JPH0713026B2 - 血友病ａ抑制患者の治療のための製剤及び該製剤の製造方法 - Google Patents
血友病ａ抑制患者の治療のための製剤及び該製剤の製造方法Info
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- JPH0713026B2 JPH0713026B2 JP60505194A JP50519485A JPH0713026B2 JP H0713026 B2 JPH0713026 B2 JP H0713026B2 JP 60505194 A JP60505194 A JP 60505194A JP 50519485 A JP50519485 A JP 50519485A JP H0713026 B2 JPH0713026 B2 JP H0713026B2
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、血友病Ａ抑制患者の治療のための製剤及び
該製剤の製造方法に関する。
該製剤の製造方法に関する。
血友病Ａは、凝固因子VIII:Cの欠如による先天的な病気
である。この因子は血漿中に存在し、血液から部分的に
精製することができる。この因子（AHF）を含む製剤
は、患者の血液が凝固することができるようにするため
に血友病Ａ患者に投与することができる。この種の製剤
の製造は例えば米国特許第3,652,530号及び国際出願WO8
4/03628号に記載されている。これらの製剤において、
因子VIII:Cタンパク質は、通常、全タンパク質の0.1％
を占める。より純度の高い因子VIII:Cは、親和性クロマ
トグラフィーによって得ることができる（Zimmerman
ら、米国特許第4,361,509号、Fassら、Blood59,394,198
2）。
である。この因子は血漿中に存在し、血液から部分的に
精製することができる。この因子（AHF）を含む製剤
は、患者の血液が凝固することができるようにするため
に血友病Ａ患者に投与することができる。この種の製剤
の製造は例えば米国特許第3,652,530号及び国際出願WO8
4/03628号に記載されている。これらの製剤において、
因子VIII:Cタンパク質は、通常、全タンパク質の0.1％
を占める。より純度の高い因子VIII:Cは、親和性クロマ
トグラフィーによって得ることができる（Zimmerman
ら、米国特許第4,361,509号、Fassら、Blood59,394,198
2）。
因子VIII:Cタンパク質はまだ完全に特徴づけられてはい
ないけれども、その構造の一部は知られている（エル・
ダブリュ・ホイヤー、Blood58,1,1981;エム・ウェイン
スタインら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA78,5137,1981;ジ
ー・クオら、Thromb.Haemostas.50,262,1983）。分子量
は約300kDである。
ないけれども、その構造の一部は知られている（エル・
ダブリュ・ホイヤー、Blood58,1,1981;エム・ウェイン
スタインら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA78,5137,1981;ジ
ー・クオら、Thromb.Haemostas.50,262,1983）。分子量
は約300kDである。
血友病Ａ患者の10ないし20％は、因子VIII:Cを欠くだけ
でなく、因子VIII:Cに対する抗体を生じている。このよ
うな患者は抑制患者と呼ばれ、また、その抗体は因子VI
II:Cの前凝固（procoagulant）活性を抑制するので抑制
抗体と呼ばれる（エイチ・アール・ロバーツとアール・
クロマティ、Progress in Clinical and Biological Re
search150,1,1984）。この抗体が存在すると、因子VII
I:Cがこれによって中和されるので、AHF製剤を投与して
も効果がなくなり、より高い抗体濃度が誘起される。
でなく、因子VIII:Cに対する抗体を生じている。このよ
うな患者は抑制患者と呼ばれ、また、その抗体は因子VI
II:Cの前凝固（procoagulant）活性を抑制するので抑制
抗体と呼ばれる（エイチ・アール・ロバーツとアール・
クロマティ、Progress in Clinical and Biological Re
search150,1,1984）。この抗体が存在すると、因子VII
I:Cがこれによって中和されるので、AHF製剤を投与して
も効果がなくなり、より高い抗体濃度が誘起される。
抑制抗体は免疫測定において因子VIII:C抗原を測定する
ために用いることができる（ビー・ディネセン、シー・
フェダーソン、Thromb.Res.Haemostas.31,707,1983、オ
ー・ノードファングら、Thromb.Haemostas.50,111,198
3）。
ために用いることができる（ビー・ディネセン、シー・
フェダーソン、Thromb.Res.Haemostas.31,707,1983、オ
ー・ノードファングら、Thromb.Haemostas.50,111,198
3）。
抑制患者は従来、次のようにして治療されていた。
ａ）活性化プロトロンビン複合体製剤（フェイバ、オ
ートプレックス）による治療。これらの製剤は、多量
の抑制抗体が存在するにもかかわらず血漿を凝固させる
ことができる未知の成分（おそらく因子VIIa、ユー・ヘ
ドナーとダブリュ・キシエル、J.Clin.Invest.71,1837,
1983）を含んでいる。しかしながら、活性化されたプロ
トロンビン複合体製剤は、全ての抑制患者を治療できる
というわけではなく、また、患者もその抑制抗体を治癒
させることはできない。さらに、この種の製剤を用いる
と、血栓症を引き起こす危険性が高い。
ートプレックス）による治療。これらの製剤は、多量
の抑制抗体が存在するにもかかわらず血漿を凝固させる
ことができる未知の成分（おそらく因子VIIa、ユー・ヘ
ドナーとダブリュ・キシエル、J.Clin.Invest.71,1837,
1983）を含んでいる。しかしながら、活性化されたプロ
トロンビン複合体製剤は、全ての抑制患者を治療できる
というわけではなく、また、患者もその抑制抗体を治癒
させることはできない。さらに、この種の製剤を用いる
と、血栓症を引き起こす危険性が高い。
ｂ）抑制抗体の形成は、非常に大量なAHF（１日当たり1
00ないし200ユニット/kg）を投与することによって抑え
ることができることがわかっている。これにより、因子
VIIIに対する免疫トレランスを誘導することが可能にな
る（ヘイチ・ヘイチ・ブラックマンとジェイー・ゴーム
セン、Lancet,p.933,1977）。この種の治療の後、患者
は他の血友病患者と同様にAHF製剤による治療が可能に
なる。しかしながら、関係のないタンパク質が大量に投
与されるので、大量のAHF治療もまた非特異的であり、
患者は治療の間、AHF製剤中の前凝固活性を利用するこ
とができない。
00ないし200ユニット/kg）を投与することによって抑え
ることができることがわかっている。これにより、因子
VIIIに対する免疫トレランスを誘導することが可能にな
る（ヘイチ・ヘイチ・ブラックマンとジェイー・ゴーム
セン、Lancet,p.933,1977）。この種の治療の後、患者
は他の血友病患者と同様にAHF製剤による治療が可能に
なる。しかしながら、関係のないタンパク質が大量に投
与されるので、大量のAHF治療もまた非特異的であり、
患者は治療の間、AHF製剤中の前凝固活性を利用するこ
とができない。
治療段階の初期において、抑制抗体濃度は増加し、しだ
いに減少してゼロになる。治療中、AHFで出血を阻止す
ることはできないが、出血は上述のフェイバ（因子８
抑制剤バイパス活性）製剤によって部分的に止めること
