JPS62501006A - 血友病ａ抑制患者の治療のための製剤及び該製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血友病Ａ抑制患者の治療のための製剤及び該製剤の製造この発明は、血友病Ａ抑 制、を者の治療のための製剤及び該製剤の製造方法に関する。

血友病Ａは、凝固因子Ｖｌｌｌ：Ｃの欠如による先天的な病気である。この因子 は血漿中に存在し、血液から部分的に精製することかてきる。この因子（ＡＩＩ 　Ｆ　）を含む製剤は、患者の血液か凝固することかてきるようにするために血 友病Ａ患者に投与−することがてきる、この種の製剤の製造は例えば米国特許第 ：ｌ、６５２，５３０号及び国際出願ＷＯ３４１０：１６２８号に記載されてい る。これらの製剤において、因子Ｖｌｌｌ二Ｃタンパク賀は、通常、全タンパク 質の０゜１ｚを占める。より純度の高い因子Ｖｌｌｌ：（：は、親和性クロマト クラフィーによって得ることかてきる（Ｚｉ＋＊ｍｅｒｍａｎ因子ＶＩＩＩ：Ｃ タンパク質はまた完全に特徴づけられてはいないけれども、その構造の一部は知 られている（工６２、　ｌ’１８’ｌ）。分子量は約］ＯＱｋ［ｌである。

血友病Ａ患者の１０ないし２０％は、因子Ｖｌｌｌ：Ｃを欠くだけでなく、因子 Ｖｌ［ｌ：Ｃに対する抗体を生じている。このような患者は抑制患者と呼ばれ、 また、その抗体は因子Ｖ！＋！：Ｃの前凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性 を抑制するのて抑制抗体と呼ばれる（エイチ・アール・ロバーツとアール−クロ マティ、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５０．１．１９８４）。この抗体が存在すると、 因子Ｖ１目：Ｃかこれによって中和されるのて、ＡＨＦ製剤を投与しても効果か なくなり、より高い抗体濃度か誘起される。

抑制抗体は免疫測定において因子Ｖｌｌｌ：Ｃ抗原を測定するために用いること ができる（ビー・ディネセン、シー・フェダーソン、　Ｔｈｒｏｓｂ、　Ｒｅｓ 、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　Ｈ。

７０７、１９８：ｌ　、オー・ノートファングら、Ｔｈｒｏｍｂ。

１１ａｅｍｏｓｔａｓ、　５０．１１１．１９８３）。

抑制患者は従来、次のようにして治療されていた。

ａ）活性化プロトロンビン複合体製剤（フェイバ■、オートプレックス■）によ る治療、これらの製剤は、多量の抑制抗体が存在するにもかかわらず血漿を凝固 させることかできる未知の成分（おそらく因子Ｖｌｌａ、ニー・ヘドナーとダブ リュ・キシエル、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｓＬ、　７１゜１８：１７．１９ ８３）を含んでいる。しかしながら、活性化されたプロトロンビン複合体製剤は 、全ての抑制患者を治療できるというわけてはなく、また、患者もその抑制抗体 を治癒させることはできない。さらに、この種の製剤を用いると、血栓症を引き 起こす危険性が高い。

ｂ）抑制抗体の形成は、非常に大量なＡＨＦ（１０”ｌたり１０口ないし２００ ユニット／ｋｇ）を投与することによって抑えることかできることかわかってい る。これにより、因子ｖｔ＋ｒに対する免疫トレランスを誘導することか可使に なる（ヘイチ・ヘイチ・ブラックマンとシェイー・ボームセン、ＬａｎｃｅＬ、 　ｐ、９’ｌコ、　＋９７７）。この種の治療の後、患者は他の血友病患者と同 様にＡＨＦ製剤による治療が可使になる。しかしなから、関係のないタンパク質 か大量゛に投与−されるのて、大量のＡＨＦ治療もまた非特異的であり、患者は 治療の間、ＡＨＦｔＡ剤中の前凝固活性を利用することかてきない。

治療段階の初期において、抑制抗体濃度は増加し。

したいに減少してゼロになる。治療中、ＡＨＦて出血を阻止することはできない が、出血は上述のフェイハ■（因子８抑制剤バイパス活性）製剤によって部分的 にＩＦめることはできる。

この治療は非常に高価であり（通常患者−人当たり６００．０００米ドル、ステ ンブジャーグら、　Ｔ　ｂ　ｒ　ｏ　ｍ　ｂ　、　ＩＩ　ｅ　ｓ　。

３４、５：１３．　＋９８４　参照のこと）、従って、あまり用いられていない 。

この発明は、因子Ｖｉｌｅ：ＣＡｇ反応性を有し、因子Ｖｌｌｌ：Ｃｌｌｌ：Ｃ 全凝固活性あるいは全く右さない血漿分画から得られた成分が、抑制患者からの ７つの抗体のうち７つに対して反応性を有していたという惹くべき知見に基づく 。従って、有意なＶｌｌｌ：Ｃ前凝固活性な右さない適当に火礒のＶ１口：ＣＡ ｇを含む製剤を投与することによって、抑制ｆｔ１療は有効なものとなる。

