ES2327013T3 - Preparacion terapeutica de fviia de muy alta pureza y metodo para su obtencion. - Google Patents
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Abstract
Método para la obtención de una preparación terapéutica de FVIIa que tiene una pureza de, como mínimo, 1000 UI/mg de proteína estando libre de proteínas de origen no humano, estando dicho método caracterizado porque el FVII se purifica a partir de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su activación.
Description
Preparación terapéutica de FVIIa de muy alta
pureza y método para su obtención.
La presente invención se refiere a una
preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza y un método para
su obtención, que presentan notables características de novedad y
actividad inventiva.
El tratamiento de los problemas hemorrágicos en
hemofilia y otros desórdenes relacionados, como enfermedad
hepática, se realiza mediante terapia sustitutiva con factores de la
coagulación.
El tratamiento de elección en la hemofilia A
(déficit del factor VIII de la coagulación) comprende la
administración de dicho factor VIII (FVIII), tanto a nivel
profiláctico, como en episodios agudos. Desafortunadamente, uno de
los problemas de la terapia con FVIII es la aparición de anticuerpos
inhibidores frente al FVIII, lo cual merma la eficacia de este
tratamiento.
Otros tratamientos alternativos incluyen la
administración de concentrados del complejo de protrombina activado
(APCC). El APCC consiste en una mezcla de factores de coagulación
dependientes de la vitamina K (factores II, VII, IX y X) y otras
proteínas acompañantes (fundamentalmente Proteína C y proteína S).
El tratamiento con estos APCCs produce el incremento de niveles de
los factores no deficitarios, encontrándose además algunos de los
factores en su forma activada, por esto se pueden desencadenar
fenómenos trombogénicos en el paciente, como la coagulación
intravascular diseminada.
La capacidad del factor VII activado (FVIIa)
para iniciar la coagulación independientemente de la actividad del
factor VIII es de gran utilidad terapéutica, ya que permite
restaurar la hemostasia en pacientes hemofílicos que han
desarrollado anticuerpos inhibidores contra el factor VIII y que,
por tanto, no responden adecuadamente a la terapia sustitutiva. En
comparación con otros factores, el FVIIa presenta una semivida
biológica corta (unas 4 horas) mientras que los otros factores del
APCC presentan una semivida mas larga, lo cual provoca su
acumulación.
Otra ventaja del tratamiento con FVIIa
purificado es que su acción se localiza por la disponibilidad de su
cofactor, el factor tisular, que se libera en los puntos lesionados
(hemartrosis, extracciones dentales, intervenciones quirúrgicas,
etc.). En la actualidad se tiende a considerar al FVIIa como un
agente hemostático global, con una amplia posibilidad de
indicaciones, como sobredosis de dicumarínicos, fallo hepático,
sangrado incoercible, entre otras.
Además, en la administración de FVIIa de alta
pureza, por su elevada actividad, la infusión de proteína es mínima
y no se infunden otras proteínas no necesarias.
Las preparaciones de FVIIa de origen plasmático,
han presentado hasta el momento una actividad de FVIIa relativamente
baja, en comparación con la de la presente invención. La patente
US4479938 por "Therapeutic composition containing factor VIIa"
("Composición terapéutica que contiene factor VIIa") de BAXTER
TRAVENOL LAB muestra un FVIIa de baja pureza, al igual que la
patente EP0346241 por "Process for preparing a factor VIIa
fraction, and its use as a medicament" ("Proceso de
preparación de una fracción de factor VIIa y su uso como
medicamento") de FOND NAT TRANSFUSION SANGUINE, que también
muestra la preparación de un FVII de baja pureza, con una actividad
entre 95 y 130 UI de FVIIa/mg de proteína.
Los métodos conocidos de purificación del FVIIa
a nivel industrial parten del complejo de protrombina o de
fracciones equivalentes del fraccionamiento plasmático, como muestra
la patente EP0346241 y se basan en métodos que incluyen
precipitaciones selectivas y la utilización de la centrifugación
como método de separación de precipitados. Como hemos visto, en los
procesos de purificación basados en la precipitación el grado de
purificación obtenido es limitado, describiendo además procesos
complejos en que la separación de precipitados es por
centrifugación, el cual es un método industrialmente complejo y
caro.
