ES2252986T3 - Reactivos de tromboplastina y metodos para preparar y usar tales reactivos. - Google Patents
Reactivos de tromboplastina y metodos para preparar y usar tales reactivos.Info
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Abstract
Método para separar un factor de coagulación plasmático de una disolución de tromboplastina, comprendiendo el método: exponer una disolución de tromboplastina que comprende factor tisular biológicamente activo y un factor de coagulación plasmático a una primera superficie de una membrana semipermeable; permitir que el factor de coagulación pase desde la disolución de tromboplastina a través de la membrana; y retener el factor tisular biológicamente activo en la disolución de tromboplastina.
Description
Reactivos de tromboplastina y métodos para
preparar y usar tales reactivos.
La presente invención se refiere generalmente a
ensayos de diagnósticos de coagulación y específicamente a reactivos
de tromboplastina adecuados para su uso en el ensayo de coagulación
basado en tromboplastina. La invención se refiere particularmente,
en las realizaciones preferidas, a extractos de tromboplastina de
mamíferos, a métodos para preparar tales extractos, a reactivos de
tromboplastina preparados a partir de los mismos y al uso de tales
reactivos en los ensayos de tiempo de protrombina.
Los reactivos de tromboplastina incluyen el
factor tisular activo, que cuando se expone a una muestra de plasma
en presencia de iones calcio (Ca^{++}), activa la ruta extrínseca
de coagulación sanguínea. Más específicamente, el factor tisular
activa el factor VII en presencia de Ca^{++} que, a su vez, activa
el factor X y el factor V para iniciar la formación de trombina a
partir de protrombina (factor II). La trombina es una serín
endopeptidasa que escinde el fibrinógeno para formar fibrina. La
fibrina, que es soluble como monómero, se polimeriza para formar un
coágulo blando y posteriormente se reticula para formar un coágulo
duro. El tiempo requerido para formar un coágulo con la combinación
de un reactivo de tromboplastina y una muestra de plasma es una
medida de la actividad procoagulante del plasma.
Los ensayos de diagnósticos que emplean reactivos
de tromboplastina y se basa en los tiempos de coagulación
(denominados normalmente ensayos de tiempo de protrombina (TP)), se
han usado ampliamente para determinar las deficiencias en la
coagulación sanguínea asociadas con la ruta extrínseca de la
coagulación. Véase Quick, Am. J. Med. Soc. 190: 501 (1935). Los
ensayos de TP se emplean, por ejemplo, para seleccionar el plasma de
los pacientes antes de una intervención quirúrgica. Los ensayos de
TP también se emplean para monitorizar el tratamiento anticoagulante
con productos farmacéuticos, tales como la cumarina
(Warfarin^{MR}, Coumadin^{MR}), que afecta a la ruta extrínseca
de la coagulación.
Los principales criterios de rendimiento para los
reactivos de tromboplastina para su uso en los ensayos de TP son el
tiempo de coagulación para una muestra de plasma "normal", la
sensibilidad del reactivo y la reproducibilidad de un lote a otro
del reactivo. El tiempo para la coagulación de un plasma normal en
un ensayo de TP, según se determina por Quick, fue de
aproximadamente 12 segundos y posteriormente, el "TP normal" de
12 segundos se ha convertido en un criterio esperado para los
reactivos de tromboplastina en los Estados Unidos. Aunque los
reactivos de tromboplastina tienen preferiblemente un tiempo TP
normal de aproximadamente 12,0 segundos, tiempos que oscilan desde
aproximadamente 9,0 hasta aproximadamente 20,0 segundos pueden ser
satisfactorios en determinadas circunstancias y los tiempos que
oscilan desde aproximadamente 9,0 hasta aproximadamente 14,0
segundos, preferiblemente desde aproximadamente 9,0 hasta
aproximadamente 13,0 segundos, son generalmente aceptables. La
sensibilidad de un reactivo de tromboplastina se refiere
generalmente al intervalo dinámico en los tiempos del ensayo de TP
obtenidos para una muestra de plasma "normal", en comparación
con una muestra de plasma "anómala normalizada". Las muestras
de plasma "anómalas normalizadas" con respecto a aquellas en la
que está caracterizada la sensibilidad de un reactivo de
tromboplastina dado, incluyen, por ejemplo, las muestras de plasma
tratadas con cumarina (por ejemplo, plasmas tratados con
Coumarin^{MR} para tener un cociente internacional normalizado
(INR) de aproximadamente 3,0), y las muestras de plasma deficiente
en factor VII en un 99%^{+}. Los tiempos de coagulación asociados
a los plasmas normales reunidos (PNP), los PNP diluidos (por
ejemplo, PNP diluido al 50%), o la diferencia en tales tiempos
también son parámetros útiles para evaluar los reactivos de
tromboplastina. La sensibilidad puede cuantificarse en forma de
razones o razones normalizadas para permitir una comparación más
significativa entre ensayos que emplean diferentes reactivos de
tromboplastina.
El factor tisular activo de un reactivo de
tromboplastina se obtiene normalmente extrayendo tejido de mamífero
homogeneizado o un polvo en acetona del mismo con una disolución
salina. Los extractos de tromboplastina, (procedentes de polvo en
acetona de cerebro de conejo, cerebro humano o placenta humana, por
ejemplo) se combinan con iones calcio (Ca^{++}), tampones y
estabilizadores para formar un reactivo de tromboplastina activo
listo para usarse en un ensayo de TP. Sin embargo, los reactivos de
tromboplastina preparados de esta manera a partir de extractos de
tromboplastina son limitados con respecto a la sensibilidad. La
insensibilidad de los ensayos basados en tromboplastina se puede
atribuir parcialmente a la presencia de proteínas contaminantes de
origen animal en la disolución de tromboplastina (especialmente de
proteínas dependientes de vitamina K tales como el factor VII, el
factor IX, el factor X, el factor II, la proteína C y la proteína
S). Estas proteínas contaminantes son producto de la sangre endógena
residual presente en el tejido de mamífero a partir del cual se
prepara el extracto de tromboplastina.
Un enfoque para mejorar la sensibilidad de los
reactivos de tromboplastina supone la absorción parcial de los
factores de coagulación dependientes de vitamina K y la posterior
separación de los mismos del extracto de tromboplastina. Por
ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.270.451 concedida a
Hawkins y cols. describe un método para preparar un extracto de
tromboplastina que incluye el tratamiento con BaSO_{4} para
adsorber los factores de coagulación dependientes de vitamina K y
eliminarlos por centrifugación posterior. Pueden emplearse
detergentes y agentes caotrópicos en combinación con BaSO_{4} para
potenciar la absorción y/o la separación de los contaminantes. Otros
métodos para mejorar la sensibilidad del reactivo de tromboplastina
se han centrado en optimizar las cantidades relativas de extracto,
tampón, estabilizador, conservantes, Ca^{++} y otros agentes en
la composición del reactivo. Tales enfoques, aunque proporcionan
sensibilidades mejoradas del reactivo de tromboplastina, dan como
resultado tiempos normales en el ensayo de TP que son
inaceptablemente más largos que los 12 segundos esperados por los
profesionales de la medicina.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad,
particularmente en los Estados Unidos, de reactivos de
tromboplastina que ofrezcan una sensibilidad mejorada, pero que
mantengan el tiempo del ensayo de TP para los plasmas normales en el
valor aceptado de aproximadamente 12 segundos.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
preparar reactivos de tromboplastina que cumplan simultáneamente
cada uno de los criterios de rendimiento relevantes con respecto a
los tiempos TP normales, sensibilidad y reproducibilidad de un lote
a otro. También es un objeto de la invención preparar tales
reactivos usando métodos comercialmente viables.
Por tanto, en resumen, la presente invención se
refiere al método para separar un factor de coagulación plasmático
de una disolución de tromboplastina que comprende exponer una
disolución de tromboplastina que comprende factor tisular
biológicamente activo y un factor de coagulación plasmático a una
primera superficie de una membrana semipermeable y permitir que el
factor de coagulación pase desde la disolución de tromboplastina a
través de la membrana y retener el factor tisular biológicamente
activo en la disolución de tromboplastina.
Además, la invención se refiere adicionalmente a
un método para determinar el tiempo de coagulación de una muestra de
plasma preparando u obteniendo un reactivo de tromboplastina
preparado según el primer aspecto; combinando el reactivo de
tromboplastina con la muestra de plasma para formar una disolución
de ensayo y determinando el tiempo transcurrido desde la formación
de la disolución de ensayo hasta la detección de la formación de
coágulos en la disolución de ensayo. La invención proporciona además
un método para determinar el nivel de un factor de coagulación
plasmático presente en un plasma de prueba determinando los tiempos
de coagulación de plasmas normalizados que tienen varios niveles
conocidos del factor de coagulación plasmático, preparando una
correlación normalizada entre los tiempos de coagulación de los
plasmas normalizados y el nivel del factor de coagulación plasmático
en los plasmas normalizados, determinando el tiempo de coagulación
del plasma de prueba y correlacionando el tiempo de coagulación
determinado del plasma de prueba con el nivel del factor de
coagulación plasmático basado en la desviación estándar.
Los reactivos de tromboplastina de la presente
invención ofrecen ventajas sustanciales con respecto a diversos
reactivos de tromboplastina de la técnica anterior al ofrecer
simultáneamente, en las realizaciones preferidas: (1) tiempos TP
normales dentro del intervalo aceptable de 9,0 a 13,0 segundos y (2)
sensibilidades aceptables con respecto a cada uno de los criterios
caracterizadores: un intervalo dinámico para un plasma tratado con
cumarina que tiene un cociente internacional normalizado (INR) de
aproximadamente 3,0 de al menos aproximadamente 40 segundos; un
intervalo dinámico para un plasma deficiente en factor VII en un
99%^{+} suficientemente grande como para cubrir los presentes
intervalos diagnósticos y/o terapéuticos (preferiblemente de al
menos aproximadamente 40 segundos); un intervalo dinámico para un
plasma normal reunido al 50% (frente a un PNP del 100%) que oscila
desde aproximadamente 3 segundos hasta aproximadamente 6 segundos; y
un índice de sensibilidad internacional (ISI) de no más de
aproximadamente 1,4. Como tales, los reactivos de tromboplastina
pueden emplearse satisfactoriamente en los ensayos de TP para una
amplia variedad de aplicaciones diagnósticas. Además, los métodos
descritos en el presente documento para preparar extractos y
reactivos de tromboplastina son efectivos y reproducibles. Como
tales, estos métodos ofrecen medios comercialmente viables para
preparar reactivos de tromboplastina mejorados.
Otras características, objetos y ventajas de la
presente invención serán evidentes en parte para los expertos en la
técnica y en parte se señalan más adelante en el presente
documento.
Además, dado que la patente y la bibliografía
distinta a patentes relacionada con el contenido descrito y/o
reivindicado en el presente documento es considerable, están
disponibles muchas referencias importantes para un experto en la
técnica que le proporcionarán instrucciones adicionales con respecto
a tal contenido.
La figura 1 es una vista esquemática en corte
transversal de una unidad de separación por membrana en flujo
tangencial que tiene láminas de membrana semipermeable.
La figura 2 es una vista en perspectiva de una
unidad de separación por membrana de tipo carcasa y tubos que tiene
membranas semipermeables tubulares.
La figura 3 es un diagrama esquemático de un
procedimiento de separación por membrana de una única etapa
configurado para el funcionamiento discontinuo.
La figura 4 es un diagrama de un procedimiento de
separación por membrana de múltiples etapas configurado para el
funcionamiento continuo de alimentación y purga.
La figura 5 es una fotografía de un gel
electroforético de SDS-PAGE que muestra patrones de
peso molecular (carril 1) y distribuciones de peso molecular de
proteínas en: la fase de disolución de un extracto de tromboplastina
antes de la diafiltración (carril 2); la disolución de material
retenido del extracto de tromboplastina tras la diafiltración
(carril 3); y la disolución de permeado resultante de la
diafiltración (carril 4).
