ES2133310T5 - Reactivo de tiempo de protrombina que utiliza factor de tejido. - Google Patents
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Abstract
LOS CRONOREACTIVOS DE PROTOMBINA COMPRENDEN UNA NUEVA COMPOSICION DE LIPOSOMAS EN LA CUAL EL FACTOR TEJIDO ESTA ASOCIADO CON EL INSERTADO EN LA BICAPA FOSFOLIPIDA DE LOS LIPOSOMAS. LA COMPOSICION DE LIPOSOMAS SE PUEDE AJUSTAR PARA PERMITIR UNA MAXIMA ACTIVIDAD DE COAGULACION Y UNA SENSIBILIDAD A LOS FACTORES DE COAGULACION EXTRINSECOS. SE DESCRIBEN TAMBIEN, LOS METODOS PARA PREPARAR TALES COMPOSICIONES LIPOSOMICAS.
Description
Reactivo de tiempo de protrombina que utiliza
factor de tejido.
La presente invención se refiere a un reactivo
de tiempo de protrombina (PT) que utiliza factor de tejido humano
natural o recombinante reconstituido purificado (rTF). Más
particularmente, la invención se refiere a la reconstitución de
factor de tejido (TF) en vesículas o micelas fosfolípidas para
producir un reactivo PT basado en factor de tejido. Un reactivo de
este tipo permite la supervisión específica de terapia
anticoagulante oral y las deficiencias en la trayectoria extrínsica
de la coagulación.
En general, los liposomas son una categoría
general de vesícula que comprende una o más bicapas lípidas que
rodean un espacio acuoso. Dentro de esta categoría, son vesículas
unilamelares compuestas de una sola membrana o bicapa lípida, y
vesículas multilamelares compuestas de muchas membranas concéntricas
(o bicapas lípidas). Los liposomas son preparados comúnmente a
partir de fosfolípidos. Szoka, F. y Papahadjopoulos, D., Ann. Rev.
Biophys. Bioeng., 9: 467-508 (1980). Las
micelas son diferentes de los liposomas. Las micelas se forman
cuando moléculas que poseen tanto propiedades hidrófobas como
hidrófilas, tales como detergentes, son colocadas en medio acuoso.
Las porciones hidrófobas de las moléculas se agregan evitar el medio
acuoso. En su estado más simple, las micelas pueden ser esféricas;
no obstante, forman agregados (bicapas) de varias configuraciones y
tamaños. Las micelas se diferencian de los liposomas en que tienen
un interior hidrófobo en lugar de un interior acuoso. Por ejemplo,
las cabezas hidrófilas de las moléculas detergentes que comprenden
la micela se dirigen hacia afuera en el agua, mientras que las
colas hidrófobas se unen en compañía con otras estructuras
hidrófobas similares. Davis, B.D. y Dulbecco, R. "Sterilization
and Disinfection" Microbiology, 3ª Edición, página 1270,
Harper & Row (Davis, B.D., y col., 1980); Mahler, H.R. y Cordes,
E.H., Bilogical Chemistry, Segunda Edición, Harper & Row
Publishers, páginas 712-714,
(1971).
(1971).
Los liposomas han sido utilizados como un
sistema de suministro de fármaco. Este método aprovecha la ventaja
del hecho de que los liposomas tienen una bicapa lípida
relativamente impermeable que puede encerrar un espacio acuoso
interior y de esta manera proporcionar un método para encapsular
completamente varios fármacos dentro de este espacio interior.
Szoka, supra, en la página 468. Un aspecto importante de un
sistema de suministro de este tipo sería que el fármaco de
ingrediente activo no está disponible al medio acuoso fuera del
liposoma hasta que alcanza su objetivo. Janoff y col., Patente de
los Estados Unidos, Nº de Serie 4.880. 635 (1989).
La Patente de los Estados Unidos Nº 4.857.319
describe métodos de preservación de liposomas utilizando un
reactivo que preserva disacáridos, de manera que los contenidos
encapsulados son retenidos después de la rehidrata-
ción.
ción.
Se ha observado que los tejidos de los
vertebrados, cuando se añaden a plasma citrado y se recalcifican,
acelerarán profundamente el tiempo de coagulación. Este
constituyente de tejido que se ha observado que activa las cascadas
de proteasa de coagulación es referido comúnmente como
tromboplastina o factor de tejido (TF).
En 1935, el uso de tromboplastina (factor de
tejido procoagulante) se describió por primera vez en un ensayo PT
de una etapa (Quick, J. Biol. Chem., 109:
73-74, 1935). Este ensayo empleaba tromboplastina
derivada de tejido de mamífero y una curva estándar preparada con
diluciones de plasma humano normal recogido. La versión moderna de
este ensayo es fácil de realizar y puede automatizarse.
El ensayo de tiempo de protrombina (PT) es la
prueba más comúnmente realizada en el laboratorio de coagulación.
Las variantes de este ensayo tienen varios usos (White y col.,
Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical
Practice, Coleman, y col., Eds., J.B. Lippencott Co.,
Filadelfia, páginas 1048-1060, 1987). Un uso es para
determinar las deficiencias en la trayectoria extrínsica de la
coagulación (factores VII, X, V, y protrombina). Un segundo uso es
para supervisar pacientes que se someten a terapia anticoagulante
oral de larga duración por trastornos tales como trombosis venosa
recurrente y cáncer (Hirsh, J., Seminars in Thrombosis and
Hemostasis, 12: 1-11, 1986). Un tercer uso
es para evaluar la disfunción del hígado.
El intervalo terapéutico de terapia
anticoagulante está basado en evitar hemorragias y complicaciones
trombólicas. Cuando se controla la terapia anticoagulante oral, así
como para una variedad de otras condiciones por el ensayo PT, un
alargamiento del tiempo de protrombina en un factor de 2 es más
deseable para terapia de larga duración (O'Reilly, Hemostasis
and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman,
y col., eds. , J.B. Lippencott Co., Filadelfia, páginas
1367-1372, 1987). Este factor de alargamiento es
definido como la relación de protrombina (PR) y se calcula
dividiendo el PT de un plasma de paciente por el PT de un depósito
de plasmas de individuos normales. Un PR mayor indica un reactivo PT
más sensible. Las ventajas de un reactivo más sensible para
supervisar la terapia de anticoagulación es el uso de dosis menores
de fármaco anticoagulante. Estas dosis menores proporcionan todavía
protección adecuada contra enfermedad tromboembólica al mismo tiempo
que reducen al mínimo las complicaciones de hemorragia.
La Patente de los Estados Unidos Nº 3 179 567
describe un reactivo útil para medir simultáneamente, en un ensayo
individual, la coagulación sanguínea tanto en proporciones
intrínsecas como extrínsecas. El reactivo incluye como una
tromboplastina débil extractos de tejido que no están
substancialmente purificados, junto con cefali-
na.
na.