La patente EP 0391974 por "Process for the
purification of vitamin K-dependent blood clotting
factors" ("Proceso de purificación de factores de la
coagulación dependientes de vitamina K") de CENTRAL BLOOD LAB
AUTHORITY se refiere fundamentalmente a la purificación del FIX, a
partir del complejo de protrombina, mediante la cromatografía con
una columna metal quelante. Como subproducto, procedente de los
lavados de la obtención del FIX, se reivindica la obtención del
FVII, no de FVIIa. Este FVII obtenido es de baja pureza (alrededor
de una UI por mg. de proteína) y se caracteriza por no contener
FII, pero si puede contener cantidades significativas de otros
factores vitamina K dependientes. Por el método descrito, no es
posible la obtención de un FVIIa de alta pureza. La cromatografía
en columna metal quelante utiliza una resina activada con Cobre. En
el método descrito en la presente invención la cromatografía metal
quelante utiliza una resina con níquel, que no requiere activación
previa; los lavados se realizan a conductividades elevadas, lo cual
permite una estabilización del FVII en la columna y la elución no
requiere la presencia de aminoácidos. Esto, ligado también a que se
parte de un material de mayor pureza, permite la obtención de un
producto de alta pureza, que no sería alcanzable según la patente EP
0391974.
Otros métodos de purificación del FVIIa
plasmático se basan en el aislamiento y separación del FVII por
inmunoafinidad (con anticuerpos monoclonales) [Vox Sanguinis (2003)
84, 54-64]. Con este método se consigue una pureza
elevada (actividad específica del orden de 40.000 UI/mg de
proteína), pero no se puede descartar la presencia, en el producto
final, de proteínas de origen no humano procedentes de los
anticuerpos monoclonales liberados por la resina empleada. Estas
proteínas no humanas serían responsables de reacciones antigénicas
en los pacientes tratados.
Otro aspecto a destacar es el material de
partida del proceso de purificación del FVIIa, que ha sido
tradicionalmente el complejo de protrombina (PTC) o fracción
equivalente. Esto implica que este material pueda ser destinado
únicamente para la obtención de uno de los dos productos, o bien PTC
o bien FVIIa. La posibilidad de purificar el FVIIa a partir de un
material alternativo, que sea una fracción de desecho no utilizada
en el fraccionamiento, como el precipitado de la suspensión de la
FrII+III, abre la posibilidad de un aprovechamiento más eficiente
del plasma fraccionado.
Por la presente invención se consigue una
preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza a partir del
plasma humano, con, como mínimo, 1000 UI/mg de proteína o
preferentemente 6000 UI/mg de proteína y a una concentración de,
como mínimo, 12000 UI/ml. El método de obtención de este FVIIa parte
de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y
comprende la precipitación con PEG y la cromatografía y el producto
resultante está libre de proteínas de origen no humano.
De acuerdo con la presente invención se describe
y reivindica una preparación terapéutica de FVIIa, procedente de
plasma humano, con una pureza de, como mínimo, 1000 UI/mg proteína,
pudiendo alcanzar más de 6000 UI/mg de proteína. Esta preparación
terapéutica de FVIIa está libre de proteínas de origen no humano y
en ella el FVIIa está presente a una concentración de, como mínimo,
12000 UI/ml.
Este FVII se purifica a partir de la fracción
II+III o de la fracción III o equivalentes, del fraccionamiento del
plasma humano y el método de purificación comprende la precipitación
con PEG y la cromatografía.
En una primera etapa la suspensión de la
fracción de partida (FrII+III, Fr III o equivalente) se precipita a
una concentración entre el 3 y el 5% de PEG y el precipitado
resultante se solubiliza y reprecipita a concentración entre el 5 y
el 7% de PEG, recuperando el sobrenadante de esta precipitación.
A partir de este sobrenadante, el FVII se
captura por cromatografía de intercambio iónico con una resina del
tipo Q Sepharosa o Q cerámica y se realiza la elusión por cambio de
pH.
Este eluido rico en FVII se purifica
opcionalmente por cromatografía de interacción hidrofóbica con una
resina del tipo Octyl Sepharosa. Una característica de este
procedimiento es que se realiza en ausencia de sales de amonio.
Adicionalmente se realiza una etapa de
purificación del FVII por cromatografía Metal Quelante con la resina
Ni Sepharosa HP.
La activación del FVII se realiza en presencia
de calcio.
