DK165940B - Praeparat til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadant praeparat - Google Patents

Description

i

DK 165940B

Den foreliggende opfindelse angår et præparat til behandling af hæmofili A inhibitor patienter samt fremgangsmåder til fremstilling af et sådant præparat.

5 Hæmofili A er en medfødt sygdom, som skyldes mangel på koagulationsfaktor VIII:C. Denne faktor findes i blodplasma og kan oprenses delvis fra blod. Præparater, der indeholder denne faktor (AHF), kan indgives til hæmofili A patienter, således at patienternes blod bliver i stand 10 til at koagulere. Fremstillingen af denne type præparater er f.eks. beskrevet i US patentskrift nr. 3 652 530 og ansøgning nr. WO 84/03628. I disse præparater udgør Faktor VIII:C proteinet typisk 0,1% af den totale proteinmængde. Faktor VIII:C med højere renhed kan opnås ved 15 affinitetskromatografi (Zimmerman et al., US patentskrift nr. 4 361 509, Fass et al. Blood 59, 394, 1982).

Faktor VIII:C proteinet er endnu ikke fuldt ud karakteriseret, men en del af strukturen kendes. (L.W: Hoyer, 20 Blood 58, 1, 1981, M. Weinstein et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA 78, 5137, 1981; G. Kuo et al., Thromb.

Haemostas. 50, 262, 1983). Molekylvægten er ca. 300 kD.

Det er kendt, at 10-20% af hæmofili A patienterne ikke 25 blot mangler Faktor VIII:C, men også danner antistoffer mod Faktor VIII:C. Denne type patienter kaldes inhibitorpatienter, og antistoffer hos disse patienter kaldes inhibitor-antistoffer, idet de inhiberer koagulationsaktiviteten af Faktor VIII: C (H.R. Roberts & R.

30 Cromartie, Progress in Clinical and Biological Research 150, 1, 1984). Forekomsten af disse antistoffer medfører, at indgivelsen af AHF-præparatet er virkningsløs, idet Faktor VIII:C neutraliseres, og AHF indgivelsen inducerer forhøjet antistofniveau.

Inhibitor-antistoffer kan bruges som reagens i immunoassays til at måle Faktor VIII:C antigen (FVIII:CAg) (B.

35 2

DK 165940 B

Dinesen, C. Feddersen, Throms.Res. 31, 707, 1983, 0.

Nordfang et al., Thromb. Haemostas. 50, 111, 1983). En VIII:CAg enhed defineres som indholdet i 1 ml normal human plasma.

5

Inhibitor patienter er hidtil søgt behandlet: a) Ved uspecifik behandling med aktiverende prothrombin- @ ø komplex-præparater (FEIBA , Autoplex ). Disse præpara-10 ter indeholder en ukendt komponent (måske Faktor Vila, se U. Hedner og W. Kisiel, J. Clin. Invest. 71, 1837, 1983), som kan få plasma til at koagulere på trods af høje inhibitormængder. Aktiverede prothrombinkomplex-præparater kan dog ikke hjælpe alle inhibitorpatien-15 ter, og patienterne bliver ikke kureret for deres in hibitor. Desuden er der stor fare for blodpropper ved anvendelsen af denne type præparater.

b) Det har vist sig, at inhibitordannelsen kan "udraattes" 20 ved indgivelsen af meget store doser AHF (100-200 enh./kg dagligt). Derved er det muligt at inducere immuntolerance over for Faktor VIII (H.H. Brackman & J. Gromsen, Lancet, p. 933, 1977). Efter en sådan behandling kan patienten behandles med AHF præparater som 25 andre bløderpatienter. Høj dosis AHF behandling er imidlertid også uspecifik, idet der indgives meget store doser uvedkommende protein, og patienterne kan ikke udnytte koagulationsaktiviteten i AHF præparater under behandlingen.

30 I starten af behandlingsfasen stiger inhibitorniveauet, hvorefter det med tiden reduceres til 0. Blødninger kan ikke forhindres med AHF under behandlingen, men blød-

R

ninger kan til dels stoppes, med de ovennævnte FEIBA 35 (factor eight inhibitor bypassing activity) præparater.

DK 165940B

3

Denne behandling er meget dyr (typisk 600.000 US$ pr. patient, se S. Stenbjerg et al., Thromb. Res. 34, 533, 1984) og har af denne grund ringe udbredelse.

