DK173863B1 - Immunosorbent - Google Patents

Description

DK 173863 B1

Den foreliggende opfindelsen angår et immunosorbent, der er egnet , til at fjerne FVIII inhibitor antistoffer i blod.

Hæmofili A er en medfødt sygdom, som skyldes mangel på koagulations-5 faktor VIII:C. Denne faktor findes i blodplasma og kan oprenses

delvis fra blod. Præparater, der indeholder denne faktor (AHF), kan indgives til hæmofili A patienter, således at patienternes blod bliver i stand til at koagulere. Fremstilling of denne type præparater er f.eks. beskrevet i US patentskrift nr. 3.652.530 og 10 ansøgning nr. WO 84/03628. I disse præparater udgør Faktor VIII:C

proteinet typisk 0,1% af den totale proteinmængde. Faktor VIII:C med højere renhed kan opnås ved affinitetskromatografi (Zimmerman et al., US patentskrift nr. 4.361.509, Fass et al. Blood 59, 394, 1982).

15

Faktor VIII:C proteinet er endnu ikke fuldt ud karakteriseret, men en del of strukturen kendes. (L.W. Hoyer, Blood 58, 1, 1981; M.

Weinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78, 5137, 1981; G. Kuo et al., Thronib. Haemostas. 50, 262, 1983). Molekylvægten er ca. 300 20 kD.

Det er kendt, at 10-20% af hæmofili A patienterne ikke blot mangler Faktor VIII:C, men også danner antistoffer mod Faktor VIII:C. Denne type patienter kaldes inhibitorpatienter, og antistofferne hos disse 25 patienter kaldes inhibitor-antistoffer, idet de inhiberer koagulationsaktiviteten of Faktor VIII:C (H.R. Roberts & R.

Cromartie, Progress in Clinical and Biological Research 150, 1, 1984). Forekomsten of disse antistoffer medfører, at indgivelse of AHF-præparatet er virkningsløs, idet Faktor VIII:C neutraliseres, og 30 AHF indgivelse inducerer forhøjet antistofniveau.

Inhibitor-antistoffer kan bruges som reagens i immunoassays til at måle Faktor VIII:C antigen (VIIIsCAg) (B. Dinesen, C. Feddersen, Thromb.Res. 31, 707, 1983, O. Nordfang et al., Thromb. Haemostas.

35 50, 111, 1983). En VIII:CAg enhed defineres som indholdet i 1 ml normal human plasma.

DK 173863 B1 2

Inhibitor patienter er hidtil søgt behandlet: a) Ved uspecifik behandling med aktiverede prothrombin-komplex-præparater (FEIBA®, Autoplex®) . Disse præparater indeholder 5 en ukendt komponent (måske Faktor Vila, se U. Hedner og W. Kisiel, J. Clin. Invest. TI, 1837, 1983), som kan få plasma til at koagulere pa trods of høje inhibitormængder. Aktiverede prothrombin-komplex-præparater kan dog ikke hjælpe alle inhibitorpatienter, og patienterne bliver ikke kureret for deres inhibitor. Desuden er der 10 stor fare for blodpropper ved anvendelse of denne type præparater.

b) Det har vist sig, at inhibitordannelsen kan "udmattes" ved indgivelse of meget store doser AHF (100-200 enh./kg dagligt).

Derved er det muligt at inducere immuntolerance over for Faktor VIII

15 (H.H. Brackman & J. Gormsen, Lancet, p. 933, 1977). Efter denne type behandling kan patienten behandles med AHF præparater som andre bløderpatienter. Høj dosis AHF behandling er imidlertid også uspecifik, idet der indgives meget store doser uvedkommende protein, og patienterne kan ikke udnytte koagulationsaktiviteten i AHF 20 præparater under behandlingen.

I starten of behandlingsfasen stiger inhibitorniveauet, hvorefter det med tiden reduceres til 0. Blødninger kan ikke forhindres med AHF under behandlingen, men blødninger kan til dels stoppes med de ovennævnte FEIBA® (factor eight inhibitor bypassing activity) 25 præparater.