従って、この発明の製剤は、少なくとも０．５Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ　Ｕ／ｍｇ、好 ましくは少なくともｌ　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ　１１／ａｇの特異的因子Ｖｌｌｌ： ＣＡｇ活性を有し、因子Ｖ【目：　ＣＡｇ活性と因子Ｖｌｌｌ：Ｃ活性との比が ５：ｌよりも大きく、好ましくは１０：Ｉよりも大きなことを特徴とするタンパ ク質又はペプチドを含む。製剤は、好ましくは因子Ｖｌｌｌ：Ｃｌｌｌ：Ｃ全凝 固活 性射可能な溶液の形態に製剤する場合には。

Ｖｌｌｌ：（：Ａｇ１７）ｅ度は通常１０　Ｕ／ｍｌ以玉、好ましくは５０　Ｕ ／ｍ１以上に調製される。

フェイバ■のような、抑制患者の因子Ｖｆｌｌ：Ｃ治療と並行して投与すること かてきるプロトロンビン複合体製剤はまたＶｌｌｒ：ＣＡｇを含むかその含量は 一般的にわずか４．５ｖ目１：ＣＡｇ　Ｕ／ｍｌである（アラインら、Ｐｒｏｇ ｒｅｓｓ　１ｎＣ１ｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｔ＋　１５０．　９９．　＋９８４参照）。しかしながら、フェイハ製剤は また、有意量の因子Ｖｌｌｌ：Ｃｌｌｌ：Ｃ全凝固活性り（へロウクリフら、Ｔ ｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　２１．１８１−１８５．１９８１）　、これがその効 果にとって重要な役割を果たすと考えられる。バロウクリフは、　２　Ｕ／ｍｌ ノＶｌｌｌ：ＣＡｇｅ度と１．３　Ｕ／ｍ１（７）因子ＶＩ！［：Ｃ活性とを測 定し、これは１．５：Ｉの比に対応する。

プロトロンビン複合体製剤はまた。他の多くの凝固因子、特に因子１１．Ｖ目、 （×、及びＸ、さらにおそらく因子Ｖｌｌａ、１χａ及びＸａを含み（アロンマ ン、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　１ｎＣ１ｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５０，２４３．１９８４）。

これらはおそらく血友病血漿の凝固を促進し、従って、また血友病Ａ患者の出血 を止めるのに用いることがてきる。

上述のようにこの発明の製剤は、　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ：　Ｖｌｌｌ：Ｃが少なく とも５：１、好ましくは少なくともＩＯ：Ｉであり。

さらに上述したように好ましくはＶｌｌｌ：Ｃ活性か実質的にない０通常、製剤 は他の凝固因子を含まず、血友病Ａ血漿の凝固を促進しない（第１表参照）、所 望ならば、上述したような凝固因子を加えてこれらの因子の公知の効果を追加し てもよい。

製剤の活性成分として用いられるＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　：　ＣＡｇ活性を有するタン パク質は１例えば、　５ＤＳ−ＰＡＧＥ中て二重項を示し１分子量が約８０／７ ７　ｋＤの因子Ｖｌｌｌ：Ｃフラグメント、又はトロンビン活性化によって得ら れ、二屯項を示し、およその分子量が７０／６７ｋＤであるそのフラグメントで あってよい（クオら、ｌｏｃ、ｃｉＬ、）。

クオらより、８０／７７ｋＤフラグメントは特異的抑制抗体（ｚ　Ｉｆ　ｌ　） に対しＶｌｌｌ：ＣＡｇ活性を示し、前凝固活性を示さないように思われる。し かしながら、このことから、このフラグメントは、以下に示すように、７つの抑 制抗体の７つの抑制活性を阻止することができるということは予想できなかった 。

この発明によると、血漿分画からのＶｌｌｌ：ＣＡｇ反応性を有する８０／７７ 　ｋＤのフラグメントの回収は、例えば親和性クロマトグラフィー、疎水性相互 作用クロ７トグラフイー又はカチオン交換のような種々の方法によって行なうこ とがてきる。出発材料は原則的にはいずれのＶｌｌｌ：ＣＡｇ−含有フラグメン トであってもよいが、クリオ上清（ｃｒｙｏｓｕｐｅｒｎａＬａｎＬ）　、又は 再溶解されたクリオ沈殿（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を２ないし６ 重量％、好ましくは約４玉量％のＰＥＧで沈殿させて得られた血漿分画を便利に 用いることがてきる。この沈殿は通常、さらなる血漿分画化において用いられな いのて、後者の方法は特に便利である。

この発明は、因子Ｖｌｌｌ：Ｃの８０／７７　ｋＤフラグメントの使用に限定さ れない。以下てさらに説明するように、第１ｂ図には、より小さな因子Ｖｌｌｌ ：Ｃフラグメントガ抑制抗体に対して反応性であることが示されている。同様に 、他の抑制抗体が因子Ｖｌｌｌ：Ｃ分子の他の部分に対して反応性を有すること か予想される。このように血漿から単離された因子Ｖｌｌｌ：Ｃは９２　ｋＤの フラグメントを有する（シマーマンら、米国特許第４．：１６１，５（１’１号 ）。下記第５表に示すような抑制抗体を阻止てきるフラグメントである限り、そ れらはこの発明の°一部である。