En la presente invención, se separan proteínas
contaminantes, tales como factores de coagulación, de una disolución
de tromboplastina mediante permeación de membrana. La disolución de
tromboplastina se expone a una membrana semipermeable y se permite
que las proteínas contaminantes pasen desde la disolución de
tromboplastina a través de la membrana, mientras que el factor
tisular biológicamente activo se retiene en la disolución de
tromboplastina. En un método preferido, uno o más factores de
coagulación contaminantes se separan por diafiltración de un
extracto de tromboplastina de tejido de mamífero y el extracto de
tromboplastina purificado se combina con iones Ca^{++} para formar
un reactivo de tromboplastina.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "factor tisular" se refiere a una glucoproteína
integral de membrana que es biológicamente activa para iniciar la
coagulación sanguínea a través de la ruta extrínseca. El factor
tisular comprende un componente proteico, denominado en el presente
documento "proteína de factor tisular" y un componente
lipídico. El componente lipídico del factor tisular comprende
principalmente fosfolípidos. El factor tisular puede ser un factor
tisular que se produce en la naturaleza, tal como el incluido en
extractos de tejido de mamíferos o, alternativamente, puede
prepararse sintéticamente, por ejemplo, mediante la combinación de
proteína de factor tisular aislada o producida por recombinación y
fosfolípidos en razones apropiadas. Véase la patente de los EE.UU.
número 5.017.556 y la bibliografía citada en la misma.
El término "disolución de tromboplastina",
tal como se usa en el presente documento, es una disolución que
comprende factor tisular biológicamente activo y uno o más factores
de coagulación plasmáticos, independientemente de la manera en que
se prepara la disolución e independientemente de si otros
componentes están presentes en la disolución. Como tal, el término
"disolución de tromboplastina" incluye dentro de su alcance un
"extracto de tromboplastina" y un "reactivo de
tromboplastina", definidos tal como sigue. Un "extracto de
tromboplastina", tal como se usa en el presente documento, se
refiere a una disolución de tromboplastina que comprende factor
tisular biológicamente activo y uno o más factores de coagulación
plasmáticos, en el que el factor tisular se obtiene como un extracto
de tejido de mamífero. Un "reactivo de tromboplastina", tal
como se usa en el presente documento, se refiere a una disolución de
tromboplastina que comprende factor tisular biológicamente activo,
uno o más factores de coagulación plasmáticos e iones calcio,
Ca^{++}, independientemente de la fuente o el método de
preparación del factor tisular.
Aunque el enfoque de separación descrito en el
presente documento puede aplicarse a cualquier disolución de
tromboplastina, los factores de coagulación plasmáticos se separan
preferiblemente de un extracto de tromboplastina, antes de la
formación de un reactivo de tromboplastina que contiene Ca^{++}.
El extracto de tromboplastina puede prepararse mediante cualquiera
de los muchos protocolos conocidos en la técnica y/o posteriormente
desarrollados. El extracto de tromboplastina puede prepararse
recientemente, puede prepararse, almacenarse congelado y
descongelarse, o por lo demás puede conservarse con respecto a su
actividad procoagulante.
El extracto de tromboplastina puede prepararse
mediante la extracción de factor tisular de tejidos de mamífero. Los
tejidos de mamífero pueden ser tejidos de cualquier mamífero que
tenga factor tisular biológicamente activo que pueda extraerse,
incluyendo, por ejemplo, cerebro, pulmón y/o placenta de seres
humanos, conejos, vacas, cerdos y/o primates no humanos. El cerebro
de conejo, el cerebro humano y la placenta humana son fuentes
tisulares preferidas para el extracto de tromboplastina. El tejido
puede lavarse antes de la extracción para eliminar la sangre
residual. El tejido que va a extraerse puede ser tejido completo o
tejido homogeneizado y puede, si se desea, ser tejido deshidratado.
Ejemplos de formas de tejido deshidratado incluyen polvos en
disolvente (por ejemplo, un polvo en acetona) del tejido o tejido
liofilizado. Tales tejidos deshidratados están comercialmente
disponibles de, por ejemplo, Sigma Chemical, St. Louis, MO. Una
fuente de tejido más preferida es el polvo en acetona de cerebro de
conejo (RBAP).
El tejido de mamífero se pone en contacto con una
disolución, preferiblemente con una disolución salina, y lo más
preferiblemente con una disolución acuosa de sales orgánicas y/o
inorgánicas, para extraer el factor tisular del tejido. La
disolución de extracción tiene preferiblemente una ausencia esencial
de iones calcio. Las disoluciones de extracción acuosas preferidas
comprenden una sal de cloruro y/o una sal de lactato, acetato o
citrato. Una disolución acuosa que comprende cloruro de sodio y
citrato de sodio es una disolución de extracción más preferida.
Véanse, por ejemplo, los ejemplos 1 y 2. En la disolución de
extracción preferida, la concentración de citrato de sodio oscila
desde más de 5 mM hasta aproximadamente 50 mM, más preferiblemente
desde aproximadamente 7 mM hasta aproximadamente 15 mM, y lo más
preferiblemente es de aproximadamente 13 mM. Cuando se usa en
combinación con una sal inorgánica (por ejemplo, NaCl), la razón
molar de citrato de sodio con respecto a la sal inorgánica oscila
preferiblemente desde aproximadamente 1:10 hasta aproximadamente
1:1, y preferiblemente es de aproximadamente 1:5. La extracción con
una disolución de extracción que comprende citrato de sodio es
ventajosa con respecto al uso de citrato de calcio u otras sales de
calcio porque el calcio, a diferencia del sodio, facilita la
formación de complejos entre ciertos factores de coagulación
plasmáticos (por ejemplo, el factor VII) y el factor tisular.
Si se desea, la extracción del tejido también
puede efectuarse en presencia de detergentes, (por ejemplo,
detergentes no iónicos, tal como Triton® X-100),
agentes caotrópicos (por ejemplo, tiocianato), y/o absorbentes (por
ejemplo, BaSO_{4}) tal como se enseña en la patente de los EE.UU.
número 5.270.451 concedida a Hawkins y cols. Véase, por ejemplo, el
ejemplo 3D. La disolución de extracción también puede comprender,
alternativamente o en combinación, quelantes de metales (por
ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), tal como se
enseña en la patente de los EE.UU. número 5.391.380 concedida a
Barrows y cols. Véase, por ejemplo, el ejemplo 3D. Tal como se trata
más adelante, sin embargo, tales quelantes se añaden preferiblemente
al extracto de tromboplastina tras la extracción, pero antes de la
separación por membrana y, además, se emplean preferiblemente en
concentraciones superiores que las enseñadas por Barrows y
cols.
Aunque el pH, la temperatura y la duración de la
extracción no son de importancia crítica y están dentro del
conocimiento general del experto en la técnica, la extracción se
realiza preferiblemente a un pH que oscila desde aproximadamente 6,5
hasta aproximadamente 8,5, y preferiblemente a aproximadamente 8,0,
a una temperatura que oscila desde aproximadamente 30ºC hasta
aproximadamente 50ºC, y preferiblemente a aproximadamente 45ºC
durante un periodo de tiempo que oscila desde aproximadamente 10
minutos hasta aproximadamente 1 hora, y preferiblemente durante
aproximadamente 15 minutos. Preferiblemente, la mezcla de extracción
se remueve y/o de otro modo se agita durante la extracción. Tras la
extracción, la disolución de extracto de tromboplastina se separa
del tejido extraído residual, preferiblemente por
centrifugación.
La estabilidad del extracto de tromboplastina
puede mejorarse combinando la disolución de extracción o el extracto
de tromboplastina resultante con un inhibidor de la fosfolipasa. Sin
retringirse a ninguna teoría no enumerada específicamente en las
reivindicaciones, se cree que los contaminantes de fosfolipasa
presentes en el extracto de tromboplastina tienen un efecto adverso
sobre la actividad procoagulante del extracto a medida que se
envejece. Un inhibidor de la fosfolipasa preferido es D609. Véase el
ejemplo 5, con respecto a los datos experimentales relacionados con
los inhibidores de la fosfolipasa.
En una realización, las proteínas contaminantes
se separan de la disolución de tromboplastina, y preferiblemente de
un extracto de tromboplastina, tras el tratamiento de la disolución
de tromboplastina con una enzima proteolítica. La enzima
proteolítica tiene preferiblemente actividad proteolítica frente a
las proteínas contaminantes, pero no es sustancialmente activa
frente al factor tisular, y como tal, no afecta sustancialmente a la
actividad procoagulante del factor tisular. La quimotripsina es una
enzima proteolítica preferida. La proteína contaminante en el
extracto de tromboplastina se digiere enzimáticamente para formar
fragmentos de proteína contaminante. En un enfoque preferido que
emplea quimotripsina (1018 U/mg), la concentración de quimotripsina
oscila desde aproximadamente 1 \mug/ml hasta aproximadamente 10
\mug/ml, preferiblemente desde aproximadamente 1 \mug/ml hasta
aproximadamente 5 \mug/ml, y lo más preferiblemente es que se
añadan aproximadamente 3 \mug/ml al extracto de tromboplastina y
se incuben a temperatura ambiente durante la noche. Sin embargo,
pueden emplearse adecuadamente otras concentraciones, temperaturas y
periodos de incubación. Los fragmentos de proteína contaminante
digerida pueden separarse entonces del extracto de tromboplastina
para formar un extracto de tromboplastina purificado. Tal separación
se realiza preferiblemente mediante permeación de membrana, tal como
se trata más adelante. Véase el ejemplo 5, con respecto a los datos
experimentales relacionados con la digestión enzimática de las
proteínas contaminantes.
Las proteínas contaminantes, incluyendo los
fragmentos de proteína contaminante digerida y las proteínas
contaminantes no digeridas, pueden separarse de la disolución de
tromboplastina, y preferiblemente de un extracto de tromboplastina,
mediante permeación de membrana. Véanse, por ejemplo, los ejemplos
3A a 3F. Tal como se usa en el presente documento, el término
"permeación de membrana" se refiere a un procedimiento de
separación en el que una primera especie molecular (por ejemplo, un
factor de coagulación) en una disolución de alimentación se
transporta a través de una membrana semipermeable debido a las
diferencias de concentración y/o presión a través de la membrana,
pero una segunda especie molecular (por ejemplo, factor tisular) en
la disolución de alimentación, o bien no se transporta a través de
la membrana o se transporta a una velocidad más lenta, mediante lo
cual se realiza la separación de las especies molecular primera y
segunda. Véase, en general, Perry's Chemical Engineers' Handbook, 6ª
Ed., págs. 17/14-17/33, McGraw-Hill
(1984). El disolvente de la disolución de alimentación también puede
acompañar al factor de coagulación a través de la membrana
semipermeable.
Las proteínas que se están separando de la
disolución de tromboplastina son preferiblemente factores de
coagulación plasmáticos. En particular, es ventajoso separar uno o
más factores de coagulación plasmáticos que afectan a la ruta
extrínseca de la coagulación, incluyendo principalmente los factores
de coagulación dependientes de vitamina K (por ejemplo, el factor
VII, el factor II, el factor X, el factor IX, el factor XI y el
factor XII), la proteína C, la proteína S y la proteína Z. Es
especialmente deseable separar al menos el factor VII de la
disolución de tromboplastina. Otras proteínas contaminantes, tales
como la hemoglobina (Hb), también pueden separarse de manera
efectiva según los métodos de la presente invención.
Preferiblemente, cada uno de los factores de coagulación
plasmáticos mencionados anteriormente se separa de la disolución de
tromboplastina simultáneamente en una única operación. Sin embargo,
si se desea, se puede usar una serie de operaciones de
procedimiento para separar selectivamente tales proteínas
contaminantes. Además, no es esencial una separación completa de
todos los factores de coagulación de un tipo particular para obtener
los beneficios de la presente invención. Más bien, incluso una
separación/eliminación parcial de un factor de coagulación
particular (por ejemplo, el factor VII) puede mejorar la
sensibilidad del reactivo de tromboplastina hasta un grado
comercialmente significativo.
