PL181102B1

PL181102B1 - Sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywności wybranego składnika koagulacji krwi

Info

Publication number: PL181102B1
Application number: PL94310050A
Authority: PL
Inventors: Björn Dahlbäck
Original assignee: Dahlbaeck Bjoern
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 2001-05-31
Also published as: CA2154080A1; CA2154080C; ES2119165T3; BR9406223A; DK0690991T4; ATE168781T1; EP0690991A1; HU9502190D0; FI953565A; NZ261190A; CZ184995A3; US20070212743A1; GR3027697T3; US7169572B1; HUT72191A; DK0690991T3; FI953565A0; EP0690991B2; PL310050A1; AU5982794A

Abstract

1. Sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywnosci wybranego skladnika koagu- l acji krwi, do diagnozowania zaburzen koagulacyjnych 1 antykoagulacyjnych krwi, zwlaszcza zaburzen zakrzepowo-zatorowych a takze okreslania sklonnosci do tych zaburzen u osobni- ków, korzystnie u ssaków zwlaszcza u ludzi, zwiazanego z ukladem antykoagulacyjnym bialka C i obejmujacym bialko C, aktywne bialko C (APC), bialko S lub antykoagulacyjny czynnik V w oparciu o powiazanie tej aktywnosci funkcjonalnej z konwersja specyficznego dla APC substratu, w obecnosci wspomnianych skladników ukladu antykoagulacyjnego bialka C, znamienny tym, ze do roztworu testowego zawierajacego próbke 1 substrat dla APC dodaje sie jedna lub dwie substancje inne niz oznaczany skladnik, albo inhibitor jego aktyw- nosci, wybrane sposród a) APC, b) bialka S lub inhibitora, który blokuje aktywnosc bialka S, oraz c) posiadajacego antykoagulacyjna aktywnosc czynnika v albo inhibitora, który blokuje te aktywnosc, mierzy sie szybkosc powodowanej przez APC konwersji substratu, oraz wyko- nuje sie korelacje zmierzonej wielkosci z aktywnoscia oznaczanego skladnika, przy czym, gdy badanym skladnikiem jest bialko C/APC lub bialko S, do medium testowego dodaje sie co najmniej czynnik V posiadajacy aktywnosc antykoagulacyjna lub inhibitor blokujacy te akty- wnosc, i diagnozuje sie na podstawie poziomu substancji analizowanej w próbce od osobnika sklonnosci do zaburzen koagulacyjnych i antykoagulacyjnych a takze ocenia sie sklonnosc do zaburzen zakrzepowo-zatorowych. P L 1 8 1 1 0 2 B1 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywności wybranego składnika koagulacji krwi. Nowa aktywność kofaktora antykoagulanta uczestnicząca w ludzkim układzie krzepnięcia krwi jest prawdopodobnie zaangażowana również w układzie krzepnięcia krwi niektórych innych gatunków ssaków.

Krzepnięcie krwi jest złożonym procesem, w którym bierze udział wiele białek, których funkcje wspólnie z płytkami składająsię na hemostazę. Układ krzepnięcia podlega ścisłej regulacji przez szereg białek antykoagulacyjnych obecnych w osoczu i na powierzchni śródbłonkowych komórek krwi (Esmon, J. Biol. Chem. 264. 4743 - 4746, 1989; Bauer, Sem. Hematol. 28, 10-18, 1991; Rapaport, Blood 73, 359-365, 1989). W warunkach fizjologicznych mechanizmy pro- i antykoagulacyjne są delikatnie zrównoważone, co zapewnia hemostazę i krzepnięcie. Zaburzenia tej równowagi prowadzą albo do krwawień albo do zakrzepów.

Przedmiot wynalazku jest związany z nową aktywnością biorącą udział w ważnym fizjologicznie układzie antykoagulacji związanym z białkiem C i białkiem S, co zostało wyjaśnione w ostatnich latach i jest przedstawione poniżej jako część powiązanych ze sobą interakcji w procesie koagulacji krwi, zilustrowanych na schemacie 1.

We wspomnianym powyżej układzie antykoagulacji, kluczowym składnikiem jest białko C, czyli białko osoczowe zależne od witaminy K. Białko to po aktywacji przebiegającej na komórkach

181 102 śródbłonkowych przez kompleks: trombma/trombomodulina do aktywnego białka C (APC) selektywnie rozkłada czynniki krzepnięcia V_a i VIII_a, czyli aktywne formy odpowiednio czynników krzepnięcia V i VIII (Esmon, jak wyżej; Stenflo w książce: „Protem C and related proteins”; pod red. Bertina'y (Churchill Livingstone Longham Group, W. Brytania, 21 -54,1988 oraz Mann i wsp. Ann. Rev. Biochem 57, 915-956, 1988 i Kane i wsp., Blood 71, 539-1988).

Na aktywność APC wpływa inne, zależne od witaminy K białko osoczowe, nazwane białkiem S, pełniące rolę kofaktora w stosunku do APC w procesach rozkładu czynników V_a i VIII_a (Esmon, jak wyżej, Stenflo, jak wyżej, i Dahlback, Thromb. Haemostas. 66,49-61,1991)

Wspomniane wyżej czynniki V_a i VHI_a są kofaktorami związanymi z fosfolipidami biorącymi udział w aktywacji odpowiednio czynnika X i protrombmy, a zatem, pośrednio zaangażowanymi w konwersję fibrynogenu do fibryny, to znaczy, w powstawanie skrzepu. Zgodnie z tym, szybkość reakcji krzepnięcia jest zależna od równowagi między aktywacją czynników VIII i V a rozkładem ich form aktywnych, przy czym nieaktywne formy czynników VIII i V są słabymi substratami dla APC.

Zaburzenia w układzie krzepnięcia krwi często manifestują się poważnymi stanami, często zagrażającymi życiu a wiedza o ich przyczynach ma często zasadnicze znaczenie dla prawidłowej diagnozy i/lub powodzenia leczenia ujawniającej się choroby albo sknningu osobników wykazujących predyspozycje do chorób związanych z krzepliwością krwi. Przykładowo, konsekwencjąwykrycia niedoboru białka C towarzyszącego trombofilii było zastosowanie lecznicze oczyszczonego białka C.

Trombofilię można zdefiniować jako skłonność do choroby zakrzepowo-zatorowej żył występującą w młodym wieku u dorosłych przy braku znanych czynników ryzyka. Jakkolwiek u niektórych pacjentów z trombofiliąstwierdza się nieprawidłowości, to w większości takich przypadków nie wykrywa się zmian w próbach laboratoryjnych.

181 102

Schemat 1
Czynnik IX	trombop1astyna
		tkankowa
czynn i k X I _a — _ ą. Ca²*	-	czynn i k VII;	Ca²*
		czynni	k X
Czunnik IX_ .
- a - Fosfolipid

Czynnik VI l l —>czynn i k VIII

Protromb i na

8i alko S czynnik X_a-fos-fol i p i d Ca²*

Aktywowane b i alko C (APC) trombomodulina b i alko C f i brynogen czynnik V tromb i na --» czynn i k XIII czynn i k V_a

fi bryna f t bryna (rozpuszczalna) czynni k XIll_a (n i erozpuszczalna) etapy prokoagulacyjne etapy hamowania koagulacji

181 102

Niniejszy wynalazek jest związany z nowym defektem w odpowiedzi antykoagulacyjnej na aktywną formę białka C, zwanym opornością na APC. Okazuje się, że defekt ten jest dziedziczny i związany z trombofilią rodzinną.

W pewnych przypadkach trombofilię wiązano z hipotetycznymi czynnikami, takimi jak przeciwciało przeciw białku C (Mitchell i wsp., New England Journal of Medicme, 316, 1638-1642,1987), przeciwciało przeciw kardiolipinie (Amer. i wsp., Thrombosis Research 57, 247-258, 1990) i z defektem cząsteczki czynnika VIII (Dahlback i wsp., Thromb. Haemost. 65, Abstrakt 39, 658, 1991).

W opisie patentowym PCT, WO 93/10261, opublikowanym po dacie najwcześniejszego pierwszeństwa zastrzeganego dla niniejszego zgłoszenia, ujawnione są metody in vitro diagnozowania objawów zaburzeń krzepnięcia krwi bądź skriningu osobników wykazujących skłonność do zaburzeń krzepnięcia krwi. Próby te są oparte na pomiarze antykoagulacyjnej odpowiedzi na egzogenne APC dodane do próbki osocza pobranego od osobnika poddawanego badaniom. Słaba odpowiedź antykoagulacyjna na APC, to jest, oporność na APC, wskazuje na wystąpienie objawów lub skłonność do zaburzeń krzepliwości krwi, a zwłaszcza do choroby zakrzepowo-zatorowej. W cytowanej publikacji nie podano wyjaśnienia powstania oporności na APC, jednak przypuszcza się, że oporność ta wynika z nieznanych dotychczas interakcji w układzie krzepnięcia albo wywołują ją nieznane czynniki krzepnięcia. Wykluczono jednak niektóre możliwe hipotezy, wiążące oporność na APC z funkcyjnym niedoborem białka S, z przeciwciałem hamującym białko C, z inhibitorem proteazy dla APC lub z mutacją genu dla cząsteczki opornego na APC czynnika V_a albo czynnika VIII.

Jak wykazały badania twórców wynalazku oporność na APC wynika z niedoboru uprzednio nierozpoznanej aktywności kofaktora antykoagulanta zwiększającej działanie proteolityczne APC skierowane przeciw czynnikowi V_a i czynnikowi VIII_a. Obserwacje stanowiące podstawę do wykrycia aktywności kofaktora antykoagulacji zostały opisane przez Dahlbacka i wsp. i opublikowane po dacie najwcześniejszego pierwszeństwa zastrzeganego w niniejszym zgłoszeniu (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1004-1008, 1993).

Badania twórców wykazały zwłaszcza, że tę aktywność antykoagulacyjną wykazuje czynnik v, co jest spostrzeżeniem zdumiewającym, gdyż czynnik v jest prekursorem prokoagulacyjnego czynnika V_a który to czynnik V_a jest rozkładany przez APC w wyżej wspomnianym układzie antykoagulacyjnym z udziałem białka C. Tak więc, czynnik V jest drugim po wspomnianym wyżej białku S kofaktorem, jaki znaleziono dla APC. Zgodnie z tym, tej nowej aktywności kofaktora antykoagulanta nadano nazwę „aktywność APC-kofaktora 2” albo „aktywność antykoagulacyjna czynnika V” i tam, gdzie to stosowne czynnik V jest również nazwany „APCkofaktorem-2”. Uprzednio znana aktywność czynnika V jest znana pod nazwą „aktywności prokoagulacyjnej czynnika V”. Nie można jednak całkowicie wykluczyć ewentualności, że aktywność ta jest związana z czynnikiem V_a.