また、発明は血漿から分離された因子ＶＩＩＩ：Ｃの使用に限定されない。因子 Ｖｌｌｌ：ＣのＤＮＡ配列に基づき、因子Ｖｌｌｌ：（：遺伝子の部分断片を製 造することかてきる。それらの部分断片を適当なベクター（例えばプラスミド又 はウィルス）に挿入することかてきる。これらのベクターな適当な宿主細胞（例 えば大腸菌、酵母、　Ｃｌｌ０１ＣＯ８又は他の動物細胞）に挿入し、因子Ｖｌ ｌｌ：Ｃの部分フラグメントを製造できるように細胞を変えることができる。

これらのフラグメントは、実質的に因子Ｖ目１：Ｃ前凝固活、／−性を有するこ となく第５表に示すような抑制抗体を阻害することかで゛きると予想される。な ぜなら、これらは、血漿から分離された対応するペプチドと同じ分子構造を有し ているからである。従って、このようなフラグメンる。

抗体の反応性 数人の著者（ヘイチ・ビー・ムラ−ら、　Ｂｌｏｏｄ　５８゜１０（１（１，１ ９８２，ビー・ソラら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、’。

ＵＳＡ　７９．１９８３．１９８２）が、因子Ｖｌｌｌ：Ｃニ対する単一クロー ン抗体の製造を記載している。これらの抗体はマウスを因子Ｖｌｌｌ：Ｃで免疫 化した後、肺細胞と腫瘍細胞とをケーラーとミルスタイン（Ｎａｔｕｒｅ　２５ ５．４９５．　Ｉ’９８５）によって記載されたように°して融合することによ って得ることがてきる。この方法を用いることによって、因子Ｖｌｌｌ：Ｃに対 する単一クローン抗体か製造された（それぞれ４２１ｇＧ、４７１ｇＧ、５６１ ｇＧと呼ばれる）。

第１ａ図は、弔−クローン抗体を用いた固相免疫分離を示している。プラスチッ クビーズをマウス免疫グロブリン／巾−クローン抗体に対する抗体て覆った。ビ ーズを洗った後　１２５１でラベルした因子Ｖｌｌｌ：Ｃと共にインキュベート した。因７−Ｖｌｌｌ：Ｃはイー・ツデンハムら（Ｊ。

１．ａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｃｄ、　９３．４０．１９７９）に記載されたよう にして製造した。ビーズを洗った後、ＳＤＳ試料緩衝液で抽出し、溶ｍ物をＳＤ Ｓゲルに架けた。図はＳＤＳゲルのオートラジオグラムを示している。

レーンｌニドレーサー（”Ｊてラベルされた因子Ｖｌｌｌ：Ｃ）　、　レーン２ ：正常マウＸＩｇＧ　、　Ｌｙ−ン３　：　４２！ｇＧ　、レーン４・４７１ｇ Ｇ、レーン５・５６１ｇＧ第１ａ図より、これらの抗体は因子Ｖ目に〇の８０／ ７７ｋＤ成分（レーン３．４，５）と結合するように思われる。これはヒト抑制 抗体ｚｌｌｌによって結合された成分と同じである。

第１ｂ図は、第１ａ図の試験と同様に、ビーズに結合されたｚｌｌｌと分解され たＶｌｌｌ：Ｃ試料とを用いて行なった固相免疫分離を示す、第１ｂ図より、　 ｚＨｌに対するＶｌｌｌ：ＣＡｇ活性を有する８０／７７　ｋＤ二重項以外のペ プチドも分解試料中には存在するように思える。

第２図は、７つの抑制抗体のうち７つがＶＩＩ：ＣＡｇ抑制試験においてｚｌｌ ｌの結合を阻ＩＦすることができることを示している。ｚｌｌｌ抗体は８０／７ ７　ｋＤ二重項に結合するのて、他の抑制抗体もまた、この因子Ｖｌｌｌ：Ｃの フラグメントに対する反応性を有しているはすである。試験は次のようにして行 なった。マイクロタイタープレートのウェルをｚ　Ｉｔ　［免疫グロブリンでコ ーティングした。洗浄した後、因子Ｖｌｌｌ：Ｃ含有血漿を加え、さらに洗浄し た後、抑制免疫グロブリンをペルオキシダーゼでラベルされたｚ　Ｉｔ　Ｉ抗体 と共に加えた。抑制免疫グロブリンに代えて緩衝液を加えることによって、ベル オキターゼ標識ｚ１１］は完全に結合した。

Ｖｌｌｌ：（：Ａｇの親和性クロマトグラフィーセファロースに結合された単一 ・クローン抗体４７１ｇＧによるＡＨＦの吸着において、Ｖｌｌｌ：ＣＡ、、の みか吸着され、凝固活性因子−Ｖｌｌｌ：Ｃは吸着されないことかわかった（第 １表）。抗原は因７−　ＶＩＩ：Ｃ及びＶＩＩＩ＋Ｃ八ｇの両方へ存在するのて 、これは驚くべきことである。しかしながら、抗原は凝固不活性Ｖｌｌｌ：ＣＡ ｇの方か因子Ｖ目１：Ｃよりも接近しやすいように思われる。