Al tratarse de un producto de origen biológico,
es aconsejable la inclusión de, como mínimo, una, o preferiblemente
dos o más etapas de eliminación de agentes patógenos. Por su
eficacia contrastada, es conveniente, por ejemplo, la inclusión de
una etapa de eliminación de virus por tratamiento con
solvente/detergente previa a cualquiera de las etapas
cromatográficas. Este método, y el producto obtenido, permiten
también la inclusión de etapas adicionales de eliminación de virus,
por ejemplo, por nanofiltración.
En una forma de realización preferente del
método descrito, el FVII se purifica a partir de la FrII+III,
mediante la precipitación con PEG entre 3,5 y 4,5% a pH entre 5 y
5,4. El precipitado obtenido se resuspende y precipita con PEG
entre 5,5 y 6,5% a un pH entre 6 y 7. La adsorción del FVII del
sobrenadante de esta precipitación se realiza por intercambio
iónico, con una resina del tipo Q-Sepharosa FF, a un
pH próximo a la neutralidad y eluyendo el FVII a un pH entre 5 y
6.
Posteriormente, se realiza opcionalmente una
purificación del FVII por cromatografía de interacción hidrofóbica,
adsorbiendo el FVII en una resina del tipo Octyl Separosa FF. Esta
adsorción se realiza a pH neutro. La elución del FVII purificado se
realiza mediante una solución que contiene fosfato disódico anhidro
10 mmol/l citrato trisódico dihidratado 10 mmol/l Na, Cl 500 mmol/l
a pH neutro.
El eluido, rico en FVII, se aplica a una columna
metal quelante, con una resina Ni Separosa HP, adsorbiendo el FVII
a un pH entre 7,5 y 8,5. Esta resina permite la realización de
lavados en condiciones de elevada conductividad y también a un pH
entre 6 y 7. La elución del FVII con una solución que contiene
fosfato disódico anhidro 10 mmol/l, NaCl 25 mmol/l, ajustado a pH
neutro permite la obtención de un FVII de alta pureza, con una
actividad específica alrededor de 200 UI/mg de proteína.
\newpage
La activación del FVII puede realizarse mediante
la adición de calcio, aplicada a cualquiera de los materiales
intermedios o final, del proceso de purificación, lo cual no variará
las condiciones de obtención ni del FVII descrito.
Asimismo, se pueden implementar una o varias
etapas de reducción de agentes patógenos, aplicadas al proceso
descrito, sin variar la esencia de la invención.
A continuación se adjunta, a título ilustrativo,
un ejemplo de realización de la presente invención, dividido en las
etapas sucesivas 1 a 4.
Etapa
1
La suspensión inicial de la fracción II+III, se
realizó con una solución de extracción fosfato 5 mmol/l y sorbitol
5%.
Una vez completada la suspensión se mantuvo
durante 1 hora en agitación entre 2-6ºC. Después de
ajustar el pH, a la suspensión de la fracción II+III se le adicionó
PEG hasta una concentración final del 4% (p/p).Después de la
adición, se mantuvo la suspensión en agitación durante 30 minutos. A
la suspensión obtenida anteriormente, se le añadió bentonita
agitándola posteriormente durante 20 minutos, momento a partir del
cual se iniciará una etapa de reposo de, como mínimo, 4 horas.
Posteriormente se inició el proceso de centrifugación durante 20
minutos. Una vez finalizado el proceso de centrifugación se separó
el sobrenadante del precipitado. Este último fue disuelto en
solución tampón fosfato, realizándose las valoraciones analíticas de
FVII, tanto en este material como en la suspensión inicial de la
fracción II+III. Para el ensayo de actividad se empleó el kit
COASET®FVII (CHROMOGENIX). Este método se basa en dos pasos. En el
primero, el Factor X se activa a FXa por la vía extrínseca
(FVII-tromboplastina).El factor VII es completamente
activado a FVIIa durante este proceso, por lo tanto, en este ensayo
no hay interferencia con el FVII preactivado. En el segundo paso el
Factor Xa generado, hidroliza el sustrato cromogénico
S-2765 liberándose el grupo cromogénico pNA. El
color se lee fotométricamente a 405 nm. El Factor Xa generado y en
consecuencia la intensidad de color, es proporcional a la actividad
de Factor VII de la muestra. El precipitado de PEG reconstituido
muestra una actividad de Factor VII de 0,86 UI/ml. Estos resultados
indican que la actividad de FVII esta presente en la fracción
II+III, y que se recupera significativamente en el precipitado,
obtenido al adicionar PEG 4% en las condiciones descritas.