Wykrycie tej nowej aktywności kofaktora antykoagulanta było związane z obserwacją jednego pacjenta z zakrzepem i z nienormalną opornością na APC wykrytą podczas badania osocza tego pacjenta metodami ujawnionymi w opisie patentowym PCT WO 93/10261 (z pierwszeństwaz 13 listopada 1991 r., w którym Stany Zjednoczone sąjednym z krajów wyznaczonych; ujawnienie tego opisu jest wprowadzone do niniejszego opisu jako odnośnik) i przez Dahlbacka i wsp. (Thromb. Haemost. 65, streszczenie 39, 658, 1991). Badając dużą populację pacjentów z chorobą zakrzepową wykazano, że oporność na APC jest przyczyną 30-40% idiopatycznych zdarzeń zakrzepowo-zatorowych (Thromb. Haemostas. 69, streszczenie 39, 999, 1993).

Okazało się także, że surowa frakcja uzyskana z normalnego osocza wykazuje aktywność naprawiającą defekt osocza APC-opomego, podczas gdy odpowiednia frakcja osocza APC-opomego pochodzącego od pacjenta z silną APC-opomościąbyła nieaktywna. Świadczy to o istnieniu nowego kofaktora dla APC. Dodatkowo, stosując preparaty oczyszczone pod kątem tej aktywności do prób zaprojektowanych do celów pomiaru tej aktywności uzyskano rozstrzygający dowód na istnienie nowego kofaktora dla APC.

181 102

Nieoczekiwanie okazało się, że ludzki czynnik v, niezależnie od swej znanej funkcji prekursora dla prokoagulacyjnego czynnika v_a wykazuje aktywność kofaktora dla APC. Jest prawdopodobne, że ta podwójna funkcja ludzkiego czynnika v występuje również w czynniku v pochodzącym z krwi niektórych gatunków zwierząt, zwłaszcza ssaków ale nie występuje u innych gatunków. Przykładowo, wszystkie uzyskane dotychczas wyniki wskazują, że aktywności tej nie wykazuje osocze bydlęce.

Ta aktywność czynnika V jako kofaktora oznacza, że zwiększa on działanie proteolityczne aktywnego białka C i w konsekwencji rozkład czynnika V_a będącego aktywną formą czynnika V, a także zwiększa rozkład czynnika VUI_a.

Uprzednio było wiadomo, że prokoagulacyjna aktywność czynnika v wynika z jego aktywacji przez trombinę, podczas której to aktywacji ulegają rozszczepieniu trzy wiązania peptydowe i powstaj e prokoagulacyjny czynnik V_a w postaci kompleksu wytworzonego w miej scach N- i C-końcowych części natywnego czynnika V. Funkcja dwu dużych aktywnych peptydów pochodzących z centralnej części czynnika v pozostaje jednak nieznana. Jak to będzie przedstawione w części doświadczalnej niniejszego ujawnienia, nie wykryto aktywności APC-kofaktora 2 w czynniku V_a w próbie APC-opomości.

Aktywność APC-kofaktora 2 wykazuje preferencyjnie cała, nienaruszona cząsteczka czynnika V; prawdopodobnie duże fragmenty odszczepiane podczas jego aktywacji do czynnika V_a są odpowiedzialne za większą część tej aktywności. Nie można jednak całkowicie wykluczyć ewentualności, że aktywność ta jest związana zjednostkąmolekulamątworzącąbardzo trwały kompleks z czynnikiemV, który to kompleks me podlega rozszczepieniu w procesach oczyszczania zastosowanych do izolacji czynnika V wykazującego aktywność APC-kofaktora 2.

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywności wybranego składnika koagulacji krwi, do diagnozowania zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych krwi, zwłaszcza zaburzeń zakrzepowo-zatorowych a także określania skłonności do tych zaburzeń u osobników, korzystnie u ssaków zwłaszcza u ludzi, związanego z układem antykoagulacyjnym białka C i obejmującym białko C, aktywne białko C (APC), białko S lub antykoagulacyjny czynnik V w oparciu o powiązanie tej aktywności funkcjonalnej z konwersją specyficznego dla APC substratu, w obecności wspomnianych składników układu antykoagulacyjngo białka C, polegający na tym, że do roztworu testowego zawierającego próbkę i substrat dla APC dodaje się jedną lub dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S dla lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyj ną aktywność czynnika v albo inhibitora, który blokuje tę aktywność, mierzy się szybkość powodowanej przez APC konwersji substratu, oraz wykonuje się korelację zmierzonej wielkości z aktywnością oznaczanego składnika, przy czym gdy badanym składnikiem jest białko C/APC lub białko S, do medium testowego dodaje się co najmniej czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną lub inhibitor blokujący tę aktywność i diagnozuje się na podstawie poziomu substancji analizowanej w próbce od osobnika skłonność do zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych a także ocenia się skłonność do zaburzeń zakrzepowo-zatorowych.

Korzystnie w sposobie według wynalazku dodaje się do medium testowego dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tą aktywność.

Również korzystnie do medium testowego dodaje się jedną lub dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tą aktywność, każdą w ilości wystarczającej do dostosowania do zmiennego poziomu wspomnianych substancji, korzystnie wspomnianą substancję dodaje się w nadmiarze.

W sposobie według wynalazku korzystnie oznacza się antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC, lub antykoagulacyjny czynnik V związany z odpornością na APC.

Aktywność antykoagulacyjną czynnika V można także oznaczać w obecności dodanego białka S, albo inhibitora blokującego pochodzącąz próbki aktywność białka S, natomiast w przypadku, gdy oznacza się białko C po aktywacji do APC lub APC, do medium testowego dodaje się czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną albo inhibitor blokujący aktywność pochodzącą z próbki i białko S lub inhibitor blokujący pochodzącą z próbki aktywność białka S. Korzystnie w przypadku, gdy oznacza się białko S, do medium testowego dodaje się czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną albo inhibitor blokujący aktywność pochodzącą z tej samej próbki oraz APC. Bardziej korzystnie w sposobie według wynalazku do medium testowego dodaje się czynnik VIII i/lub czynnik VIIIa. Jeżeli w sposobie według wynalazku stosuje się białka koagulacyjne do pomiaru substratowej konwersji APC, a substrat dla APC zawiera czynnik Va i/lub czynnik VIIIa i próbka pochodzi od osobnika, do medium testowego dodaje się białko S albo inhibitor białka S, z tym, że jeśli próbka pochodzi od osobnika leczonego antagonistami witaminy K lub z deficytem innego pochodzenia zależnych od witaminy K czynników koagulacji, wówczas modyfikuje się aktywności tych czynników zależnych od witaminy K w próbce przez dodanie co najmniej jednego czynnika koagulacji zależnego od witaminy K w formie aktywnej lub nieaktywnej, ewentualnie, w połączeniu z białkiem S.

W sposobie według wynalazku korzystnie do medium testowego dodaje się taką ilość wybranej substancji aby poziom jej aktywności funkcjonalnej był stały w porównywalnych próbkach, i bardziej korzystnie do badanego medium testowego wprowadza się funkcjonalny nadmiar wybranej substancji w porównaniu z poziomem tej substancji występującym w samej próbce. Także korzystnie, jako inhibitor stosuje się przeciwciało wiążące się swoiście z epitopem związanym z aktywnością APC, lub z antykoagulacyjną aktywnością czynnika V związaną z opornością na APC. Najbardziej korzystnie w sposobie według wynalazku jako próbkę stosuje się krew albo próbkę pochodzącąz krwi, zwłaszcza próbkę osocza, a także korzystnie jedną albo dwie dodawane substancje wprowadza się w postaci osocza z deficytem oznaczanej substancji. Można także korzystnie dodawać do medium testowego prawidłowe osocze z deficytem oznaczanej substancji, w tym przypadku korzystne jest aby oznaczaną substancję stanowił antykoagulacyjny czynnik v jako kofaktor dla APC, a osocze z deficytem oznaczanej substancji stanowiło osocze wolne od czynnika V. Również korzystnie oznaczaną substancję może stanowić antykoagulacyjny czynnik V związany z opornością na APC, a osocze wolne od oznaczanej substancji może stanowić osocze wolne od czynnika V.

Najbardziej korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC lub związany z opornością na APC do medium testowego dodaje się czynnik koagulacji krwi lub odczynnik, który aktywuje układ koagulacji krwi na drodze zewnętrznej lub wewnętrznej, można także ponadto korzystnie dodawać koagulacyjne czynniki krwi wybrane z grupy obejmującej czynnik VII/VIIa, czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X/Xa, czynnik II, czynnik XIa, czynnik XIIa oraz aktywator kontaktowy lub czynnik tkankowy.

Najkorzystniej sposób według wynalazku jest realizowany wtedy gdy jeśli oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjnąjako kofaktor dla APC lub związany z opornością na APC, dodaje się osocze z deficytem aktywności antykoagulacyjnej, które to osocze stanowi osocze ludzkie, pozbawione tej aktywności, albo też osocze ludzkie od jednego lub więcej osobników, których osocze jest pozbawione takiej aktywności.

W sposobie według wynalazku można też oznaczać aktywność antykoagulacyjnączynnika v jako kofaktora dla APC, lub jako aktywność związaną z opornością na APC. Zatem tę aktywność antykoagulacyjnąmożna oznaczać w sposób dostosowany do pomiaru aktywności antykoagulacyjnej czynnika v jako kofaktora dla APC, albo w sposób dostosowany do oznaczania antykoagulacyjnego czynnika v związanego z opornością na APC. Pomiary takie, to znaczy ocena aktywności antykoagulacyjnej czynnika V można korzystnie wykonać metodą immunologiczną.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku aktywność antykoagulacyjnączynnika V jako kofaktora dla APC oznacza się w próbce w oparciu o próbę koagulacji, w której to próbie (i) jedną porcję próbki inkubuje się przy nieobecności dodanego APC, ale ewentualnie w

181 102 obecności innych składników układu krzepnięcia krwi, umożliwiających pomiar konwersji substratu przez APC i (ii) jednąporcję próbki inkubuje się w obecności dodanego APC i ewentualnie w obecności innych składników układu krzepnięcia krwi, umożliwiających pomiar konwersji substratu przez APC, i wyniki prezentuje się jako czas aglutynacji, ewentualnie po odpowiedniej konwersji, przy czym wyniki poniżej ustalonej wartości „odcięcia” przyjętej w oparciu o pomiar czasów aglutynacji wykonany w ten sam sposób u normalnych osobników, wskazująna niedobór aktywności antykoagulacyjnej czynnika V. W powyżej zastosowanej korzystnej odmianie sposobu według wynalazku do medium testowego dodaje się prawidłowe osocze wolne od oznaczanej substancji a oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC, a osocze wolne od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika V.

Korzystnie, oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V związany z opornością na APC, a plazmę wolną od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika V. Jeszcze mną korzystną odmianą sposobu wynalazku jest to, że w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC lub związany z opornością na APC do medium testowego dodaje się czynnik koagulacji krwi lub odczynniki, które aktywują układ krzepnięcia krwi na drodze wewnętrznej lub zewnętrznej.

W powyżej opisanym przypadku, w sposobie według wynalazku, można dodawać inne składniki koagulacji krwi, które to składniki wybrane są z grupy obejmującej czynnik VII/VIIa, czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X/Xa, czynnik II, czynnik XIa, czynnik XIIa oraz odczynnik, taki jak aktywator kontaktowy lub czynnik tkankowy. Natomiast w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V, posiadający aktywność antykoagulacyjnąjako kofaktor dla APC, lub związany z opomościąna APC, dodaje się osocze wolne od tej aktywności antykoagulacyjnej, które to osocze stanowi osocze ludzkie, które zostało pozbawione tej aktywności, albo też osocze ludzkie od jednego lub więcej osobników, których osocze było pozbawione takiej aktywności.