第１表 セファロースに結合された４７１ｇＧへの特異的Ｖｌｌｌ：ＣＡｇの吸着 ＡＨＦ　１石イ”　ＥＱ／Ｒａｃｅ　５Ｘ３にダ″υ免疫吸着材ＶＩ：ＣＶＭ： ＣＡｇ　’Ｊ’ｆｌ：ＣＶＩＩ［：ＣＡｇ　Ｗ：ＣＶＩＥ：ＣへＨ４７１ｇＧ／ Ｃｌ２８　８８　２７０　９０　９０　０．：１２　１：１８対照Ｃ１２［１８ ８２７０７７２４８０，１４０，０９第２表には、？Ｉｉ−クローン抗体を有す る免疫吸着材からＶｌｌｌ：ＣＡｇを溶離させるのに、エチレングリコール（Ｅ Ｇ）と共に種々の塩を用いることがてきることを示している。ＥＧにあまり溶け ないＭｇＣ１，は、ＥＧの不存在下て溶離のために用いることかできる。

第２表 ５６１ｇＧからのエチレングリコール溶離における種々の塩の効果 Ｘｔ４　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ単位 ＡＨＦ（／Ｊｌｚディオクト＠）　２１０流通　＋１１０ 溶離液：　５０％　ＥＧ／飽和ＮａＣｌ　２２溶離液：　５０％　ＥＧ／　ｆｆ ｉ和ＫＣＬ　Ｉ　９溶離液：　５０％　ＥＧ／２Ｍ　Ｋｌ　３．６溶敲液：　５ ０！　ＥＧ／２Ｍ　ＣａＣＬ　２．２溶敲液：２Ｍ　閘ｇｃ１．　２２ 溶敲液：　５０％　ＥＧ／飽和ＮａＡｃ　２４セフアロースに結合した５６１ｇ Ｇを用いると、ラジオ上清からＶｌｌｌ：１１：八ｇを精製することが可能であ る。ラジオ上清は０．４　ＶＩＩ：ＣＡｇ　Ｕ／ａｔな含み、全タンパク質のｌ ｐｐｍ未満かＶｌｌｌ：ＣＡｇである。第３表には、１つの１程で８０００倍の 精製が可能てあり、　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇの比活性がタンパク質１＋ａｇ当り６１ 単位である製剤のｔＡ造が可能になることを示している。これは現存するＡＨＦ 製剤の比活性よりも有、αに高い。

より精製されていないＡＨＦからの高純度（ＩＩＰ）製剤の製造においては、４ ％のＰＥＧ沈殿か発生し得る（米国特許第：ｌ、６５２，３３０号、国際出願１ ０８４１０３６２８号）、コの沈殿はＶｌｌｌ：ＣＡｇを含んでおり、第３表か られかるように、この沈殿をＶｒｌｌ：ＣＡｇ精製のための出発材料として用い ることか可能である。わずか０．２５ｍ１の免疫吸着筆を用いて、再溶解された ４＄　ＰＥＧ沈殿１４０　ｍｌから９２０　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ中位を精製するこ とが可能である。得られる製剤はタンパク質ｌ■ｇ当たり６９０（１位の比Ｖｌ ｌｌ：ＣＡｇ活性を有していた。

セファロースＣＩ　２Ｂに結合されたヒト抑制御ｇＧを用いて、再溶解された４ ％　ＰＥＧ沈殿からＶｌｌｌ：ＣＡｇを精製することも可ｆ＠である（第３表） 。しかしながら、Ｖｌｌｌ：ＣＡｇの収量は、単一クローン抗体を用いた場合よ りも少ない。なぜなら、、５０％エチレングリコールと２．５１　ＮａＣ１との 混合物は結合したＶＩＩ：ＣＡｇを定量的に溶離することがてきないからである 。上述の試験は下記実施例２〜４においてさらに詳細に記載されている。

第３表 ５６１ｇＧ及びヒト抑制御ｇＧを用いた、種々の出発材ネ１からのＶｌｌｌ：（ ：八ｇの精製 （実施例２） ラジオ」二清５００Ｉｌｌ　２００　３０．０００　０．００７クリ第１二？Ｉ ＋７　、流通、５００＋ｓｌ　１００　３０，０００　０．００：１（実施例３ ） ４％　ＰＥＧ沈殿１４０　ｍｌ　＋５００　５．２００　０．２９４％　Ｉ’Ｅ Ｇ沈殿、流通、１４０ｍ１　３４０　５，２００　０．０７（実施例４） Ｉ　Ｉ’ＥＧ沈殿１１０１１０００　：ｌ、４００　０．２９［ＰＥＧ沈殿、流 通、ＩＩＯ＋ｓｌ　：１４０　Ｊ４００　Ｑ、ＩＯこの発明はまた１例えば血漿 分画のような因子Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ含有溶液を、固体粒子に結合された、因子Ｖ ｌｌｌ：ＣＡｇに特異的な抗体てを含む免疫吸着材で処理し、結合したＶｌｌｌ ：ＣＡｇ？：緩衝液て溶離して製剤に加工することを特徴とする、血友病Ａ抑制 患者の治療のための因子Ｖｌｌｌ：Ｃ八、：製剤へ製造方法にも関する。加工は 通常、生理緩衝液への変更を要する。これは例えば乾燥、透析、ゲルろ過、又は イオン交換などによって行なうことかてきる。

ヒｌ〜抑制抗体又は弔−クローン抗体、好ましくは５６％ｇＧ又は４７１ｇＧを 免疫吸着材として用いることかできる。

Ｖｌｌｌ：ＣＡｇの疎水相！！二作用クロマ１〜グラフィー及びカチオン交換 Ｖｌｌｌ：ＣＡｇは、例えば血漿のようなＶｌｌｌ：ＣＡｇ含有溶液から、抗体 を利用した親和性クロマトグラフィーを用いることなく精製することができる。