Wingaards y col., Biochem, Biophys Acta
488 161-171 (1977) describen ciertos
estudios relacionados con actividad tromboplastina medida después
de recombinación de una fracción de proteína inactiva de
tromboplastina o bien con un fosfolípido puro o con combinaciones
binarias de fosfolípidos puros.
Varios reactivos para determinar PTs están
disponibles comercialmente. Estos incluyen Thromborel S (Curtis
Matheson Scientific, Inc., Yorba Linda, CA) y Simplastin (Organon
Teknika Corp. Charlotte, NC). Estos reactivos producen PTs muy
diferentes para el mismo plasma del paciente, mostrando Tromborel S
un tiempo mayor que Simplastin. Son requeridas, por lo tanto, dosis
menores de fármaco anticoagulante para mantener tiempos PT
prolongados (PR alto) cuando los PTs son supervisados utilizando
Tromborel S en lugar de Simplastin. Existe una necesidad de un
reactivo PT basado en factor de tejido humano incluso más sensible
para supervisar la terapia anticoagulante y otras condiciones. La
presente invención proporciona un reactivo sensible de este tipo con
su PR muy
deseable.
deseable.
La presente invención se refiere a reactivos de
factor de tejido que comprenden composiciones de liposomas que
tienen factor de tejido asociado con la bicapa lípida, donde la
bicapa lípida comprende una mezcla de fosfolípidos y a métodos para
la preparación de tales composiciones según se definen en las
reivindicaciones. La relación de la bicapa lípida de los
fosfolípidos en los liposomas proporcionados, permite máxima
actividad coagulante del reactivo de factor de tejido resultante y,
por lo tanto, sensibilidad mejorada del reactivo con respecto a los
factores de coagulación extrínsecos que se determinan.
Entre otros factores, la presente invención está
basada en los descubrimientos sorprendentes de que se ha encontrado
que el reactivo de factor de tejido de este invención comprende
liposomas que tienen factor de tejido asociado con su bicapa lípida
que es un complejo coagulante activo, un complejo que es capaz de
conversión eficiente de la proenzima, factor VII, en la proteasa de
coagulación activa, factor VIIa. Este descubrimiento fue
sorprendente, puesto que ningún factor de tejido sólo en solución,
ni la mezcla fosfolípida que forma la bicapa lípida de liposomas
sola, son activos como un reactivo de tiempo de protrombina. Se ha
descubierto también que las composiciones de la presente invención
que comprenden adicionalmente glicina muestran rendimiento
substancialmente mejorado en pruebas PT haciendo que los tiempos de
protrombina para plasma humano normal sean equivalentes a los de
los controles comerciales diseñados para imitar el plasma
humano.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto
preferido, la presente invención se refiere a reactivos de factor
de tejido que comprenden composiciones de liposomas útiles para
determinar tiempos de protrombina, comprendiendo dichas
composiciones de liposomas factor de tejido asociado con la bicapa
lípida de los liposomas (o vesículas fosfolípidas), preferentemente
en un tampón que contiene tanto crioconservante como glicina. En
otro aspecto, se refiere a un método para preparar estas
composiciones.
En un aspecto preferido de la invención, el
método de preparación de liposomas utiliza un detergente que tiene
una concentración de micelas crítica relativamente alta para
solubilizar fosfolípidos altamente purificados. Un detergente
especialmente preferido es el detergente zwitteriónico,
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propansulfonato
(CHAPS). El factor de tejido, también solubilizado en detergente,
es añadido con una proteína portadora y el detergente es entonces
retirado. El detergente puede retirarse convenientemente por métodos
convencionales, tales como por diálisis, por tratamiento de resina o
por dilución en una solución libre de detergente. Los liposomas que
tienen factor de tejido asociado con e insertado en su bicapa
lípida se forman espontáneamente a medida que se reduce la
concentración de detergente de la solución circundante.
"BHT" se refiere a hidroxitolueno
butirado.
"CHAPS" se refiere a
3-[(3-colamidopropil)-dimetil-amonio]-1-propansulfonato.
"MOPS" se refiere a ácido
3-(N-morfolino)-propansulfónico.
"OTG" se refiere a octil
beta-D-tioglucopiranosido.
"Fosfolípido" se refiere a una molécula
orgánica derivada o bien de glicerol (más comúnmente) o de
esfingosina. Los fosfolípidos derivados de glicerol (o
fosfoglicéridos) comprenden una columna vertebral de glicerol, dos
cadenas de ácidos grasos esterificadas al primer y segundo carbones
del glicerol y ácido fosfórico esterificado al tercer carbono.
Opcionalmente, una fracción alcohol es esterificada al ácido
fosfórico.
\newpage
"PC" se refiere a fosfatidil colina, un
fosfoglicérido descargado que tiene una fracción de alcohol derivada
de colina es esterificado al ácido fosfórico.
"PE" se refiere a fosfatidil etanolamina,
un fosfoglicérido cargado positivamente que tiene una fracción de
alcohol derivada de etanolamina es esterificado al ácido
fosfórico.
"PG" se refiere a fosfatidil glicerol, un
fosfoglicérido cargado negativamente, que tiene una fracción de
alcohol derivada de glicerol es esterificado al ácido fosfórico.
"PS" se refiere a fosfatidil serina, un
fosfoglicérido cargado negativamente, que tiene una fracción de
alcohol derivada de serina es esterificado al ácido fosfórico.
"Tiempo de Protrombina" es abreviado como
PT y se refiere al intervalo de tiempo entre la adición de un
reactivo de tiempo de tromboplastina o protrombina y la aparición
de un coágulo en el plasma citrado, pobre en plaque-
tas.
tas.
"Relación de Protrombina" es abreviado como
PR y se refiere al tiempo de protrombina de un plasma de individuo
(o bien normal o anormal) dividido por el tiempo de protrombina de
depósito de plasmas de individuos norma-
les.
les.
"rTF" se refiere a factor de tejido
recombinante.
"TBS" se refiere a 20 mM Tris (pH 7,5) que
contiene 150 mM de cloruro de sodio.
La figura 1 muestra las relaciones de
protrombina de reactivos PT, reactivo rTF PT y Thromborel S, como
una función de actividad de factor porcentual.
La figura 2 muestra las sensibilidades relativas
de reactivos PT con respecto a plasmas de pacientes que se someten
a terapia anticoagulante oral.
La presente invención proporciona reactivos de
factor de tejido que comprenden liposomas que tienen factor de
tejido asociado con la bicapa lípida de los liposomas, de tal manera
que el factor de tejido es insertado a través de la bicapa
lípida.
La bicapa lípida de los liposomas comprende
fosfolípidos, preferentemente, fosfoglicéridos.
Alternativamente, de acuerdo con otro aspecto de
la presente invención, están previstos reactivos de factor de
tejido que comprenden composiciones de micelas fosfolípicas que
tienen factor de tejido asociado con las micelas fosfolípidas, de
manera que el factor de tejido es insertado en la micela.