5 Opfindelsen hviler på den overraskende opdagelse, at en i det væsentlige koagulationsaktiv fraktion af FVIIIrC med de i krav 1 angivne egenskaber er generelt reaktiv overfor antistoffer fra inhibitorpatienter. Derfor vil udmat-telsesbehandlingen være fuldt så effektiv, hvis man ind-10 giver et præparat indeholdende denne fraktion i en passende høj mængde i stedet for overskud af FVIII:C. Fraktionen har VIIIrCAg-aktivitet uden væsentlig VIII:C koagulationsaktivitet. Dvs. at antallet af Vlll:CAg enheder er stort i forhold til mængden af protein i mg (specifik 15 aktivitet: Vlll:CAg enh./mg protein).

Præparatet ifølge opfindelsen indeholder således et poly-peptid eller protein med en specifik Faktor VIII:CAg aktivitet større end 0,5 FVIII:CAg enh./mg, fortrinsvis 20 mindst 1 VIII:CAg enh./mg, og præparatet er ejendommeligt ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte.

Ved formuleringen af præparatet til en injicerbar opløsning vil man ved tilsætning af forskellige medier i pas-25 sende mængde indstille VIII:CAg koncentrationen svarende til en aktivitet på mindst 50 enh./ml.

Det er i og for sig kendt, at prothrombinkompleks-præpa- β rater, såsom FEIBA , der kan indgives sideløbende med 30 Faktor VIII-behandlingen af inhibitorpatienter, også indeholder VIII:CAg, jvf. Allain et al., Progress in Clinical and Biological Research 150, 99, 1984. Når artiklen (side 101, sidste afsnit linie 8) nævner at "fri Vlll:Cag" er den normale (main) molekylære form for det 35 indgivne FV111, så skal herved forstås at "Vlll:CAg" er fri for "VlllR:Ag" (nævnt i linie 7). Dermed findes FVlll:Cag altså i FEIBA i form af koagulationsaktivt 4

DK 165940 B

FV111, hvoraf FVlll:CAg jo er en bestanddel men i sig selv koagulationsinaktiv. Indholdet er derfor i reglen kun af størrelsesordenen 4,5 VIII:CAg enh./ml. FEIBA-præ-paraterne indeholder dog også signifikante mængder Faktor 5 VIII:C koagulationsaktivitet (Barrowcliffe et al.,

Thromb. Res. 21, 181-86, 1981), der antages at spille en væsentlig rolle for virkningen. Barrowcliffe har målt en VIII:CAg koncentration på 2 enh./ml og en Faktor VIII:C aktivitet på 1,3 enh./ml svarende til et forhold på 10 2:1,3.

Prothrombinkompleks-præparater indeholder også en række andre koagulationsfaktorer, især Faktor II, VII, IX og X samt evt. Faktor Vila, IXa og Xa. (Aronson, Progress in 15 Clinical and Biological Research 150, 243, 1984), som kan tænkes at fremme koagulationen af hæmofili A plasma, og anvendes derfor også til at stoppe blødninger hos hæmofili A patienter.

20 Præparatet ifølge opfindelsen fremmer ikke koagulationen af hæmofili A plasma, jfr. Tabel I nedenfor. Koagulationsfaktorer, såsom de ovenfor nævnte, kan om ønsket tilsættes for at opnå de kendte yderligere virkninger af faktorerne.

25

Proteinet med VIII :CAg reaktivitet, der anvendes som ak-tivkomponent i præparatet, er et Faktor VIII:C fragment, der ved SDS-PAGE udviser en dublet med en omtrentlig molekylvægt på 80/77 kD eller et fragment deraf, som kan 30 opnås ved thrombin-aktivering, og som udviser dublet med en molekylvægt på 70/67 kD, jfr. Kuo et al. loc. cit.

Af Kuo et al. fremgår det, at man har isoleret 80/77 kD fragmentet, at det udviser VIII:CAg aktivitet over for et 35 bestemt inhibitorantistof (zHI) og ingen koagulationsaktivitet. Derfra kunne man dog ikke forvente, at fragmentet, som påvist nedenfor, er i stand til generelt at

DK 165940 B

5 blokere inhibitoraktiviteten af inhibitorantistoffer. På basis af det i denne publikation anførte har man ikke kunnet forudse, at nævnte fragment kan benyttes til fremstilling af præparater med inhibitorneutraliserende egen-5 skaber. Det ifølge opfindelsen fremstillede præparat har ved forsøg vist sig at kunne blokere inhibitoraktiviteten af alle inhibitorantistoffer i en gruppe på 7.

Ved de i krav 2 og 3 anførte metoder, hvor udvindingen i 10 krav 2 foregår ved, at et plasmaprodukt indeholdende en koagulationsaktiv fraktion af FVIII:C med FVIII:CAg aktivitet behandles med et fast immunosorbent, hvortil der er bundet 56 IgG eller 15 47 IgG antistoffer, som er specifikke overfor FVIII:CAg, hvorpå det adsorberede polypeptid med FVIII:CAg aktivitet elueres med en puffer og oparbejdes til et præparat, og i krav 3 foregår ved, 20 at et plasmaprodukt indeholdende en koagulationsinaktiv fraktion af FVIIIrC med FVIII:CAg aktivitet underkastes kromatografi på en hydrofob gel efterfulgt af kationkro-matografi før oparbejdning til et præparat.