Además de la disolución de tromboplastina, la
disolución de alimentación también puede comprender aditivos de
potenciación de la separación que faciliten la separación de uno o
más factores de coagulación plasmáticos de la disolución de
tromboplastina, y particularmente, del factor tisular. Sin
restringirse a ninguna teoría, los factores de coagulación
plasmáticos contaminantes asociados con el factor tisular extraído
pueden considerarse, o bien que son factores de coagulación libres
disueltos en la disolución de extracción o, alternativamente,
factores de coagulación complejados con las vesículas asociadas al
factor tisular relativamente grandes. Como tales, pueden emplearse
ventajosamente aditivos de potenciación de la separación que pueden
romper los factores de coagulación complejados para hacerlos más
susceptibles a la separación. Por ejemplo, se sabe que el factor VII
se compleja con el factor tisular de una manera dependiente de
calcio. Como tal, es preferible incluir un agente quelante de
calcio, tal como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sales
del mismo en la disolución de alimentación, para reducir la
afinidad entre el factor VII y el factor tisular. Véase, por
ejemplo, el ejemplo 3B. Asimismo pueden usarse otros agentes
quelantes de calcio, tales como citrato, sales de citrato y el ácido
etilenbis(oxietilen-nitrilo)tetraacético.
EDTA es un quelante de calcio preferido y se incluye preferiblemente
en la disolución de alimentación a concentraciones que oscilan desde
aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, más
preferiblemente que oscilan desde aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 20 mM, y lo más preferiblemente a aproximadamente
10 mM. Si la disolución de tromboplastina es un extracto de
tromboplastina y si se incluyó un quelante de iones metálicos tal
como EDTA en la disolución de extracción, entonces puede que no se
requiera EDTA adicional para reducir la afinidad entre el factor VII
y el factor tisular. También pueden incluirse otros agentes de
disociación, tales como detergentes, agentes caotrópicos, tampones y
similares en la disolución de alimentación. Pueden emplearse
adecuadamente detergentes no iónicos tales como Triton 100® y/o
CHAPS. Véase, por ejemplo, el ejemplo 3D.
Si se desea, el procedimiento de permeación de
membrana también puede incluir una disolución de dilución y/o una
disolución vehículo. Se emplea una disolución de dilución en los
procedimientos en los que se permite que el disolvente de la
disolución de alimentación se transfiera a través de la membrana con
el factor de coagulación. La dilución se usa para enrasar o volver
a diluir la disolución de alimentación a medida que el disolvente se
elimina de la misma. Se emplea una disolución vehículo en el lado
opuesto de la membrana en relación con la disolución de
alimentación. Las disoluciones vehículo se emplean normalmente en
procedimientos de transferencia de masa basados en la difusión
dirigidos por diferencias de concentración y no son necesarios en
los procedimientos dirigidos por la presión en los que se permite
que el disolvente de la disolución de alimentación se transfiera a
través de la membrana con el factor de coagulación. No obstante,
pueden emplearse disoluciones vehículo, si se desea, incluso en
tales procedimientos. La disolución vehículo, si se emplea, puede
tener una concentración de proteínas contaminantes (por ejemplo,
factores de coagulación plasmáticos) que es inferior a la
concentración de las mismas en la disolución de alimentación (para
permitir la transferencia de masa dirigida por la concentración) y/o
puede mantenerse a una presión inferior con relación a la presión de
la disolución de alimentación (para permitir la transferencia de
masa por flujo de disolvente). En cualquier caso, la disolución de
dilución y/o la disolución vehículo pueden ser cualquier líquido
adecuado para arrastrar y/o alojar el factor de coagulación,
respectivamente, a medida que pasa a través de la membrana
semipermeable. El agua y las disoluciones acuosas son disoluciones
de dilución y/o vehículo preferidas. La disolución de dilución y/o
la disolución vehículo coinciden preferiblemente con la disolución
de alimentación lo más estrechamente posible, excepto con respecto a
los solutos implicados que deben separarse en el procedimiento: el
factor tisular y uno o más factores de coagulación plasmáticos. Por
tanto, cuando la disolución de tromboplastina que se está
purificando es un extracto de tromboplastina (tal como se prefiere),
la disolución de dilución/vehículo puede ser el mismo tipo de
disolución que se empleó como disolución de extracción (antes de la
extracción).
El protocolo de separación por membrana
particular, usado para llevar a cabo la separación no es
restringidamente crítico y puede incluir, por ejemplo, diálisis,
ósmosis, ósmosis inversa, ultrafiltración, diafiltración,
electrodiálisis y similares. Tal como se trata más adelante, los
protocolos de fraccionamiento de macrosolutos, tales como la
ultrafiltración o la diafiltración, son procedimientos de separación
preferidos. Cada uno de tales protocolos de separación por membrana
incluye generalmente exponer la disolución de alimentación de
tromboplastina a una primera superficie de una membrana
semipermeable y recoger la disolución de alimentación expuesta como
un material retenido. La concentración de un contaminante proteico
de interés (por ejemplo, un factor de coagulación plasmático) en el
material retenido es inferior que en la disolución de alimentación.
Adicionalmente, la segunda superficie de la membrana se expone
normalmente, o bien a una disolución vehículo o al disolvente que se
origina a partir de la disolución de alimentación y pasa a través de
la membrana con la proteína contaminante. En cualquier caso, el
líquido expuesto a la segunda superficie de la membrana se denomina
permeado. Si se usa una disolución vehículo, el permeado se
enriquece en el contaminante proteico que se está separando con
relación a la disolución vehículo.
La membrana semipermeable puede comprender
cualquier material a través del cual pasen uno o más factores de
coagulación plasmáticos preferentemente con relación al factor
tisular. Los factores de coagulación plasmáticos tienen pesos
moleculares de aproximadamente 60.000 Dalton (60 kD). El factor
tisular es algo heterogéneo con respecto al peso molecular:
aproximadamente el 90% del factor tisular tiene un peso molecular de
más de 1 millón de Dalton (1000 kD), y el 80% del factor tisular
tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2 millones de
Dalton (2000 kD), basado en los estudios de separación por membrana
con membranas de 1000 kD y 2000 kD, respectivamente. En
consecuencia, la membrana semipermeable empleada debe tener un punto
de corte de peso molecular nominal (MWCO), como se caracteriza
usando proteínas similares a globulinas de normalización industrial,
que oscile desde al menos aproximadamente 75.000 Dalton (75 kD)
hasta aproximadamente 2 millones de Dalton (2000 kD), más
preferiblemente que oscile desde al menos aproximadamente 100.000
Dalton (100 kD) hasta aproximadamente 1 millón de Dalton (1000 kD),
incluso más preferiblemente que oscile desde al menos
aproximadamente 100.000 Dalton (100 kD) hasta aproximadamente
500.000 Dalton (500 kD), y lo más preferiblemente que oscile desde
aproximadamente 200.000 Dalton (200 kD) hasta aproximadamente
400.000 Dalton (400 kD). La membrana semipermeable tiene más
preferiblemente un punto de corte de peso molecular nominal, como se
caracteriza usando proteínas similares a globulinas de normalización
industrial, de aproximadamente 300.000 Dalton (300 kD). Sin
embargo, dado que aplicaciones industriales conocidas que incluyen
separaciones de membrana de otros solutos pueden incluir membranas
que tienen un valor de punto de corte de peso molecular nominal de
diez veces el peso molecular del soluto que debe pasar a través de
la membrana o más, pueden determinarse valores de MWCO de hasta
aproximadamente 600.000 Dalton (600 kD) o superiores que sean más
útiles una vez llevados a cabo estudios de optimización por expertos
en la técnica para una aplicación particular de la presente
invención. Considerada con respecto al paso y la retención de los
solutos implicados, la membrana semipermeable de la presente
invención debería tener un MWCO con un tamaño que permita que al
menos aproximadamente el 25%, preferiblemente al menos
aproximadamente el 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 75%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el
90%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% y lo
más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de los factores
de coagulación plasmáticos detectables de interés, pasen a través
de la membrana, mientras que simultáneamente se retenga al menos
aproximadamente el 10%, preferiblemente al menos aproximadamente el
25%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, incluso
más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, todavía más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente el 99% del factor tisular
biológicamente activo detectable. Una membrana semipermeable más
preferida permitirá que el 100% del factor de coagulación plasmático
detectable de interés pase, mientras que se retiene el 100% del
factor tisular activo detectable.
Varias membranas semipermeables que tienen MWCO
dentro de los intervalos preferidos descritos anteriormente y
adecuadas para su uso en relación con la presente invención se
conocen en la técnica y están comercialmente disponibles. Tales
membranas semipermeables son preferiblemente membranas sólidas y son
normalmente de naturaleza polimérica, pero no están limitadas a
tales para los fines de la presente invención. Las membranas
poliméricas pueden ser de polímeros naturales o de polímeros
sintéticos, y pueden ser de estructura cristalina y/o amorfa.
Ejemplos de materiales de membrana polimérica incluyen polímeros
celulósicos, poliamidas, polisulfonas, poliacrilonitrilos,
polifuranos, polialquenos, poliacetatos, polivinilos y copolímeros
de los mismos, entre otros. Una membrana de polietersulfona es un
material de membrana adecuado. Las membranas pueden estar en
diversas formas o diseños, tales como diseños de "láminas",
"fibras huecas", "canal delgado" y "hoja paralela", y
pueden ser simétricas o asimétricas. La selección de una membrana
particular, incluyendo la elección del (de los) material(es),
forma, simetría, tamaño de poro, densidad de poros (porosidad),
permeabilidad, estabilidad química, estabilidad térmica y
estabilidad mecánica (por ejemplo, para limpieza) para su uso en
relación con las aplicaciones descritas en el presente documento,
está dentro del conocimiento normal del experto en la técnica. Si se
desea, las membranas pueden tratarse previamente y/o tratarse "en
línea" con agentes de hinchamiento, estirarse, tratarse
térmicamente y/o hacerse reaccionar químicamente, para controlar,
por ejemplo, la porosidad y el tamaño de poro, parámetros que
afectan a las tasas de transferencia globales. Las membranas
semipermeables preferidas incluyen DispoDialyzer® (Spectrum)
y Pellicon XL® (Millipore) que están disponibles con el tamaño de
MWCO preferido de 300 kD, así como con otros tamaños de MWCO.
La configuración física particular para la
membrana semipermeable no es restringidamente crítica. La membrana
semipermeable puede montarse como un módulo en diversos diseños,
tales como "carcasa y tubo", "placa y marco", "pila",
"pila de doble flujo" y "arrollamiento en espiral", entre
otras. Véase Perry's Chemical Engineer's Handbook, citado
anteriormente. Los diseños mayores a escala comercial normalmente
son de tipo "tanque", en los que la disolución de alimentación
se hace circular a través de un tanque alrededor de bolsas de
membrana semipermeable plana que incluyen la disolución vehículo,
tipos de "filtro-prensa", en los que se
intercalan membranas verticales entre estructuras alternas de
disolución de alimentación y disolución vehículo, o tipo de
"carcasa y tubo", en los que se configuran membranas tubulares
(por ejemplo, membranas de fibra hueca) dentro de una carcasa con la
disolución de alimentación pasando a través de los tubos y la
disolución vehículo, si se emplea, pasando a través de la
carcasa.
La membrana semipermeable puede ser de una forma
y configuración diseñadas adecuadamente por diversos protocolos de
separación, diversos regímenes de flujo y diversos enfoques de
funcionamiento. Más específicamente, la membrana y/o el diseño del
módulo de membrana pueden ser adecuados para las separaciones
realizadas basándose principalmente en diferencias de concentración
a través de la membrana (por ejemplo, como en los procesos de
permeación de tipo diálisis) o basándose en diferencias de presión a
través de la membrana (por ejemplo, como en el proceso de permeación
de tipo ultrafiltración). La membrana y/o el diseño del módulo de
membrana pueden permitir varios tipos de regímenes de flujo de la
disolución de tromboplastina con relación a la superficie de la
membrana, incluyendo, por ejemplo, los regímenes de flujo directo o
de choque o de flujo tangencial. Se prefiere generalmente un diseño
que permita que la disolución de alimentación fluya tangencialmente
a través de la superficie de una membrana semipermeable, ya que tal
diseño reduce el grado de taponamiento de los poros de la membrana
debido a la acción "de barrido" de la disolución de
alimentación. Cuando se emplea una disolución vehículo, la membrana
y/o el diseño del módulo de membrana también puede permitir diversos
tipos de regímenes de flujo de la disolución de tromboplastina con
relación a la superficie de la membrana, incluyendo regímenes de
flujo en paralelo, flujo cruzado o en contracorriente. Con respecto
a las consideraciones de funcionamiento, la membrana y/o el diseño
del módulo de membrana pueden ser adecuados para el funcionamiento
discontinuo, semicontinuo (por ejemplo, alimentación y purga), o
funcionamiento continuo.