はできる。
いに減少してゼロになる。治療中、AHFで出血を阻止す
ることはできないが、出血は上述のフェイバ（因子８
抑制剤バイパス活性）製剤によって部分的に止めること
はできる。
この治療は非常に高価であり（通常患者一人当たり600,
000米ドル、ステンブジャーグら、Thromb.Res.34,533,1
984参照のこと）、従って、あまり用いられていない。
000米ドル、ステンブジャーグら、Thromb.Res.34,533,1
984参照のこと）、従って、あまり用いられていない。
この発明は、因子VIII:CAg反応性を有し、因子VIII:C前
凝固活性をほとんどあるいは全く有さない血漿分画から
得られた成分が、抑制患者からの７つの抗体のうち７つ
に対して反応性を有していたという驚くべき知見に基づ
く。従って、有意なVIII:C前凝固活性を有さない適当に
大量のVIII:CAgを含む製剤を投与することによって、抑
制治療は有効なものとなる。
凝固活性をほとんどあるいは全く有さない血漿分画から
得られた成分が、抑制患者からの７つの抗体のうち７つ
に対して反応性を有していたという驚くべき知見に基づ
く。従って、有意なVIII:C前凝固活性を有さない適当に
大量のVIII:CAgを含む製剤を投与することによって、抑
制治療は有効なものとなる。
従って、この発明の製剤は、少なくとも0.5VIII:CAgU/m
g、好ましくは少なくとも1VIII:CAgU/mgの特異的因子VI
II:CAg活性を有し、因子VIII:CAg活性と因子VIII:C活性
との比が5:1よりも大きく、好ましくは10:1よりも大き
なことを特徴とするタンパク質又はペプチドを含む。製
剤は、好ましくは因子VIII:C前凝固活性がない。
g、好ましくは少なくとも1VIII:CAgU/mgの特異的因子VI
II:CAg活性を有し、因子VIII:CAg活性と因子VIII:C活性
との比が5:1よりも大きく、好ましくは10:1よりも大き
なことを特徴とするタンパク質又はペプチドを含む。製
剤は、好ましくは因子VIII:C前凝固活性がない。
注射可能な溶液の形態に製剤する場合には、VIII:CAgの
濃度は通常10U/ml以上、好ましくは50U/ml以上に調整さ
れる。
濃度は通常10U/ml以上、好ましくは50U/ml以上に調整さ
れる。
フェイバのような、抑制患者の因子VIII:C治療と並行
して投与することができるプロトロンビン複合体製剤は
またVIII:CAgを含むがその含量は一般的にわずか4.5VII
I:CAgU/mlである（アラインら、Progress in Clinical
and Biological Research150,99,1984参照）。しかしな
がら、フェイバ製剤はまた、有意量の因子VIII:C前凝固
活性を含んでおり（バロウクリフら、Thromb.Res.21,18
1-186,1981）、これがその効果にとって重要な役割を果
たすと考えられる。バロウクリフは、2U/mlのVIII:CAg
濃度と1.3U/mlの因子VIII:C活性とを測定し、これは1.
5:1の比に対応する。
して投与することができるプロトロンビン複合体製剤は
またVIII:CAgを含むがその含量は一般的にわずか4.5VII
I:CAgU/mlである（アラインら、Progress in Clinical
and Biological Research150,99,1984参照）。しかしな
がら、フェイバ製剤はまた、有意量の因子VIII:C前凝固
活性を含んでおり（バロウクリフら、Thromb.Res.21,18
1-186,1981）、これがその効果にとって重要な役割を果
たすと考えられる。バロウクリフは、2U/mlのVIII:CAg
濃度と1.3U/mlの因子VIII:C活性とを測定し、これは1.
5:1の比に対応する。
プロトロンビン複合体製剤はまた、他の多くの凝固因
子、特に因子II、VII、IX、及びＸ、さらにおそらく因
子VIIa、IXa及びXaを含み（アロンソン、Progress in C
linical and Biological Research150,243,1984）、こ
れらはおそらく血友病血漿の凝固を促進し、従って、ま
た血友病Ａ患者の出血を止めるのに用いることができ
る。
子、特に因子II、VII、IX、及びＸ、さらにおそらく因
子VIIa、IXa及びXaを含み（アロンソン、Progress in C
linical and Biological Research150,243,1984）、こ
れらはおそらく血友病血漿の凝固を促進し、従って、ま
た血友病Ａ患者の出血を止めるのに用いることができ
る。
上述のようにこの発明の製剤は、VIII:CAg:VIII:Cが少
なくとも5:1、好ましくは少なくとも10:1であり、さら
に上述したように好ましくはVIII:C活性が実質的にな
い。通常、製剤は他の凝固因子を含まず、血友病Ａ血漿
の凝固を促進しない（第１表参照）。所望ならば、上述
したような凝固因子を加えてこれらの因子の公知の効果
を追加してもよい。
なくとも5:1、好ましくは少なくとも10:1であり、さら
に上述したように好ましくはVIII:C活性が実質的にな
い。通常、製剤は他の凝固因子を含まず、血友病Ａ血漿
の凝固を促進しない（第１表参照）。所望ならば、上述
したような凝固因子を加えてこれらの因子の公知の効果
を追加してもよい。
製剤の活性成分として用いられるVIII:CAg活性を有する
タンパク質は、例えば、SDS-PAGE中で二重項を示し、分
子量が約80/77kDの因子VIII:Cフラグメント、又はトロ
ンビン活性化によって得られ、二重項を示し、およその
分子量が70/67kDであるそのフラグメントであってよい
（クオら、Ioc.cit.）。
タンパク質は、例えば、SDS-PAGE中で二重項を示し、分
子量が約80/77kDの因子VIII:Cフラグメント、又はトロ
ンビン活性化によって得られ、二重項を示し、およその
分子量が70/67kDであるそのフラグメントであってよい
（クオら、Ioc.cit.）。
クオらより、80/77kDフラグメントは特異的抑制抗体（z
HI）に対しVIII:CAg活性を示し、前凝固活性を示さない
ように思われる。しかしながら、このことから、このフ
ラグメントは、以下に示すように、７つの抑制抗体の７
つの抑制活性を阻止することができるということは予想
できなかった。
HI）に対しVIII:CAg活性を示し、前凝固活性を示さない
ように思われる。しかしながら、このことから、このフ
ラグメントは、以下に示すように、７つの抑制抗体の７
つの抑制活性を阻止することができるということは予想
できなかった。
この発明によると、血漿分画からのVIII:CAg反応性を有
する80/77kDのフラグメントの回収は、例えば親和性ク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
又はカチオン交換のような種々の方法によって行なうこ
とができる。出発材料は原則的にはいずれのVIII:CAg−
含有フラグメントであってもよいが、クリオ上清（cryo
supernatant）、又は再溶解されたクリオ沈殿（cryopre
cipitation）を２ないし６重量％、好ましくは約４重量
％のPEGで沈殿させて得られた血漿分画を便利に用いる
ことができる。この沈殿は通常、さらなる血漿分画化に
おいて用いられないので、後者の方法は特に便利であ
る。
する80/77kDのフラグメントの回収は、例えば親和性ク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
又はカチオン交換のような種々の方法によって行なうこ
とができる。出発材料は原則的にはいずれのVIII:CAg−
含有フラグメントであってもよいが、クリオ上清（cryo
supernatant）、又は再溶解されたクリオ沈殿（cryopre