すなわち、　７７／８０　ｋＤ因子Ｖｌｌｌ二Ｃ／１ｇは極めてＩｉ！基性て疎 水性であることかわがっている。これらの性質は、疎水相互作用クロマトグラフ ィー及びカチオン交換による血漿分画からの因子Ｖｌｒｌ：ＣＡｇの回収に利用 することがてきる。実施例５を参照のこと。

疎水クロマトグラフィーをこの発明に従って６ないし９．５のｐｏ丁で行なうこ とがてきる。もっとも、最も強い結合は約８．５のｐＨて得られる。フェニルセ ファロース（ファルマシア）のような疎水ゲルか用いられる。フェニルセファロ ースへの結合は塩を加えることなく起きるか、ＮａＣＩを加えることによって有 意に改善される。０．３ＭのＮａＣｌをラジオり清に加えることは適当である。

なぜなら、それはアルブミンや免疫グロブリンのような他の血漿タンパク賀の後 からの回収を妨げないからである。

再溶解されたラジオ沈殿からの４ｚＰＥＧ沈殿を用いる場合には、より高いＮａ Ｃｌ３度を採用することができる。結合した因子Ｖｌｌｌ：Ｃ八ｇは、例えば後 述する実施例５で述べる条件下において、緩衝液で溶離することかてきる。

゛　カチオン交換はこの発明に従って、８．０未満のｐＨ下で行なうことかてき る。なぜなら、このｐＨ下において結合が最良になるからである。適当な値はｐ Ｈ下５．５である。なぜなら、クリ第４ニア古中のｐＨｉはＶＩＩＩ：ＣＡｇを 損なうことなくこの値にまて下げることかてきるからである。

［ワットマン■５Ｅ５３Ｊのような強力なカチオン交換を用いることがてきる。

結合した因子Ｖｌｌｌ：Ｃ八ｇは１例えば後述する実施例５て述べる条件下にお いて緩衝液て溶離することかてきる。

これらの方法のいずれによっても、因子Ｖｌｌｌ：Ｃ八ｇの極めて選択的な精製 を行ない、極めて純粋な溶離物を得ることかてきる。Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ活性の濃 度をさらに高める場合には、上述したように、また後述の実施例５及び６で示す ように、疎水クロマトグラフィーとカチオン交換とを組み合わせることかてきる 。この場合には、例えばｒＣＭ・ファースト・フロー・セファロース」のような 弱いイオン交換か好ましい。

実施例５及び第４表かられかるように、これら２つの精製方法はＶＩＩＩ：ＣＡ ｇの種々の性質を利用しており、これらを組み合わせることによって、ラジオに 清から１１００倍の精製を行なうことかてきる。親和性クロマトグラフィーと同 様、これらの精製方法は、血漿分画のような全てのＶｒｌｌ：ＣＡｇ含有溶液に 適用することかてきる。ラジオ上清及び再溶解されたクリオ゛沈殿の４％　ＰＥ Ｇからの精製を示す第４表を参照のこと。

第４表 疎水相互作用クロマトグラフィー及びカチオン交換にょルＶｌｌｌ：（：Ａｇ（ ７）精製 （実施例５） ラジオ」−清　＋１００　１６０．０００　０．００７ＳＥ５］’からの流通　 ５０　２，０００　０．０４ＳＥ５３カラノ溶＃　：１００　３７．５　８．０ ４％　ＰＥＧ沈殿　７９８　３，０００　０．２６ＳＥ５３から（７）Ｒ通　６ ４　８３　０．７７生体外ての１固抑制実験により、この発明の精製ＶＩＩ［： ＣＡ、、は、生住内てもまた効果を有することが示されタ、凝固抑制試験におい ては、抑制御　ｇＧの正常血漿に対する凝固抑制効果が測定される。５０％の抑 制をグーえる希釈率はベセスダ単位て表わされる（シー・ケイ・カスバー　ら　 、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄ　１ａｔｈ、Ｈａｃｍｏｒｒ、：１４．　８６０．　１９７ ２）　。

６人の異なる抑制患者から得た約３ベセスダ単位の抑制御ｇＧを有する正常血漿 をインキュベートしたもの、及び対照として上述したｚｌｌｌ　ＩｇＧを有する ものの比較実験の結果が第５表に示されている。この実験は、ＩＱＧＶｌｌｌ： ＣＡｇ　Ｕ／■１を有するこの発明の製剤の存在下で又は不存在下て行なうた。

第５表より、この発明の精製Ｖｌｌｌ：ＣＡｇは、　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇを含まな い試験結果に比較して顕著な抑制抗体阻害効果を示すことがわかる。すなわち、 全ての抗体のベセスダカ価は２５％以上減少した。このことは、試験した７つの 抗体全ての抑制効果は、因子Ｖｌｌｌ：Ｃの８０／７７　ｋＤに対する反応性の 故であることを示している。

第５表 ８０／７７−Ｖｌｌｌ：ＣＡｇニよる凝固抑制の阻害ＩＩＺ（ｚｌｌｌ）　０　 ８２ 上記７つの抗体は、１９８４年１０月３０口にコペンハーゲンのスタテンス・エ ルミンスチツット（州立血清研究因子【Ｘ抑制患者の血液を、因子］Ｘか結合さ れたカラムに流通させることによって、この血液から因子ｌ×を除去することが 回部である。（シー・フレイバーブハウス、Ｔｈｒｏｓｂ、ｌＩａｇｍｏｓＬａ ｓ、５０．　１０８．　１９８３）　。