Un modulo de membrana semipermeable de flujo
tangencial a modo de ejemplo incluye, con referencia a la figura 1,
dos láminas 10 de membrana configuradas en una unidad 20 de
separación de tipo de flujo tangencial, que tiene el terminador 30
de entrada, la sección 40 media y el terminador 50 de salida. Placas
60 separan la sección 40 media del terminador 30 de entrada y el
terminador 50 de salida. Cada lámina 10 de membrana tiene una
primera superficie 11 y una segunda superficie 12. Una disolución
100 de alimentación que comprende la disolución de tromboplastina,
se suministra a través del terminador 30 de entrada de la unidad 20
y fluye hasta la sección 40 media a través de las aberturas 62 en
las placas 60. En la sección 40 media, la disolución 100 de
alimentación entra en contacto con la primera superficie 11 de cada
lámina 10 de membrana. Aunque no se muestra en la figura 1, puede
suministrarse simultáneamente una disolución vehículo a través del
orificio 22 de entrada de vehículo de la unidad 20 que va a
exponerse a la segunda superficie 12 de las láminas 10 de membrana.
Independientemente de si se suministra una disolución vehículo a la
unidad 20, uno o más factores de coagulación en la disolución 100 de
alimentación y, en una realización preferida, el disolvente de la
disolución 100 de alimentación, pasan a través de las láminas 10 de
membrana hasta el espacio 70 entre las láminas 10 de membrana,
mientras el factor tisular se retiene en la disolución de
alimentación. La disolución de alimentación empobrecida en factor de
coagulación, que ahora se denomina material 110 retenido, se
descarga de la sección 40 media a través del terminador 50 de
salida de la unidad 20. El material 110 retenido descargado está
empobrecido en el factor de coagulación con relación a la disolución
100 de alimentación. El disolvente que lleva el factor de
coagulación, denominado permeado 210, se descarga de la sección 40
media de la unidad 20 a través del orificio 24 de salida de
permeado.
En otra configuración a modo de ejemplo, con
referencia a la figura 2, la membrana semipermeable puede ser una
membrana 10 de tipo tubular (por ejemplo, fibra hueca o canal
delgado) configurada en una unidad 20 de separación de tipo carcasa
y tubo, que tiene el terminador 30 de entrada, la sección 40 media y
el terminador 50 de salida. Las placas 60 del tubo separaran la
sección 40 media del terminador 30 de entrada y el terminador 50 de
salida. Cada membrana 10 tiene una primera superficie 11 interna y
una segunda superficie 12 externa. Una disolución 100 de
alimentación que comprende la disolución de tromboplastina se
suministra a través del terminador 30 de entrada de la unidad 20 a
la superficie 11 interna de las membranas 10. Si se desea, una
disolución 200 vehículo, puede suministrarse simultáneamente a
través de la sección 40 media de la unidad 20 a la superficie 12
externa de las membranas 10. Uno o más factores de coagulación en la
disolución 100 de alimentación pasan a través de la membrana hasta
la disolución 200 vehículo, acompañados normalmente por el
disolvente de la disolución 100 de alimentación, mientras que el
factor tisular se retiene en la disolución 100 de alimentación. La
disolución de alimentación empobrecida en factor de coagulación,
denominada ahora material 110 retenido, se descarga de las membranas
10 a través del terminador 50 de salida de la unidad 20. La
disolución vehículo enriquecida en factor de coagulación, denominada
ahora permeado 210, se descarga desde la sección 40 media de la
unidad 20. El permeado 210 descargado está enriquecido con el factor
de coagulación con relación a la disolución 200 vehículo.
Una unidad de separación por membrana, tal como
las unidades a modo de ejemplo descritas anteriormente pueden
emplearse, solas o en combinación con otras unidades, en
procedimientos discontinuos, semicontinuos (continuos de una única
fase o "alimentación y purga" de una única fase), o continuos
de múltiples fases para realizar la separación del factor de
coagulación del factor tisular.
En un procedimiento discontinuo preferido, un
extracto de tromboplastina se trata en una diafiltración de flujo
tangencial. Con referencia a la figura 3, una disolución 100 de
alimentación que comprende el extracto de tromboplastina no tratado
se recircula continuamente desde un tanque 300 de alimentación, se
hace pasar a través de una unidad 400 de separación por membrana,
opcionalmente frente a una disolución 200 vehículo, y luego se hace
volver hasta el tanque 300 de alimentación por medio de una bomba
500. La unidad 400 de separación por membrana comprende una membrana
10 semipermeable que tiene una primera superficie 11 a la que se
expone la disolución 100 de alimentación y una segunda superficie 12
a la que se expone la disolución 200 vehículo. Cada una de las
superficies 11, 12 primera y segunda tiene un área A superficial. La
presión de la disolución 100 de alimentación, tal como se determina
mediante el manómetro 510 de entrada, es mayor que en el lado de la
disolución vehículo/permeado de la membrana 10 y cada paso a través
de la unidad 400 de separación por membrana da como resultado el
paso del factor de coagulación y del disolvente de la disolución 100
de alimentación hasta el otro lado de la membrana 10, de tal manera
que el material 110 retenido que se recircula de nuevo hacia el
tanque 300 de alimentación esté empobrecido en factor de coagulación
con relación a la disolución 100 de alimentación, y esté más
concentrado en factor tisular. El nivel de la disolución 100 de
alimentación en el tanque 300 de alimentación disminuye desde su
nivel inicial, L_{l}, hasta un nivel inferior, L_{2}, a medida
que el disolvente se elimina por la permeación a través de la
membrana 10. Una vez que el nivel en el tanque 300 de alimentación
ha disminuido hasta L_{2}, la disolución 100 de alimentación
concentrada puede volver a diluirse con una disolución de dilución
y elevarse el nivel hasta el nivel inicial, L_{1}. Cada ciclo en
el que el tanque 300 de alimentación se vacía y se vuelve a llenar
se considera, para los fines de descripción en el presente
documento, como un ciclo de dilución. Si se desea, la recirculación
puede continuarse durante tantos ciclos de dilución como sean
necesarios para lograr el nivel deseado de separación. Otras
configuraciones del procedimiento discontinuo serán evidentes para
un experto en la técnica.
Un parámetro de diseño en tal esquema de
separación discontinua preferido es el nivel de separación logrado
para un volumen unitario de la disolución 100 de alimentación que
pasa a través de la unidad 400 de separación. La separación
incremental para tal volumen unitario generalmente es una función
del tipo de membrana 10 semipermeable (o módulo) que se está
empleando en la unidad 400, siendo consideraciones importantes de
diseño el MWCO, la permeabilidad, el área total, A, el régimen de
flujo y la configuración, tal como se trató anteriormente. Para una
unidad 400 de separación dada, la separación incremental y la
separación total que pueden lograrse durante un periodo de tiempo
pueden evaluarse usando estudios a escala de laboratorio. Un
parámetro que debe considerarse en los estudios a escala de
laboratorio para tal procedimiento discontinuo preferido es la
velocidad de flujo del permeado (volumen del permeado que pasa a
través de un área superficial unitaria de la membrana por tiempo
unitario), que, a su vez, es dependiente del diferencial de presión
a través de la membrana 10. El diferencial de presión puede
controlarse ajustando la bomba 500 y la correspondiente velocidad de
flujo volumétrico de la disolución 100 de alimentación recirculante.
Para evaluar la separación total, el volumen de la disolución de
alimentación que se está tratando, el diferencial de volumen del
tanque 300 de alimentación por ciclo (es decir, el volumen de
dilución), el número de ciclos, el tiempo por ciclo y el tiempo
total para lograr un grado de separación particular, también son
parámetros que deben determinarse. Un experto en la técnica puede
variar los parámetros de control del procedimiento, según sea
necesario, para optimizar el procedimiento de separación.
En estudios a escala de laboratorio a modo de
ejemplo que incluyen el procedimiento discontinuo preferido
explicado anteriormente, se sometieron a diafiltración 100 ml de un
extracto de tromboplastina en Na_{3}-citrato/NaCl
a través de un portafiltro Pellicon XL® (Millipore) de 50 cm^{2}
de flujo tangencial con un MWCO de 300 kD usando una disolución de
dilución de Na_{3}-citrato/NaCl. En un primer
estudio, la velocidad de flujo de recirculación se ajustó para
obtener una presión de entrada de aproximadamente 0,681 atm, lo que
da como resultado una velocidad de flujo en la membrana de
aproximadamente 100 ml/h (que corresponde a un flujo en la membrana
de aproximadamente 4 ml/cm^{2}\cdoth). La disolución de
alimentación original se diluyó aproximadamente 100 veces en un
tiempo total de aproximadamente 5 horas usando 5 ciclos de dilución,
cada uno de los cuales efectuó aproximadamente una dilución de 2,5
veces en la disolución de alimentación. Véase, por ejemplo, el
ejemplo 3B. En un segundo estudio, en el que la velocidad de flujo
de recirculación se cambió para obtener una presión de entrada de
aproximadamente 1,364 atm, lo que da como resultado una velocidad de
flujo en la membrana de aproximadamente 200 ml/h (que corresponde a
un flujo en la membrana de aproximadamente 8 ml/cm^{2}\cdoth),
se logró una dilución de 100 veces en la disolución de alimentación
en un tiempo total de aproximadamente 3 horas, con 3 ciclos de
dilución, en los que cada ciclo efectuó aproximadamente una dilución
de 5 veces de la disolución de alimentación. Véase, por ejemplo, el
ejemplo 3B. La comparación de los parámetros de funcionamiento de
los dos experimentos a escala de laboratorio sugiere que una
velocidad de flujo en la membrana superior puede lograr resultados
comparables a la velocidad inferior, o bien con (1) una reducción
del 50% en el tiempo de tratamiento usando el mismo área superficial
de la membrana (y una reducción correspondiente en los costes de
funcionamiento), o (2) con el mismo tiempo usando una reducción del
50% en el área superficial de la membrana (y una reducción
correspondiente en los costes de capital). Se realizó una ampliación
a escala del estudio en planta piloto discontinua basándose en estos
estudios a escala de laboratorio.
Aunque la descripción mencionada anteriormente
supone un enfoque de procedimiento discontinuo, la invención también
puede emplearse en procedimientos semicontinuos o continuos. En un
procedimiento semicontinuo a modo de ejemplo basado en el
procedimiento discontinuo mostrado en la figura 3, el nivel en el
tanque 300 de alimentación puede mantenerse constante (por ejemplo,
en L_{1}) añadiendo continuamente disolución de dilución al tanque
200 de alimentación a una velocidad que es igual a la velocidad de
flujo del disolvente a través de la membrana 10 semipermeable. En un
procedimiento continuo de "alimentación y purga" a modo de
ejemplo, mostrado esquemáticamente en la figura 4, se bombea una
disolución 100 de alimentación desde un tanque 300 de alimentación
por medio de la bomba 310 de alimentación hasta un circuito 600 de
recirculación de primera fase. Una primera bomba 610 de
recirculación recircula una primera corriente a través de una
primera unidad 620 de separación, descargándose el permeado 210 a
través de un colector de descarga combinado, recirculándose la mayor
parte del material 110 retenido a través del circuito 600 y
purgándose una parte relativamente pequeña del material 110 retenido
para suministrarla a un segundo circuito 700 de recirculación. Una
segunda bomba 700 de recirculación recircula una segunda corriente
a través de una segunda unidad 720 de separación, descargándose el
permeado 220 a través de un colector de descarga combinado,
recirculándose la mayor parte del material 120 retenido a través del
circuito 700 y purgándose una parte relativamente pequeña del
material 120 retenido para suministrarla a un tercer circuito 800 de
recirculación. Una tercera bomba 810 de recirculación recircula una
tercera corriente a través de una tercera unidad 820 de separación,
descargándose el permeado 230 a través de un colector de descarga
combinado, recirculándose la mayor parte del material 130 retenido a
través del circuito 800 y purgándose una parte relativamente pequeña
del material 130 retenido como extracto de tromboplastina
purificado. Cada fase funciona a concentración casi constante del
soluto retenido, el factor tisular, teniendo las últimas fases
concentraciones de factor tisular relativamente más altas que en las
fases iniciales. Otras configuraciones de procedimiento
semicontinuo y continuo serán evidentes para un experto en la
técnica.