Etapa
2
La suspensión de la fracción de precipitado de
PEG al 4% se realizó con una solución de extracción (fosfato 5
mmol/l, citrato 5 mmol/l y NaCl 50 mmol/ pH 7,5 con NaOH 0,5 mol/l)
a una temperatura de 20-25ºC. Una vez completada la
resuspensión se mantuvo durante 2 horas en agitación, enfriándose
después hasta 5ºC y ajustando el pH a 6,5. Esta suspensión, se
diluyó con una solución compuesta por fosfato 45 mmol/l, NaCl 50
mmol/l a pH 6,5 a 5\pm3ºC y se le adicionó PEG hasta obtener una
concentración final de PEG del 6% (p/p). Finalmente se procedió a
clarificar el sobrenadante de PEG al 6% mediante una filtración con
una placa de profundidad para separar el precipitado del PEG. Una
vez finalizado el proceso, la solución filtrada fue analizada con
relación a la actividad de FVII y su contenido en proteína (estimado
por densidad óptica), obteniendo una actividad especifica de 0,11
UI/UA. Este valor ha sido calculado dividiendo la actividad del
FVII (UI/ml) entre la proteína aproximada, valorado mediante el
método descrito en la etapa 1.
En este punto se realiza la implementación de
una etapa de inactivación de virus mediante tratamiento con un
disolvente orgánico asociado a un detergente. Estos reactivos de
inactivación de virus son posteriormente separados en las etapas
cromatográficas siguientes.
A partir del sobrenadante de PEG al 6%
clarificado de la fracción II+III, se realizó una dilución al 20%
con API ajustando el pH a 7,5 con el fin de disminuir la
conductividad. A continuación se adicionaron resinas Q Sepharose FF
(previamente equilibradas) a la solución anterior, la cual sé
mantuvo bajo agitación moderada durante una hora. Posteriormente se
procedió al empaquetamiento de la columna (FINE LINE FF) con la
suspensión con resinas. Una vez empaquetada se realizó el lavado de
las resinas mediante fosfato 10 mmol/l, citrato 10 mmol/l, NaCl 100
mmol/l ajustado a pH 7,5 y a una temperatura de
2-8ºC. Finalizado el lavado, se inyectó la solución
de elución Q en la columna. Esta elución se realizó con fosfato 10
mmol/l NaCl 200 mmol/l ajustado a pH 5,5 a una temperatura de
2-8ºC. El Eluido Q fue valorado, obteniéndose una
actividad específica de FVII de 1,16 UI/UA.
Se partió del Eluido Q Sepharose, el cual fue
ajustado a 2,5 mol/ de NaCl, pH 7,0 y a una temperatura de
25\pm3ºC. A continuación se realizó el equilibrado de la columna
(Octyl Sepharose FF) con fosfato 10 mmol/l, citrato 10 mmol/l, NaCl
2500 mmol/l a pH 7,0 y a una temperatura de 25\pm3ºC. El siguiente
paso fue la inyección del eluido en la columna y el lavado con la
misma solución de equilibrado (a una temperatura de 25\pm3ºC).
Seguidamente se realizó la elución con fosfato 10 mmol/l citrato 10
mmol/l Na, Cl 500 mmol/l a pH 7,0 y una 25\pm3ºC de temperatura.
El eluido octyl se valoró obteniendo unos resultados de actividad
específica de FVII de 3,79 UI/UA. Como podemos observar, los
resultados obtenidos en esta etapa 2 reflejan un aumento de la
actividad específica a lo largo de las tres etapas de 34 veces
respecto al valor inicial en el sobrenadante de PEG 6%
clarificado.
Etapa
3
En primer lugar, se realizó el equilibrado de la
Columna Ni Sepharose HP con fosfato 10 mmol/l, NaCl 1 mol/l
ajustado a pH 8,0\pm0,05. A continuación se inyectó el Eluido
Octyl en la columna. Seguidamente se realizaron dos lavados, un
primer lavado en condiciones de elevada conductividad (1 mol/l
NaCl), seguido de un segundo lavado con una reducción de pH (6,5).
Finalmente, se procedió a la elución específica con una solución que
comprende fosfato 10 mmol/l, NaCl 25 mmol/l, ajustado a pH 7,0. Al
eluido Ni resultante se le realizaron las valoraciones analíticas,
obteniendo unos resultados de actividad específica de 204 UI/UA, lo
que representa un incremento de pureza respecto al Eluido Q de en
unas 54 veces.