一方、同様にして因子Ｖｌｌ＋抑制抗体を特異的に除去することはてきない、こ れはいくつかの理由に基づく　。

１）ＡＨＦ製剤は因子Ｖｌｌｌ：ＲＡｇをも含むノテ、ＡＨＦ製剤中の因子Ｖｌ ｌ＋の分子用は通常１．０００ないし２，０００　ｋＤである。従って、因子Ｖ ｌｌ＋はゲルに非常に弱く結合する。

２）因子ｖ１１！複合体を結合する場合には、　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇはνＩ　Ｉ　 Ｉ　：　ＲＡｇ又は因子ｖ１目の他の部分を介して結合することかできる。従っ て、Ｖｌｌｌ：ＣＡｇは使用中に結合ゲルから容易に洗い流されてしまう。

これらの条件はここで記載した精製されたＶｌｌｌ：ＣＡｇには適用されない。

従って、この発明のＶｌｌｌ：ＣＡｇはセファロースゲルのような固体マトリッ クスに適当に結合することかてき、例えば因子Ｖｌｌｒ抑制思名の体外ての特異 的吸着、処置などにおいて免疫吸着材として適当に用いることができる。

上述した種々の方法によるこの発明の製剤の製造を次の実施例でさらに例示する 。結果のうちのいくつかは既に記載した表中に示されている。

実施例１ ５ｍｇの４７　ＩｇＧを、　０．５ｇのＣＮＢｒて活性化したセファロース４Ｂ 　５１に結合した。ＩＮグリシン（ｐｌ＋８．５）てブロウクし、溶離緩衝液サ イクラス（ｃｙｃｌｕｓ）て洗った後、４００　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ　Ｕ／ｍｌを 有するＡＩＩＦ　（ノルディオクト（ン）１００１と共に一夜インキユベートし た。ゲルをカラムして２０１の緩衝液Ａ（２ｈＭイミダゾール、１０　ｍＭ　Ｃ ａＣＩｚ　、。

０．１５　Ｍ　ＮａＣ１，０，０２＄　ＮａＮｆｆ、ｐＨ７冑）及び０．５１　 ＮａＣｌを有する１００　ｍｌの緩衝液Ａて洗った。ゲルは０．５　Ｍ　ＮａＣ １を含む５０！　ＥＧ中の緩衝液Ａて溶離した。６１の溶離物は７２００単位の ＶＩＩＩ：ＣＡｇを含んていた。第３図は、溶離された分画の５ＤＳ−ＰＡＧＥ を示す。色強度による評価によると、溶離物中のタンパク質の２５％以上が８０ ／７７　ｋＤタンパク質て０．５　Ｂの５６　ＩｇＧを０．５１のセファロース ２Ｂ／ＣＩ　に結合した。ブロッキングを行ない、溶離緩衝液サイクラスて洗っ た後、２００　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇを４１するラジオ」：清（クリオ沈殿後のプラ ズマ）　５００　ａｌｌと共にゲルを一夜インキユベートした。２Ｉｌｌの使い 捨てシリンジから作られたカラムにインキュベート混合物を通すことによってラ ジオ上清から免疫吸着材を分離した。流通物は＋００　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ単位を 含んていた。２　ｍｌの緩衝液Ｂ（５０■閤イミダゾール、０．１５１４　Ｎａ Ｃｌ、　０．０２＄　ＮａＮ３．ｐＨ７１５）と、２．５　Ｍ　ＮａＣｌを含む 緩衝液８　２．５ｍｌて洗った後、　２．５　Ｍ　Ｎａ１ｌを５０Ｘ　ＥＧ中に 含むものを含む緩衝液８　２．５ｍｌて溶離した。溶ｇＩ物は：］９　Ｖｌｌｌ ：ＣＡｇ単位（比活性６１　Ｕ／ｍｌ）、及び０．５単位のＶｌｌｌ：Ｃ前凝固 活性を有していた。に記第３表参照のこと。

実施例３ 再溶解したラジオ沈殿を、国際出願ＷＯ８４１０３６２８に記載されたように、 八１□０３に吸着させ、４％　ＰＥＧて沈殿させた。沈殿を、０．５　Ｍ　Ｎａ Ｃｌと１０　ｎＭ　ＥＤＴΔとを含むＩ／４低温体積（ｃｒｙｏｖｏｌｕｍｅ） の緩衝液て４５分間かきまぜることによって再溶解した。遠心によって濁りを除 去し。

１，５００　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ単位（比活性０．２９　Ｕ／＋ａｇ）を有すル再 溶解した沈殿を、Ｓ　ｔａｇの５６１ｇＧ／ｍｌが結合された「セファロース４ 　Ｂ　Ｊ　Ｏ，２５ｍｌ　と共に一夜培養した。実施例２に記載したようにゲル を集め、流通物は３４０　Ｖｌｌｌ：（：Ａｇ単位を含んでいた。ゲルを３ｍｌ の緩衝液Ｂ及び２．５　Ｍ　ＮａＣｌを含む２１の緩衝液Ｂて洗った。５ｏｚエ チレングリコール中に２．５　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ　１．１ｍｌて溶離 を行なった。溶離物は９２０　シＩｌｌ：ＣＡｇ単位（比活性８］ＯＩＩ／ｍｌ ）、及び０．５単位のＶｌｌｌ：Ｃ前凝固活性を有していた。Ｌ記第３表参照の こと。