cipitation）を２ないし６重量％、好ましくは約４重量
％のPEGで沈殿させて得られた血漿分画を便利に用いる
ことができる。この沈殿は通常、さらなる血漿分画化に
おいて用いられないので、後者の方法は特に便利であ
る。
この発明は、因子VIII:Cの80/77kDフラグメントの使用
に限定されない。以下でさらに説明するように、第1b図
には、より小さな因子VIII:Cフラグメントガ抑制抗体に
対して反応性であることが示されている。同様に、他の
抑制抗体が因子VIII:C分子の他の部分に対して反応性を
有することが予想される。このように血漿から単離され
た因子VIII:Cは92kDのフラグメントを有する（ジマーマ
ンら、米国特許第4,361,509号）。下記第５表に示すよ
うな抑制抗体を阻止できるフラグメントである限り、そ
れらはこの発明の一部である。
に限定されない。以下でさらに説明するように、第1b図
には、より小さな因子VIII:Cフラグメントガ抑制抗体に
対して反応性であることが示されている。同様に、他の
抑制抗体が因子VIII:C分子の他の部分に対して反応性を
有することが予想される。このように血漿から単離され
た因子VIII:Cは92kDのフラグメントを有する（ジマーマ
ンら、米国特許第4,361,509号）。下記第５表に示すよ
うな抑制抗体を阻止できるフラグメントである限り、そ
れらはこの発明の一部である。
また、発明は血漿から分離された因子VIII:Cの使用に限
定されない。因子VIII:CのDNA配列に基づき、因子VIII:
C遺伝子の部分断片を製造することができる。それらの
部分断片を適当なベクター（例えばプラスミド又はウイ
ルス）に挿入することができる。これらのベクターを適
当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母、CHO、COS又は他の
動物細胞）に挿入し、因子VIII:Cの部分フラグメントを
製造できるように細胞を変えることができる。これらの
フラグメントは、実質的に因子VIII:C前凝固活性を有す
ることなく第５表に示すような抑制抗体を阻害すること
ができると予想される。なぜなら、これらは、血漿から
分離された対応するペプチドと同じ分子構造を有してい
るからである。従って、このようなフラグメントはま
た、この発明の製剤として用いることができる。
定されない。因子VIII:CのDNA配列に基づき、因子VIII:
C遺伝子の部分断片を製造することができる。それらの
部分断片を適当なベクター（例えばプラスミド又はウイ
ルス）に挿入することができる。これらのベクターを適
当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母、CHO、COS又は他の
動物細胞）に挿入し、因子VIII:Cの部分フラグメントを
製造できるように細胞を変えることができる。これらの
フラグメントは、実質的に因子VIII:C前凝固活性を有す
ることなく第５表に示すような抑制抗体を阻害すること
ができると予想される。なぜなら、これらは、血漿から
分離された対応するペプチドと同じ分子構造を有してい
るからである。従って、このようなフラグメントはま
た、この発明の製剤として用いることができる。
抗体の反応性 数人の著者（ヘイチ・ピー・ムラーら、Blood58,1000,1
982;ビー・ソラら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA79,1983,1
982）が、因子VIII:Cに対する単一クローン抗体の製造
を記載している。これらの抗体はマウスを因子VIII:Cで
免疫化した後、脾細胞と腫瘍細胞とをケーラーとミルス
タイン（Nature256,495,1985）によって記載されたよう
にして融合することによって得ることができる。この方
法を用いることによって、因子VIII:Cに対する単一クロ
ーン抗体が製造された（それぞれ42IgG、47IgG、56IgG
と呼ばれる）。
982;ビー・ソラら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA79,1983,1
982）が、因子VIII:Cに対する単一クローン抗体の製造
を記載している。これらの抗体はマウスを因子VIII:Cで
免疫化した後、脾細胞と腫瘍細胞とをケーラーとミルス
タイン（Nature256,495,1985）によって記載されたよう
にして融合することによって得ることができる。この方
法を用いることによって、因子VIII:Cに対する単一クロ
ーン抗体が製造された（それぞれ42IgG、47IgG、56IgG
と呼ばれる）。
第1a図は、単一クローン抗体を用いた固相免疫分離を示
している。プラスチックビーズをマウス免疫グロブリン
／単一クローン抗体に対する抗体で覆った。ビーズを洗
った後、125Iでラベルした因子VIII:Cと共にインキュベ
ートした。因子VIII:Cはイー・ツデンハムら（J.Lab.Cl
in.Med.93,40,1979）に記載されたようにして製造し
た。ビーズを洗った後、SDS試料緩衝液で抽出し、溶離
物をSDSゲルに架けた。図はSDSゲルのオートラジオグラ
ムを示している。
している。プラスチックビーズをマウス免疫グロブリン
／単一クローン抗体に対する抗体で覆った。ビーズを洗
った後、125Iでラベルした因子VIII:Cと共にインキュベ
ートした。因子VIII:Cはイー・ツデンハムら（J.Lab.Cl
in.Med.93,40,1979）に記載されたようにして製造し
た。ビーズを洗った後、SDS試料緩衝液で抽出し、溶離
物をSDSゲルに架けた。図はSDSゲルのオートラジオグラ
ムを示している。
レーン1:トレーサー（125Iでラベルされた因子VIII:
C）、レーン2:正常マウスIgG、レーン3:42IgG、レーン
4:47IgG、レーン5:56IgG 第1a図より、これらの抗体は因子VIII:Cの80/77kD成分
（レーン３、４、５）と結合するように思われる。これ
はヒト抑制抗体zHIによって結合された成分と同じであ
る。
C）、レーン2:正常マウスIgG、レーン3:42IgG、レーン
4:47IgG、レーン5:56IgG 第1a図より、これらの抗体は因子VIII:Cの80/77kD成分
（レーン３、４、５）と結合するように思われる。これ
はヒト抑制抗体zHIによって結合された成分と同じであ
る。
第1b図は、第1a図の試験と同様に、ビーズに結合された
zHIと分解されたVIII:C試料とを用いて行なった固相免
疫分離を示す。第1b図より、zHIに対するVIII:CAg活性
を有する80/77kD二重項以外のペプチドも分解試料中に
は存在するように思える。
zHIと分解されたVIII:C試料とを用いて行なった固相免
疫分離を示す。第1b図より、zHIに対するVIII:CAg活性
を有する80/77kD二重項以外のペプチドも分解試料中に
は存在するように思える。
第２図は、７つの抑制抗体のうち７つがVIII:CAg抑制試
験においてzHIの結合を阻止することができることを示
している。zHI抗体は80/77kD二重項に結合するので、他
の抑制抗体もまた、この因子VIII:Cのフラグメントに対
する反応性を有しているはずである。試験は次のように
して行なった。マイクロタイタープレートのウェルをzH
I免疫グロブリンでコーティングした。洗浄した後、因
子VIII:C含有血漿を加え、さらに洗浄した後、抑制免疫
グロブリンをペルオキシダーゼでラベルされたzHI抗体
と共に加えた。抑制免疫グロブリンに代えて緩衝液を加
えることによって、ペルオキダーゼ標識zHIは完全に結
合した。
験においてzHIの結合を阻止することができることを示
している。zHI抗体は80/77kD二重項に結合するので、他
の抑制抗体もまた、この因子VIII:Cのフラグメントに対