Etapa
4
En esta etapa se activó el FVII a FVIIa mediante
la adición de calcio, partiendo de un eluido Ni Sepharose. Para
ello, la fracción conteniendo el FVII fue incubada a 30ºC durante 20
horas en presencia de tris 50mmol/l, NaCl 30mmol/l y CaCl_{2} 2
mmol/l para producir la autoactivación del FVII. Las valoraciones
analíticas de estas muestras para la actividad de FVIIa, se han
realizado con el kit STACLOT®VIIa-rTF (DIAGNOSTICA
STAGO) frente al 1er estándar internacional de FVIIa. El principio
de este método se basa en que el rsTF posee una función específica
como cofactor del FVIIa. El rsTF en presencia de FVIIa, fosfolípidos
y calcio produce coagulación del plasma. En este sistema el tiempo
de coagulación observado presenta una relación inversa con el nivel
de FVII inicialmente presente en el plasma. EL rsTF no activa el
FVII a FVIIa, por lo tanto, el FVII presente en el ensayo no
interfiere en le ensayo. Paralelamente se han realizado las
valoraciones de la actividad de FVII por el método descrito en la
etapa 1. Los resultados de actividad de FVII y FVIIa en la fracción
activada así obtenida muestra un ratio de 30,3 UI FVIIa/UI FVII.
La combinación de los procedimientos descritos
en las cuatro etapas, permite estimar la actividad específica de un
Factor VII activado obtenido a partir del eluido Ni entorno a las
6056 UI/UA.
Con objeto de eliminar partículas víricas u
otros patógenos que pudieran estar presentes, se implementa una
etapa final de nanofiltración de la solución por nanofiltros de 15
nanómetros de tamaño de poro.
Si bien la invención se ha explicado en la
descripción anterior, incluyendo un ejemplo ilustrativo, se
comprenderá que en base a lo que se ha dado a conocer, los expertos
en la materia podrán introducir variantes y alternativas incluidas
dentro de la invención, que queda limitada solamente por las
siguientes reivindicaciones.
Claims (17)
1. Método para la obtención de una preparación
terapéutica de FVIIa que tiene una pureza de, como mínimo,
1000 UI/mg de proteína estando libre de proteínas de origen no humano, estando dicho método caracterizado porque el FVII se purifica a partir de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su activación.
1000 UI/mg de proteína estando libre de proteínas de origen no humano, estando dicho método caracterizado porque el FVII se purifica a partir de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su activación.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la suspensión de FrII+III, FrIII o
equivalente se precipita a una concentración entre 3 y 7% de
PEG.
3. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado por que el FVII se captura por cromatografía de
intercambio iónico.
4. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la elución cromatográfica se realiza por
cambio de pH.
5. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el FVII se purifica por cromatografía de
interacción hidrofóbica.
6. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el procedimiento se realiza en ausencia
de sales de amonio.
7. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque se realiza una etapa de purificación del
FVII por cromatografía Metal Quelante.
8. Método, según la reivindicación 7,
caracterizado porque la resina Metal Quelante es Ni Sepharosa
HP.
9. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el FVII se activa en presencia de
calcio.
10. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende, como mínimo, una etapa
específica de eliminación de virus.
11. Método, según la reivindicación 10,
caracterizado porque comprende una etapa de eliminación de
virus por nanofiltración.
12. Método, según la reivindicación 10,
caracterizado porque comprende una etapa de eliminación de
virus por tratamiento con solvente/detergente.
13. Preparación terapéutica de FVIIa obtenida
por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque su una pureza es, como mínimo, de 1000
UI/mg proteína.
14. Preparación terapéutica de FVIIa, según la
reivindicación 13, caracterizada porque su pureza es de, como
mínimo, 6000 UI/mg de proteína.
15. Preparación terapéutica de FVIIa, según la
reivindicación 14, caracterizada porque el FVIIa está
presente a una concentración de, como mínimo, 12000 UI/ml.
16. Preparación terapéutica de FVIIa, según la
reivindicación 13, caracterizada por que el FVIIa procede de
plasma humano.
17. Preparación terapéutica de FVIIa, según la
reivindicación 16, caracterizada por que ha sido sometida,
como mínimo, a una etapa de eliminación de agentes patógenos.
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