Los reactivos del factor de tejido de la
presente invención comprenden desde aproximadamente 0,1 \mug hasta
aproximadamente 3 \mug de factor de tejido natural o recombinante
por mg de mezcla de fosfolípidos. La relación de factor de tejido
con respecto a mezcla de fosfolípidos puede determinar la
sensibilidad del reactivo de factor de tejido resultante. Por lo
tanto, el uso de una relación de aproximadamente 1 a 2 \mug de
factor de tejido por mg de mezcla de fosfolípidos puede ser
adecuado para un reactivo de factor de tejido que tiene un Indice
de Sensibilidad Internacional ("ISI") de aproximadamente 1,0.
El uso de una relación de aproximadamente 0,25 hasta
aproximadamente 0,5 \mug de factor de tejido por mg de mezcla de
fosfolípidos puede se adecuado para preparar un reactivo de factor
de tejido que tiene un ISI de aproximadamente 1,6 hasta
aproximadamente 2,0. Se prefieren reactivos de factor de tejido que
comprenden adicionalmente desde aproximadamente 0,5 hasta
aproximadamente 1,5% (p/v) de glicina. Donde se desee poder
liofilizar el reactivo de factor de tejido para permitir
almacenamiento y posterior reconstitución, el reactivo incluye
preferentemente un crioconservante, preferentemente un conservante
carbohidrato, más preferentemente
trehalosa.
trehalosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fosfolípidos adecuados para uso en las
composiciones de liposomas de la presente invención incluyen
aquéllos que contienen ácidos grasos que tienen de doce a veinte
átomos de carbono; dichos ácidos grasos pueden ser o bien saturados
o insaturados.
Los fosfolípidos para uso de acuerdo con la
presente invención son fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina
(PE), fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidilserina (PS). Estos
fosfolípidos pueden provenir de cualquier fuente natural y los
fosfolípidos, como tales, pueden estar compuestos de moléculas con
ácidos grasos diferentes. Pueden utilizarse mezclas de fosfolípidos
que comprenden fosfolípidos de diferentes fuentes. Por ejemplo, PC,
PG y PE pueden obtenerse a partir de yema de huevo; PS puede
obtenerse a partir de cerebro animal o cuerda espinal. Estos
fosfolípidos pueden provenir también de fuentes sintéticas.
Pueden utilizarse mezclas de fosfolípidos (PL)
que tienen una relación variada de PLs individuales. Las mezclas PL
que comprenden desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 por
ciento en moles PE, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente
20 por ciento en moles de PS, desde aproximadamente 10 hasta
aproximadamente 25 por ciento en moles de PG; y el resto PC,
preferentemente desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 90
por ciento en moles de PC. Son especialmente preferidas las mezclas
de PL que comprenden desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente
12 por ciento en moles de PE, desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 10 por ciento en moles de PS, desde aproximadamente
14 hasta aproximadamente 20 por ciento en moles de PG y de
aproximadamente 58 hasta aproximadamente 75 por ciento en moles de
PC.
Aunque los fosfolípidos pueden utilizarse en
relaciones variadas, hemos encontrado que las mezclas de
fosfolípidos que tienen ciertas cantidades de fosfolípidos
individuales dan lugar a reactivos de factor de tejido que tienen
actividad y estabilidad de actividad ventajosas. Aunque puede
utilizarse una amplia variedad de relaciones de fosfolípidos
individuales, hemos encontrado que para actividad y estabilidad
ventajosas del reactivo de factor de tejido resultante debe estar
presente un cierto nivel de PS en la composición fosfolípida total.
La cantidad de PS que está presente preferentemente hasta cierta
extensión es determinada por los componentes restantes de la mezcla
de PL y sus cantidades relativas como parte de la mezcla de PL
total. Por ejemplo, el uso de cantidades altas de PG, otro
fosfolípido cargado negativamente (del orden de aproximadamente 10%
o más) permite el uso de niveles inferiores de PS; del orden de
aproximadamente 3%. No obstante, si se usa una mezcla de PL baja en
PS, es ventajoso incluir al menos aproximadamente 5% de PE,
preferentemente al menos aproximadamente
10%.
10%.
Los fosfolípidos son combinados convenientemente
en las relaciones adecuadas para proporcionar la mezcla PL para uso
en la preparación de reactivos de factor de tejido de la presente
invención. En una forma de realización preferida, la mezcla de PL
puede comprender PC, PG, PE y PS en la relación en moles de 67: 16:
10: 7,
respectivamente.
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede utilizarse o bien factor de tejido natural
o bien factor de tejido recombinante en los reactivos de factor de
tejido de la presente invención. Puede utilizarse el factor de
tejido natural o recombinante a partir de varias
especies.
especies.
El factor de tejido natural puede aislarse por
métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Broze, Jr., G. J., y
col., J. Biol. Chem., 260(20):
10917-10920 (1985); y Morrissey, J.H., y col.,
Thrombosis Research 50: 481-493
(1988).
(1988).
El factor de tejido recombinante puede
prepararse por tecnología recombinante utilizando métodos y sistemas
de expresión conocidos por la técnica. Ver, por ejemplo, Morrissey,
J.H., y col., Cell 50: 129-135
(1987); Summers, M.D., "A Manual of Methods for Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural
Experiment Station, Boletín 1555 (1987).
El factor de tejido puede purificarse por
cromatografía de inmunoafinidad u otros métodos cromatográficos
diseñados para separar una proteína específica de otros
contaminantes de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La crioconservación se refiere a preservar la
integridad de substancias delicadas cuando los líquidos que las
contienen son congelados y deshidratados. Se ha indicado el uso de
un carbohidrato como un crioconservante de la integridad de
liposomas después de la congelación y posterior liofilización.
Racker, E., Membrane Biol., 10: 221-235
(1972); Sreter, F. y col., Biochim. Biophys. Acta., 203:
254-257 (1970); Crowe y col., Biochem. J.,
242: 1-10 (1987); Crowe y col., Biochim.
Biophys. Acta., 987: 367-384 (1988).
Donde el reactivo de factor de tejido se
liofilizará, antes del almacenamiento de uso final, es preferible
incluir un carbohidrato o carbohidratos como
crioconservante(s) para proteger la integridad de los
liposomas en la composición de liposomas resultante durante la
liofilización y posterior rehidratación. Los crioconservantes de
carbohidrato adecuados incluyen trehalosa, maltosa, lactosa, glucosa
y manitol. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente
invención, la trehalosa está incluida en solución tampón acuosa
utilizada en la preparación de los reactivos de factor de tejido de
la presente invención (antes de la liofilización), preferentemente,
en una concentración en el intervalo de aproximadamente 50 mM hasta
aproximadamente 250 mM.