Denne behandling er meget dyr (typisk 600.000 US$ pr. patient, se S. Stenbjerg et al., Thromb. Res. 34, 533, 1984) og har af denne grund ringe udbredelse.

30 Opfindelsen hviler på den overraskende erkendelse, at en komponent fra plasmafraktioner, som har Faktor VIII:CAg reaktivitet, og kun ringe eller ingen Faktor VIII:C koagulationsaktivitet, er reaktiv overfor 7 of 7 antistoffer fra inhibitorpatienter.

DK 173863 B1 4 I en udførelsesform af opfindelsen er immunosorbenten kendetegnet ved, at proteinet med FVIII:CAg aktivitet er 80/77 kD delen af FVIII:C.

5 Af Kuo et al. fremgår det, at 80/77 kD fragmentet udviser VIII:CAg aktivitet over for et bestemt inhibitorantistof (zHI) og ingen koagulationsaktivitet. Derfra kunne man dog ikke forvente, at fragmentet, som påvist nedenfor, er i stand til at blokere inhibitionsaktiviteten hos 7 of 7 inhibitorantistoffer.

10

Udvindingen of 80/77 kD fragmentet med VIII:CAg-reaktivitet fra plasmafraktioner kan ske på flere måder, eksempelvis ved affinitetskromatografi, hydrofob interaktion kromatografi eller ved kationbytning. Som udgangsmateriale kan principielt anvendes en 15 hvilken som helst VIII:CAg-holdig fraktion, men der anvendes hensigtsmæssigt en kryosupematant eller en plasmaf rakt ion opnået ved fældning af genopløst kryopræcipitat med 2-6 vægt-%, fortrinsvis ca. 4 vægt-% PEG. Det sidste er særligt hensigtsmæssigt, fordi dette bundfald normalt ikke bruges under den videre plasmafraktionering.

20

Opfindelsen er ikke begrænset til anvendelsen of fragmenterne 80/77 kD og 70/67 kD of Faktor VIII :C. På Fig. Ib nedenfor er det vist, at også mindre fragmenter af Faktor VIII:C er reaktive over for inhibitorantistoffer. Ligeledes kan det forudses, at andre 25 inhibitorantistoffer kan have reaktivitet mod andre dele of Faktor VIII:C molekylet. F.eks. indeholder Faktor VIII:C isoleret fra blodplasma et fragment med en molekylvægt pa 92 kD {Zimmerman et al., US patentskrift nr. 4.361.509).

I det omfang sådanne fragmenter er i stand til at blokere 30 inhibitorantistoffer, som vist i Tabel 5, vil de være omfattet of opfindelsen.

Opfindelsen er heller ikke begrænset til at anvende fra plasma isolerede Faktor VIII:C fragmenter. Ud fra DNA sekvensen of Faktor 35 VIII:C vil det være muligt at fremstille delfragmenter af FVIII:C genet. Disse delfragmenter vil kunne indsættes i egnede vektorer 5 DK 173863 B1 (f.eks. plasmider eller vira). Disse vektorer kan indsættes i egnede værtsceller (f.eks. E.coli, gær, CHO, COS eller andre mammale celler), således at cellerne er i stand til at producere delfragmenter of Faktor VIII:C. Det kan forudses, at sadanne 5 fragmenter er i stand til at blokere inhibitorantistoffer som vist i Tabel 5, uden at de indeholder væsentlige mængder af VIII:C koagulationsaktivitet, idet de jo har samme molekylstruktur som de tilsvarende peptidsekvenser fra blod-plasma. De vil derfor kunne anvendes til fremstilling af immunosorbenten ifølge opfindelsen.