Si la disolución de tromboplastina que se está
purificando mediante permeación de membrana es un reactivo de
tromboplastina, entonces el reactivo puede emplearse en un ensayo de
TP directamente o con la adición de componentes adicionales tratados
más adelante en relación con la preparación de un reactivo a partir
del extracto de tromboplastina. Si la disolución de tromboplastina
que se está purificando mediante permeación de membrana es un
extracto de tromboplastina, entonces puede prepararse un reactivo de
tromboplastina a partir del extracto de tromboplastina purificado,
tal como sigue.
Un reactivo de tromboplastina puede prepararse a
partir del extracto de tromboplastina purificado, denominado
alternativamente en el presente documento extracto tratado,
combinando el extracto tratado con iones calcio, Ca^{++}. La
cantidad de extracto tratado en la composición del reactivo oscila
preferiblemente desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente
el 50% en volumen, en relación con el volumen total de la
composición del reactivo, más preferiblemente desde aproximadamente
el 15% hasta aproximadamente el 45% en volumen, y lo más
preferiblemente desde aproximadamente el 25% hasta aproximadamente
el 35% en volumen. En una composición del reactivo preferida, la
cantidad de extracto tratado es de aproximadamente el 30% en
volumen. Los iones calcio pueden suministrarse a la composición del
reactivo como una sal de calcio, tal como cloruro de calcio,
CaCl_{2}, o una sal de calcio de un ácido orgánico, tal como
tartrato de calcio, gluconato de calcio, citrato de calcio y lactato
de calcio. El calcio se suministra preferiblemente como CaCl_{2} y
se emplea en la composición del reactivo a una concentración que
oscila desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 15 mM, más
preferiblemente a una concentración que oscila desde aproximadamente
10 mM hasta aproximadamente 12 mM, y lo más preferiblemente a
aproximadamente
11 mM.
11 mM.
También pueden incluirse en la composición del
reactivo de tromboplastina otros componentes de reactivo tales como
tampones, estabilizadores, conservantes, agentes sensibilizantes y
agentes de carga. Pueden emplearse tampones para mantener la
composición del reactivo a un pH que oscila desde aproximadamente
6,8 hasta aproximadamente 8,0 y preferiblemente a un pH de
aproximadamente 7,5. Tampones a modo de ejemplo incluyen, por
ejemplo, Tris, fosfato, barbital, glicilglicina, ácido
3-(N-morfolino)-propanosulfónico
(MOPS), ácido
N,N-bis-(hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico
(BES), ácido
N-tris-(hidroximetil)-metil-2-aminoetanosulfónico
(TES), ácido
N-2-hidroxietilpiperazin-N-2-etanosulfónico
(HEPES), ácido
3-[N-tris(hidroximetil)-metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico
(TAPSO) y ácido
3-[N-tris-(hidroximetil-metilamino]propanosulfónico
(TAPS), entre otros. HEPES es un tampón preferido. Estabilizadores
útiles para mantener la actividad procoagulante del reactivo de
tromboplastina se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,
tampones "Goods", Tris, albúmina sérica bovina (BSA), sal de
sodio 1,5 del ácido
piperazin-N,N-bis(2-etano-sulfónico)
(PIPES), imidazol, ácido
3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico
(MOPSO), MOPS, BES, TES, HEPES, TAPSO, TAPS, ácido
3-[N-bis(hidroxietil)amino]-2-hidroxipropano-sulfónico
(DIPSO), ácido
piperazin-N,N'-bis(2-hidroxipropano-sulfónico)
(POPSO), ácido
N-hidroxietil-piperazin-N'-2-hidroxipropanosulfónico
(HEPPSO), tricina y bicina. HEPES y BSA son los agentes
estabilizadores preferidos. Conservantes que evitan el crecimiento
de microorganismos, tales como composiciones antifúngicas,
antibacterianas y antilevaduras, también pueden incluirse en la
composición del reactivo. Conservantes a modo de ejemplo incluyen
azida sódica, timerosal, BHA, BHT y formulaciones preformuladas de
múltiples actividades tales como ProClin^{MR} (Supelco).
ProClin^{MR} es un conservante preferido. Se conoce en la técnica
una variedad de agentes sensibilizantes. Por ejemplo, se pueden usar
sales tales como el cloruro de sodio para mejorar la sensibilidad
del reactivo, normalmente junto con reactivos de desplazamiento
normal, tales como polietilenglicol (PEG). Se pueden usar otros
reactivos sensibilizantes, tales como bromuro de hexadimetrina o
protamina para inhibir actividades potencialmente interferentes,
tales como la actividad de la heparina. Agentes de carga que pueden
incluirse en la composición incluyen alcoholes (por ejemplo,
glucitol, manitol, sorbitol), glicina, dextrosa y similares. La
composición del reactivo también puede incluir tensioactivos (por
ejemplo, Tween 80 o Triton X-100) y otros agentes
comúnmente empleados en los ensayos de plasma. Las concentraciones
de estos componentes de reactivo adicionales pueden determinarse y
optimizarse por un experto en la técnica.
También se añaden preferiblemente agentes
tamponantes de calcio a la composición del reactivo de
tromboplastina. De manera significativa, la sensibilidad del
reactivo de tromboplastina puede controlarse usando tales agentes
tamponantes de calcio en el reactivo de tromboplastina. Además, tal
control se logra con sólo un efecto mínimo sobre los tiempos de
coagulación para los plasmas normales. Sin restringirse a ninguna
teoría no citada específicamente en las reivindicaciones, los
agentes tamponantes de calcio modulan la concentración del calcio
libre en el reactivo de tromboplastina. Agentes tamponantes de
calcio adecuados incluyen sales de ácidos orgánicos tales como
citrato o tartrato, quelantes de calcio tales como EDTA oEGTA, y
tampones de unión a calcio tales como el ácido
N-2-acetamidol-2-iminodiacético
(ADA),
N,N-bis(2-hidroxietil)-glicina
(bicina), MES, ACES, tricina y glicilglicina. Asimismo pueden
emplearse otros agentes tamponantes de calcio conocidos o
desarrollados posteriormente en la técnica. Agentes tamponantes de
calcio preferidos son el citrato de sodio, ADA y bicina, siendo el
citrato de sodio el más preferido. La concentración del agente
tamponante de calcio en la composición del reactivo de
tromboplastina puede variar dependiendo del agente tamponante de
calcio particular empleado, de la concentración de demás componentes
del reactivo, incluyendo en particular la concentración del extracto
y la concentración de los iones Ca^{++} y de la sensibilidad
deseada. Preferiblemente, sin embargo, la concentración del agente
tamponante de calcio puede oscilar desde aproximadamente 0,25 mM
hasta aproximadamente 15 mM, más preferiblemente desde
aproximadamente 0,5 mM hasta aproximadamente 10 mM, y lo más
preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mM hasta aproximadamente
7 mM. En una realización preferida que emplea citrato de sodio como
el agente tamponante de calcio, la concentración de citrato de sodio
oscila preferiblemente desde aproximadamente 0,5 mM hasta
aproximadamente 7 mM, más preferiblemente desde aproximadamente 1 mM
hasta aproximadamente 5 mM, y lo más preferiblemente desde
aproximadamente 2,5 mM hasta aproximadamente 4,5 mM. Con respecto a
tales agentes tamponantes de calcio, se hace referencia a los datos
experimentales del experimento 6.
El reactivo de tromboplastina puede mantenerse en
cualquier forma en la que conservará su actividad procoagulante. Por
ejemplo, el reactivo de tromboplastina puede venderse como una
disolución o en forma deshidratada (por ejemplo, en forma
liofilizada). Si se desea, el reactivo de tromboplastina puede
almacenarse congelado a -20ºC durante hasta aproximadamente 6 meses
o en cualquier otra manera adecuada conocida en la técnica.
Un reactivo de tromboplastina preparado según la
presente invención comprende preferiblemente un extracto de
tromboplastina tratado con NaCl/Na_{3}-citrato
(del 30% al 45%, lo más preferiblemente el 35% en volumen), CaCl (de
10 mM a 13 mM, lo más preferiblemente 11 mM), HEPES (de 5 mM a 50
mM, lo más preferiblemente 10 mM), NaCl (de 70 mM a 120 mM, lo más
preferiblemente 80 mM), PEG 8000 (del 0,5% a 1,0%, lo más
preferiblemente el 0,75% en peso/volumen (suponiendo una densidad de
disolución de 1 g/ml), Na_{3}-citrato adicional
(de 2,5 mM a 4,5 mM, lo más preferiblemente 3,5 mM), bromuro de
hexadimetrina (de 5 mg/l a 20 mg/l, lo más preferiblemente 12,5
mg/L), manitol (del 0,5% al 5%, lo más preferiblemente el 2% en
peso/volumen), glicina (del 0,5% al 5%, lo más preferiblemente el 4%
en peso/volumen), BSA (del 0,1% al 3%, lo más preferiblemente el 1%
en peso/volumen) y ProClin^{MR} 300 (del 0,01% al 0,07% en
peso/volumen). Véanse, por ejemplo, el ejemplo 4 y el experimento 6.
Obsérvese que ProClin se volatiliza si la disolución de reactivo se
liofiliza posteriormente. Tal como se demuestra en el ejemplo 4,
tales reactivos de tromboplastina tienen tiempos TP normales dentro
de los intervalos comercialmente aceptables.
Otras formulaciones para el reactivo de
tromboplastina están dentro del alcance de la presente invención.
Tales formulaciones tendrán preferiblemente, basándose en las
necesidades comerciales actuales, tiempos TP normales que oscilan
desde aproximadamente 9,0 segundos hasta aproximadamente 20
segundos, más preferiblemente desde aproximadamente 9,0 segundos
hasta aproximadamente 13,0 segundos y lo más preferiblemente desde
aproximadamente 10,0 segundos hasta aproximadamente 12,0 segundos.
Tales formulaciones también tendrán preferiblemente las
sensibilidades siguientes con respecto a diversos criterios
caracterizadores, considerados independientemente, en varias
combinaciones o de manera acumulativa: un intervalo dinámico para un
plasma tratado con cumarina que tiene un cociente internacional
normalizado de aproximadamente 3,0 de al menos aproximadamente 20
segundos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 30
segundos, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 40
segundos; un intervalo dinámico para un plasma deficiente en factor
VII en un 99%^{+} de al menos aproximadamente 30 segundos,
preferiblemente de al menos aproximadamente 35 segundos y lo más
preferiblemente de al menos aproximadamente 40 segundos; un
intervalo dinámico para un plasma normal reunido (PNP) al 50%,
frente al PNP al 100%, que oscila desde aproximadamente 3 segundos
hasta aproximadamente 6 segundos, y más preferiblemente desde
aproximadamente 4 segundos hasta aproximadamente 5 segundos; y un
índice de sensibilidad internacional (ISI) de no más de
aproximadamente 2,0, preferiblemente de no más de aproximadamente
1,4, y lo más preferiblemente de no más de aproximadamente 1,25.
Además, los métodos para preparar reproduciblemente tales reactivos
están comercialmente disponibles.
Las sensibilidades mejoradas de los reactivos de
tromboplastina de la invención, sin restringirse a ninguna teoría no
citada específicamente en las reivindicaciones, surgen de la
eliminación de factores de coagulación contaminantes y otras
proteínas contaminantes de la disolución de tromboplastina mediante
la permeación de membrana. Véase el ejemplo 3C. Sin tal eliminación,
los factores de coagulación plasmáticos contaminantes están
presentes en mayores concentraciones en una muestra y contribuyen a
tiempos de coagulación más rápidos y a sensibilidades inferiores.