する反応性を有しているはずである。試験は次のように
して行なった。マイクロタイタープレートのウェルをzH
I免疫グロブリンでコーティングした。洗浄した後、因
子VIII:C含有血漿を加え、さらに洗浄した後、抑制免疫
グロブリンをペルオキシダーゼでラベルされたzHI抗体
と共に加えた。抑制免疫グロブリンに代えて緩衝液を加
えることによって、ペルオキダーゼ標識zHIは完全に結
合した。
VIII:CAgの親和性クロマトグラフィー セファロースに結合された単一クローン抗体47IgGによ
るAHFの吸着において、VIII:CAgのみが吸着され、凝固
活性因子VIII:Cは吸着されないことがわかった（第１
表）。抗原は因子VIII:C及びVIII:CAgの両方に存在する
ので、これは驚くべきことである。しかしながら、抗原
は凝固不活性VIII:CAgの方が因子VIII:Cよりも接近しや
すいように思われる。
るAHFの吸着において、VIII:CAgのみが吸着され、凝固
活性因子VIII:Cは吸着されないことがわかった（第１
表）。抗原は因子VIII:C及びVIII:CAgの両方に存在する
ので、これは驚くべきことである。しかしながら、抗原
は凝固不活性VIII:CAgの方が因子VIII:Cよりも接近しや
すいように思われる。
第２表には、単一クローン抗体を有する免疫吸着材から
VIII:CAgを溶離させるのに、エチレングリコール（EG）
と共に種々の塩を用いることができることを示してい
る。EGにあまり溶けないMgCl2は、EGの不存在下で溶離
のために用いることができる。
VIII:CAgを溶離させるのに、エチレングリコール（EG）
と共に種々の塩を用いることができることを示してい
る。EGにあまり溶けないMgCl2は、EGの不存在下で溶離
のために用いることができる。
第２表 56 IgGからのエチレングリコール溶離における種々の塩
の効果試料 VIII:CAg単位 AHF（ノルディオクト） 210 流通 140 溶離液:50％EG/飽和NaCl 22 溶離液:50％EG/飽和KCl 19 溶離液:50％EG/2M KI 3.6 溶離液:50％EG/2M CaCl2 2.2 溶離液:2M MgCl2 22 溶離液：50%EG/飽和NaAc 24 セファロースに結合した56IgGを用いると、クリオ上清
からVIII:CAgを精製することが可能である。クリオ上清
は0.4VIII:CAgU/mlを含み、全タンパク質の1ppm未満がV
III:CAgである。第３表には、１つの工程で8000倍の精
製が可能であり、VIII:CAgの比活性がタンパク質1mg当
り61単位である製剤の製造が可能になることを示してい
る。これは現存するAHF製剤の比活性よりも有意に高
い。
の効果試料 VIII:CAg単位 AHF（ノルディオクト） 210 流通 140 溶離液:50％EG/飽和NaCl 22 溶離液:50％EG/飽和KCl 19 溶離液:50％EG/2M KI 3.6 溶離液:50％EG/2M CaCl2 2.2 溶離液:2M MgCl2 22 溶離液：50%EG/飽和NaAc 24 セファロースに結合した56IgGを用いると、クリオ上清
からVIII:CAgを精製することが可能である。クリオ上清
は0.4VIII:CAgU/mlを含み、全タンパク質の1ppm未満がV
III:CAgである。第３表には、１つの工程で8000倍の精
製が可能であり、VIII:CAgの比活性がタンパク質1mg当
り61単位である製剤の製造が可能になることを示してい
る。これは現存するAHF製剤の比活性よりも有意に高
い。
より精製されていないAHFからの高純度（HP）製剤の製
造においては、４％のPEG沈殿が発生し得る（米国特許
第3,652,330号、国際出願WO84/03628号）。この沈殿はV
III:CAgを含んでおり、第３表からわかるように、この
沈殿をVIII:CAg精製のための出発材料として用いること
が可能である。わずか0.25mlの免疫吸着材を用いて、再
溶解された４％PEG沈殿140mlから920VIII:CAg単位を精
製することが可能である。得られる製剤はタンパク質1m
g当たり6900単位の比VIII:CAg活性を有していた。
造においては、４％のPEG沈殿が発生し得る（米国特許
第3,652,330号、国際出願WO84/03628号）。この沈殿はV
III:CAgを含んでおり、第３表からわかるように、この
沈殿をVIII:CAg精製のための出発材料として用いること
が可能である。わずか0.25mlの免疫吸着材を用いて、再
溶解された４％PEG沈殿140mlから920VIII:CAg単位を精
製することが可能である。得られる製剤はタンパク質1m
g当たり6900単位の比VIII:CAg活性を有していた。
セファロースCl2Bに結合されたヒト抑制IgGを用いて、
再溶解された４％PEG沈殿からVIII:CAgを精製すること
も可能である（第３表）。しかしながら、VIII:CAgの収
量は、単一クローン抗体を用いた場合よりも少ない。な
ぜなら、50％エチレングリコールと2.5MNaClとの混合物
は結合したVIII:CAgを定量的に溶離することができない
からである。上述の試験は下記実施例２〜４においてさ
らに詳細に記載されている。
再溶解された４％PEG沈殿からVIII:CAgを精製すること
も可能である（第３表）。しかしながら、VIII:CAgの収
量は、単一クローン抗体を用いた場合よりも少ない。な
ぜなら、50％エチレングリコールと2.5MNaClとの混合物
は結合したVIII:CAgを定量的に溶離することができない
からである。上述の試験は下記実施例２〜４においてさ
らに詳細に記載されている。
この発明はまた、例えば血漿分画のような因子VIII:CAg
含有溶液を、固体粒子に結合された、因子VIII:CAgに特
異的な抗体でを含む免疫吸着材で処理し、結合したVII
I:CAgを緩衝液で溶離して製剤に加工することを特徴と
する、血友病Ａ抑制患者の治療のための因子VIII:CAg製
剤の製造方法にも関する。加工は通常、生理緩衝液への
変更を要する。これは例えば乾燥、透析、ゲルろ過、又
はイオン交換などによって行なうことができる。
含有溶液を、固体粒子に結合された、因子VIII:CAgに特
異的な抗体でを含む免疫吸着材で処理し、結合したVII
I:CAgを緩衝液で溶離して製剤に加工することを特徴と
する、血友病Ａ抑制患者の治療のための因子VIII:CAg製
剤の製造方法にも関する。加工は通常、生理緩衝液への
変更を要する。これは例えば乾燥、透析、ゲルろ過、又
はイオン交換などによって行なうことができる。
ヒト抑制抗体又は単一クローン抗体、好ましくは56IgG
又は47IgGを免疫吸着材として用いることができる。
又は47IgGを免疫吸着材として用いることができる。
VIII:CAgの疎水相互作用クロマトグラフィー及びカチオ
ン交換 VIII:CAgは、例えば血漿のようなVIII:CAg含有溶液か
ら、抗体を利用した親和性クロマトグラフィーを用いる
ことなく精製することができる。すなわち、77/80kD因
子VIII:CAgは極めて塩基性で疎水性であることがわかっ
ている。これらの性質は、疎水相互作用クロマトグラフ
ィー及びカチオン交換による血漿分画からの因子VIII:C
Agの回収に利用することができる。実施例５を参照のこ
と。
ン交換 VIII:CAgは、例えば血漿のようなVIII:CAg含有溶液か
ら、抗体を利用した親和性クロマトグラフィーを用いる
ことなく精製することができる。すなわち、77/80kD因
子VIII:CAgは極めて塩基性で疎水性であることがわかっ
ている。これらの性質は、疎水相互作用クロマトグラフ
ィー及びカチオン交換による血漿分画からの因子VIII:C
Agの回収に利用することができる。実施例５を参照のこ
と。
疎水クロマトグラフィーをこの発明に従って６ないし9.