25

Udvindingen af 80/77 kD fragmentet med VIII:CAg-reaktivi-tet fra plasmafraktioner kan ifølge opfindelsen ske på flere måder, eksempelvis ved affinitetskromatografi, hydrofob interaktion kromatografi eller ved kationbytning.

30 Som udgangsmateriale kan principielt anvendes en hvilken som helst VIII:CAg-holdig fraktion, men der anvendes hensigtsmæssigt en kryosupernatant eller en plasmafraktion opnået ved fældning af genopløst kryopræcipitat med 2-6 vægt-%, fortrinsvis ca. 4 vægt-% PEG. Det sidste er 35 særligt hensigtmæssigt, fordi dette bundfald normalt ikke bruges under den videre plasmafraktionering.

DK 165940B

6

Det omhandlede polypeptid er udvundet af plasma, men opfindelsen er ikke begrænset til anvendelse af fra plasma isolerede Faktor VIII:C fragmenter. Ud fra DNA sekvensen af Faktor VIII:C vil det være muligt at fremstille del-5 fragmenter af Faktor VIII:C genet. Disse delfragmenter vil kunne indsættes i egnede vektorer (f.eks. plasmider eller vira). Disse vektorer kan indsættes i egnede værtsceller (f.eks. E. coli, gær, CHO (Chinese Hamster Ovary), COS (abenyreceller) eller andre mammale celler), således 10 at cellerne er i stand til at producere del fragmenter af Faktor VIII:C. Det kan forudses, at sådanne fragmenter er i stand til at blokere . inhibitorantistoffer som vist i tabel 5, uden at de indeholder væsentlige mængder af VIII:C koagulationsaktivitet, idet de jo har samme mole-15 kylstruktur som de tilsvarende peptidsekvenser fra blodplasma. De vil derfor kunne anvendes til fremstilling af præparatet ifølge opfindelsen.

Reaktivitet af antistoffer 20

Flere forfattere (H.P. Muller et al.. Blood 58, 1000, 1981; B. Sola' et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79, 1983, 1982) har beskrevet fremstillingen af monoklonale antistoffer mod Faktor VIII:C. Disse antistoffer kan op-25 nås efter immunisering af mus med Faktor VIII, ved at fusionere miltceller med tumorceller, som beskrevet af Kohier & Milstein (Nature 256, 495, 1975). Ved brug af denne teknik er der fremstillet monoklonale antistoffer mod Faktor VIII:C, benævnt henholdsvis 42 IgG, 47 IgG og 30 56 IgG.

Fig. la viser en fast phase immunisolation med monoklonale antistoffer. Plastikkugler blev coated med antistof mod muse immunglobulin/monoklonalt antistof. Efter vask 125 35 blev kuglerne inkuberet med I-mærket Faktor VIII:C.

Faktor VIII:C fremstillet som beskrevet af E. Tuddenham et al., J. Lab. Clin. Med. 93, 40, 1979. Efter vask blev

DK 165940B

7 kuglerne ekstraheret med SDS-prøvebuffer, og eluaterne blev kørt på SDS-gel. Figuren viser antoradiogram af SDS-gel: 125 5 Spor 1; Tracer. ( I-mærket Faktor VIII:C); Spor 2: nor mal muse IgG? Spor 3: 42 IgG; Spor 4: 47 IgG; Spor 5: 56 IgG.

Det fremgår af Fig. la, at disse antistoffer binder 80/77 10 kD delen af Faktor VIII:C (spor 3, 4, 5). Dette er den samme del, som bindes af et humant inhibitor-antistof, zHI.

Fig lb viser en fast phase immunisolation udført som for-15 søg i Fig la med zHI bundet til kugle, og med en nedbrudt VIII:C prøve. Det fremgår af Fig. lb, at der i en nedbrudt prøve kan fremkomme andre peptider end 80/77 kD dubletten med VIII:CAg aktivitet overfor zHI (70/67 kD og andre nedbrydningsprodukter).