Por ejemplo, la contaminación del factor VII presente en la
disolución de reactivo daría como resultado una disminución en la
sensibilidad para determinar si el plasma de un paciente tiene una
deficiencia en el factor VII, debido a que el factor VII
contaminante compensaría parcialmente, en efecto, parte de la
deficiencia. La contribución de los factores de coagulación
contaminantes y el efecto resultante sobre el tiempo de coagulación
es proporcionalmente más significativa para una muestra de plasma
deficiente en factor (por ejemplo, un plasma deficiente de paciente
o un plasma anómalo normalizado usado para determinar la
sensibilidad) que para una muestra de plasma normal. Como tal, la
influencia de la disolución de tromboplastina tratada sobre el
plasma anómalo da como resultado tiempos PT - de coagulación más
largos, mientras que la influencia sobre los plasmas normales es
menos sustancial y da como resultado un cambio pequeño o nulo en el
tiempo PT – de coagulación normal.
Además de lograr una sensibilidad mejorada
reproduciblemente, mientras se mantienen tiempos PT - normal
aceptables, tales reactivos tienen un aspecto mejorado en
comparación con los reactivos de tromboplastina conocidos. Estos
reactivos se caracterizan visualmente por ser de aspecto blanquecino
de tipo lechoso. Sin restringirse a ninguna teoría, el aspecto más
atractivo del reactivo parece basarse en la separación de los
contaminantes de hemoglobina (Hb) residual de la disolución de
tromboplastina mediante permeación de membrana durante el proceso de
purificación explicado anteriormente. La Hb es una proteína
tetramérica que tiene un peso molecular de aproximadamente 64.000
Dalton (64 kD) y, como tal, se separaría del factor tisular de la
misma manera que los factores de coagulación plasmáticos, tal como
se trató anteriormente. El nivel de Hb en el reactivo puede
determinarse mediante el ensayo de la hemoglobina (por ejemplo,
procedimiento diagnóstico de Sigma nº 527), y es preferiblemente
inferior a aproximadamente 2,0 mg/dl, más preferiblemente inferior a
aproximadamente 1,0 mg/dl, incluso más preferiblemente inferior a
aproximadamente 0,5 mg/dl, y lo más preferiblemente no detectable
usando el ensayo del procedimiento diagnóstico de Sigma nº 527.
Véanse, por ejemplo, los datos experimentales incluidos como
experimento 7.
Los reactivos de tromboplastina de la presente
invención se pueden usar en una variedad de aplicaciones
diagnósticas conocidas en la técnica. Preferiblemente, los reactivos
de tromboplastina se usan en ensayos basados en los tiempos de
coagulación, tales como ensayos de tiempo de protrombina (TP). Tales
ensayos suponen normalmente la determinación del tiempo de
coagulación, es decir, del tiempo transcurrido medido desde la
formación de una disolución de ensayo (mediante la combinación de un
reactivo de tromboplastina y una muestra de plasma) hasta la
detección de la formación de coágulos en la disolución de ensayo. La
medida del tiempo y/o la detección de coágulos pueden automatizarse
o llevarse a cabo manualmente usando una variedad de técnicas
conocidas en la técnica. Métodos a modo de ejemplo para la
determinación de la formación de coágulos incluyen observaciones
visuales con una técnica de "inclinación del tubo", métodos
electroquímicos (por ejemplo, fibrómetro), métodos ópticos (por
ejemplo, basados en la absorbancia o la velocidad de cambio de la
absorbancia), entre otros. Analizadores automáticos a modo de
ejemplo incluyen Amelung CS-190,
MLA-900.
Los ensayos de TP pueden emplearse ventajosamente
para determinar las deficiencias en la coagulación sanguínea
asociadas con la ruta extrínseca de la coagulación. Por ejemplo, los
reactivos de tromboplastina que tienen menos contaminantes de factor
VII proporcionarán una selección más exacta de los pacientes que
tienen una deficiencia en el factor VII. Los ensayos de tiempo de
protrombina también pueden emplearse para monitorizar el tratamiento
anticoagulante con productos farmacéuticos, tales como la cumarina,
que afectan a la ruta extrínseca de la coagulación. Dado que la base
de tal tratamiento de anticoagulación es una disminución controlada
en las proteínas funcionales dependientes de vitamina K en un
paciente, los reactivos de tromboplastina sensibles de la presente
invención proporcionarán una monitorización y un control más
precisos de la pauta posológica terapéutica. Los reactivos de la
presente invención pueden usarse en ensayos de selección
cualitativos y, además, en determinaciones cuantitativas del nivel
de un factor de coagulación plasmático presente en un plasma de
prueba. Tal determinación cuantitativa supone determinar los tiempos
de coagulación de plasmas normalizados que tienen diversos niveles
conocidos del factor de coagulación plasmático y preparar una
correlación normalizada entre los tiempos de coagulación de los
plasmas normalizados y el nivel del factor de coagulación plasmático
en los plasmas normalizados. Se determina entonces el tiempo de
coagulación de un plasma de prueba, y el nivel del factor de
coagulación plasmático en la muestra se determina basándose en la
correlación normalizada.
Los siguientes ejemplos ilustran los principios y
ventajas de la invención.
Se preparó una disolución para su uso como una
disolución de extracción, una disolución de dilución y/o una
disolución vehículo combinando NaCl (2,92 g) y
Na_{3}-Citrato (3,93 g) con agua (1000 ml) para
lograr una disolución de extracción/dilución/vehículo que comprende
NaCl 50 mM y Na_{3}-Citrato 13 mM.
Se preparó un extracto de tromboplastina que
comprendía factor tisular activo poniendo en contacto 5 g de polvo
en acetona de cerebro de conejo con 100 ml de la disolución de
extracción del ejemplo 1 durante 15 minutos a 45ºC con mezclado a
400 rpm. Tras la extracción del factor tisular en la disolución de
extracción, el sobrenadante se separó del tejido extraído mediante
una centrífuga.
En los siguientes experimentos, las muestras
normalizadas de plasma "normales" y "anómalas" empleadas
en los ensayos de TP para evaluar diversos reactivos de
tromboplastina incluyeron: un plasma normal "Control nivel I"
(Sigma Diagnostics, C7906); un plasma normal reunido ("PNP");
un plasma tratado con cumarina que tiene un cociente internacional
normalizado (INR) de aproximadamente 3,0; y plasma deficiente en
factor VII en un 99%^{+} (Sigma Diagnostics,
R7D-S). Se usó un analizador óptico
CS-190 en el modo óptico para determinar los tiempos
de coagulación TP para las diversas muestras de plasma, excepto que
se especifique otra cosa.
Ejemplo
3A
Se preparó un extracto de tromboplastina tal como
se describe en el ejemplo 2 y se dializó a través de un
DispoDyalyzer^{MR} (Spectrum) a escala de laboratorio, que
tiene un MWCO de 100 kD. La diálisis se llevó a cabo a un pH de 7,0
a 8,0, a una temperatura de 2 - 8ºC y a presión atmosférica, durante
un periodo de seis horas frente a una disolución vehículo preparada
como en el ejemplo 1.
El extracto dializado se usó para preparar un
reactivo de tromboplastina mediante la combinación del extracto
dializado (35% en volumen) con CaCl_{2} (11 mM), HEPES, NaCl, PEG
8000, bromuro de hexadimetrina, manitol, glicina, BSA y
ProClin^{MR} 300. La composición del reactivo de tromboplastina se
evaluó en los ensayos de TP para un plasma normal reunido, un
control de coagulación de nivel I (Coag I), un plasma tratado con
cumarina (CP), y un plasma deficiente en factor VII en un 99%^{+}
(F7D-I) usando un analizador óptico
CS-190 para determinar los tiempos de coagulación TP
para las diversas muestras de plasma. Los resultados se muestran en
la tabla 3A.1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Extracto | Coag I | PNP | CP | F7D-I | CP/PNP |
| Control no dializado | 11,0 | 11,1 | 26,2 | 26,6 | 2,36 |
| Diálisis MWCO de 100 K | 10,6 | 10,6 | 26,4 | 29,9 | 2,49 |
| Diálisis MWCO de 300 K | 10,5 | 10,5 | 26,1 | 29,4 | 2,49 |
Estos datos demuestran que los factores de
coagulación contaminantes se eliminaron de manera efectiva del
extracto de tromboplastina mediante diálisis dirigida por la
concentración, mientras que el factor tisular biológicamente activo
quedaba retenido en la disolución del extracto. El reactivo de
tromboplastina preparado a partir del extracto dializado tenía una
actividad procoagulante y ofrecía un aumento en la sensibilidad del
reactivo, tal como se pone de manifiesto por un aumento en la razón
CP/PNP, un aumento en el intervalo dinámico para el plasma
deficiente en factor VII y sólo un efecto moderado sobre los tiempos
TP normales.
Ejemplo
3B
Se preparó un extracto de tromboplastina tal como
se describe en el ejemplo 2 y después se combinaron 100 ml del
extracto con EDTA (10 mM) para formar una disolución de
extracto/EDTA.
En un primer experimento a escala de laboratorio,
la disolución de extracto/EDTA se sometió a diafiltración a través
de un portafiltro Pellicon XL^{MR} (Millipore) de 50 cm^{2} a
escala de laboratorio, que tiene una membrana de polietersulfona con
un MWCO de 300 kD en un funcionamiento discontinuo análogo al del
sistema mostrado en la figura 3. La diafiltración se produjo a un pH
de 7 - 8, a una temperatura de 18 – 22ºC, a una presión de entrada
de la disolución de alimentación de 0,681 atm, y a una velocidad de
flujo de alimentación de aproximadamente 25 ml/min. La disolución
de extracto/EDTA se diluyó aproximadamente 100 veces con una
disolución de dilución que comprendía NaCl (50 mM) y EDTA (10 mM)
en un tiempo total de aproximadamente 5 horas usando 5 ciclos de
dilución, cada uno de los cuales efectuó una dilución de
aproximadamente 2,5 veces en la disolución de alimentación. La
velocidad de flujo medida en la membrana fue de aproximadamente 100
ml/h. El permeado del primer ciclo de la diafiltración se recogió
para la evaluación del factor VII. Véase el ejemplo 3C. El material
retenido del extracto sometido a diafiltración se dializó
posteriormente de nuevo frente a una disolución que comprende NaCl
(50 mM) y Na_{3}-Citrato (13 mM) usando una única
membrana de diálisis con un MWCO de 12.000 Dalton (12 kD).
El extracto sometido a diafiltración se usó para
preparar un reactivo de tromboplastina combinando el extracto
sometido a diafiltración (25% en volumen) con CaCl_{2} (11 mM),
HEPES, NaCl, PEG 8000, bromuro de hexadimetrina, manitol, glicina,
BSA y ProClin^{MR} 300. La composición del reactivo de
tromboplastina se evaluó en los ensayos de TP para un plasma normal
control de coagulación de nivel I, para un plasma normal reunido
(PNP), para un plasma tratado con cumarina (CP) y para un plasma
deficiente en factor VII en un 99%^{+} (F7D-I)
usando un analizador óptico CS-190 para determinar
los tiempos de coagulación TP. También se evaluó un reactivo control
preparado con el extracto no tratado, pero en cualquier caso
idéntico a la composición del reactivo que se está evaluando. Los
resultados se muestran en la tabla 3B.1.
| Control | PNP | Plasma de | F7D-I | CP/PNP | |
| Nivel I | cumarina | ||||
| Extracto no tratado | 10,2 | 10,2 | 19,9 | 23,4 | 1,95 |
| (control) | |||||
| Extracto sometido a | 11,1 | 11,2 | 24,2 | 31,0 | 2,18 |
| diafiltración |
Estos datos demuestran un aumento sustancial en
la sensibilidad del reactivo de tromboplastina que comprende el
extracto sometido a diafiltración en comparación con el reactivo
control que comprende el extracto no tratado, con sólo un moderado
aumento en los tiempos TP normales.
En un segundo experimento a escala de
laboratorio, otra disolución de extracto/EDTA preparada a partir de
un extracto de tromboplastina diferente de la misma forma que la
descrita anteriormente, se sometió a diafiltración a través del
mismo portafiltro Pellicon XL^{MR} a escala de laboratorio
empleado anteriormente tras limpiarlo, pero con una presión de
entrada de la disolución de alimentación de 1,364 atm, y una
velocidad de flujo de alimentación de aproximadamente 45 ml/min. La
disolución de extracto/EDTA se diluyó aproximadamente 100 veces con
una disolución de dilución que comprendía NaCl (50 mM) y EDTA (10
mM) en un tiempo total de aproximadamente 3 horas usando 3 ciclos de
dilución, cada uno de los cuales efectuó aproximadamente una
dilución de 5 veces en la disolución de alimentación. La velocidad
de flujo medida en la membrana fue de aproximadamente 200 ml/h. El
material retenido del extracto sometido a diafiltración se dializó
posteriormente de nuevo frente a una disolución que comprendía NaCl
(50 mM) y Na_{3}-Citrato (11 mM), tal como se
describió anteriormente.
