およびその評価 以下の実験において、種々のトロンボプラスチン試薬を評価するためのＰＴア
ッセイに用いる標準「正常」および「異常」血漿試料には、「コントロールレベ
ルＩ」正常血漿（Sigma Diagnostics, C7906）;プール正常血漿（「ＰＮＰ」）
、国際標準比（ＩＮＲ）約３．０のクマリン化血漿、および９９％＋第VII因子
欠損血漿）（Sigma Diagnostics, R7D-S）が含まれた。特記しない限りCS-190 O
ptical Analyzerを光学的方法に用い、種々の血清試料のＰＴ凝固時間を測定し
た。
プラスチン試薬の製造、およびその評価 以下の実験において、種々のトロンボプラスチン試薬を評価するためのＰＴア
ッセイに用いる標準「正常」および「異常」血漿試料には、「コントロールレベ
ルＩ」正常血漿（Sigma Diagnostics, C7906）;プール正常血漿（「ＰＮＰ」）
、国際標準比（ＩＮＲ）約３．０のクマリン化血漿、および９９％＋第VII因子
欠損血漿）（Sigma Diagnostics, R7D-S）が含まれた。特記しない限りCS-190 O
ptical Analyzerを光学的方法に用い、種々の血清試料のＰＴ凝固時間を測定し
た。
【００４７】 実施例３Ａ：トロンボプラスチン抽出物の透析 （１００ｋＤ ＭＷＣＯ：ベンチスケール） トロンボプラスチン抽出物を実施例２に記載のごとく調製し、ＭＷＣＯ １０
０ｋＤのベンチスケールDispoDyalyzer（登録商標）で透析した。透析は、ｐＨ
７．０〜８．０、温度２〜８℃、および大気圧で、実施例１のごとく調製した担
体溶液に対して６時間行った。 透析抽出物を用い、該透析抽出物とＣａＣｌ２（１１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ、Ｎ
ａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリシン
、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300と混合することによりトロンボプラス
チン試薬を調製した。種々の血漿試料のＰＴ凝固時間を測定するためにSC-190 O
ptical Analyzerを用いるプール正常血漿、レベルＩ凝固コントロール（Ｃｏａ
ｇＩ）、クマリン化血漿（ＣＰ）、および９９％＋第VII因子欠損血漿（Ｆ７Ｄ
−１）のＰＴアッセイを用いてトロンボプラスチン試薬組成物を評価した。結果
を表３Ａ．１に示す。
０ｋＤのベンチスケールDispoDyalyzer（登録商標）で透析した。透析は、ｐＨ
７．０〜８．０、温度２〜８℃、および大気圧で、実施例１のごとく調製した担
体溶液に対して６時間行った。 透析抽出物を用い、該透析抽出物とＣａＣｌ２（１１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ、Ｎ
ａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリシン
、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300と混合することによりトロンボプラス
チン試薬を調製した。種々の血漿試料のＰＴ凝固時間を測定するためにSC-190 O
ptical Analyzerを用いるプール正常血漿、レベルＩ凝固コントロール（Ｃｏａ
ｇＩ）、クマリン化血漿（ＣＰ）、および９９％＋第VII因子欠損血漿（Ｆ７Ｄ
−１）のＰＴアッセイを用いてトロンボプラスチン試薬組成物を評価した。結果
を表３Ａ．１に示す。
【００４８】 表３Ａ．１：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（３５％透析抽出物・１０
０ＭＷＣＯ） これらのデータは、濃度誘導（driven)透析によりトロンボプラスチン抽出物か
ら夾雑凝固因子が効果的に除去されたが、生物学的に活性な組織因子は抽出溶液
中に保持されたことを示す。透析抽出物から調製したトロンボプラスチン試薬は
プロコアグラント活性を有し、ＣＰ／ＰＮＰ比の増加、第VII因子欠損血漿にお
ける動的範囲の増加により示される試薬感度の増加をもたらし、ＰＴ正常時間に
対しては軽度の影響しかなかった。
０ＭＷＣＯ） これらのデータは、濃度誘導（driven)透析によりトロンボプラスチン抽出物か
ら夾雑凝固因子が効果的に除去されたが、生物学的に活性な組織因子は抽出溶液
中に保持されたことを示す。透析抽出物から調製したトロンボプラスチン試薬は
プロコアグラント活性を有し、ＣＰ／ＰＮＰ比の増加、第VII因子欠損血漿にお
ける動的範囲の増加により示される試薬感度の増加をもたらし、ＰＴ正常時間に
対しては軽度の影響しかなかった。
【００４９】 実施例３Ｂ：トロンボプラスチン抽出物のディアフィルトレーション（３００ｋ
Ｄ ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ：ベンチスケール） トロンボプラスチン抽出物を実施例２に記載のごとく調製し、次いで抽出物１
００ｍｌをＥＤＴＡ（１０ｍＭ）と混合し、抽出物／ＥＤＴＡ溶液を形成させた
。 最初のベンチスケール実験では、図３に示す系と同様のベンチ型操作で、ＭＷ
ＣＯ ３００ｋＤのポリエチレンスルホン膜を有するベンチスケールPellicon XL
（登録商標）（Millipore）５０ｃｍ２カセットを用いて抽出物／ＥＤＴＡ溶液
をディアフィルトレーションした。ディアフィルトレーションはｐＨ７〜８、温
度１８〜２２℃、フィード溶液インレット圧１０ｐｓｉｇ、およびフィード流速
約２５ｍｌ／ｍｉｎで行った。抽出物／ＥＤＴＡ溶液を、５希釈サイクル（各サ
イクルでフィード溶液の約２．５希釈をもたらす）を用い総時間約５時間で、Ｎ
ａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を含む希釈溶液で約１００倍に
希釈した。測定膜流速は約１００ｍｌ／ｈｒであった。ディアフィルトレーショ
ンの第一サイクルからの浸透物を第VII因子評価用に回収した。実施例３Ｃ参照
。次に、ディアフィルトレーションした抽出物の濃縮物を、簡単な１２，０００
ダルトン（１２ｋＤ）ＭＷＣＯ透析膜を用い、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびクエ
ン酸Ｎａ３（１３ｍＭ）を含む溶液に逆透析した。
Ｄ ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ：ベンチスケール） トロンボプラスチン抽出物を実施例２に記載のごとく調製し、次いで抽出物１
００ｍｌをＥＤＴＡ（１０ｍＭ）と混合し、抽出物／ＥＤＴＡ溶液を形成させた
。 最初のベンチスケール実験では、図３に示す系と同様のベンチ型操作で、ＭＷ
ＣＯ ３００ｋＤのポリエチレンスルホン膜を有するベンチスケールPellicon XL