20

Fig. 2 viser, at 7 af 7 inhibitorantistoffer er i stand til at blokere bindingen af zHI i VIII:CAg inhibitionsas-say. Da zHI antistoffet binder 80/77 kD dubletten, må de andre inhibitorantistoffer også have reaktivitet imod 25 dette fragment af Faktor VIII:C, når de kan hindre bindingen af zHI antistoffet. Y-aksen viser denne stigende hindring af bindingen af zHI. X-aksen viser faldende inhibitoraktivitet. Maksimal binding af zHI, og maksimal inhibitoraktivitet ligger således i nulpunktet. Assayet 30 gennemførtes på følgende måde: Brønde i mikrotiterplader blev coated med zHI immunglobulin. Efter vask blev plasma indeholdende Faktor VIII:C tilsat, og efter endnu en vask blev inhibitor-immunglobulin tilsat sammen med peroxi-dasemærket zHI antistof. 100% binding af peroxidasemærket 35 zHI opnås ved at tilsætte buffer i stedet for inhibitor-immunglobulin.

8

DK 165940 B

Affinitetskromatografi af VIII-CAg

Ved absorption af AHF med monoklonalt 47 IgG koblet til Sepharose Cl 2B har det vist sig, at der kun adsorberes 5 VIII:CAg og ikke koagulationsaktivt Faktor VIII:C (Tabel I). Dette er overraskende, idet antigenet er til stede både på faktor VIII:C og VIII:CAg. Imidlertid synes antigenet mere tilgængeligt på det koagulationsinaktive VIII:CAg end på Faktor VIII:C.

10

TABEL I

Specifik VIII:CAg adsorption til 47 IgG koblet til Sepharose 15

Immuno- AHF ikke-bundet EG/NaCl eluat sorbent_VIII:C VIII:CAg VIII:C VIII:CAg VIII:C VIIIzCAg 20 47 IgG/Cl 2B 88 270 90 90 0,32 138

Kontrol Cl 2B 88 270 77 248 0,14 0,09

Tabel 2 viser, at en række salte kan anvendes sammen med 25 ethylenglycol (EG) til eluering af VIII:CAg fra immunosorbent med monoklonalt antistof. MgC^, som er tungtop-løseligt i EG, kan bruges til eluering uden tilstedeværelse af EG.

30 35

DK 165940B

9 TABEL 2

Effekt af forskellige salte på ethylenglycol eluering fra

56 IgG

5 ---------------------------------------------------------

Prøve VIII;CAg enh.

AHF (Nordiocto R) 210 10 gennemløb 140 eluat, 50% EG/mættet NaCl 22 - 50% EG/mættet KC1 19 , 50% EG/2 M Kl 3,6 - 50% EG/2 M CaCl2 2,2 15 - 2M MgCl2 22 , 50% EG/mættet NaAc 24

Med 56 IgG koblet til sepharose er det muligt af oprense 20 VIII:CAg fra kryosupernatant. Kryosupernatant indeholder 0,4 VIII:CAg enh./ml, og mindre end 1 ppm af proteinet er VIII :CAg. Tabel 3 viser, at der i et trin kan opnås en 8.000 gange oprensning, således at der kan fremstilles et præparat med en specifik VIII:CAg aktivitet på 61 enh.

25 VIII:CAg/mg protein. Dette er en betydeligt højere specifik aktivitet end der findes i eksisterende AHF-præparat-er.

Ved fremstilling af high purity (HP) præparater ud fra 30 mindre oprenset AHF kan der bl.a. fremkomme et 4% PEG-bundfald (US 3 652 330, WO 84/03628). Dette bundfald indeholder VIII:CAg, og som det fremgår af Tabel 3, er det muligt at bruge dette bundfald som udgangsmateriale til VIII:CAg oprensning. Med blot 0,25 ml immunosorbent er 35 det muligt at oprense 920 VIII :CAg enheder fra 140 ml genopløst 4% PEG bundfald. Det opnåede præparat har en specifik VIII:CAg aktivitet på 6.900 enh. VIII:CAg/mg 10

DK 165940 B

protein.

Med humant inhibitor IgG koblet til Sepharose Cl 2B er det også muligt af oprense VIII:CAg fra genopløst 4% PEG 5 bundfald (Tabel 3). Udbyttet af VIII:CAg er imidlertid mindre end ved anvendelsen af monoklonalt antistof, idet 50% ethylenglycol med 2,5M NaCl ikke er i stand til kvantitativt af eluere det bundne VIII:CAg. Forsøgene er nærmere beskrevet i eksempel 2-4 nedenfor.

10 TABEL 3

Oprensning af VIII:CAg fra forskellige udgangsmaterialer ved hjælp af 56 IgG og humant inhibitor IgG

15 --------------------------------------------------------- VIII:CAg protein spec.akt.