Preparat do użycia jako osocze kontrolne do oznaczenia in vitro aktywności antykoagulacyjnej czynnika V jako kofaktora dla APC, charakteryzuje się tym, że preparat ten stanowi mieszaninę osocza od osobników, u których występuje częściowy niedobór aktywności antykoagulacyjnej czynnika v, która to mieszanina wykazuje wspomnianą aktywność antykoagulacyjnąna dogodnie niskim poziomie.

Preparat osocza z deficytem aktywności antykoagulacyjnej czynnika V jako kofaktora dla APC lub związanej z opomościąna APC, charakteryzuje się tym, że posiada zdolność do wyrażania aktywności prokoagulacyjnej czynnika V, i tym, że preparat ten zawiera osocze, korzystnie ludzkie osocze tak przygotowane, aby wykazywało deficyt tej aktywności antykoagulacyjnej, np. na drodze immunologicznego pozbawienia tej aktywności w odniesieniu do czynnika V wykazującego tę aktywność, które to osocze jest ewentualnie wzbogacone w czynnik V, pochodzący z gatunków, w których nie występuje aktywność antykoagulacyjna tego czynnika, np. bydlęcy czynnik V, albo w czynnik Va albo składa się z ludzkiego osocza pochodzącego od jednego lub większej ilości osobników, u których brakuje tej aktywności.

Preparat osocza z deficytem aktywności antykoagulacyjnej czynnika V jako kofaktora dla APC albo czynnika V związanego z APC, do użycia jako osocze kontrolne, charakteryzuje się tym, że preparat ten składa się z osocza, korzystnie z ludzkiego osocza tak przygotowanego, aby wykazywało deficyt tej aktywności antykoagulacyjnej, np. na drodze immunologicznego pozbawienia tej aktywności w odniesieniu do czynnika V zdolnego do wykazywania tej aktywności, ewentualnie wzbogaconego w czynnik V pochodzący z gatunków, w których nie występuje aktywność antykoagulacyjna tego czynnika, np. bydlęcy czynnik V, albo w czynnik Va albo składa się z ludzkiego osocza pochodzącego od jednego lub większej ilości osobników, u których brakuje tej aktywności, które to zubożone osocze miesza się z prawidłowym osoczem albo z czynnikiem v wykazującym taką aktywność, bądź też z mieszaniną osocza od osobników o częściowym braku aktywności antykoagulacyjnej czynnika v, która to mieszanina wykazuje wspomnianą aktywność antykoagulacyjnąna dogodnie niskim poziomie.

181 102

Tak więc, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wyrażenia „czynnik V” i „czynnik V wykazujący aktywność APC-kofaktora 2” i podobne obejmują również wspomniany kompleks czynnika V, jak również fragmenty czynnika V, korzystnie inne niż fragmenty pochodzące z rozszczepienia czynnika V trombiną, posiadającą tę aktywność. Modyfikowany czynnik v z zachowaną aktywnością APC-kofaktora można również otrzymać przez rozkład proteolityczny innymi enzymami pochodzenia ludzkiego lub nie-ludzkiego, takimi jak enzymy jadu żmiji i inne proteazy. Ponadto okazało się, że aktywność APC-kofaktora 2 zachowuje się po częściowej proteohzie nieznanym enzymem podczas procesu oczyszczania, co wskazuje na potencjalne istnienie fragmentów czynnika V z aktywnością APC kofaktora 2. Produkty ekspresyjne APC-kofaktora 2 jak również czynnika v wykazujące aktywność antykoagulacyjną obejmują fragmenty i podjednostki czynnika V7Va wykazujące tę aktywność albo determinantę immunologiczną związaną z rejonem związanym z tą aktywnością. Jakkolwiek dla wygody, czynnik koagulacji ani czynniki podobne me są opisane w niniejszym opisie, to o ile nie podano inaczej, należy rozumieć, że są to czynniki pochodzenia ludzkiego.

W części doświadczalnej mniejszego ujawnienia opisane sąprecedury oczyszczania i charakteryzacji będącej przedmiotem wynalazku aktywności APC-kofaktora 2 i jest zweryfikowane powiązanie tej aktywności z czynnikiem V. Podsumowując, istniejąnastępujące dowody na obecność aktywności APC-kofaktora 2 w czynniku V.

1. Proces zaprojektowany dla izolacji aktywności APC-kofaktora 2 i wcześniejsze metody izolacji czynnika V są bardzo podobne. Podczas elektroforezy w żelu pohakryloamidowym SDS-PAGE pojawiają się trzy pasma odpowiadające wielkości około 200-220 kDa (część C-końcowa), 140-160 kDA (część N-końcowa) i 330 kDa, co jest również bardzo podobne do opisu Czynnika V. (Patrz sekcja doświadczalna ujawnienia oraz artykuł Dahlbacka i wsp. w J. Clm Invest. 66, 583-591, 1980). Przy użyciu wyższych stężeń inhibitorów proteazy podczas procesu oczyszczania zwiększa się intensywność pasma dla 330 kDa zarówno dla aktywności APC-kofaktora 2 jak i dla czynnika v. Przykładowo, chlorowodorek benzamidyny w stężeniu 10 mM daje znaczny wzrost intensywności pasma dla 330 kDa.

2. Swoista antysurowica pohklonalna przeciw ludzkiemu czynnikowi V (Dekopatt A/S, Dania) reaguj e z każdym z trzech pasm związanych z aktywnością APC-kofaktora 2 w próbie hybrydyzacji techniką Westerna.

3. Po dodaniu trombiny do preparatów według wynalazku zawierających aktywność APC-kofaktora 2, te trzy pasma zanikają a otrzymanych produktów nie można odróżnić od produktów powstałych w wyniku aktywacji czynnika V trombiną.

4. Otrzymano siedemnaście przeciwciał monoklonalnych reagujących z czynnikiem V stosując preparat oczyszczony z użyciem aktywności APC-kofaktora 2 jako immunogenu. Dwa z tych przeciwciał monoklonalnych częściowo hamują aktywność APC-kofaktora 2 nie hamując przy tym aktywności prokoagulacyjnej czynnika V.

5. Aktywność prokoagulacyjnączynnika v i aktywność APC-kofaktora 2 eluowano łącznie na każdym z niżej testowanych materiałów: Hepann Sepharose, Blue-Sepharose, Wheat Germ Lectin Sepharose, Q-Sepharose i S-Sepharose (Pharmacia, Szwecja), ilustrujących materiały stosowane do badań.

6. Zarówno aktywność prokoagulacyjna czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 pozostały na matrycy zawierającej przeciwciała pohklonalne przeciw ludzkiemu czynnikowi V (Dakopatts A/S, Dania).

7. Zarówno aktywność prokoagulacyjna czynnika v jak i aktywność APC-kofaktora 2 pozostaje na matrycach takich jak Sepharose i Affigel, zawierających antysurowice przeciw różnym fragmentom bydlęcego czynnika V, który reaguje krzyżowo z ludzkim czynnikiem V.

8. Zarówno aktywność prokoagulacyjna czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 zostaje zatrzymana i eluuje wspólnie na nośniku chromatograficznym takim jak Affigel, zawierającym przeciwciało monoklonalne o wysokim powinowactwie, uprzednio przygotowane przy użyciu preparatu oczyszczonego w odniesieniu do aktywności APC-kofaktora 2 jako immunoge

181 102 nu. Samo w sobie, to przeciwciało nie hamuje ani aktywności APC-kofaktora 2 ani prokoagulacyjnej aktywności czynnika V. Eluowanie prowadzono przy wartości pH około 10,5 do 11.

9. Publikacja, w której stwierdzono, że autoprzeciwciała przeciw czynnikowi v mogą prowadzić do trombozy (Kapur A. i wsp., A. J. Hematol. 42, 384-388, 1993).

Preparaty wzbogacone w aktywność APC-kofaktora 2 otrzymano takimi samymi metodami jakie były uprzednio stosowane do izolacji czynnika V. Okazało się, że dwuwartościowe jony metali, takie jak jon wapniowy wykazują działanie stabilizujące na aktywność APC-kofaktora 2, tak więc jony wapniowe dodawano podczas procesu oczyszczania.

Zastosowano zasadniczo tę samą procedurę oczyszczania jaka była użyta w pierwszych próbach mających na celu wyjaśnienie istoty nowej aktywności ujawnionej w wyżej wspomnianym opisie patentowym PCT, WO 93/10261. Zgodnie z przedstawionymi w niniejszym opisie wynikami prób, tę nową aktywność zidentyfikowano jako aktywność kofaktora w stosunku do APC wyrażoną jako nowa właściwość czynnika V, bądź, być może, jego kompleks albo fragmenty, jak to opisano powyżej. Tak więc, staną się dostępne alternatywne, prostsze metody preparaty wne. Po ulepszeniu stosowano nowoczesne metody, takie jak chromatografię żelową chromatografię powinowactwa z np. przeciwciałem przeciw aktywności APC-kofaktora 2 jako ligandem powinowactwa, chromatografię jonowymienną i podobne. Ponadto, mogą znaleźć zastosowanie metody oparte na technikach rekombinacji DNA.

Zgodnie z powyższym preparat osocza pochodzi z krwi albo z produktów pokrewnych krwi takich jak osocze, który to preparat jest oczyszczony pod względem składnika krzepnięcia krwi wykazującego aktywność antykoagulacyjnąjako kofaktor dla APC, co zwiększa jego aktywność proteolityczną skierowaną przeciw czynnikowi V_a i czynnikowi VIII_a, który to składnik krzepnięcia krwi zawiera czynnik V albo ewentualnie trwały kompleks czynnika V i jednostki molekularnej o zdolności ekspresji tej aktywności.

Normalny poziom czynnika V w osoczu wynosi około 10-20 μ/ml. Analogicznie do innych czynników koagulacji/antykoagulacji krwi, przyjęto umownie aktywność APC-kofaktora 2 w 1 ml normalnego osocza jako 1 jednostkę (U). W oparciu o preparat osocza można również utworzyć przeciwciała i preparaty przeciwciał swoiste wobec regionu czynnika V, który jest związany z aktywnością APC-kofaktora 2, to jest, regionu, w którym istnieje miejsce zawierające epitop powodujący albo aktywność APC-kofaktora 2 albo nieaktywność APC-kofaktora 2. Te preparaty przeciwciał mogą być poliklonalne albo monoklonalne. Przeciwciała w tych preparatach wiążą się swoiście z jednym lub z większą ilością miejsc na czynniku v związanych z aktywnością APC-kofaktora 2. Alternatywnie, takie miejsce mogłoby zawierać epitop związany z nieaktywnością APC-kofaktora 2 w czynniku v, to znaczy' z APC-opomością. W niniejszym opisie wynalazku wyrażenie „epitop związany z nieaktywnością APC-kofaktora 2” obejmuje epitop związany ze spadkiem lub utratą aktywności APC-kofaktora 2.