10

Reaktivitet of antistoffer

Flere forfattere (H.P. Muller et al., Blood 5J3, 1000, 1981; B. Sola et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79, 1983, 1982) har beskrevet 15 fremstilling of monoklonale antistoffer mod Faktor VIII:C. Disse antistoffer kan opnås efter immunisering of mus med Faktor VIII, ved at fusionere miltceller med tumorceller, som beskrevet af K6hler & Milstein (Nature 256, 495, 1975). Ved brug af denne teknik er der fremstillet monoklonale antistoffer mod Faktor VIII:C, benævnt 20 henholdsvis 42 IgG, 47 IgG og 56 IgG.

Fig. la viser en solid phase immunisolation med monoklonale antistoffer. Plastikkugler blev coated med antistof mod muse immunglobulin/monoklonalt antistof. Efter vask blev kuglerne 25 inkuberet med 125I-mærket Faktor VIII:C. Faktor VIII:C fremstillet som beskrevet of E. Tuddenham et al-, J. Lab. Clin. Med. 93, 40, 1979. Efter vask blev kuglerne ekstraheret med SDS-prøvebuffer, og eluaterne blev kørt på SDS-gel. Figuren viser autoradiogram af SDS-gel: 30 Spor 1: Tracer. (125l-mærket Faktor VIII:C); Spor 2: normal muse IgG; Spor 3: 42 IgG; Spor 4: 47 IgG; Spor 5: 56 IgG.

Det fremgår of Fig. la, at disse antistoffer binder 80/77 kD delen 35 of Faktor VIII:C (spor 3, 4, 5). Dette er den samme del, som bindes of et humant inhibitorantistof, zHI.

___________ ηηΛ i ni i r-\T^ DK 173863 B1 6

Fig. Ib viser en solid phase immunisolation udført som forsøg i Fig. la mod zHI bundet til kugle, og mod en nedbrudt VIII:C prøve. Det fremgår of Fig. Ib, at der i en nedbrudt prøve kan fremkomme andre 5 peptider end 80/77 kD dubletten med VIII:CAg aktivitet overfor zHI (70/67 kD og andre nedbrydningsprodukter).

Fig. 2 viser, at 7 of 7 inhibitorantistoffer er i stand til at blokere bindingen of zHI i VIII:CAg inhibitionsassay. Da zHI 10 antistoffet binder 80/77 kD dubletten, må de andre inhibitorantistoffer også have reaktivitet imod dette fragment of Faktor VIII:C. Assayet gennemførtes på følgende måde: Brønde i mikrotiterplader blev coated med zHI immunglobulin. Efter vask blev plasma indeholdende Faktor VIII:C tilsat, og efter endnu en vask 15 blev inhibitor-immunglobulin tilsat sammen med peroxidasemærket zHI antistof. 100% binding of peroxidasemærket zHI opnås ved at tilsætte buffer i stedet for inhibitor-immunglobulin.

Affinitetskromatografi of VIII:CAg 20

Ved absorption of AHF mod monoklonalt 47 IgG koblet til Sepharose har det vist sig, at der kun adsorberes VIII:CAg og ikke koagulationsaktivt Faktor VIII:C (Tabel 1). Dette er overraskende, " idet antigenet er til stede både på Faktor VIII:C og VIII:CAg.

25 Imidlertid synes antigenet mere tilgængeligt på det koagulationsinaktive VIII:CAg end på Faktor VIII:C.

TABEL 1

Specifik VIII:CAg adsorption til 47 IgG 30 koblet til Sepharose AHF ikke-bundet EG/NaCl eluat

Immunosorbent VIII:C VIIIiCAq VIII:C VIII;CAq_VIH;CVIII;CAq 47 IgG/Cl 2B 88 270 90 90 0,32 138 35 Kontrol Cl 2B 88 270 77 248 0,14 0,09 DK 173863 B1 7

Tabel 2 viser, at en række salte kan anvendes sammen med ethylenglycol (EG) til eluering af FVIII:CAg fra immunosorbent med monoklonalt antistof. MgCl2, som er tungtopløseligt i EG, kan bruges 5 til eluering uden tilstedeværelse of EG.