（登録商標）（Millipore）５０ｃｍ２カセットを用いて抽出物／ＥＤＴＡ溶液
をディアフィルトレーションした。ディアフィルトレーションはｐＨ７〜８、温
度１８〜２２℃、フィード溶液インレット圧１０ｐｓｉｇ、およびフィード流速
約２５ｍｌ／ｍｉｎで行った。抽出物／ＥＤＴＡ溶液を、５希釈サイクル（各サ
イクルでフィード溶液の約２．５希釈をもたらす）を用い総時間約５時間で、Ｎ
ａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を含む希釈溶液で約１００倍に
希釈した。測定膜流速は約１００ｍｌ／ｈｒであった。ディアフィルトレーショ
ンの第一サイクルからの浸透物を第VII因子評価用に回収した。実施例３Ｃ参照
。次に、ディアフィルトレーションした抽出物の濃縮物を、簡単な１２，０００
ダルトン（１２ｋＤ）ＭＷＣＯ透析膜を用い、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびクエ
ン酸Ｎａ３（１３ｍＭ）を含む溶液に逆透析した。
【００５０】 ディアフィルトレーション抽出物を用い、ディアフィルトレーション抽出物（
２５容量％）とＣａＣｌ２（１１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＰＥＧ８００
０、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリシン、ＢＳＡ、およびProC
lin（登録商標）300を混合することによりトロンボプラスチン試薬を調製した。
ＰＴ凝固時間を測定するためにSC-190 Optical Analyzerを用いる凝固コントロ
ールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、クマリン化血漿（ＣＰ）、
および９９％＋第VII因子欠損血漿（Ｆ７Ｄ−１）のＰＴアッセイを用いてトロ
ンボプラスチン試薬組成物を評価した。非処理抽出物を用いて調製した（その他
は評価する試薬組成物と同じ）コントロール試薬も評価した。結果を表３Ｂ．１
に示す。
２５容量％）とＣａＣｌ２（１１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＰＥＧ８００
０、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリシン、ＢＳＡ、およびProC
lin（登録商標）300を混合することによりトロンボプラスチン試薬を調製した。
ＰＴ凝固時間を測定するためにSC-190 Optical Analyzerを用いる凝固コントロ
ールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、クマリン化血漿（ＣＰ）、
および９９％＋第VII因子欠損血漿（Ｆ７Ｄ−１）のＰＴアッセイを用いてトロ
ンボプラスチン試薬組成物を評価した。非処理抽出物を用いて調製した（その他
は評価する試薬組成物と同じ）コントロール試薬も評価した。結果を表３Ｂ．１
に示す。
【００５１】 表３Ｂ．１：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（２５％ディアフィルトレ
ーション抽出物／３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／１０ｐｓｉｇ）
ーション抽出物／３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／１０ｐｓｉｇ）
【００５２】 これらデータは、非処理抽出物を含むコントロール試薬に比べてディアフィルト
レーション抽出物を含むトロンボプラスチン試薬の感度が実質的に増加し、ＰＴ
正常時間は軽度に増加するだけであることを示す。 第二ベンチスケール実験では、上記と同じようにして異なるトロンボプラスチ
ン抽出物から調製した別の抽出物／ＥＤＴＡ溶液を、上記で用いた同じベンチス
ケールPellicon XL（登録商標）カセットを洗浄したものを用い、フィード溶液
インレット圧２０ｐｓｉｇ、およびフィード流速約４５ｍｌ／ｍｉｎにてディア
フィルトレーションした。抽出物／ＥＤＴＡ溶液を、３希釈サイクル（各サイク
ルでフィード溶液の約５希釈をもたらす）を用い総時間約３時間で、ＮａＣｌ（
５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を含む希釈溶液で約１００倍に希釈した
。測定膜流速は約２００ｍｌ／ｈｒであった。ディアフィルトレーションした抽
出物の濃縮物を、上記のごとくＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびクエン酸Ｎａ３（１
１ｍＭ）を含む溶液に逆透析した。
レーション抽出物を含むトロンボプラスチン試薬の感度が実質的に増加し、ＰＴ
正常時間は軽度に増加するだけであることを示す。 第二ベンチスケール実験では、上記と同じようにして異なるトロンボプラスチ
ン抽出物から調製した別の抽出物／ＥＤＴＡ溶液を、上記で用いた同じベンチス
ケールPellicon XL（登録商標）カセットを洗浄したものを用い、フィード溶液
インレット圧２０ｐｓｉｇ、およびフィード流速約４５ｍｌ／ｍｉｎにてディア
フィルトレーションした。抽出物／ＥＤＴＡ溶液を、３希釈サイクル（各サイク
ルでフィード溶液の約５希釈をもたらす）を用い総時間約３時間で、ＮａＣｌ（
５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を含む希釈溶液で約１００倍に希釈した
。測定膜流速は約２００ｍｌ／ｈｒであった。ディアフィルトレーションした抽
出物の濃縮物を、上記のごとくＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびクエン酸Ｎａ３（１
１ｍＭ）を含む溶液に逆透析した。
【００５３】 ディアフィルトレーション抽出物を用いて２種類の異なるトロンボプラスチン
試薬組成物を調製した。ディアフィルトレーション抽出物（２５容量％）とＣａ
Ｃｌ２（１１ｍＭ）を混合して第一試薬組成物を調製した。ディアフィルトレー
ション抽出物（３７．５容量％）とＣａＣｌ２（１１ｍＭ）を混合して第二試薬
組成物を調製した。ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリン
ブロミド、マンニトール、グリシン、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300を
各試薬組成物に加えた。 種々の血漿試料のＰＴ凝固時間を測定するためにSC-190 Optical Analyzerを用
いる凝固コントロールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、およびク