Przeciwciała poliklonalne można uzyskać stosując znane techniki, obejmujące immunizację odpowiednich zwierząt, takich jak myszy, króliki, psy, konie, owce, kozy, ptaki, np. kury, kurczaki i podobne, odpowiednim immunogenem i wyodrębnienie powstałych przeciwciał z odpowiedniego płynu pochodzącego od tego zwierzęcia, np. z krwi albo z surowicy w przypadku immumzacji zwierząt albo jaj w przypadku immunizacji ptaków.

Przeciwciała takie mogą być przeciwciałami monoklonalnymi, możliwymi do otrzymania znanymi sposobami, np. w sposób w zasadzie zgodny z opisanym przez Kohlefa G. i Milstein'a N. (Naturę 256,495,1975). Sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych polega na immunizacji ssaka, korzystnie myszy, odpowiednim immunogenem, wytworzeniu komórek hybrydowych przez fuzję limfocytów takich jak komórki śledziony, pochodzących od tego immunizowanego ssaka z komórkami szpiczaka, selekcji komórek fuzyjnych w odpowiedniej pożywce, skriningu komórek wytwarzających przeciwciała (hybrydoma) i wytworzeniu przeciwciał monoklonalnych w płynie puchlinowym jamy otrzewnowej myszy albo ewentualnie, w pożywce hodowli, przez namnożenie w niej tych hybrydoma. Przeciwciała monoklonalne według wynalazku i ich fragmenty wiążące antygen można również otrzymać metodami rekombinacji, co jest znane ze stanu techniki. W metodach tych można użyć odpowiednie komórki go

181 102 spodarza pochodzące z organizmów eukariotycznych lub prokariotycznych. Takie komórki gospodarza są dobrze znane ze stanu techniki.

Jako immunogen można zastosować oczyszczony preparat czynnika V lub jego fragmenty albo pochodne zawierające determinanty antygenowe odpowiedzialne za ekspresję aktywności APC-kofaktora 2. Takie fragmenty lub pochodne, w celu nadania im antygenowości można koniugować z immunogennym nośnikiem, zwykle z białkiem.

Stosując jako immunogen ludzki czynnik V me wykazujący aktywności APC-kofaktora 2 (który można otrzymać w sposób opisany poniżej) w połączeniu z dwuetapowym procesem sknningu w celu selekcji komórek hybrydom wytwarzających przeciwciała monoklonalne reagujące z tym immunogenem ale nie z normalnym, niezmienionym ludzkim czynnikiem V, można ewentualnie uzyskać przeciwciała monoklonalne reagujące swoiście z epitopem dla ludzkiej nieaktywności APC-kofaktora 2, to znaczy, z epitopem związanym ze spadkiem lub utratą aktywności APC-kofaktora 2.

Przeciwciała monoklonalne, przynajmniej częściowo wiążąsię z aktywnością APC-kofaktora 2 czynnika V i hamują tę aktywność. Mogą istnieć także ich pochodne i fragmenty tych przeciwciał monoklonalnych, zdolne do wiązania z antygenami.

Przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane przez komórki hybrydom mysio/mysie, gdyż są one łatwe do otrzymania. Jako przykład takich przeciwciał monoklonalnych mogą służyć przeciwciała wytwarzane przez nową hybrydową linię komórkową zdeponowaną w dniu 8 grudnia 1993. W PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, European Collection od Animal Celi Culture, Salisbury, W. Brytania pod tymczasowym numerem akcesyjnym ΧΑΜ-4-5-1 93120846. Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez te hybrydomy otrzymały oznakowanie M4 (Master 4).

O ile nie zaznaczono inaczej, termin „przeciwciało” (albo „preparat przeciwciała”) obejmuj e przeciwciała nienaruszone, z ich dwoma łańcuchami ciężkimi i dwoma łańcuchami lekkimi oraz różne formy przeciwciał zderywatyzowanych, zawierających domeny zmienne (F_v), np. fragmenty takie jak Fab, Fab', F(ab')2; przeciwciała jednołańcuchowe, przeciwciała znakowane, np. znakowane znacznikiem radioaktywnym, fluorescencyjnym albo sprzęgnięte z enzymem, przeciwciała związane z fazą stałą i podobne.

Preparaty przeciwciał, utworzone na podstawie izolowanego czynnika V, mogą zawierać określonąilość przeciwciał monoklonalnych o wyżej opisanej swoistości, np. 1,2,3,4,5 lub więcej różnych przeciwciał monoklonalnych albo sąpohklonalne. Preparaty przeciwciał pohklonalych i monoklonalnych skierowanych swoiście przeciw epitopom obecnym w miejscu związanym z aktywnością APC-kofaktora 2 mogąbyć użyteczne w próbach immunologicznych, do swoistego oznaczania obecności lub nieobecności aktywności APC-kofaktora 2 w danej próbce (ilościowo i jakościowo).

Czynnikiem wytwarzającym takie przeciwciała monoklonalne mogąbyć komórki hybrydowe (hybrydomy i korzystnie, wyżej wspomniane hybrydomy o tymczasowym numerze akcesyjnym ΧΑΜ-4-5-1 93120846.

Jakkolwiek były znane poliklonalne i monoklonalne przeciwciała swoiste wobec czynnika V, które można stosować do oczyszczania czynnika V, to nie zostały dotychczas ujawnione przeciwciała monoklonalne umyślnie hodowane przeciw regionowi czynnika V związanemu z aktywnością APC-kofaktora 2.

Preparat przeciwciała (monoklonalnego jak również poliklonalnego) można w większości przypadków stosować w procesach oczyszczania opartych na chromatografii powinowactwa. W procesach tych przeciwciała wiąże się ze stałym nośnikiem i stosuje do selektywnego związania czynnika V obecnego np. w preparacie osocza. Następnie eluuje się i zbiera czynnik V, związany ze stałym nośnikiem.

Jakie przeciwciała monoklonalne wiążące się z czynnikiem V i hamujące przynajmniej częściowo aktywność APC-kofaktora 2 w czynniku V można stosować do hamowania aktywności czynnika V. Takie przeciwciała monoklonalne, tak jak uprzednio znane przeciwciała przeciw czynnikowi V można również stosować do otrzymywania preparatów osocza nie wykazujących aktywności APC-kafaktora 2.

Czynnik V, jego podjednostki lub fragmenty wykazujące aktywność antykoagulacyjnąjako kafaktora dla APC stosować można do wytwarzania leku lub preparatu farmaceutycznego przeznaczonego do zwiększania lub przywracania aktywności antykoagulacyjnej APC in vivo. Preparaty takie są zwłaszcza przeznaczone do leczenia pacjentów cierpiących na choroby naczyń krwionośnych, takie jak zaburzenia zatorowo-zakrzepowe, w tym zakrzepicę i rozsiane zakrzepy wewnątrznaczyniowe (DIC). Taki lek lub preparat farmaceutyczny może zawierać wysoce oczyszczony preparat czynnika V, który można przechowywać w niskich temperaturach , takich jak -70°C.

Preparaty można również stosować w innych stanach lub sytuacjach, w których może być korzystna skorygowana lub zwiększona aktywność antykoagulacyjna krwi, na przykład w różnych sytuacjach klinicznych związanych ze zwiększonym ryzykiem zakrzepów tętniczych i żylnych.

Ponadto, ponieważ aktywność APC-kofaktora 2 ma zasadnicze znaczenie dla działania APC, aktywność tę można stosować jako taką albo w połączeniu z białkiem C/APC i/lub z białkiem S. Przypadki kliniczne, w których może się to okazać ważne dotyczą pacjentów z deficytem aktywności APC-kafaktora 2, zwłaszcza w sytuacjach zwiększonego ryzyka zakrzepu. Dodatkowo podana aktywność APC-kofaktora 2 może być ponadto korzystna w zawale mięśnia sercowego po leczeniu trombolitycznym, w okresie pooperacyjnym, zwłaszcza u pacjentów wysokiego ryzyka, jako adiuwant dla pacjentów, u których leczono zakrzepy, dla pacjentów podlegających mikrochirurgii i w podobnych przypadkach.

Preparat wykazujący aktywność APC-kofaktora 2 można podawać drogą, jaką zazwyczaj stosuje się w terapii przy użyciu czynników koagulacji/antykoagulacji krwi, a więc, drogą iniekcji albo infuzji dożylnych lub dotętniczych. Analogicznie jak się zaleca dla innych czynników krwi nie można wykluczyć podawania doustnego. Ilość podana pacjentowi powinna być skuteczna w tym sensie, że przynajmniej na pewien czas w pełni lub częściowo przywróci działanie własnego aktywnego białka C pacjenta bądź podawanych łącznie białka C/aktywnego białka C w tym znaczeniu, że nawet słabsze działanie może być korzystne dla pacjenta z ryzykiem zakrzepu. Można założyć, że użyteczne będą dawki w zakresie odldolOOa możliwie od 40 do 70 mg/dzień. Korzystne jest podawanie wielokrotne, ponieważ czynnik v wykazujący aktywność APC-kofaktora 2 podlega metabolizmowi w organizmie ssaków.

Preparat można przygotowywać w postaci różnych znanych typów kompozycji farmaceutycznych, takich samych jakie stosuje się dla innych czynników koagulacji/antykoagulacji krwi, należy jednak zachować określone wymagania stabilności, niezbędne dla czynnika V wykazującego APC-kofaktora 2. Przykładowo mogą być stosowane liofilizaty lub proszki suszone metodą rozpyłową, ewentualnie rozcieńczane w odpowiednich nośnikach oraz sterylne lub wytwarzane w warunkach aseptycznych roztwory wodne.

Białko C/aktywne białko C i/lub białko S stosować można do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia zaburzeń związanych z niedoborem aktywności APC-kofaktora 2 W tym celu mogą być stosowane te same typy kompozycji, jakie sązalecane dla znanego użycia leczniczego białka C i białka S.

Preparat czynnika V pozbawiony aktywności APC-kofaktora 2, korzystnie pochodzi od ludzi. Jego potencjalne zastosowanie lecznicze obejmuje przypadki, w których zwiększenie aktywności czynnika V_a ponad aktywność APC-kofaktora 2 jest korzystne dla pacjenta.

Wyżej opisane sposoby leczenia i preparaty są wskazane dla ssaków, zwłaszcza dla ludzi.

Nowa aktywność kofaktora antykoagulacyjnego może być stosowana do opracowywania metod diagnozowania zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych krwi związanych z aktywnością APC, a także do opracowywania metod monitorowania i/lub pomiaru aktywności funkcyjnej komponentów biorących udział w układzie koagulacji/antykoagulacji krwi, bezpośrednio bądź pośrednio zależnych od aktywności funkcyjnej APC.

Przedmiotem dogodnego rozwiązania jak już wspomniano jest sposób diagnozowania zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych krwi, zwłaszcza zaburzeń zakrzepowo-zatorowych, a także określania skłonności do tych zaburzeń u osobników, korzystnie u ssaków,

181 102 zwłaszcza u łudzi, który to sposób polega na oznaczeniu w próbce korzystnie w próbce krwi lub w próbce materiału krwiopochodnego takiego jak osocze, pochodzącego od tego osobnika, poziomu składnika krwi wykazującego aktywność antykoagulacyjną, który to składnik krwi zawiera czynnik V. w którym oznacza się poziom aktywności antykoagulacyjnej jako kofaktora APC, przy czym poziom nienormalny, zwłaszcza obniżony wskazuje na istnienie lub skłonność do powyższych zaburzeń, a szczególnie, przy poziomie obniżonym zaburzenia mają charakter zaburzeń zakrzepowo-zatorowych.