TABEL 2

Effekt af forskellige salte på ethylenglycol eluering

fra 56 IgG

10 -----------------------------------------------------

Prøve VIII:CAg enh.

AHF (Nordiocto® 210

Gennemløb 140 15 eluat, 50% EG/mættet NaCl 22 , 50% EG/mættet KCl 19 , 50% EG/2 M Kl 3,6 , 50% EG/2 M CaCl2 2,2 , 2M MgCl2 22 20 - , 50% EG/mættet NaAc 24

Med 56 IgG koblet til sepharose er det muligt at oprense VIII:CAg fra kryosupernatant. Kryosupernatant indeholder 0,4 VIII:CAg 25 enh./ml, og mindre end 1 ppm of proteinet er VIII:CAg. Tabel 3 viser, at der i et trin kan opnås en 8.000 gange oprensning, således at der kan fremstilles et præparat med en specifik VIII:CAg aktivitet pa 61 enh. VIII:CAg/mg protein. Dette er en betydeligt højere specifik aktivitet end der findes i eksisterende AHF-30 præparater.

Ved fremstilling of high purity (HP) præparater ud fra mindre oprenset AHF kan der bl.a. fremkomme et 4% PEG-bundfald (US 3.652.330, W0 84/03628). Dette bundfald indeholder VIII:CAg, og som 35 det fremgår of Tabel 3, er det muligt at bruge dette bundfald som DK 173863 B1 8 udgangsmateriale til VIII:CAg oprensning. Med blot 0,25 ml immunosorbent er det muligt at oprense 920 VIII:CAg enheder fra 140 ml genopløst 4% PEG bundfald. Det opnåede præparat har en specifik VIII:CAg aktivitet pa 6.900 enh. VIII:CAg/mg protein.

5

Med humant inhibitor IgG koblet til Sepharose Cl 2B er det også muligt at oprense VIII:CAg fra genopløst 4% PEG bundfald (Tabel 3). Udbyttet of VIII:CAg er imidlertid mindre end ved anvendelsen of monoklonalt antistof, idet 50% ethylenglycol med 2,5M NaCl ikke er i 10 stand til kvantitativt at eluere det bundne VIII:CAg. Forsøgene er nærmere beskrevet i eksempel 2-4 nedenfor.

TABEL 3

Oprensning of VIII:CAg fra forskellige udgangsmaterialer 15 ved hjælp of 56 IgG og humant inhibitor IgG

Fraktion VIII:CAg protein spec.akt.

_enh. _mg, Ε28ο_enh./mg (Eks. 2) 20 Kryosup, 500 ml 200 30.000 0,007

Kryosup-gennemløb 500 ml 100 30.000 0,003 EG/NaCl eluat fra 5.6 IgG, 2 ml_39_0,64_61 (EkS. 3) 25 4% PEG bdf., 140 ml 1500 5.200 0,29 4% PEG bdf. gennemløb, 140 ml 340 5.200 0,07 EG/NaCl eluat fra 56 IgG, 1 ml_920_0,131 6900_ 30 (Eks. 4) 4% PEG bdf., 110 ml 1000 3.400 0,29 4% PEG bdf. gennemløb, 110 ml 340 3.400 0,10 EG/NaCl eluat fra human 35 inhibitor, 1 ml_ 68_0,082 830_ 9 DK 173863 B1

Faktor VIII:CAg kan fremstilles ved, at en Faktor VIII:CAg-holdig opløsning, f.eks. plasmafraktion, behandles med en immunosorbent omfattende antistoffer, der er specifikke over for Faktor VIII:CAg, bundet til faste partikler, hvorpå det bundne VIII:CAg desorberes 5 ved eluering med en buffer og oparbejdes til et præparat.

Som immunosorbent kan anvendes humane inhibitorantistoffer eller monoklonale antistoffer, fortrinsvis 56 IgG eller 47 IgG.