マリン化血漿（ＣＰ）のＰＴアッセイを用いて第一トロンボプラスチン試薬組成
物を評価した。非処理抽出物を用いて調製した（その他は評価する対象試薬組成
物と同じ）トロンボプラスチン試薬を用いるコントロールアッセイも評価した。
結果を表３Ｂ．２に示す。
試薬組成物を調製した。ディアフィルトレーション抽出物（２５容量％）とＣａ
Ｃｌ２（１１ｍＭ）を混合して第一試薬組成物を調製した。ディアフィルトレー
ション抽出物（３７．５容量％）とＣａＣｌ２（１１ｍＭ）を混合して第二試薬
組成物を調製した。ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリン
ブロミド、マンニトール、グリシン、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300を
各試薬組成物に加えた。 種々の血漿試料のＰＴ凝固時間を測定するためにSC-190 Optical Analyzerを用
いる凝固コントロールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、およびク
マリン化血漿（ＣＰ）のＰＴアッセイを用いて第一トロンボプラスチン試薬組成
物を評価した。非処理抽出物を用いて調製した（その他は評価する対象試薬組成
物と同じ）トロンボプラスチン試薬を用いるコントロールアッセイも評価した。
結果を表３Ｂ．２に示す。
【００５４】 表３Ｂ．２：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（２５％ディアフィルトレ
ーション抽出物／３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／２０ｐｓｉｇ）
ーション抽出物／３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／２０ｐｓｉｇ）
【００５５】 ディアフィルトレーション抽出物を含む該試薬組成物は、コントロール試薬に比
べて正常時間に対する影響はほとんどなしに、感度が増加することを示した。 凝固コントロールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、クマリン化
血漿（ＣＰ）、５０％ＰＮＰ、および９９％＋第VII因子欠損血漿（Ｆ７Ｄ−Ｉ
）のＰＴアッセイを用いて第二トロンボプラスチン試薬組成物を評価した。CS-1
90 Optical Analyzerおよび比較のために機械的ＰＴ試験を用い、種々の血漿試
料のＰＴ凝固時間を測定した。光学分析器の結果を表３Ｂ．３に示す。
べて正常時間に対する影響はほとんどなしに、感度が増加することを示した。 凝固コントロールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、クマリン化
血漿（ＣＰ）、５０％ＰＮＰ、および９９％＋第VII因子欠損血漿（Ｆ７Ｄ−Ｉ
）のＰＴアッセイを用いて第二トロンボプラスチン試薬組成物を評価した。CS-1
90 Optical Analyzerおよび比較のために機械的ＰＴ試験を用い、種々の血漿試
料のＰＴ凝固時間を測定した。光学分析器の結果を表３Ｂ．３に示す。
【００５６】 表３Ｂ．３：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（３７．５％ディアフィル
トレーション抽出物／３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／２０ｐｓｉｇ）
トレーション抽出物／３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／２０ｐｓｉｇ）
【００５７】 実施例３Ｃ：夾雑血漿凝固因子および他のタンパク質をディアフィルトレーショ
ン抽出物から除去する 膜透過によりトロンボプラスチン溶液から夾雑血漿凝固因子および他の凝固タ
ンパク質を除去することを証明する種々の試験を行った。 最初の実験では、実施例３Ｂにおける最初のベンチスケール実験のディアフィ
ルトレーション抽出物の第一サイクル（３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／１０ｐｓｉ
ｇ）からの浸透（透過）物について、第VII因子の存在、および独立してプロコ
アグラント活性の存在を評価した。ディアフィルトレーションから回収した浸透
物を濃縮し、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）／クエン酸Ｎａ３（１１ｍＭ）溶液に透析し
てＥＤＴＡを除去した。次に、浸透物を第VII因子欠損血漿試料に加え、市販の
トロンボプラスチン試薬、ThromboMAX(Sigma Chemical. St.Louis MO)を用いる
ＰＴアッセイを用いて評価した。表３Ｃ．１（ａ）に示したアッセイ結果は、浸
透試料のＰＴアッセイ時間が９９％＋第VII因子欠損血漿試料のそれより短いこ
とから、第VII因子が浸透溶液に存在したことを示す。したがって、これら結果
は、活性第VII因子がディアフィルトレーションによりトロンボプラスチン抽出
物溶液から効果的に分離されたことを示す。さらに、表３Ｃ．１に示すように、
濃縮浸透物では、Sigma Diagnostics ThromboMAX（登録商標）をコントロールに
用い、濃縮浸透物を凝固コントロールレベルＩ血漿に加えて凝固時間を測定する
ことにより示されるようにプロコアグラント活性は認められなかった。
ン抽出物から除去する 膜透過によりトロンボプラスチン溶液から夾雑血漿凝固因子および他の凝固タ
ンパク質を除去することを証明する種々の試験を行った。 最初の実験では、実施例３Ｂにおける最初のベンチスケール実験のディアフィ
ルトレーション抽出物の第一サイクル（３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ／１０ｐｓｉ
ｇ）からの浸透（透過）物について、第VII因子の存在、および独立してプロコ
アグラント活性の存在を評価した。ディアフィルトレーションから回収した浸透
物を濃縮し、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）／クエン酸Ｎａ３（１１ｍＭ）溶液に透析し
てＥＤＴＡを除去した。次に、浸透物を第VII因子欠損血漿試料に加え、市販の
トロンボプラスチン試薬、ThromboMAX(Sigma Chemical. St.Louis MO)を用いる
ＰＴアッセイを用いて評価した。表３Ｃ．１（ａ）に示したアッセイ結果は、浸
透試料のＰＴアッセイ時間が９９％＋第VII因子欠損血漿試料のそれより短いこ
とから、第VII因子が浸透溶液に存在したことを示す。したがって、これら結果
は、活性第VII因子がディアフィルトレーションによりトロンボプラスチン抽出
物溶液から効果的に分離されたことを示す。さらに、表３Ｃ．１に示すように、