El extracto sometido a diafiltración se usó para
preparar dos composiciones diferentes del reactivo de
tromboplastina. Se preparó una primera composición del reactivo
combinando el extracto sometido a diafiltración (25% en volumen)
con CaCl_{2} (11 mM). Se preparó un segundo reactivo combinando el
extracto sometido a diafiltración (37,5% en volumen) con CaCl_{2}
(11 mM). Se añadieron HEPES, NaCl, PEG 8000, bromuro de
hexadimetrina, manitol, glicina, BSA y ProClin^{MR} 300 a cada una
de las composiciones de reactivo.
La primera composición del reactivo de
tromboplastina se evaluó en ensayos de TP para un plasma normal
control de coagulación de nivel I, para un plasma normal reunido
(PNP), y para un plasma tratado con cumarina (CP) usando un
analizador óptico CS-190 para determinar los tiempos
de coagulación TP para las diversas muestras de plasma. También se
evaluó un ensayo control que emplea un reactivo de tromboplastina
preparado con un extracto no tratado, pero por lo demás idéntico a
la composición del reactivo objeto. Los resultados se muestran en la
tabla 3B.2.
| Control | PNP | Plasma de | CP/PNP | |
| Nivel I | cumarina | |||
| Extracto no tratado (extracto al 25%) | 10,1 | 10,1 | 19,6 | 1,94 |
| Extracto sometido a diafiltración | 10,5 | 10,7 | 23,1 | 2,16 |
| (extracto al 25%) |
La composición del reactivo que comprende el
extracto sometido a diafiltración demuestra de nuevo un aumento en
la sensibilidad y un pequeño efecto sobre los tiempos normales, en
comparación con el reactivo control.
La segunda composición del reactivo de
tromboplastina se evaluó en ensayos de TP para un plasma normal
control de coagulación de nivel I, para un plasma normal reunido
(PNP), para un plasma tratado con cumarina (CP), para un PNP al 50%,
y para un plasma deficiente en factor VII en un 99%^{+}
(F7D-I). Se determinaron los tiempos de coagulación
TP para las diversas muestras de plasma usando un analizador óptico
CS-190 y, para comparación, usando una prueba de TP
mecánica. Los resultados para el analizador óptico se muestran en la
tabla 3B.3.
| Control | PNP | Plasma de | F7D-1 | PNP | CP/PNP | Delta | |
| Nivel 1 | cumarina | al 50% | 100:50 PNP | ||||
| CS-190 óptico Tiempos de | 12,1 | 12,1 | 42,0 | 40,5 | 16,1 | 3,47 | 4,0 |
| coagulación de TP (s) |
Ejemplo
3C
Se llevaron a cabo varios experimentos que
demostraron la eliminación de los factores de coagulación
plasmáticos contaminantes y otras proteínas contaminantes de la
disolución de tromboplastina mediante permeación de membrana.
En un primer experimento, el permeado procedente
del primer ciclo de diafiltración del primer experimento a escala de
laboratorio del ejemplo 3B (MWCO de 300/EDTA/0,681 atm) se evaluó
para determinar la presencia del factor VII e, independientemente,
para determinar la presencia de actividad procoagulante. El permeado
recogido a partir de la diafiltración se concentró y se dializó en
una disolución de NaCl (50 mM)/Na_{3}-Citrato (11
mM) para eliminar el EDTA. El permeado se añadió entonces a una
muestra de plasma deficiente en factor VII y se evaluó con un ensayo
de TP empleando un reactivo de tromboplastina comercialmente
disponible, ThromboMAX (Sigma Chemical, St. Louis MO). Los
resultados del ensayo, notificados en la tabla 3C.l(a),
muestran que el factor VII estaba presente en la disolución de
permeado, puesto que los tiempos del ensayo de TP para la muestra de
permeado fueron más cortos para aquellos con una muestra de plasma
deficiente en factor VII en un 99^{+}%. Por tanto, estos
resultados demuestran que el factor VII activo se separó de manera
efectiva de la disolución del extracto de tromboplastina por
diafiltración. Además, tal como se muestra en la tabla
3C.1(b), el permeado concentrado no tenía actividad
procoagulante demostrable, tal como se evidenció mediante la adición
del permeado concentrado a un plasma normal control de coagulación
de nivel I y la medición de los tiempos de coagulación, usándose
ThromboMAX^{MR} de Sigma Diagnostics como control. El ensayo de TP
iniciado con el permeado concentrado se detuvo tras 200 segundos,
sin detección de coágulos.
Tabla 3C.1(a)
| TP(s) | |
| Control Coag nivel I | 11,8 |
| Plasma deficiente en factor VII F7D-I | 32,7 |
| F7D-I más 10 \mul de la disolución del ejemplo 1 | 32,9 |
| F7D-I más 10 \mul de permeado concentrado | 30,6 |
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 3C.1(b)
| Coag I TP(s) | |
| Iniciado con ThromboMAX | 12,1 |
| Iniciado con permeado conc. + CaCl_{2} | > 200,0 |
En un segundo experimento, se preparó un extracto
de tromboplastina como en el ejemplo 2, y se sometió a diafiltración
usando protocolos análogos a los del ejemplo 3B (MWCO de 300/EDTA).
El extracto sometido a diafiltración, junto con un extracto control
no tratado, se limpió de material particulado sólido (y de factor
tisular absorbido en el mismo) mediante centrifugación. Los
sobrenadantes limpios del extracto de tromboplastina sometido a
diafiltración y del extracto control no tratado, así como el
permeado resultante de la diafiltración, se evaluaron de manera
electroforética mediante SDS-PAGE. Los resultados,
mostrados en la figura 5, demuestran que las proteínas presentes en
el extracto no tratado (carril 2) se separaron sustancialmente por
permeación de membrana, reteniéndose poca cantidad de proteína en el
material retenido del extracto tratado (carril 3) y pasando la
mayoría de las proteínas a través de la membrana hasta el permeado
(carril 4).
Ejemplo
3D
Se preparó un extracto de tromboplastina a partir
de polvo en acetona de cerebro de conejo en (25 g) con una
disolución de extracción (500 ml) que comprendía NaCl (50 mM), EDTA
(10 mM) y BaSO_{4} (5 g).
El extracto con EDTA/BaSO_{4} se dializó, con y
sin una pequeña cantidad de detergente CHAPS, en
Dispo
Dialyzers^{MR} con MWCO de 300 kD frente a una disolución vehículo que comprendía NaCl 50 mM y EDTA 10 mM. El extracto dializado se dializó posteriormente de nuevo en una disolución de NaCl (50 mM)/Na_{3}-Citrato (11 mM).
Dialyzers^{MR} con MWCO de 300 kD frente a una disolución vehículo que comprendía NaCl 50 mM y EDTA 10 mM. El extracto dializado se dializó posteriormente de nuevo en una disolución de NaCl (50 mM)/Na_{3}-Citrato (11 mM).
Cada uno del extracto no tratado, el extracto
dializado con CHAPS, y el extracto dializado sin CHAPS se analizaron
en una composición de reactivo de tromboplastina que comprende el
extracto (35% en volumen) y CaCl_{2} (11 mM). También se
añadieron HEPES, NaCl, PEG 8000, bromuro de hexadimetrina, manitol,
glicina, BSA y ProClin^{MR} 300 a la composición del reactivo. Las
composiciones del reactivo de tromboplastina se evaluaron entonces
en ensayos de TP para un plasma normal "control de nivel I",
para un plasma normal reunido (PNP), para un plasma tratado con
cumarina al 80%, para un plasma deficiente en factor VII en un
99%^{+} y para el índice de sensibilidad internacional (ISI)
usando un analizador óptico CS-190 para determinar
los tiempos de coagulación TP. También se evaluaron dos ensayos
control, uno usando un reactivo de tromboplastina preparado con
extracto no tratado, pero por lo demás idéntico a la composición de
reactivo objeto, y el otro usando un reactivo de tromboplastina
preparado con un reactivo no tratado dializado frente a una membrana
con MWCO de 12.000 Dalton (12 kD), pero por lo demás idéntico a la
composición de reactivo objeto. Los resultados se muestran en la
tabla 3D.1.
| Control | PNP | Plasma de | F7D-I | ISI | |
| Nivel I | cumarina | simple | |||
| Extracto control no tratado con EDTA/BaSO_{4} | 10,7 | 11,1 | 23,6 | 26,7 | 1,79 |
| Extracto control dializado con EDTA/BaSO_{4} | 10,5 | 10,7 | 25,4 | 27,1 | 1,56 |
| (MWCO de 12 kD) | |||||
| Extracto dializado con EDTA/BaSO_{4} (MWCO | 12,4 | 12,5 | 33,4 | 47,8 | 1,37 |
| de 300 kD sin CHAPS) | |||||
| Extracto dializado con EDTA/BaSO_{4} (MWCO | 13,4 | 13,8 | 35,0 | 45,2 | 1,45 |
| de 300 kD con CHAPS) |
Estos datos demuestran un marcado aumento en la
sensibilidad de los reactivos de tromboplastina dializados con
relación a los reactivos control, tal como se evidencia por la
disminución en el valor de ISI, junto con el gran aumento en los
intervalos dinámicos para los tiempos de coagulación del plasma
deficiente en factor VII y para el plasma tratado con cumarina. La
presencia de CHAPS durante la diálisis dio como resultado una
pérdida detectable de actividad procoagulante, tal como se evidencia
por los tiempos normales relativamente más largos, en comparación
con los reactivos preparados a partir de extractos dializados sin
CHAPS.
Ejemplo
3E
Se congeló un extracto de tromboplastina
preparado como en el ejemplo 2. El extracto congelado se descongeló
posteriormente, y se llevó a 10 mM en EDTA. El extracto se dializó
en DispoDialyzers^{MR} con MWCO de 300 kD frente a una disolución
vehículo que comprendía NaCl 50 mM y EDTA 10 mM, y se dializó
posteriormente de nuevo en una disolución de NaCl (50 mM)/
Na_{3}-Citrato (11 mM).
El extracto no tratado y el extracto dializado se
analizaron en una composición de reactivo de tromboplastina que
comprendía el extracto (35% en volumen) y CaCl_{2} (11 mM).
También se añadieron a la composición del reactivo HEPES, NaCl, PEG
8000, bromuro de hexadimetrina, manitol, glicina, BSA y
ProClin^{MR} 300. Las composiciones del reactivo de tromboplastina
se evaluaron en ensayos de TP para un plasma normal "control de
nivel I", para un plasma normal reunido (PNP), para un plasma
tratado con cumarina al 80%, para un plasma deficiente en factor VII
en un 99%^{+} y para determinar el índice de sensibilidad
internacional (ISI) usando un analizador óptico
CS-190, para determinar los tiempos de coagulación
TP. Un reactivo de tromboplastina preparado con el extracto no
tratado, pero por lo demás idéntico a la composición reactivo
objeto, se empleó como control. Los resultados se muestran en la
tabla 3E.1
| Control | PNP | Plasma de | F7D-I | ISI | |
| Nivel I | cumarina | simple | |||
| Extracto no tratado | 10,9 | 10,9 | 25,3 | 28,3 | 1,61 |
| Dializado con EDTA para | 12,5 | 12,6 | 35,1 | 50,8 | 1,32 |
| J6619, MWCO de 300 K |
Concordando con otros resultados, estos datos
demuestran una marcada mejoría en la sensibilidad de la composición
del reactivo y una mejoría en los tiempos de coagulación deficientes
en el factor VII.