Dogodne rozwiązania w powyższym sposobie są oparte na analizie odpowiedniej próbki pochodzącej od danego osobnika na obecność aktywności białka C/AOC, białka S albo APC- kofaktora 21 powiązaniu stwierdzonego nienormalnego poziomu, zwłaszcza obniżonego poziomu, z diagnozą, że dany osobnik cierpi na zaburzenie koagulacji krwi związane z analizowanym czynnikiem, to jest, z aktywnym białkiem C/ białkiem C, białkiem S albo czynnikiem V pod względem jego właściwości jako APC- kofaktora 2, który to defekt może tkwić u podstaw zaburzeń zatorowo-zakrzepowych albo powodować skłonność do tych zaburzeń.

W powyższych sposobach, poziom antykoagulacyjny aktywności APC- kofaktora 2 korzystnie oznacza się metodami opracowanymi zgodnie z wynalazkiem do oznaczania aktywności funkcji APC- kofaktora 2 opisanymi poniżej. Mogą być również użyte immunologiczne analizy aktywności i próby niefunkcyjne, swoiste dla czynnika V posiadającego elementy strukturalne związane z aktywnością APC- kofaktora 2. Tak więc, następne aspekty wynalazku dotyczą analiz fiinkcji dla aktywnego białka C/ białka C, dla białka S i czynnika V wykazującego aktywność APC- kofaktora 2, jak również prób immunologicznych i prób hybrydyzacji kwasów nukleinowych dla czynnika V wykazującego aktywność APC- kofaktora 2 oraz metody sekwencjonowania DNA i RNA. Próby te jako takie mogą mieć inne zastosowania niż diagnostyka, na przykład mogą być stosowane do monitorowania procesu oczyszczania składników w układzie APC- kofaktora, do kontroli i standaryzacji osocza i innych.

A. Próby oparte na oznaczaniu funkcji APC, białka C. aktywności APC- kofaktora 2 i białka S.

W tych próbach stosuje się protokoły podobne do opisanych w piśmiennictwie (Bertina i wsp., Res. Clin. Lab. 20,127-138,1990; Wolf i wsp., Thromb. Haemost. 62,1144-1145,1989; publikacje zgłoszeń patentowych PCTWO-A-9102812; WO-A-9101382; WO 93/10261, którego wyznaczenie na Stany Zjednoczone włączono do opisu jako załącznik; Bahlback i wsp., Thromb. Haemost. 65, streszczenie 39,658,1991). Tak więc, dany składnik w układzie APC, białka S i czynnika V, przy czym ten ostatni pod względem właściwości jako APC- kofaktora 2, oznacza się na podstawie konwersji odpowiedniego substratu dla APC przez APC. Normalnymi substratami dla APC są czynniki V_a i/lub VIII_a. Jeden z nich lub obydwa korzystnie dodaje się do oznaczonego roztworu w postaci preparatów wzbogaconych lub wysoce oczyszczonych, w tym preparatów otrzymanych techniką rekombinacji DNA, białek nieaktywnych (czynnik V, czynnik VIII) albo aktywnych. W obrębie serii próbek, które należy porównać, w oznaczanych roztworach znajdują się zasadniczo takie same poziomy:

a) co najmniej jednego spośród: czynnika V wykazującego aktywność APC- kofaktora 2 albo inhibitora, który blokuje aktywność, pochodzącąz tej samej próbki i białka S albo inhibitora, który blokuje aktywność białka S, pochodzącego z tej próbki, jeśli ma być oznaczany APC albo białko C.;

b) co najmniej jednego spośród białka S albo inhibitora blokującego pochodzącąz próbki aktywność białka S i APC, jeśli ma być oznaczana aktywność APC- kofaktora 2, oraz

c) co najmniej jednego spośród czynnika V, wykazującego aktywność APC- kofaktora 2 albo inhibitora, który blokuje tę właśnie pochodna z próbki aktywność i APC, jeśli ma być oznaczane białko S.

Tak więc, końcowe roztwory badane dla serii próbek, które będą porównywane zawierają próbkę i substrat dla APC i ewentualnie, również w korzystnych wariantach, jedną lub dwie, korzystnie dwie substancje nie pochodzące z próbki i wybrane spośród APC, białka S albo inhibitora dla białka S oraz czynnika V, wykazującego aktywność APC- kofaktora 2albo inhibitora tej

181 102 aktywności, z zastrzeżeniem, że jedną z tych substancji jest substancja, która ma być oznaczana (np. APC, białko C, białko S albo aktywność APC- kofaktora 2).

W mniejszym sposobie prowadzi się:

a) w jednym lub w większej ilości etapów inkubację w wodnym roztworze do oznaczeń, próbki i substratu dla APC, który to substrat j est nieodłącznie obecny w próbce lub j est dodany do oznaczanego roztworu i ewentualnie dalszych składników koagulacji krwi nieodłącznie obecnych w tej próbce albo dodanych do oznaczanego roztworu,

b) pomiar konwersji substratu pod działaniem APC podczas inkubacji według punktu a), oraz

c) korelację zmierzonej wartości z oznaczaną aktywnością. Korelację tę wykonuje się w znany sposób. W sposobie tym do oznaczanego roztworu z punktu a) dodaje się ewentualnie jedną albo dwie, korzystnie dwie substancje wybrane spośród APC, białka S lub inhibitora białka S i czynnika V, wykazującego aktywność antykoagulacyjnąalbo inhibitora tej aktywności, z zastrzeżeniem, że jedna z pozostających w tym roztworze substancji; APC białko S albo aktywność APC- kofaktora 2 jest obecna w próbce i jest składnikiem, którego aktywność funkcyjna ma być oznaczana. Dla czynnika V, aktywnością tą jest aktywność antykoagulacyjna jako kofaktora dla APC.

Przykładami innych składników, które mogą być obecne są enzymy koagulacyjne i inne czynniki krwi umożliwiające pomiar rozkładu czynników V_a i/lub VIII_a. Te inne czynniki mogą być dodane osobno albo mogąbyć już wcześniej obecne w próbce. W przypadku, gdy próbka zawiera białko C, a oznaczaną substancją jest APC, wówczas należy dodać aktywator dla białka C. W przypadku, gdy próbka zawiera różne poziomy czynników koagulacyjnych (innych niż te, które mają być oznaczane), przeszkadzających w reakcjach analizy, wówczas należy zapewnić ich nadmiar (to znaczy zasadniczo stałe poziomy w oznaczanych roztworach) w celu uniknięcia różnic w wynikach oznaczeń między poszczególnymi próbkami. W próbkach osocza można zapewnić wspomniane stałe poziomy dodając w nadmiarze normalne osocze nie zawierające oznaczanej substancji. Dodawane składniki mogą również występować w formach wzbogaconych albo wysoce oczyszczonych. Można wykazać, że dodanie czynnika VIII/VIII_a i/lub form czynnika V nie wykazujących aktywności APC- kofaktora jest korzystne. Przykładami form nie wykazujących aktywności APC- kofaktora są: ludzki czynnik V bez tej aktywności, czynnik V pochodzący z gatunków normalnie pozbawionych tej aktywności (np. bydlęcy czynnik V, a także fragmenty czynnika V, wykazujące aktywność czynnika V, ale pozbawione aktywności APC- kofaktora 2).

Białko S dodaje się do badanego roztworu w celu wyeliminowania różnic w mierzonym poziomie spowodowanych różnicami w poziomie białka S w poszczególnych próbkach, wówczas, gdy oznacza się aktywność APC- kofaktora 2 albo białko C. Jeśli oznacza się białko S, to w tym samym celu można dodać aktywność APC- kofaktora 2. Główną ideą takiego postępowania jest utrzymanie w badanych roztworach należących do różnych serii w zasadzie stałego poziomu funkcyjnej aktywności czynnika innych niż ten, któryjest oznaczany. Jak podano powyżej, można tego dokonać wprowadzając do badanego roztworu te czynniki w nadmiarze, np. dodając normalne osocze w nadmiarze i/lub wprowadzając nadmiar funkcyjny inhibitorów dla tych czynnika, np. przeciwciał wiążących się z epitopem odpowiedzialnym za aktywność tych czynnika. Dahlback z powodzeniem wprowadził przeciwciało monoklonalne swoiste wobec epitopów odpowiedzialnych za aktywność APC- kofaktora białka S do roztworu, w którym oznaczał aktywność APC- kofaktora 2 (HPS 54, Dahlback i wsp., J. Biol. Chem. 265, 8127-8235, 1990). Podobnie, funkcyjne inhibitory aktywności APC- kofaktora 2, takie jak przytoczone powyżej przeciwciała monoklonalne mogąbyć potencjalnie dodawane do badanych roztworów podczas oznaczania białka S.

Według wynalazku, oznaczenia aktywności funkcyjnej prowadzi się dogodnie wobec dodanego czynnika VIII/VUI_aq.

Zasady dotyczące kolejności mieszania, dodawanych składników i różnych metod wykonywania pomiarów są ogólnie znane specjalistom. (Patrz powyższe cytowania). Dotyczy to również oznaczania aktywności APC, którą można śledzić za pomocą substratów, takich jak

181 102 fibrynogen (próby koagulacji) i substratów chromogennych dla enzymów koagulacyjnych, na aktywność których wpływa aktywność APC. Odpowiednimi substratami chromogennymi, fluorogennymi i lumonogennymi są zatem substraty trombiny i cynnika X_a.

Próbkę na ogół stanowi osocze od osobnika/pacjenta albo próbką może być czynnik V, wykazujący aktywność APC- kofaktora 2, białko C (APC) albo białko S. Wszystkie te substancje pochodząz procesu produkcyjnego albo ze standardów przeznaczonych do użycia w tej próbie.

Zamiast czynnika V oczyszczonego z osocza, można użyć natywny czynnik V (w skrócie FV) wytwarzany technologią rekombinacji DNA (rFV) jako addukt w metodach diagnostycznych dla białka C/APC albo białka S, jako standard albo odczynnik kontrolny w próbach oznaczania aktywności koagulacyjnej czynnika V lub jako środek leczniczy do podawania pacjentom, u których wystąpił częściowy lub całkowity niedobór aktywności APC- kofaktora 2. Alternatywnie, do tych samych celów oraz w adduktach stosowanych w metodach oznaczania aktywności antykoagulacyjnej czynnika V można użyć rekombinatowe warianty lub fragmenty czynnika V ze zmodyfikowanymi ekspresjami aktywności pro- i antykoagulacyjnej. Takie modyfikacje można otrzymać w wyniku mutacji miejsc trombiny lub miejsc rozszczepienia APC w czynniku. Aktywność prokoagulacyjna czynnika V w poprzednim przypadku i aktywność antykoagulacyjna czynnika V w ostatnim przypadku jest częściowo lub całkowicie stracona. Poza tym, taki produkt rekombinacji lub jego odpowiednie immunogenne peptydowe fragmenty można stosować do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych do celów diagnostycznych lub leczniczych.