濃縮浸透物では、Sigma Diagnostics ThromboMAX（登録商標）をコントロールに
用い、濃縮浸透物を凝固コントロールレベルＩ血漿に加えて凝固時間を測定する
ことにより示されるようにプロコアグラント活性は認められなかった。
【００５８】 表３Ｃ．１：第VII因子の浸透物評価 表３Ｃ．１（ａ） 表３ｃ．１（ｂ）
【００５９】 第二実験では、トロンボプラスチン抽出物を実施例２のごとく調製し、実施例
３Ｂと同様のプロトコール（３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ）を用いてディアフィル
トレーションした。ディアフィルトレーション抽出物および非処理コントロール
抽出物の固体粒子（およびそれに吸着した組織因子）を遠心分離により除去した
。ディアフィルトレーションから得られる浸透物、およびディアフィルトレーシ
ョントロンボプラスチン抽出物および非処理コントロール抽出物の透明な上清を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動的に評価した。図５に示す結果は、非処理抽出
物に存在するタンパク質（レーン２）が膜透過により実質的に分離され、該タン
パク質は処理抽出物の濃縮物中にほとんど保持されず（レーン３）、大部分のタ
ンパク質は浸透物へと膜を通過した（レーン４）ことを示す。
３Ｂと同様のプロトコール（３００ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ）を用いてディアフィル
トレーションした。ディアフィルトレーション抽出物および非処理コントロール
抽出物の固体粒子（およびそれに吸着した組織因子）を遠心分離により除去した
。ディアフィルトレーションから得られる浸透物、およびディアフィルトレーシ
ョントロンボプラスチン抽出物および非処理コントロール抽出物の透明な上清を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動的に評価した。図５に示す結果は、非処理抽出
物に存在するタンパク質（レーン２）が膜透過により実質的に分離され、該タン
パク質は処理抽出物の濃縮物中にほとんど保持されず（レーン３）、大部分のタ
ンパク質は浸透物へと膜を通過した（レーン４）ことを示す。
【００６０】 実施例３Ｄ：ＢａＳＯ４／ＥＤＴＡトロンボプラスチン抽出物の透析（３００ｋ
Ｄ ＭＷＣＯ） トロンボプラスチン抽出物を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）
、およびＢａＳＯ４（５ｇ）を含む抽出溶液（５００ｍｌ）を用いてウサギ脳ア
セトン粉末（２５ｇ）から調製した。 ＥＤＴＡ／ＢａＳＯ４抽出物を、３００ｋＤ ＭＷＣＯ DispoDialyzers（登録
商標）を用い、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む担体溶液に対
して透析した（少量のＣＨＡＰＳ界面活性剤を使用および不使用の両方で）。次
に、透析抽出物をＮａＣｌ（５０ｍＭ）／クエン酸Ｎａ３（１１ｍＭ）溶液中で
逆透析した。
Ｄ ＭＷＣＯ） トロンボプラスチン抽出物を、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）
、およびＢａＳＯ４（５ｇ）を含む抽出溶液（５００ｍｌ）を用いてウサギ脳ア
セトン粉末（２５ｇ）から調製した。 ＥＤＴＡ／ＢａＳＯ４抽出物を、３００ｋＤ ＭＷＣＯ DispoDialyzers（登録
商標）を用い、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む担体溶液に対
して透析した（少量のＣＨＡＰＳ界面活性剤を使用および不使用の両方で）。次
に、透析抽出物をＮａＣｌ（５０ｍＭ）／クエン酸Ｎａ３（１１ｍＭ）溶液中で
逆透析した。
【００６１】 非処理抽出物、ＣＨＡＰＳを用いて透析した抽出物、およびＣＨＡＰＳを用い
ずに透析した抽出物をそれぞれ、抽出物（３５容量％）およびＣａＣｌ２（１１
ｍＭ）を含むトロンボプラスチン試薬組成物を用いて分析した。ＨＥＰＥＳ、Ｎ
ａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリシン
、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300も該試薬組成物に加えた。次に、ＰＴ
凝固時間を測定するためのCS-190 Optical Analyzerを用い、「コントロールレ
ベルＩ」正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、８０％クマリン化血漿、９９％ ＋ 第VII因子欠損血漿、および国際感度指数（ＩＳＩ）についてＰＴアッセイを
用いてトロンボプラスチン試薬組成物を評価した。２種類のコントロールアッセ
イ、すなわち、非処理抽出物を用いる他は対象試薬組成物と同じに調製したトロ
ンボプラスチン試薬を用いるアッセイ、およびもう一つは１２，０００ダルトン
（１２ｋＤ）ＭＷＣＯ膜に対して透析した非処理抽出物を用いる他は対象組成物
と同じに調製したトロンボプラスチン試薬を用いるアッセイも評価した。結果を
表３Ｄ．１に示す。
ずに透析した抽出物をそれぞれ、抽出物（３５容量％）およびＣａＣｌ２（１１
ｍＭ）を含むトロンボプラスチン試薬組成物を用いて分析した。ＨＥＰＥＳ、Ｎ
ａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリシン
、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300も該試薬組成物に加えた。次に、ＰＴ
凝固時間を測定するためのCS-190 Optical Analyzerを用い、「コントロールレ
ベルＩ」正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、８０％クマリン化血漿、９９％ ＋ 第VII因子欠損血漿、および国際感度指数（ＩＳＩ）についてＰＴアッセイを
用いてトロンボプラスチン試薬組成物を評価した。２種類のコントロールアッセ
イ、すなわち、非処理抽出物を用いる他は対象試薬組成物と同じに調製したトロ
ンボプラスチン試薬を用いるアッセイ、およびもう一つは１２，０００ダルトン
（１２ｋＤ）ＭＷＣＯ膜に対して透析した非処理抽出物を用いる他は対象組成物
と同じに調製したトロンボプラスチン試薬を用いるアッセイも評価した。結果を
表３Ｄ．１に示す。
【００６２】 表３Ｄ．１：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（３５％透析ＥＤＴＡ／Ｂ
ａＳＯ４抽出物／３００ＭＷＣＯ）
ａＳＯ４抽出物／３００ＭＷＣＯ）
【００６３】 これらデータは、第VII因子欠損血漿の凝固時間、およびクマリン処理血漿の動