De acuerdo con un aspecto particularmente
preferido de la presente invención, la glicina está incluida como
un componente adicional de estos reactivos de factor de tejido. La
inclusión de la glicina en estos reactivos de factor de tejido da
lugar a reactivos que muestran rendimiento substancialmente mejorado
en pruebas PT dando tiempos de protrombina para plasma humano
normal que son substancialmente equivalentes a los de controles
comerciales designados para imitar el plasma humano. Por lo tanto,
estos reactivos de factor de tejido preferidos comprenden
adicionalmente desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1,5
por ciento (p:v) de glicina, más preferentemente desde
aproximadamente 0,6 hasta aproximadamente 1,2 por ciento de
glicina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fosfolípidos, que pueden obtenerse del
fabricante en un disolvente orgánico, se mezclan juntos en las
relaciones adecuadas para producir la composición especificada. Un
antioxidante es añadido entonces para reducir la peroxidación de la
cadena alquilo de las porciones de ácido graso de los fosfolípidos,
y el disolvente orgánico, si está presente, es retirado por
evaporación. Un antioxidante adecuado es hidroxi tolueno butirado.
Preferentemente, se utiliza aproximadamente 0,1% (en peso) de
antioxidante.
La mezcla de fosfolípidos seca (evaporada) es
disuelta de nuevo entonces con una solución de detergente acuoso.
Los detergentes adecuados incluyen aquéllos que tienen una
concentración de micelas relativamente muy crítica (CMC). Womack y
col., Biochim. Biophys. Acta, 733: 210 (1983). Tales
detergentes incluyen detergentes que tienen una CMC mayor de
aproximadamente 2 mM. Son preferidos detergentes que tienen una CMC
de entre aproximadamente 2 y 25 mM. Tales detergentes preferidos
incluyen
3-[(3-colamidopropil)-dimetil-amonio]-1-propansulfonato
(CHAPS) y alquilglucopiranosidos tales como octil
beta-D-glucopiranosido, octil
beta-D-tioglucopiranosido y
similares. Opcionalmente, la solución detergente puede incluir
otros componentes. Estos componentes pueden incluir sales tampón
tales como HEPES, Tris, fosfato, y similares; otras varias sales
como NaCl, KCl y similares; un crioconservante de carbohidrato tal
como trehalosa, maltosa, glucosa, y similares; y glicina. De
acuerdo con una forma de realización preferida de la presente
invención, la solución detergente comprende 20 mM Tris, pH 7,5, 150
mM NaCl, (TBS) que contiene 100 mM CHAPS, 150 mM trehalosa y 0,8%
de glicina. De acuerdo con esta forma de realización preferida, los
fosfolípidos son disueltos de nuevo en esta solución para dar una
concentración final de aproximadamente 20 mg/ml.
El factor de tejido y la proteína portadora son
combinados con los fosfolípidos disueltos de nuevo y el volumen de
la mezcla resultante se ajusta con un tampón como se describe
anteriormente, que contiene preferentemente crioconservante (más
preferentemente trehalosa) y glicina, pero no detergente. Como se
indica anteriormente, el factor de tejido utilizado en la
preparación de los reactivos de factor de tejido de la presente
invención puede ser o bien de una fuente natural o recombinante. De
acuerdo con una forma de realización preferida de la presente
invención, se utiliza el factor de tejido recombinante (rTF). El
factor de tejido es añadido seguido por proteína portadora, tal
como gamma globulina bovina, y se añade tampón suficiente para
ajustar las concentraciones finales de factor de tejido a 10
\mug/ml, de gamma globulina bovina hasta 1 mg/ml, de fosfolípido a
4 mg/ml y de detergente a 20 mM. Los tampones adecuados incluyen
TBS que contiene 150 mM de trehalosa y 0,8% de
glicina.
glicina.
La solución incolora, clara resultante no
requiere tratamiento con torbellino o sonicación para asegurar la
co-solubilización.
El detergente en la mezcla de
fosfolípido-factor de tejido puede retirarse por un
número de métodos resultando una composición de liposomas estable
que tiene un factor de tejido asociado e insertado a través de la
bicapa lípida. Los métodos adecuados de eliminación de detergente
incluyen diálisis, diafiltración de flujo tangencial, filtración de
fibra hueca de flujo cruzado, tratamiento con resina de
cromatografía hidrófoba, y dilución simple.
Un método preferido de retirada de detergente de
la mezcla de factor de tejido-fosfolípido utiliza
diálisis durante al menos 30 horas a temperatura ambiente en tubo
de membrana de diálisis contra un tampón tal como TBS que contiene
150 mM de trehalosa, 0,8% de glicina y 0,05% de NaN_{3} para
eliminar el detergente. Otro método preferido de eliminación del
detergente utiliza tratamiento con resina. Las resinas adecuadas
incluyen resinas cromatográficas hidrófobas tales como Amberlite
XAD-2 (Rohm and Haas Co. de Filadelfia, Pensilvania)
o Bio-Beads SM-2 (BioRad in
Richmond, California). Las resinas pueden utilizarse para eliminar
el detergente, o bien por contacto directo con la solución de
factor de tejido-fosfolípido o separado de ella por
una membrana de diálisis. La velocidad de retirada del detergente
de la solución de factor de tejido-fosfolípido es
proporcional a la relación del peso del detergente en solución y
las perlas de resina cromatográficas.
La solución de liposomas resultante de la etapa
de retirada del detergente se ajusta entonces a 5 mM de CdCl_{2}.
De acuerdo con un aspecto preferido, la solución de liposomas que
contiene el factor de tejido completamente activo se diluye hasta
una concentración de 50 mM Tris, pH 7,5, 75 mM trehalosa, 0,8% de
glicina y 10 a 15 mM de CaCl_{2} antes de uso. Alternativamente,
el reactivo diluido puede liofilizarse para conservación de larga
duración de sus características de rendimiento como un reactivo de
tiempo de protrombina y reconstituirse después por suspensión en
agua antes del uso.
Otro método preferido de retirada del detergente
evita el uso o bien de diálisis o de tratamiento con resina y se
ocupa todavía de la preparación de reactivo TF activo. De acuerdo
con este método, los fosfolípidos solubilizados con detergente que
contienen TF son diluidos en un tampón sin detergente para producir
micelas mezcladas que contienen TF que continúan siendo capaces de
activarse completamente por CdCl_{2}. De acuerdo con este aspecto
de la invención, los fosfolípidos se disuelven a 20 mg/ml en un
tampón que contiene detergente, preferentemente un alquil
glucopiranosido. Una solución de detergente-tampón
adecuada comprende 20 mM HEPES (pH 6) que contiene 50 mM de octil
beta-D-tioglucopiranosido (OTG) y
150 mM de NaCl. Se añaden entonces la proteína portadora, TF, y
CdCl_{2} y la mezcla se diluye adicionalmente con tampón sin
detergente, tal como 20 mM HEPES (pH 6) que contiene 150 mM de NaCl,
para producir concentraciones finales de TF a 10 \mug/ml,
proteína portadora (gamma globulina bovina) a 1 mg/ml, CdCl_{2} a
5 mM, fosfolípidos a 4 mg/ml, y OTG a 10 mM. El reactivo puede
liofilizarse para almacenamiento como se describe anteriormente, o
diluirse como se describe anteriormente antes del
uso.
uso.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, este reactivo puede prepararse siguiendo los métodos
para la preparación de vesículas y micelas mixtas de
detergente-fosfolípidos a partir de fosfolípidos por
métodos basados en medios mecánicos, por la retirada de disolventes
orgánicos, por la retirada de detergente y por la transformación
del tamaño como se ha descrito por Lichtenberg, D. y Barenholz, Y.,
Methods of Biochemical Analysis, 33: 337-462
(1988), y cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia.