5のpH下で行なうことができる。もっとも、最も強い結
合は約8.5のpHで得られる。フェニルセファロース（フ
ァルマシア）のような疎水ゲルが用いられる。フェニル
セファロースへの結合は塩を加えることなく起きるが、
NaClを加えることによって有意に改善される。0.3MのNa
Clをクリオ上清に加えることは適当である。なぜなら、
それはアルブミンや免疫グロブリンのような他の血漿タ
ンパク質の後からの回収を妨げないからである。再溶解
されたクリオ沈殿からの４％PEG沈殿を用いる場合に
は、より高いNaCl濃度を採用することができる。結合し
た因子VIII:CAgは、例えば後述する実施例５で述べる条
件下において、緩衝液で溶離することができる。カチオン交換 はこの発明に従って、8.0未満のpH下で行
なうことができる。なぜなら、このpHにおいて結合が最
良になるからである。適当な値はpH5.5である。なぜな
ら、クリオ上清中のpHはVIII:CAgを損なうことなくこの
値にまで下げることができるからである。
5のpH下で行なうことができる。もっとも、最も強い結
合は約8.5のpHで得られる。フェニルセファロース（フ
ァルマシア）のような疎水ゲルが用いられる。フェニル
セファロースへの結合は塩を加えることなく起きるが、
NaClを加えることによって有意に改善される。0.3MのNa
Clをクリオ上清に加えることは適当である。なぜなら、
それはアルブミンや免疫グロブリンのような他の血漿タ
ンパク質の後からの回収を妨げないからである。再溶解
されたクリオ沈殿からの４％PEG沈殿を用いる場合に
は、より高いNaCl濃度を採用することができる。結合し
た因子VIII:CAgは、例えば後述する実施例５で述べる条
件下において、緩衝液で溶離することができる。カチオン交換 はこの発明に従って、8.0未満のpH下で行
なうことができる。なぜなら、このpHにおいて結合が最
良になるからである。適当な値はpH5.5である。なぜな
ら、クリオ上清中のpHはVIII:CAgを損なうことなくこの
値にまで下げることができるからである。
「ワットマンSE53」のような強力なカチオン交換を用
いることができる。結合した因子VIII:CAgは、例えば後
述する実施例５で述べる条件下において緩衝液で溶離す
ることができる。
いることができる。結合した因子VIII:CAgは、例えば後
述する実施例５で述べる条件下において緩衝液で溶離す
ることができる。
これらの方法のいずれによっても、因子VIII:CAgの極め
て選択的な精製を行ない、極めて純粋な溶離物を得るこ
とができる。VIII:CAg活性の濃度をさらに高める場合に
は、上述したように、また後述の実施例５及び６で示す
ように、疎水クロマトグラフィーとカチオン交換とを組
み合わせることができる。この場合には、例えば「CM・
ファースト・フロー・セファロース」のような弱いイオ
ン交換が好ましい。
て選択的な精製を行ない、極めて純粋な溶離物を得るこ
とができる。VIII:CAg活性の濃度をさらに高める場合に
は、上述したように、また後述の実施例５及び６で示す
ように、疎水クロマトグラフィーとカチオン交換とを組
み合わせることができる。この場合には、例えば「CM・
ファースト・フロー・セファロース」のような弱いイオ
ン交換が好ましい。
実施例５及び第４表からわかるように、これら２つの精
製方法はVIII:CAgの種々の性質を利用しており、これら
を組み合わせることによって、クリオ上清から1100倍の
精製を行なうことができる。親和性クロマトグラフィー
と同様、これらの精製方法は、血漿分画のような全ての
VIII:CAg含有溶液に適用することができる。クリオ上清
及び再溶解されたクリオ沈殿の４％PEGからの精製を示
す第４表を参照のこと。
製方法はVIII:CAgの種々の性質を利用しており、これら
を組み合わせることによって、クリオ上清から1100倍の
精製を行なうことができる。親和性クロマトグラフィー
と同様、これらの精製方法は、血漿分画のような全ての
VIII:CAg含有溶液に適用することができる。クリオ上清
及び再溶解されたクリオ沈殿の４％PEGからの精製を示
す第４表を参照のこと。
この発明のVIII:CAgの効果 生体外での凝固抑制実験により、この発明の精製VIII:C
Agは、生体内でもまた効果を有することが示された。凝
固抑制試験においては、抑制IgGの正常血漿に対する凝
固抑制効果が測定される。50％の抑制を与える希釈率は
ベセスダ単位で表わされる（シー・ケイ・カスパーら、
Thromb.Diath.Haemorr.34,860,1972）。６人の異なる抑
制患者から得た約３ベセスダ単位の抑制IgGを有する正
常血漿をインキュベートしたもの、及び対照として上述
したzHIIgGを有するものの比較実験の結果が第５表に示
されている。この実験は、100VIII:CAgU/mlを有するこ
の発明の製剤の存在下で又は不存在下で行なった。第５
表より、この発明の精製VIII:CAgは、VIII:CAgを含まな
い試験結果に比較して顕著な抑制抗体阻害効果を示すこ
とがわかる。すなわち、全ての抗体のベセスダ力価は25
％以上減少した。このことは、試験した７つの抗体全て
の抑制効果は、因子VIII:Cの80/77kDに対する反応性の
故であることを示している。
Agは、生体内でもまた効果を有することが示された。凝
固抑制試験においては、抑制IgGの正常血漿に対する凝
固抑制効果が測定される。50％の抑制を与える希釈率は
ベセスダ単位で表わされる（シー・ケイ・カスパーら、
Thromb.Diath.Haemorr.34,860,1972）。６人の異なる抑
制患者から得た約３ベセスダ単位の抑制IgGを有する正
常血漿をインキュベートしたもの、及び対照として上述
したzHIIgGを有するものの比較実験の結果が第５表に示
されている。この実験は、100VIII:CAgU/mlを有するこ
の発明の製剤の存在下で又は不存在下で行なった。第５
表より、この発明の精製VIII:CAgは、VIII:CAgを含まな
い試験結果に比較して顕著な抑制抗体阻害効果を示すこ
とがわかる。すなわち、全ての抗体のベセスダ力価は25
％以上減少した。このことは、試験した７つの抗体全て
の抑制効果は、因子VIII:Cの80/77kDに対する反応性の
故であることを示している。
上記７つの抗体は、1984年10月30日にコペンハーゲンの
スタテンス・エルミンスチツット（州立血清研究所）に
50-KR-306の番号で寄託された。
スタテンス・エルミンスチツット（州立血清研究所）に
50-KR-306の番号で寄託された。
免疫吸着材としてのVIII:CAgの使用 因子IX抑制患者の血液を、因子IXが結合されたカラムに
流通させることによって、この血液から因子IXを除去す
ることが可能である。（シー・フレイバーグハウス、Th
romb.Haemostas.50,108,1983）。
流通させることによって、この血液から因子IXを除去す
ることが可能である。（シー・フレイバーグハウス、Th
romb.Haemostas.50,108,1983）。
一方、同様にして因子VIII抑制抗体を特異的に除去する
ことはできない。これはいくつかの理由に基づく。
ことはできない。これはいくつかの理由に基づく。
１）AHF製剤は因子VIII:RAgをも含むので、AHF製剤中の