的範囲の大きな増加と共にＩＳＩ値の減少により示されるように、透析トロンボ
プラスチン試薬の感度の著しい増加を証明した。透析時のＣＨＡＰＳの存在は、
ＣＨＡＰＳを用いずに透析した抽出物から調製した試薬に比べて比較的長い正常
時間が示すようにプロコアグラント活性の検出可能な低下をもたらした。
的範囲の大きな増加と共にＩＳＩ値の減少により示されるように、透析トロンボ
プラスチン試薬の感度の著しい増加を証明した。透析時のＣＨＡＰＳの存在は、
ＣＨＡＰＳを用いずに透析した抽出物から調製した試薬に比べて比較的長い正常
時間が示すようにプロコアグラント活性の検出可能な低下をもたらした。
【００６４】 実施例３Ｅ：凍結／解凍トロンボプラスチン抽出物の透析（３００ｋＤ ＭＷＣ
Ｏ／ＥＤＴＡ） 実施例２のごとく調製したトロンボプラスチン抽出物を凍結した。次いで、凍
結抽出物を解凍し、１０ｍＭ ＥＤＴＡとした。３００ｋＤ ＭＷＣＯ DispoDial
yzer（登録商標）を用い、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む担
体溶液に対して抽出物を透析し、次いで、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）／クエン酸Ｎａ ３ （１１ｍＭ）溶液に逆透析した。 非処理抽出物および透析抽出物を、抽出物（３５容量％）およびＣａＣｌ２（
１１ｍＭ）を含むトロンボプラスチン試薬組成物を用いて分析した。ＨＥＰＥＳ
、ＮａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリ
シン、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300も該試薬組成物に加えた。ＰＴ凝
固時間を測定するためのCS-190 Optical Analyzerを用い、「コントロールレベ
ルＩ」正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、８０％クマリン化血漿、９９％＋ 第VII因子欠損血漿、および国際感度指数（ＩＳＩ）についてＰＴアッセイを用
いてトロンボプラスチン試薬組成物を評価した。非処理抽出物を用いる他は対象
試薬組成物と同じに調製したトロンボプラスチン試薬をコントロールに用いた。
結果を表３Ｅ．１に示す。
Ｏ／ＥＤＴＡ） 実施例２のごとく調製したトロンボプラスチン抽出物を凍結した。次いで、凍
結抽出物を解凍し、１０ｍＭ ＥＤＴＡとした。３００ｋＤ ＭＷＣＯ DispoDial
yzer（登録商標）を用い、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む担
体溶液に対して抽出物を透析し、次いで、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）／クエン酸Ｎａ ３ （１１ｍＭ）溶液に逆透析した。 非処理抽出物および透析抽出物を、抽出物（３５容量％）およびＣａＣｌ２（
１１ｍＭ）を含むトロンボプラスチン試薬組成物を用いて分析した。ＨＥＰＥＳ
、ＮａＣｌ、ＰＥＧ８０００、ヘキサジメトリンブロミド、マンニトール、グリ
シン、ＢＳＡ、およびProClin（登録商標）300も該試薬組成物に加えた。ＰＴ凝
固時間を測定するためのCS-190 Optical Analyzerを用い、「コントロールレベ
ルＩ」正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、８０％クマリン化血漿、９９％＋ 第VII因子欠損血漿、および国際感度指数（ＩＳＩ）についてＰＴアッセイを用
いてトロンボプラスチン試薬組成物を評価した。非処理抽出物を用いる他は対象
試薬組成物と同じに調製したトロンボプラスチン試薬をコントロールに用いた。
結果を表３Ｅ．１に示す。
【００６５】 表３Ｅ．１：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（３５％透析解凍抽出物／
３００ ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ） 他の結果と一致して、これら結果は、該試薬組成物の感度の著しい改良と、第VI
I因子欠損凝固時間の改良を示す。
３００ ＭＷＣＯ／ＥＤＴＡ） 他の結果と一致して、これら結果は、該試薬組成物の感度の著しい改良と、第VI
I因子欠損凝固時間の改良を示す。
【００６６】 実施例４：トロンボプラスチン試薬の製造 実施例３Ｂのごとく調製したトロンボプラスチン抽出物から、該抽出物（３５
容量％）、ＣａＣｌ２（１１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（８０
ｍＭ）、ＰＥＧ８０００（０．７５％）、クエン酸Ｎａ３（３．５ｍＭ）、ヘキ
ジメトリンブロミド（１２．５ｍｇ／ｌ）、マンニトール（２％）、グリシン（
４％）、およびＢＳＡ（１％）を含むトロンボプラスチン試薬を製造した。 ＰＴ凝固時間を測定するためのCS-190 Optical Analyzerを用い、凝固コントロ
ールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、クマリン化血漿、および９
９％＋第VII因子欠損血漿についてＰＴアッセイを用いてトロンボプラスチン試
薬を評価した。非処理抽出物を用いる他は対象試薬組成物と同じに調製したトロ
ンボプラスチン試薬をコントロールに用いた。結果を表４．１に示す。
容量％）、ＣａＣｌ２（１１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（８０
ｍＭ）、ＰＥＧ８０００（０．７５％）、クエン酸Ｎａ３（３．５ｍＭ）、ヘキ
ジメトリンブロミド（１２．５ｍｇ／ｌ）、マンニトール（２％）、グリシン（
４％）、およびＢＳＡ（１％）を含むトロンボプラスチン試薬を製造した。 ＰＴ凝固時間を測定するためのCS-190 Optical Analyzerを用い、凝固コントロ
ールレベルＩ正常血漿、プール正常血漿（ＰＮＰ）、クマリン化血漿、および９
９％＋第VII因子欠損血漿についてＰＴアッセイを用いてトロンボプラスチン試
薬を評価した。非処理抽出物を用いる他は対象試薬組成物と同じに調製したトロ
ンボプラスチン試薬をコントロールに用いた。結果を表４．１に示す。
【００６７】 表４．１：トロンボプラスチン試薬のＰＴ凝固時間（３５％ディアフィルトレー
ション抽出物抽出物／３００ＭＷＣＯ：パイロット）
ション抽出物抽出物／３００ＭＷＣＯ：パイロット）
【００６８】 実施例５：トロンボプラスチン抽出物中の夾雑物の酵素的消化 ヒトおよびウシ組織因子はキモトリプシン消化に抵抗性であることが報告され
ている。残存ウサギ凝固因子の酵素的消化によりより感度のよい抽出物が調製で
きるかを検討するためにさらに実験を行った。 ウサギ脳アセトン粉末（ＲＢＡＰ）抽出物の部分標本を、室温で一夜、加える