10 Hydrofob interaktion kromatografi of VIII:CAg og kation-bytninq VIII:CAg kan oprenses fra VIII:CAg-holdige opløsninger, f.eks. plasmafraktioner uden anvendelse of affinitetskromatografi med 15 antistoffer. Det har således vist sig, at 77/80 kD Faktor VIIIzCAg er uhyre basisk og hydrofob. Disse egenskaber kan udnyttes til udvinding of Faktor VIII:CAg fra plasmafraktioner ved hydrofob interaktion kromatografi og kationbytning, jfr. også eksempel 5 nedenfor.

20

Hydrofob kromatografi kan gennemføres ved pH 6 - 9,5, men bindingen er dog kraftigst ved højt pH, f.eks. pH 8,5. Der anvendes en hydrofob gel, såsom phenyl-Sepharose (Pharmacia). Bindingen til phenyl-Sepharosen kan foregå uden salttilsætning, men forøges dog 25 væsentligt ved tilsætning of NaCl. 0,3M NaCl tilsætning til kryosupernatanten er passende, idet det ikke vil interferere med den senere udvinding of andre plasmaproteiner, såsom albumin og immunoglobulin G. Ved anvendelse of 4% PEG bundfaldet fra genopløst kryopræcipitat, kan der anvendes højere NaCl-koncentrationer. Det 30 bundne Faktor VIII:CAg elueres med en puffer, f.eks. under de i eksempel 5 nedenfor angivne betingelser.

Kationbytning kan gennemføres ved en pH-værdi under 8,0, idet dette giver den bedste binding. En velegnet værdi er pH 5,5, idet pH i 35 kryosupernatanten kan nedsættes hertil, uden at VIII:CAg tager skade.

DK 173863 B1 10

Der kan anvendes en stærk kationbytter, såsom "Whatman®SE53". Det bundne Faktor VIII:CAg elueres med en puffer, f.eks. under de i eksempel 5 nedenfor angivne betingelser.

5 Ved begge de ovennævnte metoder opnås der en meget selektiv oprensning of Faktor VIIl:CAg, og et meget rent eluat. En særlig hensigtsmæssig metode til yderligere koncentration of VIII:CAg aktiviteten er at kombinere en hydrofob kromatografi med en kationbytning, som beskrevet ovenfor og illustreret i eksempel 5 og 10 6 nedenfor. I dette tilfælde foretrækkes en svagere kationbytter, såsom "CM fast flow sepharose".

Som det fremgår of eksempel 5 og Tabel 4 udnytter disse to oprensningsmetoder forskellige egenskaber ved VIII :CAg og giver 15 kombineret en 1100 gange oprensning fra kryosupernatanten. Disse oprensningsmetoder kan, som affinitetskromatografi, anvendes pa alle VIII:CAg-holdige opløsninger, f.eks. plasmafraktioner, jfr. Tabel 4, der både viser oprensning of kryosupernatant og bundfaldet fra 4% PEG fældning af genopløst kryopræcipitat.

20 TABEL 4

Oprensning of VIII:CAg ved hydrofob interaktion kromatografi og kationbytning 25 Fraktion VIII:CAg protein spec.akt.

_enh._mg, E2Bq enh. /mg (Eks. 5)

Kryosup. 1100 160.000 0,007 30 Gennemløb fra phenyl-Sepharose 390 160.000 0,002

Eluat fra phenyl-Sepharose 440 2.100 0,21

Gennemløb fra SE 53 50 2.000 0,04 35 Eluat fra SE 53_300_37,5_8,0 11 DK 173863 B1 4% PEG bdf. 798 3.000 0,26

Gennemløb fra phenyl-Sepharose 36 2.400 0,01

Eluat fra 5 phenyl-Sepharose 560 83 6,7

Gennemløb fra SE 53 64 83 0,77

Eluat fra SE 53_380_1,83 210

Effekt of VIII:CAg 10

In vitro koagulation inhibitionsforsøg tyder på, at det oprensede VIII:CAg også vil have en effekt in vivo. I koagulation inhibitionsassay måles den koagulationsinhiberende effekt of inhibitor IgG på normalplasma. Den fortynding, som giver 50% 15 inhibition, angives i Bethesda enheder (C.K. Kasper et al. Thromb.