因子VIIIの分子量は通常1,000ないし2,000kDである。従
って、因子VIIIはゲルに非常に弱く結合する。
因子VIIIの分子量は通常1,000ないし2,000kDである。従
って、因子VIIIはゲルに非常に弱く結合する。
２）因子VIII複合体を結合する場合には、VIII:CAgはVI
II:RAg又は因子VIIIの他の部分を介して結合することが
できる。従って、VIII:CAgは使用中に結合ゲルから容易
に洗い流されてしまう。
II:RAg又は因子VIIIの他の部分を介して結合することが
できる。従って、VIII:CAgは使用中に結合ゲルから容易
に洗い流されてしまう。
これらの条件はここで記載した精製されたVIII:CAgには
適用されない。
適用されない。
従って、この発明のVIII:CAgはセファロースゲルのよう
な固体マトリックスに適当に結合することができ、例え
ば因子VIII抑制患者の体外での特異的吸着処置などにお
いて免疫吸着材として適当に用いることができる。
な固体マトリックスに適当に結合することができ、例え
ば因子VIII抑制患者の体外での特異的吸着処置などにお
いて免疫吸着材として適当に用いることができる。
上述した種々の方法によるこの発明の製剤の製造を次の
実施例でさらに例示する。結果のうちのいくつかは既に
記載した表中に示されている。
実施例でさらに例示する。結果のうちのいくつかは既に
記載した表中に示されている。
実施例１ 5mgの47IgGを、0.5gのCNBrで活性化したセファロース4B
5mlに結合した。1Mグリシン（pH8.5）でブロックし、溶
離緩衝液サイクラス（cyclus）で洗った後、400VIII:CA
gU/mlを有するAHF（ノルディオクト）100mlと共に一
夜インキュベートした。ゲルをカラム上で20mlの緩衝液
Ａ（20mMイミダゾール、10mMCaCl2,0.15MNaCl,0.02％Na
N3、pH7.35）及び0.5MNaClを有する100mlの緩衝液Ａで
洗った。ゲルは0.5MNaClを含む50％EG中の緩衝液Ａで溶
離した。6mlの溶離物は7200単位のVIII:CAgを含んでい
た。第３図は、溶離された分画のSDS-PAGEを示す。色強
度による評価によると、溶離物中のタンパク質の25％以
上が80/77kDタンパク質であった。
5mlに結合した。1Mグリシン（pH8.5）でブロックし、溶
離緩衝液サイクラス（cyclus）で洗った後、400VIII:CA
gU/mlを有するAHF（ノルディオクト）100mlと共に一
夜インキュベートした。ゲルをカラム上で20mlの緩衝液
Ａ（20mMイミダゾール、10mMCaCl2,0.15MNaCl,0.02％Na
N3、pH7.35）及び0.5MNaClを有する100mlの緩衝液Ａで
洗った。ゲルは0.5MNaClを含む50％EG中の緩衝液Ａで溶
離した。6mlの溶離物は7200単位のVIII:CAgを含んでい
た。第３図は、溶離された分画のSDS-PAGEを示す。色強
度による評価によると、溶離物中のタンパク質の25％以
上が80/77kDタンパク質であった。
実施例２ 0.5mgの56IgGを0.5mlのセファロース2B/Clに結合した。
ブロッキングを行ない、溶離緩衝液サイクラスで洗った
後、200VIII:CAgを有するクリオ上清（クリオ沈殿後の
プラズマ）500mlと共にゲルを一夜インキュベートし
た。2mlの使い捨てシリンジから作られたカラムにイン
キュベート混合物を通すことによってクリオ上清から免
疫吸着材を分離した。流通物は100VIII:CAg単位を含ん
でいた。2mlの緩衝液Ｂ（50mMイミダゾール、0.15MNaC
l,0.02％NaN3、pH7.35）と、2.5MNaClを含む緩衝液B2.5
mlで洗った後、2.5MNaClを50％EG中に含むものを含む緩
衝液B2.5mlで溶離した。溶離物は39VIII:CAg単位（比活
性61U/ml）、及び0.5単位のVIII:C前凝固活性を有して
いた。上記第３表参照のこと。
ブロッキングを行ない、溶離緩衝液サイクラスで洗った
後、200VIII:CAgを有するクリオ上清（クリオ沈殿後の
プラズマ）500mlと共にゲルを一夜インキュベートし
た。2mlの使い捨てシリンジから作られたカラムにイン
キュベート混合物を通すことによってクリオ上清から免
疫吸着材を分離した。流通物は100VIII:CAg単位を含ん
でいた。2mlの緩衝液Ｂ（50mMイミダゾール、0.15MNaC
l,0.02％NaN3、pH7.35）と、2.5MNaClを含む緩衝液B2.5
mlで洗った後、2.5MNaClを50％EG中に含むものを含む緩
衝液B2.5mlで溶離した。溶離物は39VIII:CAg単位（比活
性61U/ml）、及び0.5単位のVIII:C前凝固活性を有して
いた。上記第３表参照のこと。
実施例３ 再溶解したクリオ沈殿を、国際出願WO84/03628に記載さ
れたように、Al2O3に吸着させ、４％PEGで沈殿させた。
沈殿を、0.5MNaClと10mMEDTAとを含む1/4低温体積（cry
ovolume）の緩衝液で45分間かきまぜることによって再
溶解した。遠心によって濁りを除去し、1,500VIII:CAg
単位（比活性0.29U/mg）を有する再溶解した沈殿を、5m
gの56IgG/mlが結合された「セファロース4B」0.25mlと
共に一夜培養した。実施例２に記載したようにゲルを集
め、流通物は340VIII:CAg単位を含んでいた。ゲルを3ml
の緩衝液Ｂ及び2.5MNaClを含む2mlの緩衝液Ｂで洗っ
た。50％エチレングリコール中に2.5MNaClを含む緩衝液
B1.1mlで溶離を行なった。溶離物は920VIII:CAg単位
（比活性830U/ml）、及び0.5単位のVIII:C前凝固活性を
有していた。上記第３表参照のこと。
れたように、Al2O3に吸着させ、４％PEGで沈殿させた。
沈殿を、0.5MNaClと10mMEDTAとを含む1/4低温体積（cry
ovolume）の緩衝液で45分間かきまぜることによって再
溶解した。遠心によって濁りを除去し、1,500VIII:CAg
単位（比活性0.29U/mg）を有する再溶解した沈殿を、5m
gの56IgG/mlが結合された「セファロース4B」0.25mlと
共に一夜培養した。実施例２に記載したようにゲルを集
め、流通物は340VIII:CAg単位を含んでいた。ゲルを3ml
の緩衝液Ｂ及び2.5MNaClを含む2mlの緩衝液Ｂで洗っ
た。50％エチレングリコール中に2.5MNaClを含む緩衝液
B1.1mlで溶離を行なった。溶離物は920VIII:CAg単位
（比活性830U/ml）、及び0.5単位のVIII:C前凝固活性を
有していた。上記第３表参照のこと。
実施例４ AHF過程から得られた、1000VIII:CAgを含む４％PEG沈殿
を、0.5MNaClと10mMEDTAをと含む緩衝液Ｂに再溶解し
た。再溶解後、10mgのヒト抑制IgG/mlが結合された「セ
ファロースC12B」ゲル0.25mlと共に一夜培養した。実施
例２に記載したようにゲルを回収し、流通物は340VIII:
CAg単位を有していた。実施例３に記載したようにゲル
を洗って溶離した。溶離物は68VIII:CAg単位を含み、比
活性は830U/mgであった。上記第３表参照のこと。