キモトリプシンの濃度を変えながらインキュベーションし、次いで透析した。次
に、これら調製物を４２％抽出物・予備凍結乾燥トロンボプラスチン試薬として
試験した。
ている。残存ウサギ凝固因子の酵素的消化によりより感度のよい抽出物が調製で
きるかを検討するためにさらに実験を行った。 ウサギ脳アセトン粉末（ＲＢＡＰ）抽出物の部分標本を、室温で一夜、加える
キモトリプシンの濃度を変えながらインキュベーションし、次いで透析した。次
に、これら調製物を４２％抽出物・予備凍結乾燥トロンボプラスチン試薬として
試験した。
【００６９】 表５．１：ＰＴ凝固時間に対するキモトリプシンの影響 トロンボプラスチン試薬のキモトリプシン処理は、キモトリプシン処理が該抽
出物の組織因子活性やＰＴアッセイの正常値に影響せずに、同時に該生成物の感
度を改良することを示した。
出物の組織因子活性やＰＴアッセイの正常値に影響せずに、同時に該生成物の感
度を改良することを示した。
【００７０】 実施例６：遊離カルシウム結合剤の調節による試薬感度の増加 カルシウム結合試薬のクエン酸Ｎａ３、ＡＤＡ（Ｎ−２−アセタミドール−２
−イミド二酢酸）、およびビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリ
シン）を添加したトロンボプラスチン試薬の性能を評価し、該試薬における遊離
Ｃａ＋＋調節の効果を検討した。下記表に示すように、Ｃａ＋＋調節剤の使用は
、正常ＰＮＰ時間を期待範囲内に保ちながら該試薬の感度を増加する。
−イミド二酢酸）、およびビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリ
シン）を添加したトロンボプラスチン試薬の性能を評価し、該試薬における遊離
Ｃａ＋＋調節の効果を検討した。下記表に示すように、Ｃａ＋＋調節剤の使用は
、正常ＰＮＰ時間を期待範囲内に保ちながら該試薬の感度を増加する。
【００７１】 表６．１：ＰＴ凝固時間に対するＨＥＰＥＳ緩衝剤中の種々の濃度のクエン酸Ｎ
ａ３の影響
ａ３の影響
【００７２】 表６．２トロンボプラスチン溶液に対するビシンおよびＡＤＡの結果
【００７３】 実施例７：トロンボプラスチン抽出物のディアフィルトレーションの効果の特徴
付け 機能アッセイと独立してトロンボプラスチン抽出物のディアフィルトレーショ
ンの効果を特徴づけるため、ディアフィルトレーションおよび非ディアフィルト
レーションＲＢＡＰ抽出物の血漿ヘモグロビンアッセイを行った。 該方法はSigma Diagnostics Plasma Hemoglobin Kit No.527を用いて行った。
結果は以下の通りである。
付け 機能アッセイと独立してトロンボプラスチン抽出物のディアフィルトレーショ
ンの効果を特徴づけるため、ディアフィルトレーションおよび非ディアフィルト
レーションＲＢＡＰ抽出物の血漿ヘモグロビンアッセイを行った。 該方法はSigma Diagnostics Plasma Hemoglobin Kit No.527を用いて行った。
結果は以下の通りである。
【００７４】 非ディアフィルトレーション抽出物は夾雑物由来と思われる褐色または赤色を
帯びているが、ディアフィルトレーション抽出物は無色透明である。アッセイの
結果は、非ディアフィルトレーション抽出物のＨｂ計算値が２．０５ｍｇ／ｄｌ
であったことを示す。ディアフィルトレーション抽出物のＨｂ計算値は、検出限
界またはそれ以下のレベルを示す−０．５１ｍｇ／ｄｌであり、このことはトロ
ンボプラスチン抽出物からの夾雑物の除去におけるディアフィルトレーション技
術の効果を示した。
帯びているが、ディアフィルトレーション抽出物は無色透明である。アッセイの
結果は、非ディアフィルトレーション抽出物のＨｂ計算値が２．０５ｍｇ／ｄｌ
であったことを示す。ディアフィルトレーション抽出物のＨｂ計算値は、検出限
界またはそれ以下のレベルを示す−０．５１ｍｇ／ｄｌであり、このことはトロ
ンボプラスチン抽出物からの夾雑物の除去におけるディアフィルトレーション技
術の効果を示した。
【００７５】 本発明の詳細な説明および上記実施例に照らして、本発明の種々の目的が達成
されることが理解できる。 本明細書に示した説明および例示は、当業者に本発明、その原理、およびその
実用的応用を熟知させるためのものである。当業者は、特定用途の要求に最適と
なるよう本発明を多くの形に適合させ、応用してよい。したがって、記載した本
発明の特定の態様は、本発明を網羅もしくは限定するものではない。
されることが理解できる。 本明細書に示した説明および例示は、当業者に本発明、その原理、およびその
実用的応用を熟知させるためのものである。当業者は、特定用途の要求に最適と
なるよう本発明を多くの形に適合させ、応用してよい。したがって、記載した本
発明の特定の態様は、本発明を網羅もしくは限定するものではない。
【図１】半透膜シートを有するタンジェンシャルフロー（tangential flow
）膜分離装置の模式的横断面図である。
）膜分離装置の模式的横断面図である。
【図２】管状半透膜を有するシェル・アンド・チューブ型膜分離装置の透視
図である。
図である。
【図３】バッチ操作を構成する一段階膜分離法の模式的ダイアグラムである
。
。
【図４】連続フィード・アンド・ブリード操作を構成する多段階一段階膜分
離法の模式的ダイアグラムである。
離法の模式的ダイアグラムである。
【図５】分子量標準（レーン１）、および透析前のトロンボプラスチン抽出
物の溶液相（レーン２）、透析後のトロンボプラスチン抽出物の濃縮物溶液、お
よび透析から得られた浸透溶液中のタンパク質の分子量分布を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動ゲルの写真である。
物の溶液相（レーン２）、透析後のトロンボプラスチン抽出物の濃縮物溶液、お
よび透析から得られた浸透溶液中のタンパク質の分子量分布を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動ゲルの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA10 BB04 BB10 BB29 BB50 FB05 2G052 AA28 AA30 AD06 AD26 AD46 EA02 GA00 JA09 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ36 QQ97 QR16 QR48 QR50 QR67 QX01 4H045 AA20 AA30 BA10 CA40 DA65 EA50 FA71 GA01 GA10
Claims (63)
- 【請求項１】 トロンボプラスチン溶液から血漿凝固因子を分離する方法で
あって、組織因子および血漿凝固因子を含むトロンボプラスチン溶液を半透膜の
第一表面に曝露し、該膜で、該凝固因子を該トロンボプラスチン溶液からろ過し