Para contribuir al entendimiento de la presente
invención, están incluidos los siguientes ejemplos, que describen
los resultados de una serie de experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo monoclonal dirigido contra TF,
TF8-5G9, se obtuvo a partir de Dr. T.S. Edgington y
se preparó por el procedimiento de Morrissey, J.H. y col.,
Thrombosis Research, 52: 247-261 (1988). La
ascitis TF8-5G9 se purificó en IgG por
cromatografía DEAE utilizando el procedimiento como se describe en
Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual,
páginas 304-305, Cold Spring Harbor Laboratory
(1988).
La resina de inmunoafinidad se preparó por
enlace covalente del anticuerpo purificado en Affigel 10 (Biorad
Laboratories en Richmond, California) por el procedimiento
recomendado por el fabricante. Por lo tanto, 200 mg de anticuerpo
monoclonal purificado con DEAE se dializó en 0,1 M MOPS (pH 7,5)
para dar una solución de 10 mg/mL. 20 mL de esta solución de
anticuerpos se añadió entonces a 20 mL de Affigel 10. La mezcla se
la dejó entonces incubar durante la noche de 2 hasta 8ºC y se
mezcló de un modo
extremo-sobre-extremo. Después de
16 a 24 horas, se añadieron veinte mL de 0,1 M de etanolamina (pH 8)
para combinar con eventuales grupos no reaccionados y terminar la
reacción de copulación. La resina se drenó y se lavó con 0,1 M de
MOPS (pH 7,5) y la resina de inmunoafinidad se almacenó a
2-8ºC. Se observó una eficiencia de copulación de
más del 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El factor de tejido recombinante (rTF) se
purificó a partir de lisados de células utilizando el siguiente
método. Las células que producen rTF se lavaron con TBS y se
suspendieron de nuevo a 2 x 10^{7}/ml en TBS que contiene 0,25%
de Triton X100, 10 \mug/ml de inhibidor de tripsina de soja, y 1
mM de EDTA. Después de la mezcla durante 30 minutos a 4ºC, los
restos celulares se retiraron por centrifugación durante 20 minutos
a aproximadamente 5000 x 4 a
4ºC.
4ºC.
El lisado aclarado se diluyó 2,5 veces con TBS
para reducir la concentración de Triton a 0,1% y luego se pasó a
través de resina de inmunoafinidad (fabricada en el Ejemplo 1) que
contenía un anticuerpo monoclonal copulado covalentemente dirigido
contra TF. El lecho de resina se lavó con 2 a 3 volúmenes de lecho
de TBS + 0,1% de Triton X100, 2 a 3 volúmenes de 20 mM Tris, pH
7,5, 0,5 M de NaCl, 0,1% de Triton X100, y finalmente con 2 a 3
volúmenes de lecho de 0,5 M de NaCl, 0,1% de Triton X100. La
proteína ligada se eluyó de la resina con 0,1 M de glicina, pH 2,5,
0,1% de Triton X100. Las fracciones recogidas después de que el
tampón se cambió a glicina se neutralizaron inmediatamente con un
volumen adecuado de 1 M Tris, pH 8. Se encontró rTF en estas
fracciones rodeando inmediatamente el punto donde el pH del efluente
de columna había cambiado.
Se agruparon las fracciones que contenían rTF,
se dializaron contra 20 mM Tris, pH 8, 0,1% de Triton X100, y luego
se concentraron ligando el rTF a una columna de Trisacrilo DEAE de
volumen de lecho pequeño (IBF Biotechniques de Columbia, Maryland).
El Triton X100 se sustituyó con CHAPS lavando el lecho de resina con
al menos 10 volúmenes de lecho de 20 mM Tris, pH 8 que contenía 10
mM de CHAPS. El rTF se eluyó con una etapa individual de 0,5 M de
NaCl en 20 mM Tris, pH 8, 10 mM de CHAPS.
Ejemplo
3
Se obtuvieron fosfatidilcolina (PC),
fosfatodiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y
fosfatidilglicerol (PG) en solución de cloroformo de Avanti Polar
Lipids en Alabaster, Alabama, o Calbiochem Corporation de La Jolla,
California, en ampollas de cristal selladas y almacenadas bajo
N_{2} a -20ºC. Se obtuvieron CHAPS, otros detergentes y gamma
globulina bovina a partir de Calbiochem. Tris base y glicina se
compraron de BioRad Laboratories de Richmond, California. Los demás
productos químicos y bioquímicos se adquirieron de Sigma en St.
Lous,
Missouri.
Missouri.
Se prepararon los fosfolípidos por
resolubilización de la manera siguiente. PC, PE, PS y PG se
calentaron a temperatura ambiente y se combinaron en un tubo o
matraz adecuado en las relaciones molares específicas. El
antioxidante, hidroxitolueno butirado (BHT) se disolvió en
cloroformo y se añadió a la mezcla de fosfolípidos en una relación
en peso de 0,1% (BHT: fosfolípidos totales). El disolvente orgánico
se retiró por evaporación bajo una corriente de nitrógeno seco o
bajo presión reducida en un evaporador giratorio. El disolvente
orgánico residual se eliminó mediante bombeo durante una hora
adicional a temperatura ambiente con una bomba de vacío a una
presión de 10 \mum o menos. La mezcla de fosfolípidos se
redisolvió a 20 mg/ml en 20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl (TBS)
que contenía 100 mM de CHAPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los fosfolípidos se combinaron en las relaciones
molares especificadas de PC, PE, PS y PG, después fueron
resolubilizados como se describe en el Ejemplo 3. Los fosfolípidos
resolubilizados se combinaron con rTF purificado de inmunoafinidad
(del Ejemplo 2) y gamma globulina bovina. Se añadió TBS adicional
que contenía 150 mM de trehalosa para producir concentraciones
finales de 4 mg/ml de fosfolípido total, 10 ug/ml de rTF, 1 mg/ml
de gamma globulina bovina y 20 mM de CHAPS. Esta solución clara e
incolora se colocó en un tubo de membrana para dálisis
(Spectrapore®, Spectrum Medical Industries, intervalo de peso
molecular de 12.000 a 14.000) y se dializó durante al menos 30 horas
a temperatura ambiente contra TBS que contenía 150 mM de trehalosa
y 0,05% de NaN_{3}. Después de diálisis, el volumen del dializado
se determinó y se ajustó de nuevo hasta el volumen original, si se
requiere, con tampón de diálisis. Se añadió CdCl_{2} hasta una
concentración final de 5 mM y la solución se incubó a 37ºC durante
2 horas.