を、0.5MNaClと10mMEDTAをと含む緩衝液Ｂに再溶解し
た。再溶解後、10mgのヒト抑制IgG/mlが結合された「セ
ファロースC12B」ゲル0.25mlと共に一夜培養した。実施
例２に記載したようにゲルを回収し、流通物は340VIII:
CAg単位を有していた。実施例３に記載したようにゲル
を洗って溶離した。溶離物は68VIII:CAg単位を含み、比
活性は830U/mgであった。上記第３表参照のこと。
実施例５（第４表参照のこと） 1100VIII:CAg単位を含む2.6lのクリオ上清を5mMのエチ
レングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）
‐N,N′‐四酢酸（EGTA）/0.3MNaClと混合し、pHを8.5
に調整した。180mlのフェニルセファロース（ファルマ
シア）を加え、１時間インキュベートした。ゲルをカラ
ム上に集め、400mlの5mMイミダゾール/0.45MNaCl、pH7.
4で洗い、250mlの50％エチレングリコール/5mMイミダゾ
ール/pH7.4で溶離した。溶離物は440単位のVIII:CAgを
含んでおり、比活性は0.21U/mgタンパク質であった。
レングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）
‐N,N′‐四酢酸（EGTA）/0.3MNaClと混合し、pHを8.5
に調整した。180mlのフェニルセファロース（ファルマ
シア）を加え、１時間インキュベートした。ゲルをカラ
ム上に集め、400mlの5mMイミダゾール/0.45MNaCl、pH7.
4で洗い、250mlの50％エチレングリコール/5mMイミダゾ
ール/pH7.4で溶離した。溶離物は440単位のVIII:CAgを
含んでおり、比活性は0.21U/mgタンパク質であった。
溶離物のpHを5.5に調整し、「ワットマンSE53」型の
カチオン交換体25mlを加え、30分間インキュベートし
た。イオン交換体をカラム上に集め、50mlの50mMリン酸
塩/5mMEGTA/pH7.4で洗った。VIII:CAgは35mlの1MNaCl/5
0mMリン酸塩/5mMEGTA/pH7.4で溶離した。溶離物は300単
位のVIII:CAgを含んでおり、比活性は8.0U/mgタンパク
質であった。
カチオン交換体25mlを加え、30分間インキュベートし
た。イオン交換体をカラム上に集め、50mlの50mMリン酸
塩/5mMEGTA/pH7.4で洗った。VIII:CAgは35mlの1MNaCl/5
0mMリン酸塩/5mMEGTA/pH7.4で溶離した。溶離物は300単
位のVIII:CAgを含んでおり、比活性は8.0U/mgタンパク
質であった。
実施例６ 国際出願WO84/03628の記載された方法に従ったAHFから
（300lの血漿から）の４％PEG500gを3.7lの50mMリン酸
塩/0.75MNaCl/5mMEDTA/pH8.5に再溶解し、pHを0.5MNaOH
で8.5に調整し、ろ紙を通してろ過すると、溶液は17500
VIII:CAg単位と19,000mgのタンパク質とを含んでいた。
再溶解した沈殿を250mlのフェニルセファロースゲルを
含むカラムに流速3.7l/hで流通させた。フェニルセファ
ロースを1.3lの25mMリン酸塩/5％エチレングリコール/p
H7.4で、流速3.7l/hで洗った。13,500VIII:CAg単位を有
する2000mgのタンパク質（比活性6.8U/mgタンパク質）
が1.3lの25mMリン酸塩/65％エチレングリコール/pH7.4
中に溶離した。溶離物を終濃度50mMのNaClと混合し、pH
を7.0に調整した。溶離物を、6.25mlの「CMファースト
・フロー・セファロース」（ファルマシア）が充填され
たカチオン交換カラムに流速500ml/hで通した。カラム
を60mlの10mMリン酸塩/50mMNaCl/pH7.3で流速500ml/hで
洗った。4.9mgのタンパク質（比活性2,200U/mg）を有す
る10,800VIII:CAg単位が、18mlの5mMリン酸/0.5MNaCl/7
1/2％サッカロース、pH7.3（600VIII:CAgU/ml）中に溶
離された。
（300lの血漿から）の４％PEG500gを3.7lの50mMリン酸
塩/0.75MNaCl/5mMEDTA/pH8.5に再溶解し、pHを0.5MNaOH
で8.5に調整し、ろ紙を通してろ過すると、溶液は17500
VIII:CAg単位と19,000mgのタンパク質とを含んでいた。
再溶解した沈殿を250mlのフェニルセファロースゲルを
含むカラムに流速3.7l/hで流通させた。フェニルセファ
ロースを1.3lの25mMリン酸塩/5％エチレングリコール/p
H7.4で、流速3.7l/hで洗った。13,500VIII:CAg単位を有
する2000mgのタンパク質（比活性6.8U/mgタンパク質）
が1.3lの25mMリン酸塩/65％エチレングリコール/pH7.4
中に溶離した。溶離物を終濃度50mMのNaClと混合し、pH
を7.0に調整した。溶離物を、6.25mlの「CMファースト
・フロー・セファロース」（ファルマシア）が充填され
たカチオン交換カラムに流速500ml/hで通した。カラム
を60mlの10mMリン酸塩/50mMNaCl/pH7.3で流速500ml/hで
洗った。4.9mgのタンパク質（比活性2,200U/mg）を有す
る10,800VIII:CAg単位が、18mlの5mMリン酸/0.5MNaCl/7
1/2％サッカロース、pH7.3（600VIII:CAgU/ml）中に溶
離された。
溶離物を濃度0.5％までヒトアルブミンと混合し、滅菌
ろ過し、3mlづつを含む３つのビンに分注した。凍結乾
燥後、製剤を68℃で72時間加熱処理した。それぞれのビ
ンを18mgの無菌H2O中に溶解し、これは190VIII:CAgU/ml
を含んでいた。
ろ過し、3mlづつを含む３つのビンに分注した。凍結乾
燥後、製剤を68℃で72時間加熱処理した。それぞれのビ
ンを18mgの無菌H2O中に溶解し、これは190VIII:CAgU/ml
を含んでいた。
実施例７ CMイオン交換体を溶離するのに50mMNaHCO3、0.5MNaCl、
pH7.3を用いることを除き、実施例６に従ってVIII:CAg
を製造した。溶離物のpHを8.5に調整し、溶離物3ml中の
4800VIII:CAgを、CNBrで活性化された1mlの「セファロ
ース4B」に結合した。結合ゲルは1MグリシンpH8.5でブ
ロックした。
pH7.3を用いることを除き、実施例６に従ってVIII:CAg
を製造した。溶離物のpHを8.5に調整し、溶離物3ml中の
4800VIII:CAgを、CNBrで活性化された1mlの「セファロ
ース4B」に結合した。結合ゲルは1MグリシンpH8.5でブ
ロックした。
200μｌのVIII:CAgセファロース4Bゲルを、因子VIII抑
制患者からの血漿6.4mlと共に37℃で２時間インキュベ
ートした。インキュベーション前には、血漿は22BU/ml
の抑制抗体を含んでいた。インキュベーション後、抗体
の量は1.8BU/mlに減少していた。3MNH4SCNで再活性化し
た後、200μｌのVII:CAgセファロース4Bゲルを因子VIII
抑制患者からの血漿6.4mlと共に37℃で２時間再びイン
キュベートした。このインキュベーションにおいて、抑