Fraktion enh. mg, E2gQ enh./mg (Eks. 2) 20 Kryosup, 500 ml 200 30.000 0,007

Kryosup-gennemløb 500 ml 100 30.000 0,003 EG/NaCl eluat fra 56 IgG, 2 ml 39 0,64 61 25 (Eks. 3) 4% PEG bdf., 140 ml 1500 5.200 0,29 4% PEG bdf. gennemløb, 140 ml 340 5.200 0,07 EG/NaCl eluat fra 30 56 IgG, 1 ml 920 0,131 6900 (Eks. 4) 4% PEG bdf., 110 ml 1000 3.400 0,29 4% PEG bdf. gennemløb, 35 110 ml 340 3.400 0,10 EG/NaCl eluat fra human inhibitor, 1 ml 68 0,082 830

DK 165940 B

n

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et Faktor VIII:CAg præparat, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 anførte. Ved denne form udvindes FVIIIrCAg fra blodplas-5 ma. Oparbejdningen af det udvundne FVIII:CAg kan f.eks. ske ved dialyse, gelfiltrering eller ionbytning og efterfølgende optagning i et injicerbart medium.

Som immunosorbent anvendes humane 56 igG eller 47 IgG in-10 hibitorantistoffer eller monoklonale antistoffer.

Hydrofob interaktion kromatografi af VIII:CAg og kation-bytning 15 VIII:CAg kan oprenses fra VIII:CAg-holdige opløsninger, f.eks. plasmafraktioner uden anvendelse af affinitetskromatografi med antistoffer. Det har således vist sig, at 77/80 kD Faktor VIII:CAg er uhyre basisk og hydrofob.

Disse egenskaber kan udnyttes til udvinding af Faktor 20 VIII:CAg fra plasmafraktioner ved hydrofob interaktion kromatografi og kationbytning, jfr. også eksempel 5 nedenfor.

Hydrofob kromatografi kan gennemføres ved pH 6-9,5, men 25 bindingen er dog kraftigst ved højt pH, f.eks. pH 8,5.

Der anvendes en hydrofob gel, såsom phenyl-Sepharose (Pharmacia). Bindingen til phenyl-Sepharosen kan foregå uden salttilsætning, men forøges dog væsentligt ved tilsætning af NaCl. 0,3 M NaCl tilsætning til kryosupema-30 tanten er passende, idet det ikke vil interferere med den senere udvinding af andre plasmaproteiner, såsom albumin og immunoglobulin G. Ved anvendelse af 4% PEG bundfaldet fra genopløst kryopræcipitat, kan der anvendes højere NaCl-koncentrationer. Det bundne Faktor VIII:CAg elueres 35 med en puffer, f.eks. under de i eksempel 5 nedenfor angivne betingelser.

12

DK 165940 B

Kationbytning kan gennemføres ved en pH-værdi under 8,0, idet denne giver den bedste binding. En velegnet værdi er pH 5,5, idet pH i kryosupernatanten kan nedsættes hertil, uden at AIIIrCAg tager skade.

5

R

Der kan anvendes en stærk kationbytter, såsom "Whatman SE53". Det bundne Faktor VIII:CAg elueres med en puffer f.eks. under i de eksempel 5 nedenfor angivne betingelser.

10

Ved begge de ovennævnte metoder opnås der en meget selektiv oprensning af Faktor VIII:CAg, og et meget rent eluat. En særlig hensigtmæssig metode til yderligere koncentration af VIII:CAg aktiviteten er at kombinere en hy-15 drofob kromatografi med en Kationbytning, som beskrevet ovenfor og illustreret i eksempel 5 og 6 nedenfor. I dette tilfælde foretrækkes en svagere kationbytter, såsom "CM fast flow sepharose".

20 Som det fremgår af eksempel 5 og Tabel 4 udnytter disse to oprensningsmetoder forskellige egenskaber ved VIII:CAg og giver kombineret en 1100 gange oprensning fra kryosupernatanten. Disse oprensningsmetoder kan, som affinitetskromatografi, anvendes på alle VIIIrCAg-holdige opl-25 øsninger, f.eks. plasmafraktioner, jfr. Tabel 4, der både viser oprensning af kryosupernatant og bundfaldet fra 4% PEG fældning af genopløst kryopræcipitat.

30 35

DK 165940B

13 TABEL 4

Oprensning af VIII:CAg ved hydrofob interaktion kromatografi og kationbytning 5 --------------------------------------------------------- VIII: CAg protein spec.akt.