La solución se congeló sobre hielo seco, después
se liofilizó utilizando un ciclo que se inicia a -40ºC y que
termina a temperatura ambiente durante un periodo de 48 horas. Los
liposomas se reconstituyeron entonces a una concentración de
trabajo con 0,1 M Tris, pH 7,5, 150 mM de trehalosa para producir
una solución que contenía rTF a aproximadamente 1 a 2 \mug/ml,
fosfolípidos a aproximadamente 400 a 800 \mug/ml y gamma
globulina bovina de 50 a 100 \mug/l.
Los reactivos rTF PT, como se prepararon
anteriormente, se utilizaron para determinar los tiempos de
protrombina de plasmas de control de Thromboscreen (Curtin Matheson
Scientific de Yorba Linda, California) y de un depósito de plasma
humano normal. Por lo tanto, se colocaron 100 \mul de plasma y 100
\mul de liposomas diluidos en el pocillo de muestra de un
coagulómetro. El instrumento añadió 100 \mul de CaCl_{2} 20 mM
y determinó automáticamente el tiempo de protrombina. Los
resultados se presentan en la Tabla I siguiente.
- ^{a}
- La relación de fosfolípidos se expresa como la relación molar de fosfatidilcolina con relación a fosfatidiletanolamina con relación a fosfatidilserina con relación a fosfatodilglicerol, espectivamente.
- ^{b}
- El depósito humano normal (NHP) está compuesto de plasma recogido de 10 individuos normales, dividido en pequeñas porciones alícuotas y congelado rápidamente.
- ^{c}
- Niveles I, II, y III son plasmas de control Thromboscreen (Curtin Matheson Scientific, Yorba Linda, California), y están destinados para simular pacientes que se someten a 3 niveles o intensidades diferentes de terapia anticoagulante oral.
- ^{d}
- Este tiempo es mayor de 300 seg.
- \text{*}
- No de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos indicaron que (1) un intervalo amplio
de relaciones molares de fosfolípidos en el reactivo rTF PT es
aceptable para iniciación intermediada por rTF del mecanismo de
coagulación, (2) el reactivo requiere una composición fosfolípida
que lleva una carga negativa neta tal como PS o PG para actividad de
coagulación inducida por rTF, y (3) el reactivo requiere PE y PG
juntos cuando PS se reduce substancialmente en concentración.
Los plasmas de control utilizados en la Tabla I
están destinados para simular plasmas de pacientes que se someten a
terapia anticoagulante oral. Los tiempos de protrombina obtenidos
utilizándolos no indican una deficiencia en ningún factor de
coagulación, sino que, en su lugar, reflejan una depresión de las
actividades de varios facto-
res.
res.
Un ejemplo de cómo un reactivo rFT PT, no de la
invención, responde a los niveles reducidos de varios factores
implicados en la trayectoria de coagulación extrínseca (factores V,
VII, X) se presenta en la figura 1. Los tiempos de protrombina (PT)
fueron determinados de la siguiente manera. El depósito de plasma
humano normal se diluyó 1:2, 1:4, 1:10, 1:20 y 1:40 con 0,15 M de
NaCl para producir 50, 25, 10, 5, y 2,5% de actividad de factor,
respectivamente. Las muestras de plasma deficientes de factor
coagulación (Thromboscreen, Curtis Matheson Scientific, Inc.) se
rehidrataron como se sugiere por los fabricantes y fueron
utilizadas no diluidas. El reactivo rTF PT utilizado aquí se fabricó
con la relación de fosfolípido de 10:1:1 (PC: PE: PS,
respectivamente) y contenía 10 mM de CaCl_{2}. Thromborel S
(Berhing Diagnostics de Somerville, New Jersey) se rehidrató y se
trató de acuerdo con la recomendación del fabricante. Cien \mum
de plasma humano normal diluido (NHP) y 100 \mul de plasma
deficiente de factor de coagulación se colocaron en una cavidad de
la muestra del coagulómetro. El reactivo PT (200 \mul) se añadió
por el instrumento y el PT se determinó automáticamente. La relación
de pro-trombina se calculó dividiendo el PT
deficiente de factor de coagulación por el PT obtenido con NHP no
diluido y se representó contra el porcentaje del factor
suministrado por el NHP.
Los datos en la figura 1 muestran que el uso del
reactivo rTF PT dio lugar a PRs mayores con todas las diluciones de
plasma ensayadas. Un reactivo PT que muestra un PR mayor que otro
reactivo PT a la misma dilución de depósito de plasma normal se
dice que es el reactivo más sensible. Por lo tanto, el reactivo rTF
PT es más sensible que el Thromborel S al agotamiento de los
factores de coagulación específicos ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
(No de la
invención)
Los fosfolípidos fueron preparados por
resolubilización de la siguiente manera. PC, PE y PS se calentaron a
temperatura ambiente y se combinaron en un tubo o matraz adecuado en
una relación molar de 7,5:1:1 de PC, PE y PS, respectivamente. El
antioxidante, hidroxitolueno butirado (BHT), se disolvió en
cloroformo y se añadió a la mezcla de fosfolípidos en una relación
en peso de 0,1% (BHT: fosfolípidos totales). El disolvente orgánico
se retiró por evaporación bajo una corriente de nitrógeno seco o
bajo presión reducida en un evaporador giratorio. El disolvente
orgánico residual se eliminó mediante bombeo durante una hora
adicional a temperatura ambiente con una bomba de vacío a una
presión de 10 \mum o menos.
La mezcla de fosfolípidos se redisolvió en 50 mM
de octil beta-D-tioglucopiranosido
(OTG) en 20 mM de HEPES (pH 6), 150 mM de NaCl hasta una
concentración final de 4 mg/ml. Se mezclaron rTF del Ejemplo 2 y
gamma globulina bovina con los fosfolípidos resolubilizados. Se
añadieron 20 mM de HEPES (pH 6), 150 mM de NaCl suficientes para
ajustar las concentraciones finales a 10 \mug/ml de rTF, 1 mg/ml
de globulina gama bovina, 4 mg/ml de fosfolípidos, y 10 mM de OTG.
Se añadió CdCl_{2} hasta una concentración final de 5 mM para
activar el rTF. Las micelas mezcladas resultantes compuestas de
rTF, OTG, y fosfolípidos se diluyeron con 20 mM de HEPES, pH 6, 150
mM de NaCl para producir una solución que contenía rTF de
aproximadamente 0,5 a 1 \mug/ml, fosfolípidos de aproximadamente
500 a 700 \mug/ml, y gamma globulina bovina de 25 a 50 \mug/ml
para dar el reactivo rTF
PT.
PT.