制力価は3.5BU/mlに減少した。
制患者からの血漿6.4mlと共に37℃で２時間インキュベ
ートした。インキュベーション前には、血漿は22BU/ml
の抑制抗体を含んでいた。インキュベーション後、抗体
の量は1.8BU/mlに減少していた。3MNH4SCNで再活性化し
た後、200μｌのVII:CAgセファロース4Bゲルを因子VIII
抑制患者からの血漿6.4mlと共に37℃で２時間再びイン
キュベートした。このインキュベーションにおいて、抑
制力価は3.5BU/mlに減少した。
Claims (12)
- 【請求項１】少なくとも0.5U/mgタンパク質の特異的因
子VIII:CAg活性を有するタンパク質又はペプチドを含
む、血友病Ａ抑制患者の治療のための製剤において、因
子VIII:CAg活性と因子VIII:C前凝固活性との比が5:1よ
りも大きいことを特徴とする製剤。 - 【請求項２】因子VIII:C前凝固活性を実質的に含まない
ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の製剤。 - 【請求項３】他の凝固因子を実質的に含まないことを特
徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の製剤。 - 【請求項４】因子VIII:CAg活性を有するタンパク質は、
SDS-PAGEにより決定される分子量が80/77kDまたは70/67
kDである因子VIII:C分子の部分であることを特徴とする
請求の範囲第１項又は第２項記載の製剤。 - 【請求項５】因子VIII:CAg活性を有するタンパク質は、
抗原部位を含む、生物合成的につくられたペプチド配列
であって、因子VIII:Cとは異なるものであることを特徴
とする請求の範囲第１項又は第２項記載の製剤。 - 【請求項６】因子VIII:CAg活性は少なくとも50U/mlであ
る請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の製
剤。 - 【請求項７】因子VIII:CAgに対して特異的な、固体粒子
に結合された抗体を含む免疫吸着材で因子VIII:CAg含有
溶液を処理し、結合されたVIII:CAgを緩衝液で溶離し、
製剤に加工することを特徴とする、少なくとも0.5U/mg
タンパク質の特異的因子VIII:CAg活性を有するタンパク
質又はペプチドを含む、血友病Ａ抑制患者の治療のため
の製剤であって、因子VIII:CAg活性と因子VIII:C前凝固
活性との比が5:1よりも大きい製剤の製造方法。 - 【請求項８】免疫吸着材がヒト抑制抗体又は単一クロー
ン抗体を含有することを特徴とする請求の範囲第７項記
載の方法。 - 【請求項９】因子VIII:CAg含有溶液をカチオン交換クロ
マトグラフィーに架け、その後製剤に加工することを特
徴とする、少なくとも0.5U/mgタンパク質の特異的因子V
III:CAg活性を有するタンパク質又はペプチドを含む、
血友病Ａ抑制患者の治療のための製剤であって、因子VI
II:CAg活性と因子VIII:C前凝固活性との比が5:1よりも
大きい製剤の製造方法。 - 【請求項１０】因子VIII:CAg含有溶液が、疎水ゲル上で
のクロマトグラフィーにより予め精製されていることを
特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】因子VIII:CAg含有溶液としてクリオ上清
血漿分画を用いることを特徴とする請求の範囲第７項な
いし第10項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】再溶解されたクリオ沈殿を２ないし６重
量％のPEGで沈殿させて得られる血漿分画を因子VIII:CA
含有溶液として用いることを特徴とする請求の範囲第７
項ないし第10項のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK525384A DK525384D0 (da) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| DK5253/84 | 1984-11-05 | ||
| PCT/DK1985/000105 WO1986002838A1 (en) | 1984-11-05 | 1985-11-05 | A preparation for the treatment of hemophilia a inhibitor patients and a process for producing such a preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501006A JPS62501006A (ja) | 1987-04-23 |
| JPH0713026B2 true JPH0713026B2 (ja) | 1995-02-15 |
Family
ID=8140859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60505194A Expired - Fee Related JPH0713026B2 (ja) | 1984-11-05 | 1985-11-05 | 血友病ａ抑制患者の治療のための製剤及び該製剤の製造方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4831119A (ja) |
| EP (1) | EP0201574B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0713026B2 (ja) |
| AT (1) | ATE69727T1 (ja) |
| AU (1) | AU599310B2 (ja) |
| CA (1) | CA1269042A (ja) |
| DE (1) | DE3584775D1 (ja) |
| DK (1) | DK525384D0 (ja) |
| ES (1) | ES8701230A1 (ja) |
| IL (1) | IL76929A (ja) |
| WO (1) | WO1986002838A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4508709A (en) * | 1983-12-05 | 1985-04-02 | Armour Pharmaceutical Company | Process for purifying factor VIII:C |
| EP0251843A1 (fr) * | 1986-06-06 | 1988-01-07 | Transgene S.A. | Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères |
| AU2473388A (en) * | 1987-11-16 | 1989-06-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Treatment of factor viii inhibitors |
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