Se preparó un reactivo de tromboplastina a partir
de un extracto de tromboplastina preparado como en el ejemplo 3B y
compuesto por el extracto (35% en volumen), CaCl_{2} (11 mM),
HEPES (10 mM), NaCl (80 mM), PEG 8000 (0,75%),
Na_{3}-Citrato (3,5 mM), bromuro de hexadimetrina
(12,5 mg/l), manitol (2%), glicina (4%) y BSA (1%). El reactivo de
tromboplastina se evaluó en ensayos de TP para un plasma normal
control de coagulación de nivel I, para un plasma normal reunido
(PNP), para un plasma tratado con cumarina, y para un plasma
deficiente en factor VII en un 99%^{+} usando un analizador
mecánico CS-190 para determinar los tiempos de
coagulación TP. El reactivo de tromboplastina preparado con el
extracto no tratado, pero por lo demás idéntico a la composición de
reactivo objeto, se empleó como control. Los resultados se muestran
en la tabla 4.1
| TP (s) | |
| Tiempo de coagulación de PNP | 12,9 s |
| Tiempo de coagulación de plasma de cumarina | 53,7 s |
| Tiempo de coagulación de plasma deficiente en FVII | 93,3 s |
| ISI simple calculado | 0,93 |
Se ha informado de que los factores tisulares
humanos y bovinos son resistentes a la digestión con quimotripsina.
Se realizó un experimento adicional para determinar si podía
prepararse un extracto de mayor sensibilidad mediante la digestión
enzimática de los factores de coagulación de conejo residuales.
Se incubaron durante la noche alícuotas de polvo
en acetona de cerebro de conejo (RBAP) a temperatura ambiente con
concentraciones variables de quimotripsina añadida, seguido por
diálisis. Estas preparaciones se probaron entonces como reactivos de
tromboplastina de preliofilización del extracto al 42%:
| Reactivo de tromboplastina de preliofilización | PNP | F7D-I | ISI simple |
| más tratamiento con quimotripsina | |||
| A: Sin enzima, no dializado | 12,0 | 71,0 | 1,13 |
| B: Sin enzima, dializado | 12,7 | 111,0 | 1,10 |
| E: 3 \mug/ml de enzima, dializado | 12,7 | 305,0 | 1,02 |
El tratamiento con quimotripsina del reactivo de
tromboplastina demostró que el tratamiento con quimotripsina no
afecta a la actividad del factor tisular de los extractos ni a los
valores normales para los ensayos de TP, mientras que
simultáneamente mejora la sensibilidad del producto.
Se evaluó la función de los reactivos de
tromboplastina complementados con reactivos de unión a calcio,
Na_{3}-citrato, ADA (ácido
N-2-acetamidol-2-iminodiacético)
y bicina
(N,N-bis(2-hidroxietil)glicina)
para determinar el efecto de modular el Ca^{++} libre en el
reactivo. Tal como se muestra en las tablas de a continuación, el
uso de los agentes de modulación de Ca^{++} aumenta la
sensibilidad del reactivo, mientras que se mantienen los tiempos de
PNP normales dentro del intervalo esperado.
| PNP | CP | 50% de PNP | ISI simple | D100-50 | |
| Extracto al sin quelante 42%, | 11,7 | 29,9 | 15,3 | 1,38 | 3,6 |
| Extracto al 42%, NaCit 1 mM | 12,0 | 32,4 | 15,2 | 1,30 | 3,2 |
| Extracto al 42%, NaCit 2 mM | 12,1 | 34,3 | 15,4 | 1,24 | 3,3 |
| Extracto al 42%, NaCit 3 mM | 12,5 | 40,9 | 15,7 | 1,09 | 3,2 |
| Extracto al 42%, NaCit 3,6 mM | 12,8 | 44,2 | 15,9 | 1,04 | 3,1 |
| PNP | CP | ISI simple | |
| Bicina 1 mM | 11,7 | 28,5 | 1,52 |
| Bicina 2 mM | 12,0 | 33,7 | 1,31 |
| Bicina 4 mM | 12,1 | 33,0 | 1,34 |
| Bicina 6 mM | 11,8 | 27,9 | 1,57 |
| Bicina 8 mM | 11,9 | 28,8 | 1,53 |
| ADA 1 mM | 11,9 | 34,0 | 1,29 |
| ADA 2 mM | 12,0 | 33,5 | 1,31 |
| ADA 4 mM | 15,5 | 118,3 | 0,66 |
| ADA 6 mM | 31,3 | NR | NR |
| ADA 8 mM | NR | NR | NR |
Con el fin de caracterizar el efecto de
diafiltración de los extractos de tromboplastina independiente de un
ensayo funcional, se realizaron ensayos de hemoglobina en plasma de
extractos de RBAP, sometidos a diafiltración y no sometidos a
diafiltración.
El procedimiento se realizó usando el kit de
diagnóstico de hemoglobina en plasma de Sigma nº 527. Los resultados
fueron los siguientes:
\newpage
| Muestra | Hb calculada (mg/dl) |
| 10 \mul de Hb hu normaliz. 30 mg/dl | 30,00 |
| 5 \mul de Hb hu normaliz. 30 mg/dl | 14,87 |
| 10 \mul de extracto no sometido a diafiltración de sobrenadante transparente | 2,05 |
| 10 \mul de extracto sometido a diafiltración de sobrenadante transparente | -0,51 |
El extracto no sometido a diafiltración tenía un
tono marrón o rojo, presumiblemente procedente de los contaminantes,
mientras que el extracto sometido a diafiltración es transparente e
incoloro. Los resultados del ensayo indican que el extracto no
sometido a diafiltración tenía una Hb calculada de 2,05 mg/dl. El
extracto sometido a diafiltración tenía una Hb calculada de -0,51
mg/dl, lo que indica niveles en o inferiores al límite de detección,
lo que demuestra la efectividad de la técnica de diafiltración en la
eliminación de contaminantes de los extractos de tromboplastina.
A la luz de la descripción detallada de la
invención y los ejemplos presentados anteriormente, puede apreciarse
que se alcanzan los diversos objetos de la invención.
Las explicaciones e ilustraciones presentadas en
el presente documento pretenden familiarizar a otros expertos en la
técnica con la invención, sus principios y su aplicación práctica.
Los expertos en la técnica pueden adaptar y aplicar la invención en
sus numerosas formas, según sea más adecuado para los requisitos de
un uso particular. En consecuencia, las realizaciones específicas de
la presente invención expuestas no pretenden ser exhaustivas ni
limitativas de la invención.
Claims (33)
1. Método para separar un factor de coagulación
plasmático de una disolución de tromboplastina, comprendiendo el
método:
exponer una disolución de tromboplastina que
comprende factor tisular biológicamente activo y un factor de
coagulación plasmático a una primera superficie de una membrana
semipermeable;
permitir que el factor de coagulación pase desde
la disolución de tromboplastina a través de la membrana; y
retener el factor tisular biológicamente activo
en la disolución de tromboplastina.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la
disolución de tromboplastina es un extracto de tromboplastina.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que los factores de coagulación plasmáticos, factor VII, factor II y
factor X pasan a través de la membrana.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos aproximadamente el 10%
del factor tisular biológicamente activo en la disolución de
tromboplastina se retiene en ella.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la disolución de tromboplastina
comprende además un agente quelante de iones calcio.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la disolución de alimentación
comprende además ácido etilendiaminotetraacético a una concentración
de al menos aproximadamente 10 mM.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la disolución de tromboplastina
comprende además un disolvente y una parte del disolvente pasa desde
la disolución de tromboplastina a través de la membrana.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la etapa de exponer una
disolución vehículo a una segunda superficie de la membrana.
9. Método según la reivindicación 2, en el que el
extracto de tromboplastina se prepara mediante la extracción de
tejido de mamífero con una disolución de extracción.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
el tejido es tejido homogeneizado, tejido deshidratado o está en la
forma de un polvo en acetona.
11. Método según las reivindicaciones 9 ó 10, en
el que la disolución de extracción es una disolución salina acuosa,
una sal de ácido orgánico o un sal de citrato.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
la disolución de extracción comprende citrato de sodio.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que el tejido se extrae con una
disolución de extracción que tiene una ausencia esencial de iones
calcio.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, en el que el extracto de tromboplastina
comprende además ácido etilendiaminotetraacético a una concentración
de al menos aproximadamente 10 mM.
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, en el que la permeación de la membrana
emplea el uso de una membrana semipermeable con un punto de corte de
peso molecular que oscila desde aproximadamente 75.000 Dalton hasta
aproximadamente 2.000.000 Dalton.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, en el que la permeación de la membrana
emplea el uso de una membrana semipermeable con un punto de corte de
peso molecular que oscila desde aproximadamente 100.000 Dalton hasta
aproximadamente 1.000.000 Dalton.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, en el que la permeación de la membrana
emplea el uso de una membrana semipermeable con un punto de corte de
peso molecular que oscila desde aproximadamente 200.000 Dalton hasta
aproximadamente 400.000 Dalton.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 17, que comprende: separar un factor de
coagulación plasmático de un extracto de tromboplastina mediante
permeación de membrana, y combinar el extracto de tromboplastina
con iones Ca^{++} para formar un reactivo de tromboplastina.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
los iones Ca^{++} se combinan con el extracto de tromboplastina
después de que se separe del mismo el factor de coagulación
plasmático.
20. Método según la reivindicación 18 ó 19, en el
que el extracto de tromboplastina comprende además ácido
etilendiaminotetraacético.
21. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 20, en el que el extracto de tromboplastina
comprende además un agente quelante de iones calcio.
22. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que el factor de coagulación
plasmático se selecciona del grupo que consiste en factor VII,
factor II, factor X, factor IX, factor XI, factor XII, proteína C,
proteína S y proteína Z.
23. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, comprendiendo el método:
exponer una disolución de alimentación que
comprende un extracto de tromboplastina a una primera superficie de
una membrana semipermeable, teniendo la membrana un punto de corte
de peso molecular que oscila entre aproximadamente 75.000 Dalton y
aproximadamente 2.000.000 Dalton;
recoger las disoluciones de alimentación
expuestas como un material retenido; y
combinar el material retenido con iones Ca^{++}
para formar un reactivo de tromboplastina.
24. Método según la reivindicación 23, en el que
la membrana semipermeable tiene un punto de corte de peso molecular
que oscila desde aproximadamente 100.000 Dalton hasta
aproximadamente 1.000.000 Dalton.
25. Método según la reivindicación 23, en el que
la membrana semipermeable tiene un punto de corte de peso molecular
que oscila desde aproximadamente 100.000 Dalton hasta
aproximadamente 500.000 Dalton o desde aproximadamente 200.000
Dalton hasta aproximadamente 400.000 Dalton o de aproximadamente
300.000 Dalton.
26. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 25, en el que la disolución de alimentación
comprende además un agente quelante de iones calcio.
27. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, en el que la disolución de alimentación
comprende además ácido etilendiaminotetraacético a una concentración
de al menos aproximadamente 10 mM.
28. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 27, que comprende además combinar el material
retenido con un tampón y un estabilizante.
29. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 28, en el que la disolución de alimentación
comprende además un disolvente y una parte del disolvente pasa desde
la disolución de alimentación a través de la membrana.
30. Método según la reivindicación 29, que
comprende además:
suministrar la disolución de alimentación a la
membrana semipermeable desde un tanque;
recircular la disolución de alimentación expuesta
hasta el tanque; y
suministrar una disolución diluida que comprende
el disolvente al tanque.
31. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 20, que comprende además la etapa de exponer
una disolución vehículo a una segunda superficie de la membrana.
32. Método para determinar el tiempo de
coagulación de una muestra de plasma, comprendiendo el método:
preparar u obtener el reactivo de tromboplastina
preparado según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 31;
combinar el reactivo de tromboplastina con la
muestra de plasma para formar una disolución de ensayo; y
determinar el tiempo transcurrido desde la
formación de la disolución de ensayo hasta la detección de la
formación de coágulos en la disolución de ensayo.
33. Método para determinar el nivel de un factor
de coagulación plasmático presente en un plasma de prueba,
comprendiendo el método:
determinar los tiempos de coagulación de plasmas
normalizados que tienen diversos niveles conocidos del factor de
coagulación plasmático según el método de la reivindicación 32;
preparar una correlación normalizada entre los
tiempos de coagulación de los plasmas normalizados y el nivel del
factor de coagulación plasmático en los plasmas normalizados;
determinar el tiempo de coagulación del plasma de
prueba según el método de la reivindicación 32; y
correlacionar el tiempo de coagulación
determinado del plasma de prueba con el nivel del factor de
coagulación plasmático basado en la desviación estándar.
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