Diath. Haemorr. 3_4, 869, 1975) . I Tabel 5 er vist et sammenlignende forsøg, hvor normal plasma blev inkuberet med ca. 3 Bethesda enheder inhibitor IgG fra 6 forskellige inhibitorpatienter samt som kontrol med det tidligere beskrevne zHI IgG. Forsøgene gennemførtes med og 20 uden tilstedeværelse af et præparat indeholdende 100 VIII:CAg enh./ml. Det fremgår af tabellen, at det oprensede VIII:CAg har en udpræget inhibitor-dæmpende effekt pa alle antistofferne i forhold til forsøgene uden VIII:CAg. Således er Bethesda-titeren of alle antistofferne nedsat med mere end 25%. Dette viser, at 25 inhibitoreffekten af alle de 7 testede antistoffer skyldes reaktivitet mod 80/77 kD-delen af Faktor VIII:C.

Tabel 5 Dæmpning af koagulation inhibition med 80/77-VIII:Cag 30 -----------------------------------------------------------

Inhibitor IgG %VIII:C efter %VIII:C efter inkubation inkubation ______uden VIII; Cag_med VIII :Cag HZ (zHI) 0 82 35 AJ 6 89 KB 17 61 DK 173863 B1 12 E O 71 THL 10 95 KH 5 80 BE 6 76 5 Normal IgG_100_102_

Ovennævnte 7 antistoffer er deponeret den 30.10.1984 på Statens Seruminstitut, København under nr. 50-KR-306.

10 Anvendelse of VIII:CAg som immunosorbent

Det er muligt at fjerne Faktor IX inhibitorantistoffer fra blodet hos en Faktor IX inhibitorpatient ved at lade blodet passere en søjle, hvortil Faktor IX er koblet, C. Freiburghaus, Thromb.

15 Haemostas. 50, 208, 1983.

Derimod er det ikke muligt specifikt at fjerne Faktor VIII inhibitor antistoffer på tilsvarende måde. Der er flere årsager hertil: 20 l) Molekylvægten of Faktor VIII i AHF-præparater er normalt 1000-20.000 kD, idet præparatet også indeholder Faktor VIII:RAg. Derfor kobler Faktor VIII meget dårligt til geler.

2) Ved kobling of Faktor VIII-kompleks kan Vlll:Cag kobles via 25 VIII:RAg eller andre dele of Faktor VIII. Dermed vil VIII:CAg let blive vasket of den koblede gel under anvendelsen.

Disse forhold vil ikke gælde for VIII:CAg oprenset som her beskrevet.

30

Derfor vil VIII:CAg bundet til en passende fast matrix, såsom en sepharosegel, være velegnet som immunosorbent, f.eks. ved extracorporal specifik adsorptionsbehandling of Faktor VIII inhibitor patienter.

Fremstillingen af immunosorbenten ifølge opfindelsen illustreres 35 DK 173863 B1 13 i de følgende eksempler, hvorfra nogle of resultaterne allerede er angivet i de foregående tabeller.

Eksempel 1 5 5 mg 47 IgG kobles til 5 ml Sepharose 4B aktiveret med 0,5 g CNBr.

Efter blokering med 1 M glycin, pH 8,5 og vask med elueringsbuffercyklus inkuberes gelen natten over med 100 ml AHF (Nordocto®) , som indeholder 400 VIIIrCAg enh./ml. Gelen vaskes pa 10 søjle med 20 ml buffer A (20 mM imidazol, 10 mM CaCl2, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN3, pH = 7,35) og 100 ml buffer A med 0,5 M NaCl. Gelen elueres med buffer A med 0,5 M NaCl i 50% EG. 6 ml eluat indeholder 7200 enh. VIII:CAg. Fig. 3 viser SDS-PAGE af elueringsfraktioner.