Fraktion enh. mg, E2qq enh./mg (Eks. 5) 10 Kryosup 1100 160.000 0,007

Gennemløb fra phenyl-Sepharose 390 160.000 0,002

Eluat fra phenyl-Sepharose 440 2.100 0,21 15 Gennemløb fra SE 53 50 2.000 0,04

Eluat fra SE 53 300 37,5 8,0 4% PEG bdf. 798 3.000 0,26 20 Gennemløb fra phenyl-Sepharose 36 2.400 0,01

Eluat fra phenyl-Sepharose 560 83 6,7

Gennemløb fra SE 53 64 83 0,77 25 Eluat fra SE 53 380 1,83 210

Effekt af VIII;CAg i præparatet ifølge opfindelsen 30 In vitro koagulation inhibitionsforsøg tyder på, at det oprensede VIII:CAg også vil have en effekt in vivo. I koagulation inhibitionsassay måles den koagulationsinhi-berende effekt af inhibitor IgG på normalplasma. Den inhibitoraktivitet der nedsætter FVlll.C aktiviteten til 35 50% af standard defineres som 1 Bethesda Unit (BU). En yderligere halvering af FVlllrC aktiviteten til 25% er således svarende til 2 BU inhibitoraktivitet og så frem- 14

DK 165940 B

deles. (C.K. Kasper et al. Thromb. Diath. Haemorr. 34, 869, 1975). I tabel 5 er vist et sammenlignende forsøg, hvor normal plasma blev inkuberet med ca. 3 Bethesda enheder inhibitor IgG fra 6 forskellige inhibitorpatienter 5 samt som kontrol med det tidligere beskrevne zHI IgG. Forsøgene gennemførtes med og uden tilstedeværelse af et præparat ifølge opfindelsen indeholdende 100 VIII:CAg enh./ml. Det fremgår af tabellen, at det oprensede VIII:CAg har en udpræget inhibitor-dæmpende effekt på 10 alle antistofferne i forhold til forsøgene uden VIII:CAg, idet procenten FV111:C aktivitet i CAg kolonnen er væsentlig højere end i kolonneri uden CAg, dog er der naturligvis ingen ændring i normal IgG, der ikke indeholder de omhandlede antistoffer mod FV111:C. I kolonnen uden CAg 15 er inhibitoraktiviteten ca. 3 BU, og det ses at den i kolonnen med CAg er nedsat til mindre end 1 BU. Dette viser, at inhibitoreffekten af alle de 7 testede antistoffer skyldes reaktivitet mod 80/77 kD-delen af Faktor VIII:C.

20 TABEL 5 Dæmpning af koagulation inhibitor med 80/77-VIII:CAg 25 % VIII:C efter % VIII:C efter inkubation inkubation

Inhibitor IgG uden VIII:CAg med VIII:CAg HZ (zHI) 0 82 30 AJ 6 89 KB 17 61 E 0 71 THL 10 95 KH 5 80 35 BE 6 76

Normal IgG 100 102 15

DK 165940 B

Ovennævnte 7 antistoffer er deponeret den 30.10.1984 på Statens Seruminstitut, København under nr. 50-KR-306.

Anvendelse af VIIlrCAg som immunosorbent 5

Det er muligt at fjerne Faktor IX inhibitorantistoffer fra blodet hos en Faktor IX inhibitorpatient ved at lade blodet passerer en søjle, hvortil Faktor IX er koblet, C. Freiburghaus, Thromb. Haemistas. 50, 208, 1983.

10

Derimod er det ikke muligt specifikt at fjerne Faktor VIII inhibitor antistoffer på tilsvarende måde. Der er flere årsager hertil: 15 1) Molekylvægten af Faktor VIII i AHF-præparater er nor malt 1000-20.000 kD, idet præparatet også indeholder Faktor VIII:RAg. Derfor kobler Faktor VIII meget dårligt til geler.

20 2) Ved kobling af Faktor VIII-kompleks kan VIIlrCAg kob les via VIII:RAg eller andre dele af Faktor VIII. Dermed vil VIIlrCAg let blive vasket af den koblede gel under anvendelsen.

25 Disse forhold vil ikke gælde for VIII:CAg oprenset som her beskrevet.

Derfor vil VIII:CAg bundet til en passende fast matrix, såsom en sepharosegel, være velegnet som immunosorbent, 30 f.eks. ved extracorporal specifik adsorptionsbehandling af Faktor VIII inhibitor patienter.

Fremstillingen af præparater ifølge opfindelsen ved de forskellige ovenfor beskrevne metoder illustreres i de 35 følgende eksempler, hvorfra nogle af resultaterne allerede er angivet i de foregående tabeller.

16

DK 165940 B

EKSEMPEL 1 5 mg 47 IgG kobles til 5 ml Sepharose 4B aktiveret med 0,5 g CNBr. Efter blokering med 1 M glycin, pH 8,5 og 5 vask med elueringsbuffercyklus, inkuberes gelen natten 0 over med 100 ml AHF (Nordocto ), som indeholder 400 VIII:CAg enh./ml. Gelen vaskes på søjle med 20 ml buffer A (20 mM imidazol, 10 mM CaClg, 0,15 M NaCl, 0,02% NaNg, pH = 7,35) og 100 ml buffer A med 0,5 M NaCl. Gelen elu-10 eres med buffer A med 0,5 M NaCl i 50% EG. 6 ml eluat indeholder 7200 enh. VIII:CAg. Fig 3 viser SDS-PAGE af elueringsfraktioner. Bedømt ved sværtningsintensiteter udgøres mere end 25% af proteinet i eluatet af 80/77 kD protein.