W próbach oznaczania aktywności APC- kofaktora 2 z zastosowaniem czynnika V_a i/lub VIIl_a jako substratów dla APC i czynnika obecnych w próbce do pomiaru konwersji substratu dla APC, czułość wykrywania aktywności APC znacznie się zwiększa w osoczu pacjentów pozostających na leczeniu antagonistami witaminy K, w wyniku czego zwiększa się wydłużenie czasu aglutynacji w niektórych próbach aglutynacji, zwłaszcza APTT. Tę zwiększoną czułość wykrywania aktywności APC można wytłumaczyć obniżonymi poziomami białek zależnych od witaminy K, takich jak Czynniki IX, X i II. Ponieważ aktywność APC- kofaktora 2 me jest zależna od witaminy K, może się okazać możliwy pomiar tej aktywności w osoczach od takich pacjentów przez dodanie do oznaczanego roztworu niektórych białek zależnych od witaminy K, takich jak co najmniej jeden z Czynnika IX. IXai Π, ewentualnie łącznie z białkiemS. Białka te można dodawać w postaci eluatii soli z metalem ciężkim, takim jak eluat z cytrynianem baru (Dahlback, Biochem J. 209, 837-46, 1983) albo eluat z wodorotlenkiem glinowym (Bertina i wsp., Thrombos Hemostas 51 1 -5,1984) albo w postaci czystych składników przed pomiarem konwersji substratu dla APC. Jeśli osocze zawiera heparynę (zwykłą albo o niskim ciężarze cząsteczkowym) korzystne jest zneutralizowanie tego działania przez dodanie nadmiaru heparyny, bądź przez dodanie pohbrenu albo Protaminy lub podobnego odczynnika, jako inhibitorów heparyny w celu zmniejszenia wpływu na wyniki pomiarów.

Jak zaznaczono powyżej, metody oznaczania aktywności funkcyjnych PC/APC albo białka S, bądź aktywności antykoagulacyjnej czynnika V sąpodobne do metod opisanych wcześniej, np. w cytowanych publikacjach, których ujawnienia są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki. Tak więc, nie powinien być potrzebny szczegółowy opis tych metod. W zasadzie metody te opierają się na pomiarze konwersji substratu. Szybkość tej konwersji można oznaczać bezpośrednio lub pośrednio i odnosić ją do oznaczanej substancji. Przykładowo, mogą się one opierać na testach koagulacji lub na metodach chromogennych, korzystnie w obecności dalszych składników potrzebnych do oznaczenia szybkości konwersji, obecnych nieodłącznie w próbce albo do tej próbki dodanych.

Składniki te mogąbyć obecne w odczynniku służącym do wprowadzenia aktywnego czynnika koagulacji, potrzebnego do oznaczenia szybkości konwersji substratu. Taki odczynnik zapewnia obecność przynajmniej czynnika IX_a i może zawierać czynnik koagulacji łub odczynnik aktywujący ten układ poprzez szlak wewnątrzustrojowy lub zewnątrzustrojowy. Zgodnie z tym, odczynnikiem może być czynnik IX_a albo czynnik XI_a (szlak wewnątrzustrojowy), czynnik XII_a, (szlak wewnątrzustrojowy), kalikreina (szlak wewnątrzustrojowy), aktywator kontaktu (szlak wewnątrzustrojowy), taki jak koalin, celit albo kwas elagikowy (szlak wewnątrzustrojowy), od

181 102 czynnik APTT (Activated Partial Thromboplastine Time; to jest odczynnik zawierający fosfolipid i aktywator kontaktu (szlak wewnątrzustrojowy), tromboplastyna tkankowa (odczynnik PT, PT = Trothrombin time (szlak zewnątrzustrojowy)), czynnik tkankowy, czynnik VH_a i czynnik X_a.

Dodatek innych składników zależy od zastosowanego modelu i może wymagać dołączenia inhibitorów proteazy osoczowej dla enzymów innych niż oznaczane albo inhibitora polimeryzacji fibryny. Ca²⁺ może występować w postaci rozpuszczalnej w osoczu soli jako źródła jonów Ca²⁺ w postaci wolnej, nieskompleksowanej, to znaczy silnych jonów wapniowych w wolnej meskompleksowanej formie. Dogodnie, takie dodatkowe składniki zawierają również czynnik VIII/VIII_a i czynnik V/V_a.

Substrat, dla którego oznacza się szybkość konwersji może być syntetycznym substratem dla enzymu, na którego aktywność ma wpływ forma białka C, to jest: trombina (= czynnik II_a) i czynnik X_a. Odpowiednie substraty syntetyczne są rozpuszczalne w wodzie i korzystnie posiadają strukturę oligopeptydu a trzema, czterema lub pięcioma resztami aminokwasowymi i końcową grupą aminową chronioną przed atakiem przez aminopeptydazy. Ochronę taką zapewnia się albo przez wprowadzenie grupy blokującej albo wprowadzając D-aminokwas na końcu aminowym. W celu uzyskania wykrywalnej odpowiedzi, końcową grupę karboksylową syntetycznego substratu poddaje się amidowaniu grupą, która będzie swoiście uwalniana i wykrywana w wyniku działania odpowiedniej proteazy układu krzepnięcia krwi. Grupę, która ma być uwalniana wybiera się spośród grup chromogennych, fluorogennych lub cheminolugenogennych i spośród innych grup wykrywalnych analitycznie. Zagadnienia te są opisane np. przez H.C. Hemkefa („Handbook of synthetic substrates in hemostatic testing” w wydawnictwie: CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, tom 19, wyd. 2, 71-134,1983). W przypadku próbek innych niż próbki osocza można jako substrat stosować egzogenny fibrynogen.

W celu uzyskania dokładnych wyników w odniesieniu do oznaczanej substancji, w niektórych przypadkach uzasadnione jest próbkowanie utrzymania możliwie najwyższej zawartości próbki osocza. Zawartość próbki osocza w testach dających dobrą swoistość powinna wynosić powyżej 10%, zwłaszcza powyżej 20% albo powyżej 35% (objętościowo). Jednak w innych przypadkach można stosować zasadniczo niższe zawartości, to jest, poniżej 10% (objętościowo).

B. Metody immunologiczne oznaczania aktywności APC-kofaktora 2.

Preparat przeciwciała umożliwia wykonywanie oznaczeń immunologicznych aktywności APC- ko faktora 2. Oznaczenie takie polega na tym, że przeciwciało przeciw APC- kofaktorowi 2 tworzy kompleks immunologiczny z czynnikiem V, wykazującym aktywność APC- kofaktora 2 w próbce, w ilości, która jest miarąjakościową lub ilościowąpoziomu aktywności APC- kofaktora 2 w tej próbce. Próbki mogąbyć takie same jak przy próbach opartych na oznaczaniu funkcji.

Odczynniki do stosowania w próbach B i C.

Jako odczynniki, standardy lub wzorce w wyżej opisanych próbach można stosować oczyszczone preparaty zawierające czynnik V, wykazujący aktywność APC- kofaktora 2, które to preparaty zostały oczyszczone od osocza lub wytworzone techniką rekombinacji DNA, preparaty białka C, ewentualnie w formie aktywnej lub w połączeniu z aktywatorem białka C i preparaty białka S, zawierające określone ilości zawartego w nich odpowiedniego czynnika. Preparat białka C można łączyć z co najmniej jednym czynnikiem krzepnięcia zależnym od witaminy K, wybranym spośród czynnika IX, X i Π, ewentualnie w połączeniu z białkiem S. Produkty i preparaty do stosowania leczniczego mogą być również otrzymane techniką rekombinacji DNA. Ponadto, przeciwciała monoklonalne również można otrzymać techniką rekombinacji DNA i w zasadzie, z zastosowaniem reakcji PCR (enzymatycznej amphfikacji DNA), która jest techniką dobrze znanąi może być stosowana do otrzymywania takich przeciwciał o żądanej swoistości.

Istnieją wskazania, że można uzyskać informację o różnych mutacjach czynnika V w oparciu o interakcję między aktywnościąantykoagulacyjnączynnika V i białkiem S. Można zaprojektować metody uzyskania takiej informacji w obecności lub nieobecności odpowiedniego przeciwciała. Takie metody w obecności przeciwciała mogąbyć użyte jako ilościowe metody analizowania substancji takiej jak aktywność antykoagulacyjna czynnika V i białko S.

C. Próby hybrydyzacji.

Wyniki doświadczeń wykonanych tuż przed dokonaniem niniejszego zgłoszenia wykazały w typowym badaniu wiązania DNA u dużej rodziny z dziedziną APC-opomościową, że istnieje ścisły związek pomiędzy obojętnym polimorfizmem w genie dla czynnika V i ekspresją APC-opomości. Wskazuje to na fakt, że przyczyną APC-opomości jest mutacja w genie dla czynnika V. Jest to ostateczny dowód na to, że próby hybrydyzacj i kwasów nukleinowych, a także sekwencj onowanie kwasów nukleinowych mogą być stosowane w sposób konwencjonalny do celów wykrywania osobników z ryzykiem występowania zakrzepów w wyniku niskiego poziomu aktywności APCkofaktora 2. Tego typu próby mogą być stosowane do sprawdzania nieprawidłowej obecności lub braku jednego lub większej ilości fragmentów i/lub sekwencji kwasów nukleinowych, które są unikalne dla występowania lub niewystępowania ekspresji cząsteczki czynnika V, wykazującego aktywność APC- kofaktora 2, bądź pozbawionego tej aktywności. Protokoły i warunki są takie same, jakie normalnie stosuje się dla innych genów, z tym, że używa się odczynniki swoiste dla genu czynnika V i ewentualnie mutanty związane z APC-opomościąalbo swoiste dla genu normalnego czynnika V. Do tego celu może być odpowiednia próbka dowolnych komórek pochodzących z organizmu danego osobnika.

Jak wykazały liczne próby, czynnik V, zwłaszcza ludzki czynnik V, j est zdolny do aktywacji i wykazywania prokoagulacyjnej aktywności czynnika V_a, ale jest pozbawiony zdolności wywierania działania antykoagulacyjnego, korzystnie aktywności antykoagulacyjnej jako kofaktor wobec APC.

Stwierdzono także, że czynnik V, zwłaszcza ludzki czynnik V zdolny jest do wykazywania aktywności antykoagulacyjnej, zwłaszcza jako kofaktor dla AC, ale pozbawiony jest zdolności ekspresji aktywności prokoagulacyjnej czynnika V_a.

Takie czynniki mogą być oczyszczone z osocza metodami podobnymi do stosowanych przy oczyszczaniu czynnika V albo przygotowane technikami rekombinacji DNA. Możliwe zastosowania obejmują standardy (wzorce), odczynniki wspomagające i zastosowania lecznicze.