、該トロンボプラスチン溶液中に組織因子が保持されることを含む方法。 - 【請求項２】 該トロンボプラスチン溶液がトロンボプラスチン抽出物であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該血漿凝固因子が第ＶII因子、第II因子、第Ｘ因子、第IＸ
因子、第ＸI因子、第ＸII因子、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテイ
ンＺからなる群から選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 該血漿凝固因子が第ＶII因子である請求項１記載の方法。
- 【請求項５】 血漿凝固因子の第ＶII因子、第II因子、および第Ｘ因子がそ
れぞれ該膜でろ過される（膜を通過する）請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 該トロンボプラスチン溶液中に組織因子が少なくとも約１０
％保持されている請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 該トロンボプラスチン溶液がさらにカルシウムイオンキレー
ト剤を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 フィード溶液がさらに少なくとも約１０ｍＭの濃度のエチレ
ンジアミン四酢酸を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 該トロンボプラスチン溶液がさらに溶媒を含み、溶媒の部分
が該膜で該トロンボプラスチン溶液からろ過される請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 担体溶液を該膜の第二表面に曝露する工程をさらに含む請
求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 トロンボプラスチン抽出組成物の製造方法であって、 哺乳動物組織を抽出溶液で抽出してトロンボプラスチン抽出物を形成し、 膜透過（浸透）によりトロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を分離するこ
とを含む方法。 - 【請求項１２】 該組織がホモゲナイズした組織である請求項１１記載の方
法。 - 【請求項１３】 該組織が脱水した組織である請求項１１記載の方法。
- 【請求項１４】 該組織がアセトン粉末の形である請求項１１記載の方法。
- 【請求項１５】 該抽出溶液が水性塩溶液である請求項１１記載の方法。
- 【請求項１６】 該抽出溶液が有機酸塩を含む請求項１１記載の方法。
- 【請求項１７】 該抽出溶液がクエン酸塩を含む請求項１１記載の方法。
- 【請求項１８】 該抽出溶液がクエン酸ナトリウムを含む請求項１１記載の
方法。 - 【請求項１９】 該組織が実質的にカルシウムイオンを含まない抽出溶液で
抽出された請求項１１記載の方法。 - 【請求項２０】 該血漿凝固因子が第ＶII因子、第II因子、第Ｘ因子、第I
Ｘ因子、第ＸI因子、第ＸII因子、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテ
インＺからなる群から選ばれる請求項１１記載の方法。 - 【請求項２１】 該血漿凝固因子が第ＶII因子である請求項１１記載の方法
。 - 【請求項２２】 該トロンボプラスチン抽出物がさらにカルシウムイオンキ
レート剤を含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項２３】 トロンボプラスチン抽出物がさらに少なくとも約１０ｍＭ
の濃度のエチレンジアミン四酢酸を含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項２４】 トロンボプラスチン試薬の製造方法であって、 膜透過によりトロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を分離し、 該トロンボプラスチン抽出物をＣａ＋＋イオンと混合することを含む方法。
- 【請求項２５】 該トロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を分離した
後に、該Ｃａ＋＋イオンと該トロンボプラスチン抽出物を混合する請求項２４記
載の方法。 - 【請求項２６】 該血漿凝固因子が第ＶII因子、第II因子、第Ｘ因子、第I
Ｘ因子、第ＸI因子、第ＸII因子、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテ
インＺからなる群から選ばれる請求項２４記載の方法。 - 【請求項２７】 該血漿凝固因子が第ＶII因子である請求項２４記載の方法
。 - 【請求項２８】 該トロンボプラスチン抽出物がさらにカルシウムイオンキ
レート剤を含む請求項２４記載の方法。 - 【請求項２９】 トロンボプラスチン抽出物がさらにエチレンジアミン四酢
酸を含む請求項２４記載の方法。 - 【請求項３０】 トロンボプラスチン試薬の製造方法であって、 トロンボプラスチン抽出物を含むフィード溶液を、約７５，０００ダルトン〜約
２，０００，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する半透膜の第一表
面に曝露し、 曝露したフィード溶液を濃縮物（retentate）として回収し、 該濃縮物をＣａ＋＋イオンと混合することを含む方法。 - 【請求項３１】 該半透膜が約１００，０００ダルトン〜約１，０００，０
００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する請求項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 該半透膜が約１００，０００ダルトン〜約５００，０００
ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する請求項３０記載の方法。 - 【請求項３３】 該半透膜が約２００，０００ダルトン〜約４００，０００
ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する請求項３０記載の方法。 - 【請求項３４】 該フィード溶液がさらにカルシウムイオンキレート剤を含
む請求項３０記載の方法。 - 【請求項３５】 該フィード溶液がさらに少なくとも約１０ｍＭの濃度のエ
チレンジアミン四酢酸を含む請求項３０記載の方法。 - 【請求項３６】 該フィード溶液がさらに少なくとも約１０ｍＭの濃度のエ
チレンジアミン四酢酸を含み、該膜が約３００，０００ダルトンの分子量カット
オフを有する請求項３０記載の方法。 - 【請求項３７】 さらに濃縮物と緩衝液および安定化剤を混合することを含