Bedemt ved sværtningsintensiteter udgøres mere end 25% af proteinet 15 i eluatet of 80/77 kD protein.

Eksempel 2 0,5 mg 56 IgG kobles til 0,5 ml Sepharose 28/C1. Efter blokering og 20 vask med elueringsbuffercyklus inkuberes gelen natten over med 500 ml kryosupernatant (plasma efter kryopræcipitering), som indeholder 200 VIII:CAg enheder (Spec, akt.: 0,007 VIII:CAg enh./mg).

Immunosorbenten isoleres fra kryosupernatanten ved at lede inkubationsblandingen gennem en søjle, fremstillet of en 2 25 ml-engangs-sprøjte. Gennemløbet indeholder 100 VIII:CAg enh. Efter vask med 2 ml buffer B (50 mM imidazol, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN3, pH = 7,35) og 100 ml buffer B med 2,5 M NaCl elueres med 2,5 ml buffer B med 2,5 M NaCl i 50% EG. Eluatet indeholder 39 VIII:CAg enh. (Spec, akt. 61 enh./mg) og 0,5 enh. VIII:C koagulationsaktivitet, jfr. også 30 Tabel 3 ovenfor.

Eksempel 3

Genopløst kryopræcipitat absorberes med Al203 og fældes med 4% PEG, 35 som beskrevet i patentansegning nr. WO 84/03628. Bundfaldet genopløses ved omrøring i 45 min. med 1/4 kryovolumen buffer B med DK 173863 B1 14 0,5 M NaCl og 10 mM EDTA. Uklarheder fjernes ved centrifugering, og det genopløste bundfald med 1.500 VIII:CAg enh. (Spec, akt.: 0,29 enh./mg) inkberes natten over med 0,25 ml "Sepharose 4B" gel koblet med 5 mg 56 IgG/ml. Gelen opsamles, som beskrevet i 5 eksempel 2, og gennemløbet indeholder 340 VIII:CAg enh. Gelen vaskes med 3 ml buffer B og 2 ml buffer B med 2,5 M NaCl. Der elueres med 1,1 ml buffer B med 2,5 M NaCl i 50% ethylenglycol. Eluatet indeholder 920 VIII:CAg enh., og den specifikke aktivitet er 6900 enh./mg, jfr. også Tabel 3 ovenfor.

10

Eksempel 4

Et 4% PEG bundfald fra AHF proces indeholdende 1000 VIll:CAg enh. genopløses i buffer B med 0,5 M NaCl og 10 mM EDTA. Efter * 15 genopløsning inkuberes natten over med 0,25 ml "Sepharose Cl 2B" gel koblet med 10 mg human inhibitor IgG/ml. Gelen opsamles, som beskrevet i eksempel 2, og gennemløbet indeholdt 340 VIII:CAg enh.

Gelen vaskes og elueres, som beskrevet i eksempel 3. Eluatet indeholder 68 VIII:CAg enh., og den specifikke aktivitet er 830 20 enh./mg, jfr. også Tabel 3 ovenfor.

Eksempel 5 (se Tabel 4) 2,6 1 kryosupernatant indeholdende 1100 VIII:CAg enh. tilsættes 5 mM 25 ethylenglycol-bis-(beta-aminoethylether)N,N'-tetraeddikesyre (EGTA)/0,3 M NaCl, og pH justeres til 8,5. 180 ml Phenyl-Sepharose (Pharmacia) tilsættes og inkuberer 1 time. Gelen opsamles på søjle og vaskes med 400 ml 5 mM imidazol/0,45 M NaCl/pH 7,4 og elueres med 250 ml 50% ethylenglycol/5 mM imidazol/pH 7,4. Eluatet 30 indeholder 440 enheder VIII:CAg med en specifik aktivitet på 0,21 enh./mg protein.