15 EKSEMPEL 2 0,5 mg 56 IgG kobles til 0,5 ml Sepharose 2B/C1. Efter blokering og vask med elueringsbuffercyklus inkuberes 20 gelen natten over med 500 ml kryosupernatant (plasma efter kryopræcipitering), som indeholder 200 VIII:CAg enheder (Spec, akt.: 0,007 VIII:CAg enh./mg, se tabel 3). Immunosorbenten isoleres fra .kryosupernatanten ved at lede inkubationsblandingen gennem en søjle, fremstillet af 25 en 2 ml-engangs-sprøjte. Gennemløbet indeholder 100 VIII:CAg enh. Efter vask med 2 ml buffer B (50 mM imidazol, 0,15 M NaCl, 0,02% NaNg, pH = 7,35) og 100 ml buffer B med 2,5 M NaCl elueres med 2,5 ml buffer B med 2,5 M NaCl i 50% EG. Eluatet indeholder 39 VIII:CAg enh. (Spec.

30 akt. 61 enh./mg) og 0,5 enh. VIII:C koagulationsaktivitet, jfr, også Tabel 3 ovenfor.

EKSEMPEL 3 35 Genopløst kryopræcipitat absorberes med Al^Og fældes med 4% PEG, som beskrevet i patentansøgning nr. WO 84/03628. Bundfaldet genopløses ved omrøring i 45 min. med 1/4

DK 165940B

17 kryovolumen buffer B med 0,5 M NaCl og 10 mM EDTA. Uklarheder fjernes ved centrifugering, og det genopløste bundfald med 1.500 VIIIrCAg enh. (Spec, akt.: 0,29 enh./mg) inkuberes natten over med 0,25 ml "Sepharose 4B" gel kob-5 let til 5 mg 56 IgG/ml. Gelen opsamles, som beskrevet i eksempel 2, og gennemløbet indeholder 340 VIII:CAg enh.

Gelen vaskes med 3 ml buffer B og 2 ml buffer B med 2,5 M NaCl. Der eluereres med 1,1 ml buffer B med 2,5 M NaCl i 50% ethylenglycol. Eluatet indeholder 920 VIII:CAg enh., 10 og den specifikke aktivitet er 6900 enh./Mg, jfr. også tabel 3 ovenfor.

EKSEMPEL 4 15 Et 4% PEG bundfald fra AHF proces indeholdende 1000 VIII :CAg enh. genopløses i buffer B med 0,5 M NaCl og 10 mM EDTA. Efter genopløsning inkuberes natten over med 0,25 ml "Sepharose Cl 2B" gel koblet med 10 mg human inhibitor IgG/ml. Gelen opsamles, som beskrevet i eksempel 20 2, gennemløbet indeholdt 340 VIII:CAg enh. Gelen vaskes og elueres, som beskrevet i eksempel 3. Eluatet indeholder 68 VIII:CAg enh., og den specifikke aktivitet er 830 enh./mg, jfr. også tabel 3 ovenfor.

25 EKSEMPEL 5 (se Tabel 4) 2,6 1 kryosupernatant indeholdende 1100 VIII:CAg enh. tilsættes 5 mM ethylenglycol-bis-(beta-aminoethylen-ether)-N,N'-tetraeddikesyre (EGTA)/0,3 M NaCl, og pH ju-30 steres til 8,5. 180 ml Phenyl-Sepharose (Pharmacia) tilsættes og inkuberer 1 time. Gelen opsamles på søjle og vaskes med 400 ml 5 mM imidazol/0,45 M NaCl/pH 7,4 og elueres med 250 ml 50% ethylenglycol/5 mM imidazol/pH 7,4. Eluatet indeholder 440 enheder VIII-CAg med en spe-35 cifik aktivitet på 0,21 enh./mg protein.

18

DK 165940 B

pH justeres til 5,5, og der tilsættes 25 ml kationbytter é af typen Whatmann SE53. Efter 30 minutter opsamles ion-bytteren på søjle, og den vaskes med 50 ml 50 mM phos-phat/5 mM EGTA/pH 7,4. VIII:CAg elueres med 35 ml 1 M 5 NaCl/50 mM phosphat/5 mM EGTA/pH 7,4. Eluatet indeholder 300 VIII ;CAg enh. med en specifik aktivitet på 8,0 enh./mg protein.