Este reactivo se utilizó en este ejemplo para
determinar el PT de los plasmas de control de Thromboscreen y de un
depósito de plasma humano normal. Los controles de plasma son
fabricados para imitar el plasma que contenía diferentes niveles de
actividades de factores de coagulación II, V, VII y X. El Control I
contenía niveles de actividad casi normales, el Control II contenía
niveles intermedios, mientras que el Control III contenía los
niveles más bajos. Se espera que los PTs sean los más cortos con el
Control I y los más largos con el Control III. Los resultados de la
Tabla II siguiente ilustran que éste es el caso.
| Muestra plasma | Tiempo medio PT en segundos |
| Depósito plasma humano normal | 12,5 |
| Plasmas de control Thromboscreen: | |
| \hskip1cm Nivel I | 13,7 |
| \hskip1cm Nivel II | 37,1 |
| \hskip1cm Nivel III | 81,1 |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{145mm} El plasma humano normal y los plasmas de control Thromboscreen se describen en la nota al pie de la Tabla I.\end{minipage} |
La sensibilidad de este activo rTF PT se comparó
también con otros reactivos de tiempo de protrombina (PT)
comerciales utilizando plasmas de pacientes que se sometieron a
terapia anticoagulante oral. Los reactivos comerciales fueron
Thromborel S (Berhing Diagnostics de Somerville, New Jersey) y
Simplastin (Organon Teknika Corporation de Charlotte, Carolina del
Norte). Las muestras de plasma, que fueron retiradas de individuos
normales y pacientes que se sometieron a terapia anticoagulante
oral, se obtuvieron congeladas de un hospital local.
El tiempo de protrombina para cada muestra de
plasma se determinó utilizando cada uno de los tres reactivos PT.
Por lo tanto, 100 \mul de plasma y 100 \mul de rTF PT de
reactivo se colocaron en el pocillo de muestra de un coagulómetro.
El instrumento añadió 100 \mul de 20 mM de CaCl_{2} y determinó
automáticamente el tiempo de protrombina. Con Thromborel S y
Simplastin, se colocaron 100 \mul de plasma en el pocillo de
muestra y el instrumento añadió 200 \mul de reactivo PT. El
logaritmo de tiempo de protrombina para cada muestra de paciente
obtenida utilizando el reactivo rTF PT y Simplastin se representó
con relación a la misma utilizando Thromborel S. Los datos
mostrados en la figura 2 ilustran que para el reactivo rTF PT y
Thromborel S, la inclinación es 0,81. Una inclinación de 1,0
indicaría rendimiento idéntico para los dos reactivos PT. Por lo
tanto, el reactivo rTF PT es aproximadamente 20% más sensible que
Thromborel S. No obstante, la inclinación de la línea observada en
el gráfico que compara Simplastin y Thromborel es 1,62, indicando
que Simplastin es mucho menos sensible que Thromborel S. Los datos
anteriores confirman la conclusión deducida de la Tabla II de que el
reactivo rTF PT es sensible a descensos en actividades del factor
de coagulación y que esta sensibilidad se observa tanto en plasmas
reales y como simulados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
(No de la
invención)
Los fosfolípidos se combinaron en la relación
molar de 7,5: 1: 1 (PC: PE: PS), se secaron para eliminar el
disolvente orgánico, después se resolubilizaron como se describe en
el Ejemplo 3. Los fosfolípidos resolubilizados a 15 mg/ml en TBS
que contenía 100 mM de CHAPS se combinaron con rTF purificado de
inmunoafinidad (del ejemplo 2) y gamma globulina bobina. Se añadió
TBS adicional que contenía 150 mM de trehalosa para producir
concentraciones finales de 4 mg/ml de fosfolípido, 10 ug/ml de rTF,
1 mg/ml de gamma globulina bovina y 20 mM de
CHAPS.
CHAPS.
El detergente (CHAPS) se retiró por
diafiltración de flujo tangencial utilizando una unidad de filtro
Pyrostart o Ultrastart (Sartorius Corp., Bohemia, NY, intervalo de
peso molecular de 20.000) y TBS que contenía 150 mM de trehalosa
como el tampón de diálisis. Aproximadamente de 95 a 100% del CHAPS
puede retirarse haciendo pasar 10 volúmenes de tampón de diálisis a
través del dispositivo. Después de la diafiltración, el volumen del
dializado se determinó y se ajustó de nuevo hasta el volumen
original (si se requiere) con TBS que contenía 150 mM de trehalosa
y 0,05% de NaN_{3}. Se añadió CdCl_{2} hasta una concentración
final de 3 mM y la solución se incubó a 37ºC durante 2 horas.
La solución puede congelarse sobre hielo seco,
después liofilizarse utilizando un ciclo que se inicia a -40ºC y
que termina a temperatura ambiente, durante un periodo de 48 horas.
El reactivo resultante puede reconstituirse hasta concentración de
trabajo con la adición de 0,1 M Tris, pH 7,5, 150 mM de trehalosa
para producir una solución que contiene rTF de aproximadamente 1 a
2 \mug/ml, fosfolípidos de aproximadamente 400 a 800 \mug/ml, y
la gamma globulina bovina de 50 a 100 \mug/ml. El rendimiento del
reactivo fue similar al que se observa en la
Tabla II.
Tabla II.
Los fosfolípidos se combinaron en relación molar
de 67: 16: 10: 7 (PC: PG: PE: PS), se secaron para eliminar el
disolvente orgánico, después se resolubilizaron como se describe en
el Ejemplo 3. Los fosfolípidos resolubilizados a 15 mg/ml en TBS
que contenía 100 mM de CHAPS y 0,8% de glicina se combinaron con rTF
purificado de inmunoafinidad (del Ejemplo 2) y gamma globulina
bovina. Se añadió TBS adicional que contenía 150 mM de trehalosa y
0,8% de glicina para producir concentraciones finales de 3 mg/ml de
fosfolípido, 4,5 \mug/ml de rTF, 1 mg/ml de gamma globulina
bovina y 20 mM de CHAPS.
Las resinas cromatográficas hidrófobas tales
como Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co., Filadelfia,
Pa). o Bio-Beads SM-2 (BioRad,
Richmond, Ca) pueden utilizarse también para eliminar el detergente
(CHAPS), o bien en contacto directo con la solución fosfolípida o
separadamente de ella por una membrana de diálisis. La velocidad de
retirada era proporcional a la relación del peso del detergente en
solución y las perlas de resina cromatográficas. En efecto, la
velocidad de retirada es proporcional tanto a la cantidad de resina
añadida como a la velocidad de adición. La cantidad requerida para
eliminar todo el detergente se calcula a partir de la capacidad de
la resina (proporcionada por el fabricante) y la masas totales del
detergente que debe retirarse. Adicionalmente, el 99,9% de la
retirada del detergente puede alcanzarse o bien en 1 hora o en 24
horas, a 30ºC dependiendo de la velocidad a la que se añade esta
cantidad de resina. Se añadió CdCl_{2} hasta una concentración
final de 5 mM y la solución se incubó a 37ºC durante 2 horas. Los
liposomas fueron diluidos entonces a una concentración de trabajo
con 50 mM Tris, pH 7,5, 75 mM de trehalosa, 15 mM de CaCl_{2},
0,8% de glicina, 1% de maltosa, y 0,05% de NaN_{3} para producir
una solución que contenía rTF de aproximadamente 0,04 a 0,20
\mug/ml, fosfolípidos de aproximadamente 40 a 150 \mug/ml, y
gamma globulina bovina desde 50 hasta 100 \mug/ml.