実施例４ ＡＨ濾過程から得られた、１０００Ｖ［Ｉｌ：ＣＡｇを含む４ｚＰＥＧ沈殿を、 ０．５　Ｍ　ＮａＣｌとｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡをと含む緩衝液Ｂに再溶解した。再 溶解後、１０１ｇのヒト抑制御ｇＧ／ｓｌか結合された「セファロースＣｌ２Ｂ 、ゲル０．２５　ｍｌ　と共に一夜培養した。実施例２に記載したようにゲルを 回収し、流通物は：１４０　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ単位を有していた。実施例３に記 載したようにゲルを洗って溶離した。溶ｇＩ物は６８　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ中位を 含み、比活性は８３０　Ｕ／ｍｇであった。上記第３天与１１００ＶＩＩＩ：Ｃ Ａｇｅｔｔ位を含む２．６ｕ１７）り’Ｊオ上清を５　ｍＭのエチレングリコー ル−ビス−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）／　 ０．コＭ　ＮａＣｌと混合し、ｐｌｌをアルマシア）を加え、１時間インキュベ ートした。ゲルをカラム上に集め、４００ｍ１の５ＩＩＭイミタゾール／　０． ４５Ｍ　ＮａＣｌ　、　ｐＨ７，４て洗い、２５０１の５０％エチレングリコー ル１５ＩＩＭイミダゾール／ｐｌ＋７．４て溶離した。溶＃物は４４０単位ｔｆ ）　Ｖ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　：　ＣＡｇ’？：含Ａ、テｇｌ：）、比活性にｔＯ，２１ Ｕ／ｌ１１ｇタンパク質てあった。

溶離物のｐＨを５．５に調整し、「ワットマン■５Ｅ５３」型のカチオン交換体 ２５１を加え、３０分間インキュベートした。イオン交換体をカラムＬに集め、 ５０１の５０１Ｍリン酸塩／　５　ｍＭＥＧＴＡ／　ｐＨ７，４で洗った。Ｖｌ ｌｌ：ＣＡｇは３５１のＩ　ＭＮａＣｌ／　５０　ｓＭリン酸塩／　５　ｍＭＥ ＧＴＡ／ｐＨ７，４て溶離した。溶Ｓ物は３００単位のＶｌｌｌ：ＣＡｇを含ん ており、比活性は８．ＯＵ／■ｇタンパク賀であった。

実施例６ 国際出願１０８４１０３６２８の記載された方法に従ったＡ１１Ｆから（：１０ ０Ｊｉ１７）血漿から）（７）４ＸＰＥＧ　５００　ｇ　を３．７文の５０　ｍ Ｍリン酸塩／　０．７５　Ｍ　ＮａＣｌ１５＊ＭＥＤＴＡ／ｐＨ８，５に再溶解 し、ｐＨを０．５　Ｍ　Ｎａ０１ｌて８．５に調整し、ろ紙を通シテロ過すルト 、溶液（ｉｊ７５００　Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ単位と１９，０００ｍｇのタンパク質 とを含んていた。再溶解した沈殿を２５０１のフェニルセファロースゲルを含む カラムに流速３．７文ハて１１！、通させた。フェニルセファロースを１．３１ の２５鳳−リン酸塩１５％エチレングリコール／　ｐＨ７，４で、流速３．７１ ／ｈＹ：洗った。＋１．５００　ＶＩＩＴ：ＣＡｇ単位を有する２　０　ＩＩ　 Ｏｔｍ　ｇのタンパク質（比活性６．８　Ｕ／■ｇタンパク質）が１．３交の２ ５　ｍＭリン酩基塩／６５ｚエチレングリコール／ｐ１１７４中に溶離した。溶 ａ物を終濃度５０１ＭのＮａＣｌと混°合し、ｐｌｌを７．０に調整した。溶離 物を、６．２５　ｍｌの「０Ｍファースト・フロー・セファロース」　（ファル マシ通した。カラムを６０１のＩｈＭリン酸塩１５０　＋ｓＭ　ＮａＣｌ　／ｐ １１７．：ｌて流速５００ｍ１／ｈて洗った。４．９　ｍｇのタンパク質（比活 性２，２００　Ｕ／ｍｇ）を有す；Ｓ　ＩＱ、８００Ｖ目１：ｃＡｇ単位か、！ ８１の５ｍＭリン酸／０．５　Ｍ　ＮａＣ１／７１／２１サツカロース、ｐＨ７ ｊ　（６ＱＯＶＩＩＩ：ＣＡｇ　Ｕ／ｍｌ　）中に溶離された。

菌ろ過し、６１づつを含む３つのビンに分注した。凍結乾燥後、製剤を６８°Ｃ で７２時間加熱処理した。それぞれのビンを１８■１ｚの無菌１１□０中に溶解 し、これは１９０Ｖｌｌｌ：ＣＡｇ　Ｕ／ｍｌを含んティた。