EKSEMPEL 6 10 500 g 4% bundfald fra AHF proces ifølge ansøgningen WO 84/03628 (fra 300 1 plasma) genopløses i 3,7 1 50 mM phosphat/0,75 M NaCl/5 mM EDTA/pH 8,5. pH justeres til 8,5 med 0,5 M NaOH, og opløsningen indeholder efter fil-15 trering gennem filtrerpapir 17.500 VIII:CAg enh. og 190.000 mg protein. Det genopløste bundfald ledes gennem søjle med 250 ml phenyl-Sepharose gel med et flow på 3,7 1/time. Phenyl-Sepharosen vaskes med 1,3 1 25 mM phos-phat/5% ethylenglycol/pH 7,4 med et flow på 3,7 1/time.

20 13.500 VIII:CAg enh. med 2.000 mg protein (Spec. akt. 6,8 enh./mg prot.) elueres i 1,3 1 25 mM phosphat/65% ethy-lenglycol/pH 7,4. Eluatet tilsættes NaCl til en koncentration på 50 mM, og pH justeres til 7,0. Eluatet ledes gennem en kationsbyttersøjle med 6,25 ml "CM-fast flow 25 Sepharose" (Pharmacia) med en flowhastighed på 500 ml/time. Søjlen vaskes med 60 ml 10 mM phosphat/50 mM NaCl/pH 7,3 ved et flow på 500 ml/time. 10.800 VIII:CAg enh. med 4,9 mg protein (specifik aktivitet 2.200 enh./mg) elueres i 18 ml 5 mM phosphat/0,5 M NaCl/7 1/2% 30 saccharose, pH 7,3 (600 VIII:CAg enh./ml).

Eluatet blandes med human albumin til en koncentration på 0,5%, sterilfiltreres og dispenseres på 3 flasker hver indeholdende 6 ml. Efter frysetørring varmebehandles præ-35 paratet ved 68 °C i 72 timer. Indholdet af hver flaske opløses i 18 mg sterilt vand og indeholder 190 VIII:CAg enh./ml.

DK 165940B

19 EKSEMPEL 7 VIII:CAg fremstilles som beskrevet i eksempel 6, bortset fra at der anvendes 50 mM NaHCOg 0,5 M NaCl, pH 7,3 til 5 eluering af CM-ionbytterne. pH af eluatet justeres til 8,5, og 4800 VIII:CAg enh. i 3 ml eluat kobles til 1 ml CNBr-aktlvitet "Sepharose 4B". Den koblede gel blokeres med 1 M glycin pH 8,5.

10 200 ul VIIIsCAg-Seph. 4B gel blev inkuberet 2 timer ved 37 °C med 6,4 ml plasma fra en Faktor VIII-inhibitor patient. Før inkubationen indeholdt plasmaet inhibitorantistoffer i en mængde på 22 BU/ml. Efter inkubationen var inhibitormængden nedsat til 1,8 BU/ml. Efter reaktivering 15 med 3M NH^SCN blev de 200 ul VIII:CAg-Seph. 4B gel atter inkuberet 2 timer ved 37 °C med 6,4 ml plasma fra samme Faktor VIII inhibitor patient. Ved denne inkubation blev inhibitortiteren nedsat til 3,5 BU/ml.

20 25 30 35

Claims (3)

20 DK 165940 B

1. Præparat til behandling af hæmofili A inhibitorpati-5 enter, og indeholdende et polypeptid eller protein med en specifik Faktor VIII:CAg aktivitet større end 0,5 FVIIIiCAg enh./mg kendetegnet ved, at polypep-tidet med FVIIIiCAg aktivitet består af eller omfatter en i det væsentlige koagulationsinaktiv fraktion af FVIII:C 10 molekylet og ved SDS-PAGE udviser en dublet med en omtrentlig molekylvægt på 80/77 kD eller 70/67 kD, samt at præparatet har et indhold af FVIIIiCAg aktivitet på mindst 50 enh/ml, men i det væsentlige er fri for FVIIIiC. 15

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et plasmaprodukt indeholdende en koagulationsaktiv fraktion af FVIIIiC med FVIIIiCAg aktivitet behandles med et fast immunosorbent, 20 hvortil der er bundet 56 IgG eller 47 IgG antistoffer, som er specifikke overfor FVIIIiCAg, hvorpå det adsorbe-rede polypeptid med FVIIIiCAg aktivitet elueres med en puffer og oparbejdes til et præparat.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et plasmaprodukt indeholdende en koagulationsinaktiv fraktion af FVIIIiC med FVIIIiCAg aktivitet underkastes kromatografi på en hydrofob gel efterfulgt af kationkromatografi før opar-30 bejdning til et præparat. 1 35 Fremgangsmåde ifølge krav 2-3, kendetegnet ved, at det som udgangsmateriale anvendte plasmaprodukt er en kryosupernatant plasmafraktion.