Wynalazek ten jest w dalszej części opisu ujawniony w sekcji doświadczalnej z powołaniem się na rysunki. Na rysunkach tych: fig. 1 przedstawia chromatografię na żywicach: Q-Sepharose (A) i Sephacryl S-300 (B) czynnika V i aktywności APC- kofaktora 2, fig. 2 - wyniki charakteryzacji wyizolowanej aktywności APC-kofaktora 2/czynnika V metodą elektroforezy w żelu pohakryloamidowym SDS-PAGE, w próbie hybrydyzacji Westema i metodą elektroforezy w żelu agarozowym, fig. 3 - wspólne oczyszczanie aktywności APC- kofaktora 21 czynnika V techniką chromatografii powinowactwa z udziałem przeciwciała monoklonalnego i fig. 4A i B przedstawiają korekcję APC-opomości za pomocą oczyszczonej aktywności APC- kofaktora 2/czynnika V.

MATERIAŁY I METODY

Próba na aktywność APC- kofaktora 2.

Do pomiaru aktywności APC-kofaktora 2 podczas jego oczyszczania opracowano modyfikację opisanej ostatnio metody APC-APTT (opis patentowy PCT/SE/9200781 i Dahlback i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,1004-1008,1993). W metodzie tej stosuje się osocze od osobnika z dziedziczną słabą odpowiedzią na APC i frakcje uzyskane z normalnego osocza, testowanego na zdolność do normalizowania słabej odpowiedzi na APC. Tę próbę, nazwaną próbą na aktywność APC- kofaktora 2 wykonywano następująco: inkubowano w czasie 5 minut w temperaturze 37°C, 50 μΐ osocza wykazującego słabąodpowiedź na APC (osocze APC-opome) z 50 μΐ badanej frakcji i 50 μΐ aktywnego odczynnika na czas tromboplastyny (APTT) dostarczonego z firmy APTT-automated Organon Technika (Stany Zjednoczone), a następnie inicjowano koagulację przez dodanie 5 μΐ mieszaniny APC-CaCl₂. Jeśli nie wskazano inaczej, był to roztwór o składzie: 20 nM ludzkiego APC w 10 mM Tns-HCl, 0,05 M NaCl, 30 mM CaCl₂, pH = 7,5, zawierający 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i mierzono czas koagulacji. Obecność aktywności APC- kofaktora 2 w badanej próbce jest związana ze wzrostem czasu koagulacji.

Każdąpróbkę analizowano również równolegle bez dodatku APC do roztworu CaCl₂ i wyliczano zależne od APC wydłużenie czasu koagulacji. Dla sporządzenia krzywej dawka - odpowiedź

181 102 dla aktywności APC- kofaktora 2, mieszano osocze z brakiem aktywności APC- kofaktora 2 z osoczem kontrolnym i stosowano jako osocze testowe w metodzie APC-APTT. Odpowiedź antykoagulacyjną APC odnoszono do procentowej zawartości osocza kontrolnego. Krzywa miała charakter krzywej wykładniczej. Ponieważ nie było wiadomo, czy osocze z niedoborem aktywności APC- kofaktora 2 jest całkowicie pozbawione czynnika V, wykazującego aktywność APCkofaktora 2, próba ta umożliwiała jedynie pół-ilościowe oznaczenie tego kofaktora w różnych frakcjach. Próba ta jednak umożliwiała śledzenie aktywności APC-kofaktora 2 podczas jego oczyszczania.

Próbę oznaczania czynnika V metodą koagulacji prowadzono stosując osocze z niedoborem czynnika V, jak to opisano poprzednio (J. Clin. Invest. 66,583-591,1980). Obecność aktywności czynnika V uwidoczniała się skróceniem czasu koagulacji osocza ubogiego w czynnik V. W obydwu próbach oznaczania aktywności APC- kofaktora 2 i oznaczania czynnika V w próbie koagulacji przedstawione są oryginalne dane dotyczące koagulacji, a nie wyniki wyrażone w jednostkach.

Metody elektroforetyczne, immunologiczne i inne: Elektroforezę żelową w warstwie żelu pohakryloamidowego, w gradiencie od 5 do 15% wobec dodecylosiarczanu sodowego (SDS-PAGE) i próbę hybrydyzacji Westema prowadzono stosując opisane poprzednio techniki (J. Biol. Chem. 261, 9495-9501, 1986). Swoista poliklonalna antysurowica królika przeciw czynnikowi V była darem Dakopatts A/S. Dane demonstrujące swoistość tej antysurowicy cytowano poprzednio (Blood 68,244-249,1986). Przeciwciała poliklonalne królika hodowano przeciwwyizolowanym fragmentom ciężkich i lekkich łańcuchów bydlęcego czynnika V (J. Biol. Chem. 261, 9495-9501,1986). Przeciwciała monoklonalne hodowano stosując metody standardowe, szczegółowo opisane poprzednio (J. Biol. Chem. 265, 8127-8135, 1990). Oczyszczone białko z puli S-300 stosowano jako antygen do immunizacji myszy Balb/c. Otrzymano siedemnaście różnych przeciwciał. Reaktywność tych przeciwciał oznaczano w próbach hybrydyzacji Westema. Ilość około 20 mg przeciwciała oznaczonego jako Master 30 sprzęgano z 4 ml żelu Affigel 10 (Biograd), postępując według instrukcji producenta. Z żelem Affigel sprzęgano również frakcje IgG antysurowicy poliklonalnej przeciw fragmentom ludzkiego czynnika V i bydlęcego czynnika V (około 5 mg/ml).

Przykład 1. Oczyszczanie aktywnego APC-kofaktora 2.

Wszystkie prace z próbkami prowadzono w łaźni z lodem. Procesy chromatografii i wirowania prowadzono w zimnym pomieszczeniu, korzystnie w temperaturze 4°C. Kolekcja krwr ludzkie, świeżo zamrożone (w temperaturze -70°C) osocze z dodatkiem cytrynianu otrzymano z miejscowego banku krwi. To zamrożone osocze (2,3 litra) rozmrożono w temperaturze 37°C i dodano następujące inhibitory proteazy: fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) w stężeniu ImM, diizopropylofluorofosforan (DFP; ImM), inhibitor trypsyny z soi (50 mg/litr), trasylol (aprotynina w ilości 1.5 mg/htr, co jest równoważne 10 jednostkom/ml) i benzydammę (10 mM). Osocze (utrzymywane w łaźni z lodem) poddano adsorpcji nad cytrynianem barn w sposób opisany poprzednio (Dahlback, Biochem. J. 209, 837-846,1983) i zaabsorbowane na soli barowej osocze poddano frakcjonowanej precypitacji glikolem polietylenowym (PEG 6000; 8% wagowo-objętościowo) przez dodanie stałego PEG.

Aktywność APC-kofaktora 2 odzyskiwano w supematancie 8 procentowego PEG Ten supematant 8 procentowego PEG rozcieńczano równą objętością 10 mM roztworu benzydarniny i następnie mieszano z żywicą Q-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Szwecja) zrównoważoną w roztworze o składzie: 20 mM Tns HC1,0,lMNaCl, ImM CaCl₂ (pH = 7,5), zawierającym 10 mM benzamidyny. Po godzinie łagodnego mieszania zbierano żel w lejku Buchnera i przemywano: Ą, buforem do równoważenia w ilości 3 litrów, B, buforem do równoważenia w ilości 1 litra z dodatkiem 0.1% Tween u 201C, buforem do równoważenia w ilości 2 litrów, zawierającym 0.15 M NaCl zamiast 0.1 M NaCL

Następnie żel umieszczono w kolumnie (o średnicy 5 cm) i eluowano zaabsorbowane białka liniowym gradientem NaCl (0,15-0,5 M NaCl w roztworze, zawierającym 20 mM Tns HC1, 1 mM CaCl₂, 10 mM benzamidyny (pH = 7,5). Każdy gradient zużywano w ilości 1,5 litra

181 102

Szybkość przepływu wynosiła 330 ml/godzinę. Zbierano frakcje po 11 ml. Frakcje analizowano na aktywność APC-kofaktora 2 i aktywność czynnika V w rozcieńczalnikach 1/10 (fig. 1).

Frakcje łączono, jak wskazano poziomym słupkiem i poddawano strącaniu za pomocą (NH₄)₂SO₄ o 70% nasyceniu. Strąt zbierano przez wirowanie, rozpuszczano w minimalnej objętości roztworu o składzie: 20 mM Tris HC1,0,15 MNaCl, ImM CaCl₂ (pH = 7,5), zawierającym 10 mM benzamidyny, 1 mM DFP i 1 mM PMSF i podawano na kolumnę (2,5 cm x 93 cm) wypełnioną żywicą Sephacryl S-300 (Pharmacia) zrównoważoną tym samym buforem, ale bez DFP i PMSF. Kolumnę przemywano z szybkością 10 ml/godzinę i zbierano frakcje po 1.2 ml. Frakcje te analizowano w próbie na aktywność APC-kofaktora 21 w próbie na aktywność czynnika V w rozcieńczalnikach 1/10 (fig. 1). Frakcje łączono, jak wskazano poziomymi paskami i przechowywano w temperaturze -70°C.

Przykład2. Chromatografia powinowactwa z użyciem przeciwciał monoklonalnych.

Białko otrzymane w przykładzie 1 w procesie chromatografii na kolumnie S-300 (w przykładowym przebiegu 6 mg w roztworze o składzie: 20 mM Tris HC1, 0.1 M NaCl, 2 mM CaCl₂(pH = 7,5) podawano na kolumnę o wymiarach 0,75 cm x 7,5 cm wypełnioną żywicą Affigel z immobilizowanym przeciwciałem monoklonalnym o nazwie Master 30, otrzymanym w przykładzie 3. Następnie kolumnę wraz z wprowadzonym na nią białkiem równoważono w roztworze o składzie: 20 mm Tris HC1,0,1 NaCl, 2 mM CaCl₂ (pH = 7,5). Kolumnę przemywano do czasu osiągnięcia absorbancji eluatu równej zero i następnie eluowano związane białka roztworem zawierającym 50 mM dietyloaminy i 2 mM CaCl₂ (pH = 10,6). Eluat natychmiast zobojętniano za pomocą 3 M Tris HC1 (pH = 7,5) w ilości 50 μΐ na 1 ml frakcji, frakcje analizowano w rozcieńczeniu 1:5 wykonując próbę na aktywność APC-kofaktora 2 i próbę koagulacji na czynnik V. Aktywne frakcje łączono, zatężano przez ultrafilFrację (membrany YM10) i przechowywano w temperaturze -70°C. Oczyszczony APC-kofaktora 2/czynnik V aktywowano trombinąw sposób opisany uprzednio (J. Clin. Invest. 66, 583-591, 1980).

Przykład 3. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych.

Oczyszczone białko z przykładu 1, to znaczy czynnik V (APC-kofaktor 2), stosowano jako immunogen do immunizacji myszy Balb/c, postępując według standardowej procedury. Następnie, komórki śledziony od tych myszy poddawano fuzji z komórkami Sp 2/0 Ag 14 mysiej linii komórek szpiczaka i selekcjonowano w pożywce hipoksantyna - aminopteryna - tymidyna (DMEM) w sposób opisany prze Kohlefa i Milstein'a (cytowanych powyżej).