pH justeres til 5,5, og der tilsættes 25 ml kationbytter af typen Whatman® SE53. Efter 30 minutter opsamles ionbytteren pa søjle, og 35 den vaskes med 50 ml 50 mM phosphat/5 mM EGTA/pH 7,4. VIII:CAg DK 173863 B1 15 elueres med 35 ml 1 M NaCl/50 mM phosphat/5 mM EGTA/pH 7,4. Eluatet indeholder 300 VIII.-CAg enh. med en specifik aktivitet på 8,0 enh./mg protein 5 Eksempel 6 500 g 4% PEG bundfald fra AHF proces ifølge ansøgning WO 84/03628 (fra 300 1 plasma) genopløses i 3,7 1 50 mM phosphat/0,75 M NaCl/5 mM EDTA/pH 8,5. PH justeres til 8,5 med 0,5 M NaOH, og opløsningen 10 indeholder efter filtrering gennem filtrerpapir 17.500 VIII:CAg enh. og 190.000 mg protein. Det genopløste bundfald ledes gennem søjle med 250 ml phenyl-Sepharose gel med et flow på 3,7 1/time.

Phenyl-Sepharosen vaskes med 1,3 1 25 mM phosphat/5% ethylenglycol/pH 7,4 med et flow på 3,7 1/time. 13.500 VIII:CAg enh.

15 med 2.000 mg protein (Spec. akt. 6,8 enh./mg prot.) elueres i 1,3 1 25 mM phosphat/65% ethylenglycol/pH 7,4. Eluatet tilsættes NaCl til en koncentration på 50 mM, og pH justeres til 7,0. Eluatet ledes gennem en kationbyttersøj le med 6,25 ml "CM-fast flow Sepharose" (Pharmacia) med en flowhastighed på 500 ml/time. Søjlen vaskes med 20 60 ml 10 mM phosphat/50 mM NaCl/pH 7,3 ved et flow på 500 ml/time.

10.800 VIII:CAg enh. med 4,9 mg protein (specifik aktivitet 2.200 enh./mg) elueres i 18 ml 5 mM phosphat/0,5 M NaCl/7 1/2 % saccharose, pH 7,3 (600 VIII:CAg enh./ml).

25 Eluatet blandes med human albumin til en koncentration på 0,5%, sterilfiltreres og dispenseres på 3 flasker hver indeholdende 6 ml.

Efter frysetørring varmebehandles præparatet ved 68°C i 72 timer.

Indholdet of hver flaske opløses i 18 mg sterilt vand og indeholder 190 VIII:CAg enh./ml.

30

Eksempel 7 VIII:CAg fremstilles som beskrevet i eksempel 6, bortset fra at der anvendes 50 mM NaHCOj 0,5 M NaCl, pH 7,3 til eluering af 35 CM-ionbytteren. PH of eluatet justeres til 8,5, og 4800 VIII:CAg DK 173863 B1 16 enh. i 3 ml eluat kobles til 1 ml CNBr-aktiveret "Sepharoae 4B". Den koblede gel blokeres med 1 M glycin pH 8,5.

200 μΐ VIII:CAg-Seph. 4B gel blev inkuberet 2 timer ved 37°C med 6,4 5 ml plasma fra en Faktor VIII-inhibitor patient. For inkubationen indeholdt plasmaet inhibitorantistoffer i en mængde på 22 BU/ml.

Efter inkubationen var inhibitormængden nedsat til 1,8 BU/ml. Efter reaktivering med 3M NH4SCN blev de 200 μΐ VIII :CAg-Seph. 4B gel atter inkuberet 2 timer ved 37°C med 6,4 ml plasma fra samme 10 Faktor VIII inhibitor patient. Ved denne inkubation blev inhibitortiteren nedsat til 3,5 BU/ml.

Claims (2)

1. Immunosorbent til fjernelse af FVIII inhibitor antistoffer, k e n 5 detegnet ved, at det indeholder et protein med FVIII:CAg aktivitet.

2. Immunosorbent ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinet med FVIII:CAg aktivitet er 80/77 kD delen af FVIII:C. 10