む請求項３０記載の方法。 - 【請求項３８】 該フィード溶液がさらに溶媒を含み、溶媒の部分が該フィ
ード溶液から該膜でろ過される請求項３０記載の方法。 - 【請求項３９】 さらに該フィード溶液をタンクから該半透膜に供給し、曝
露されたフィード溶液をタンクに再循環し、溶媒を含む希釈溶液をタンクに供給
することを含む請求項３８記載の方法。 - 【請求項４０】 さらに担体溶液を膜の第二表面に曝露することを含む請求
項３０記載の方法。 - 【請求項４１】 請求項１１記載の方法に従って製造されるトロンボプラス
チン抽出組成物。 - 【請求項４２】 請求項２４記載の方法に従って製造されるトロンボプラス
チン試薬。 - 【請求項４３】 請求項３０記載の方法に従って製造されるトロンボプラス
チン試薬。 - 【請求項４４】 プロトロンビン時間アッセイにより決定されるプロコアグ
ラント（凝血原）活性を有する、ヘモグロビン濃度が約２．０ｍｇ／ｄｌ以下の
、哺乳動物組織から抽出された組織因子およびＣａ＋＋イオンを含むトロンボプ
ラスチン試薬。 - 【請求項４５】 ヘモグロビン濃度が約１．０ｍｇ／ｄｌ以下である請求項
４４記載のトロンボプラスチン試薬。 - 【請求項４６】 ヘモグロビン濃度が約０．５ｍｇ／ｄｌ以下である請求項
４４記載のトロンボプラスチン試薬。 - 【請求項４７】 プロトロンビン時間アッセイにより決定される正常クエン
酸化血漿に対する試薬のプロコアグラント活性が約９．０秒〜約２０．０秒間の
範囲である請求項４４記載のトロンボプラスチン試薬。 - 【請求項４８】 プロトロンビン時間アッセイにより決定される国際標準比
（International Normalized Ratio (INR)）が約３．０のクマリンで処理した血
漿に対する該試薬のプロコアグラント活性が少なくとも約２０秒間である請求項
４４記載のトロンボプラスチン試薬。 - 【請求項４９】 プロトロンビン時間アッセイにより決定される、第VII因
子が少なくとも９９％欠損している第VII因子欠損血漿に対する該試薬のプロコ
アグラント活性が少なくとも約３０秒間である請求項４４記載のトロンボプラス
チン試薬。 - 【請求項５０】 プロトロンビン時間アッセイにより決定される１００％プ
ール正常血漿対５０％プール正常血漿に対する該試薬のプロコアグラント活性の
差が約３秒〜約６秒間である請求項４４記載のトロンボプラスチン試薬。 - 【請求項５１】 プロトロンビン時間アッセイにより決定される国際感度指
数（International Sensitivity Index）に基づく試薬の感度が約２．０秒間以
下である請求項４４記載のトロンボプラスチン試薬。 - 【請求項５２】 血漿試料の凝固時間の検出方法であって、請求項４２、４
３、または４４記載のトロンボプラスチン試薬を製造するかもしくは得、 該トロンボプラスチン試薬と血漿試料を混合してアッセイ溶液を形成し、 アッセイ溶液の形成からの経過時間を測定することによりアッセイ溶液中の血
餅形成を検出することを含む方法。 - 【請求項５３】 被検血漿中に存在する血漿凝固因子のレベルを測定する方
法であって、請求項５２記載の方法に従って、種々の既知レベルの血漿凝固因子
を有する標準血漿の凝固時間を測定し、 標準血漿の凝固時間と標準血漿中の血漿凝固因子レベルの標準相関を作製し、 請求項５２記載の方法に従って被検血漿の凝固時間を測定し、 標準相関に基づいて被検血漿の測定した凝固時間と血漿凝固因子のレベルを相関
させることを含む方法。 - 【請求項５４】 トロンボプラスチン抽出物の製造方法であって、 哺乳動物細胞を、少なくとも濃度約７ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む抽出溶液
と接触させることにより該組織から組織因子を抽出溶液中に抽出し、 抽出溶液を抽出された組織から分離することを含む方法。 - 【請求項５５】 該抽出溶液が濃度約７ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲のクエン酸
ナトリウムを含む請求項５４記載の方法。 - 【請求項５６】 該抽出溶液がさらに塩化ナトリウムを含む請求項５４記載
の方法。 - 【請求項５７】 該抽出溶液が濃度約１３ｍＭのクエン酸ナトリウムと濃度
約５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む請求項５４記載の方法。 - 【請求項５８】 トロンボプラスチン試薬の遊離カルシウムイオン含有量を
カルシウム緩衝剤で調節することを含むトロンボプラスチン試薬の感度を調節す
る方法。 - 【請求項５９】 トロンボプラスチン試薬の製造方法であって、 カルシウム緩衝剤を含むトロンボプラスチン抽出物を調製し、 トロンボプラスチン抽出物から血漿凝固因子を分離して精製トロンボプラスチン
抽出物を形成し、 精製トロンボプラスチン抽出物にカルシウムおよびカルシウム緩衝剤を加えるこ
とを含む方法。 - 【請求項６０】 トロンボプラスチン試薬の製造方法であって、夾雑タンパ
ク質を含むトロンボプラスチン抽出物を調製し、 夾雑タンパク質を酵素的に消化し、 トロンボプラスチン抽出物から消化した夾雑タンパク質を分離して精製トロンボ
プラスチン抽出物を形成し、 精製トロンボプラスチン抽出物にカルシウムイオンを加えることを含む方法。 - 【請求項６１】 哺乳動物組織を、ホスホリパーゼインヒビターを含む抽出
溶液で抽出することを含むトロンボプラスチン抽出物の製造方法。 - 【請求項６２】 トロンボプラスチン抽出物とホスホリパーゼインヒビター
を混合することを含むトロンボプラスチン抽出物の安定化方法。 - 【請求項６３】 ホスホリパーゼインヒビターを含むトロンボプラスチン抽
出物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10341798P | 1998-10-07 | 1998-10-07 | |
| US60/103,417 | 1998-10-07 | ||
| PCT/US1999/023369 WO2000020835A2 (en) | 1998-10-07 | 1999-10-07 | Thromboplastin reagents and methods for preparing and using such reagents |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000574903A Pending JP2002526557A (ja) | 1998-10-07 | 1999-10-07 | トロンボプラスチン試薬ならびにそのような試薬の製造および使用方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (4)
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