La solución se congeló sobre hielo seco, luego
se liofilizó utilizando un ciclo que comienza a -40ºC y que termina
a temperatura ambiente, durante un periodo de 48 horas. El reactivo
liofilizado se reconstituyó con agua destilada antes del uso.
Se determinó el rendimiento del reactivo rTF PT
y los resultados se muestran en la Tabla III siguiente. Por lo
tanto, 100 \mul de un depósito de plasma humano normal o plasmas
de control Ortho se colocaron en un pocillo de muestra del
coagulómetro. El instrumento añadió 200 \muL de reactivo RTF PT y
determinó el PT.
| Muestra plasma | Tiempo medio PT en segundos |
| Depósito de plasma humano normal | 12,1 |
| Plasmas de control Ortho: | |
| \hskip1cm Nivel I | 11,8 |
| \hskip1cm Nivel II | 35,7 |
| \hskip1cm Nivel III | 63,1 |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{145mm} El depósito humano normal (NHP) está compuesto de plasma almacenado de 10 individuos normales, dividido en porciones alícuotas pequeñas y congeladas rápidamente. El nivel I, II y III son plasmas de control de Ortho Diagnostic Systems (Raritan, New Jersey) y están destinados para imitar pacientes que se someten a 3 niveles o intensidades diferentes de terapia anticoagulante oral.\end{minipage} |
Los datos muestran que el reactivo rTF PT ofrece
el rendimiento deseado de la presente invención. En primer lugar,
los PTs para los diferentes controles reflejan los cambios esperados
puesto que estos controles están destinados para simular los
plasmas de pacientes que se someten a varios grados de terapia
anti-coagulante. En segundo lugar, los PTs para el
plasma humano normal coinciden con los del control del Nivel I. El
efecto último es atribuido a la inclusión de glicina en el
reactivo. Comparar los datos de las Tablas I y III.
Claims (19)
1. Un reactivo de tiempo de protrombina adecuado
para uso en la medición de la actividad de coagulación en la
trayectoria de coagulación extrínseca, conteniendo dicho reactivo un
factor de tejido natural o recombinante purificado que se compone
de una composición de liposomas que comprende:
(a) una mezcla de fosfolípidos que
comprende:
- (i)
- de 5 a 15 por ciento en moles de fosfatidiletanolamina;
- (ii)
- de 3 a 20 por ciento en moles de fosfatodilserina;
- (iii)
- de 10 a 25 por ciento en moles de fosfatidilglicerol;
- (iv)
- siendo lo restante fosfatidilcolina.
(b) de 0,1 \mug a 3 \mug de factor de tejido
natural o recombinante por mg de mezcla de fosfolípidos.
2. Un reactivo de tiempo de protrombina adecuado
para uso en la medición de la actividad de coagulación en la
trayectoria de coagulación extrínseca, conteniendo dicho reactivo un
factor de tejido natural o recombinante purificado que comprende
una composición de micelas fosfolípidas que comprende:
(a) una mezcla de fosfolípidos que
comprende:
- (i)
- de 5 a 15 por ciento en moles de fosfatidiletanolamina;
- (ii)
- de 3 a 20 por ciento en moles de fosfatidilserina;
- (iii)
- de 10 a 25 por ciento en moles de fosfatidilglicerol;
- (iv)
- siendo lo restante fosfatilcolina.
(b) de 0,1 \mug a 3 \mug de factor de tejido
natural o recombinante purificado por mg de mezcla de fosfolípidos;
y
(c) un detergente.
3. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende
adicionalmente de 0,5 por ciento a 1,5 por ciento de glicina.
4. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que
comprende adicionalmente un crioconservante de carbohidratos
seleccionado de un grupo que consta de trehalosa, maltosa, lactosa,
glucosa, y manitol.
5. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con la reivindicación 4, donde el crioconservante de
carbohidrato comprende desde 50 mM hasta 250 mM de trehalosa.
6. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con la reivindicación 5, donde dicha mezcla de fosfolípidos
comprende de 5 a 15 por ciento en moles de fosfatidiletanolamina; de
5 a 20 por ciento en moles de fosfatidilserina, de 10 a 25 por
ciento en moles de fosfatidilglicerol y el resto
fosfatidilcolina.
7. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con la reivindicación 5, donde dicha mezcla de fosfolípidos
comprende de 8 a 12 por ciento en moles de fosfatidiletanolamina, de
3 a 10 por ciento en moles de fosfatidilserina, de 14 a 20 por
ciento en moles de fosfatidilserina, de 14 a 20 por ciento en moles
de fosfatidilglicerol, y de 58 a 75 por ciento en moles de
fosfatidilcolina.
8. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde
dicha mezcla de fosfolípidos comprende de 8 a 12 por ciento en moles
de fosfatidiletanolamina, de 3 a 10 por ciento en moles de
fosfatidilserina, de 14 a 20 por ciento en moles de
fosfatidilglicerol, y de 58 a 75 por ciento en moles de
fosfatilcolina.
9. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho factor de tejido es
factor de tejido recombinante.
10. Un reactivo de tiempo de protrombina de
acuerdo con la reivindicación 5, que comprende de 0,6 a 1,2 por
ciento (p/v) de glicina.
\newpage
11. El reactivo de protrombina de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 3, donde el detergente es un alquil
glucopiranosido.
12. Un método para la preparación de un reactivo
de tiempo de protrombina como se reivindica en la reivindicación 1
ó cualquier reivindicación dependiente de la misma, que contiene un
factor de tejido activo asociado con bicapas lípidas de vesículas
fosfolípidas que comprende las etapas de:
(a) co-solubilizar una mezcla de
fosfolípidos, factor de tejido, y proteína portadora con
detergente;
(b) retirar el detergente; y
(c) añadir sal de cadmio.
13. Un método para la preparación de un reactivo
de tiempo de protrombina como se reivindica en la reivindicación 2
ó cualquier reivindicación dependiente de la misma, que contiene un
factor de tejido activo asociado con micelas fosfolípidas que
comprende las etapas de:
(a) co-solubilizar una mezcla de
fosfolípidos, factor de tejido y proteínas portadoras con
detergente; y
(b) añadir sal de cadmio.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, donde el detergente es seleccionado del grupo que consta de
octil beta-D-glucopiranosido, y
octil beta-D-tioglucopiranosido.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
12 ó 14, que comprende adicionalmente en la etapa (a)
co-solubilizar de 0,5 a 1,5 por ciento en moles de
glicina.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, donde el factor de tejido es factor de tejido recombinante.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, donde el detergente se selecciona del grupo que consta de
3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propansulfonato
(CHAPS), octil
beta-D-glucopiranosido, y octil
beta-D-tioglucopiranosido.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
12, donde el detergente se retira por la técnica seleccionada del
grupo que consta de diálisis, diafiltración de flujo tangencial, y
medios cromatográficos.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
14, donde el detergente comprende un alquil glucopiranosido.
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