実施例７ ＣＭイオン交換体を溶離するのに５０　ｍＭ　Ｎａ１ｌＣＯｉ。

０．５　Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，３を用いることを除き、実施例６に従ってＶｌ ｌｌ：ＣＡｇを製造した。溶離物のｐＨを８．５に調整し、溶＃物３ｍｌ中の４ ８００ＶＩＩＩ：ＣＡｇを、ＣＮＢｒて活性化された１ｍｌの「セファロース４ ＢＪに結合した。結合ゲルは１ＭクリシンｐＨ８，５てブロックした。

２００　ｐ、　ｌ　ノＶＩＩＩ：ＣＡｇｔ’　７　ｙ　ｒＪ　−Ｘ　４　Ｂゲル な、因子Ｖ１１１抑制患者からの血漿６．４１と共に３７°Ｃて２時間インキュ ベートした。インキュベーション前には、血漿は２２８１／ｓｌの抑制抗体を含 んていた。インキュベーション後、抗体の鼠は１．８８１１／＋Ｉに減少してい た。３１１Ｎ　ＩＩ　４３　ＣＮて再活性化した後、２００　ルｌのシＩＩＩ： Ｃへｇセファロース４Ｂゲルを因子Ｖｌｌｌ抑制患者からの血漿６．４１と共に ３７℃て２時間再びインキュベートした。このインキュベーションにおいて、抑 制力価は３．５　ＢＵ／＋Ｉに減少した。

図面の簡単な説明 ＦＩＧ、１ａ ＦＩＧ、１ｂ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ し内１（瞥ずマ１・１１６１１ｍ１＾膠１−４−幅ｓｌ劇−１内Ｎ＆ＰＣＴ／Ｄ に８５１００１０５ｗｗｎｍｓｍ　＾＠Ｂｍｇ＋ｍ　ｓ＆ＰＣＴ／ＤＫ８５１０ ０１０５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも０．５Ｕ／ｍｇタンパク質の特異的因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ活性 を有するタンパク質又はペプチドを含む、血友病Ａ抑制患者の治療のための製剤 において、因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ活性と因子ＶＩＩＩ：Ｃ前凝固活性との比が５ ：１、好ましくは１０：１よりも大きいことを特徴とする製剤。 （２）因子ＶＩＩＩ：Ｃ前凝固活性を実質的に含まないことを特徴とする請求の 範囲第１項記載の製剤。 （３）例えば因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ若しくはＸ又はそれらの活性化された形態 のような、他の凝固因子を実質的に含まないことを特徴とする請求の範囲第１項 又は第２項記載の製剤。 （４）因子ＶｌＩＩ：ＣＡｇ活性を有するタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ り決定される分子量が８０／７７ｋＤ又は７０／６７ｋＤである因子ＶＩＩＩ： Ｃ分子の部分であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の製剤。 （５）因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ活性を有するタンパク質は、抗原部位を含む、生物 合成的につくられたペプチド配列であって、囚子ＶＩＩＩ：Ｃとは異なるもので あることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の製剤。 （６）因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ活性は少なくとも５０Ｕ／ｍｌである請求の範囲第 １項ないし第５項のいずれか１項に記載の製剤。 （７）因子ＶＩＩ：ＣＡｇに対して特異的な、固体粒子に結合された抗体を含む 免疫吸着材で因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ含有溶液を処理し、結合されたＶＩＩＩ：Ｃ Ａｇを緩衝液で溶離４し、製剤に加工することを特徴とする請求の範囲第１項記 載の製剤の製造方法。 （８）免疫吸着材はヒト抑制抗体又は単一クローン抗体、好ましくは５６１ｇＧ 又は４７ｌｇＧを含有することを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。 （９）因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ含有溶液をカチオン交換クロマトグラフィーに架け 、その後製剤に加工することを特徴とする請求の範囲第１項記載の製剤の製造方 法。 （１０）因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ含有溶液は、疎水ゲル上でのクロマトグラフィー により予め精製されていることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。 （１１）因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ含有溶液としてクリオ上清血漿分画を用いること を特徴とする請求の範囲第７項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。 （１２）再溶解されたクリオ沈殿を２ないし６重量％、好ましくは約４重量％の ＰＥＧで沈殿させて得られる血漿分画を因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ含有溶液として用 いることを特徴とする請求の範囲第７項ないし第１０項のいずれか１項に記載の 方法。 （１３）因子ＶＩＩＩ：Ｃ抑制抗体に対する反応性を有し、因子ＶＩＩＩ：ＣＡ ｇ活性が約１０Ｕ／ｍｌよりも大きいタンパク質又はペプチドを、血友病Ａ抑制 患者の治療のための製剤の製造に活性成分として用いる、上記タンパク質又はペ プチドの用途。 （４）因子ＶＩＩＩ：Ｃ抑制抗体及び因子ＶＩＩＩ：ＣＡｇ活性に対する反応性 を有し、ＳＤＳ　ＰＡＧＥにおいて分子量約８０／７７ＫＤの二重項を示すタン パク質を、血友病抑制患者の治療のための製剤の製造において活性成分として用 いる上記タンパク資の用途。 （１５）請求の範囲第１項ないし第６項記載のタンパク質若しくはペプチド、又 は請求の範囲第７項ないし第１２項記載の方法により製造されたタンパク質若し くはペプチドを、免疫吸着材として用いる、上記タンパク質又はペプチドの用途 。