Do wykrywania przeciwciał wytworzonych przeciw czynnikowi V w antysurowicy uzyskanej od tych myszy oraz do wykrywania komórek hybrydowych wytwarzających przeciwciała zastosowano próbę ELISA (enzymatycznąpróbę immunoabsorpcji w fazie stałej). W tych próbach, czynnikiem V (10 μ/ml) w standardowym buforze do powlekania powlekano dołki w płytkach do mikromianowama. Antysurowice pochodzące od immunizowanych myszy i supematanty hodowli komórek hybrydowych dodawano do dołków w rozcieńczeniu i zawartość poszczególnych dołków analizowano na obecność przeciwciał związanych z czynnikiem V przy użyciu znakowanego enzymem drugiego przeciwciała w znany sposób.

Komórki hybrydowe z dołków dających reakcję dodatnią, to znaczy, komórki wytwarzające przeciwciała, klonowano metodą ograniczonych rozcieńczeń, subklonowano i namnażano. Po implantacji do jamy otrzewnowej myszy traktowanych uprzednio pristanem wytwarzano przeciwciała monoklonalne w płynie puchlinowym w dużych ilościach.

Otrzymano siedemnaście przeciwciał (master). Wszystkie te przeciwciała reagowały z determinantami antygenowymi na czynniku V. co wykazały analizy techniką Westema, przy czym większość tych przeciwciał monoklonalnych (skrót Mab) była skierowana przeciw temu samemu regionowi czynnika V, a mianowicie, fragmentowi aktywacji zawartemu w centralnym regionie o wielkości 150 kDa w czynniku V.

Jedno z tych przeciwciał, oznaczone nazwą Master 30, użyto do oczyszczania czynnika V metodą powinowactwa według przykładu 2.

181 102

Przykład 4. W mniejszym przykładzie analizowano przeciwciała monoklonalne wytworzone w przykładzie 3 w celu określenia ich wpływu na aktywność koagulacyjnąi aktywność APC-kofaktora 2 w osoczu.

Do normalnego osocza dodawano wzrastające ilości oczyszczonego Mab, aż do stężenia 400 pg/ml i po 15 - 30 minutowej inkubacji wykonywano pomiar aktywności czynnika V w znanej próbie oznaczania czynnika V, opartej na pomiarze koagulacji i określano odpowiedź na egzogenny APC, postępując w niżej podany sposób.

Próbki normalnego osocza zawierające różne stężenia Mab (10 - 400 pg/ml) inkubowano z handlowym odczynnikiem APTT. W badaniach użyto odczynnik „Automated APTT” z firmy Organon. Podobne wyniki uzyskano stosując odczynnik APTT z firmy COATEST APC Resistance, Chromogenix AB, Molndal, Szwecja). Po inkubacji w czasie 5 minut w temperaturze 37°C dodawano albo 30 mM CaCl₂ w roztworze o składzie: 20 mM Tris HC1, 50 mMNaCl (pH = 7.5) z dodatkiem 0.1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) albo aktywne białko C (APC) w ilości około 2 pg/ml w 30 mM CaCl₂ w roztworze o składzie: 20 mM Tris HC1,50 mM NaCl (pH = 7.5) z dodatkiem 0.1% BSA i oznaczano czasy koagulacji. Próbę APTT prowadzono w sposób zasadniczo zgodny z opisanym przez Dahłbacka i wsp. w PNAS 90, 1004-1008, 1993.

Obecność przeciwciał monoklonalnych me wpływała wcale lub tylko w niewielkim stopniu na zwykły czas krzepnięcia (APT), to znaczy, na czas aglutynacji uzyskany dla próbek zawierających dodany CaCl₂. Czas aglutynacji w tych próbkach wynosił 40-45 sekund. Jednak dwa z badanych przeciwciał monoklonalnych, oznaczone jako Master 1 i Master 4 skracały czas aglutynacji w próbkach, do których dodano APC w roztworze CaCl₂ (czas APC).

Uzyskano następujące czasy aglutynacji:

czas APC przy nieobecności Mab 110 -120 sekund czas APC wobec Master 4 80- 90 sekund.

Uzyskane wyniki wskazująna częściowe hamowanie aktywności APC-kofaktora 2 w osoczu w obecności przeciwciała Master 4. To częściowe hamowanie aktywności wykazywane przez Master 4 było zależne od dodanej ilości. Maksymalne hamowanie występowało w próbkach o zawartości 50-100 pg Master 4 na ml osocza. Przeciwciało Master 4 zdeponowano jak to zaznaczono powyżej.

Wyniki powyższych prób są opisane poniżej w odniesieniu do załączonych figur 1 -4 (A,B).

Figura 1 ilustruje chromatografię na żywicy Q-Sepharose (A) i Sephacryl S-300 (B) czynnika V i aktywności APC-kofaktora 2. Na obydwu kolumnach krzywa eluowania aktywności APC-kofaktora 2 (sekcje górne) jest zgodna z krzywą dla czynnika V (sekcje środkowe). Aktywność czynnika V wyrażona jako skrócenie czasu aglutynacji osocza z niedoborem czynnika V, podczas gdy aktywność APC-kofaktora 2 związano z zależnym od APC przedłużeniem czasu aglutynacji osocza APC-opomego. Frakcje łączono w miejscach wskazanych poprzecznymi słupkami.

Figura 2 ilustruje wyniki prób charakteryzacji wyizolowanego APC-kofaktora 2/czynnika V metodami elektroforezy SDS-PAGE, hybrydyzacji Westema i elektroforezy w żelu agarozowy Połączony materiał z kolumny S-300 z przykładu 1 analizowano metodą SDS-PAGE, przed i po mkubacji z trombiną. Żele albo barwiono błękitem Coomassie (A) albo poddawano próbom hybrydyzacji techniką Westema stosując przeciwciało monoklonalne (Master 30) otrzymane w przykładzie 3 (B) albo przeciwciała poliklonalne (C). Próbki poddawane elektroforezie SDS-PAGE redukowano. Około 20 pg białka podawano do każdego pasma w żelu barwionym białkiem, a do każdego pasma stosowanego do hybrydyzacji Westema dodawano 1 pg białka. Pasma z białkiem trawionym trombiną są oznaczone literą T. Pozycje znaczników masy cząsteczkowej są podane po lewej stronie. Polipeptydy związane z czynnikiem V są oznaczone strzałkami, a fragmenty powstałe w wyniku działania trombiną (J. Biol. Chem., 257, 6556-6564) są oznaczone grotami strzałek. Fragment o wielkości 150 kDa barwi się słabo błękitem Coomassie, ale jest łatwo zauważalny w próbie Westema. Pasma nieciągłe są oznaczone gwiazdkami. Połączony materiał z chromatografii na żywicy S-300 analizowano również metodą elektroforezy w żelu agarozowym (sekcja dolna). Pozycje albuminy (alb), pasma^c^ i β] i β2 osocza kontrolnego sąoznaczone liniami pionowymi

181 102

Figura 3 ilustruje wspólne oczyszczanie aktywności APC-kofaktora 2 i czynnika V metodą chromatografii powinowactwa z użyciem przeciwciała monoklonalnego. Na kolumnę do chromatografii powinowactwa ze związanym przeciwciałem monoklonalnym (Master 30) naniesiono połączony materiał z kolumny S-300. Ponieważ pojemność wiążąca kolumny została przekroczona, większość białka przechodzi przez kolumnę. Po wymyciu kolumny, związane białko eluowano roztworem o wysokim pH (początek eluowama wskazany jest strzałką). Frakcje analizowano zarówno na aktywność APC-kofaktora 2 jak i na obecność czynnika V. Aktywność czynnika V oznaczano na podstawie skrócenia czasu aglutynacji w osoczu z barkiem czynnika V, podczas gdy aktywność APC-kofaktora 2 dawała zależne od APC wydłużenie czasu aglutynacji w osoczu opornym na APC. Dwie linie kreskowane oznaczają czasy aglutynacji buforowanych roztworów kontrolnych.

Figura 4 (A-B) ilustruje naprawę APC-opomości przez oczyszczony APC-kofaktor 2/czynnik V. Oczyszczony metodą chromatografii powinowactwa APC-kofaktor 2/czynnik V (we wskazanych stężeniach w objętości 50 μΐ) mieszano z osoczem opornym na APC (40 ml). Następnie mieszaniny analizowano w próbie na aktywność APC-kofaktora 2 (A) z dodatkiem (o) i bez dodatku (o) APC w roztworze CaCl₂ i w próbie na obecność czynnika V (B). Każdy punkt reprezentuje średnią z dwóch pomiarów.

WYNIKI

Aktywność APC-kofaktora 2 analizowano stosując próby biologiczne z zastosowaniem osocza pobranego od osobników z APC-opomością (osocze AS) jako osocza testowego i procedury opracowanej dla oczyszczania APC-kofaktora 2 z normalnego osocza. Pierwszym etapem tego oczyszczania była absorpcj a na cytrynianie baru, pozwalająca na usunięcie białek zależnych od witaminy K, w tym białek C i S. Eluat po abso rpcj i cytrynianem baru nie wykazywał aktywności APC-kofaktora 2. Przy frakcjonowaniu supematantu osocza za pomocą strącania glikolem polietylenowym PEG 6000 aktywność APC-kofaktora 2 znajdowała się w supematancie ze strącania 8% PEG, podczas gdy rozpuszczony osad po strącaniu 0-8% roztworami PEG 6000 me wykazywał aktywności APC-kofaktora 2. Aktywność APC-kofaktora 2 w supematancie ze strącania 8% PEG oczyszczano początkowo metodą chromatografii anionowymiennej na kolumnie wypełnionej żywicą Q-Sepharose, a następnie metodą filtracji żelowej na żywicy Sephacryl S-300 (fig. 1).

Sposób oczyszczania był bardzo podobny do sposobu oczyszczania czynnika koagulacji V (J. Clin. Invest. 66, 583-591,1980). Czynnik V znajdowano w tych samych frakcjach, które zawierały aktywność APC-kofaktora 2. Oczyszczanie prowadzono co najmniej 10 razy, z różnymi modyfikacjami, otrzymując w zasadzie bardzo podobne profile eluowania dla aktywności czynnika V i aktywności APC-kofaktora 2. Białko uzyskane z puli z kolumny S-300 wykazywało aktywność zarówno czynnika V jak i APC-kofaktora 2 i posiadało właściwości opisane uprzednio dla czynnika V (J. Clin. Invest. 66, 583-591, 1980). Dodatkowe wysiłki w celu rozdzielenia tych dwu aktywności z zastosowaniem szeregu innych zasad chromatografii, takich jak chromatografia na żywicach Heparin Sepharose, Blue Sepharose i Sepharose z aglutyniną z kiełków pszenicznych nie dały zadawalających wyników (których nie przytoczono), a aktywność APCkofaktora 2 oczyszczano łącznie z czynnikiem V na każdym zastosowanym nośniku chromatograficznym.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym SDS białka uzyskanego z puli z kolumny S-300 dała pasmo o wielkości 330 000 (odpowiadające jednemu łańcuchowi czynnika V) oraz pasma odpowiadające masom cząsteczkowym około 220 0001 130 000 -150 000 (fig. 2). Te pasma reprezentują rozszczepiony czynnik V i jak białko o masie cząsteczkowej 330 000 reagują z antysurowicąpoliklonalną przeciw czynnikowi w próbach hybrydyzacji Westema (fig. 2). Pasmo o wielkości 220 000 reprezentuje C-końcową część czynnika V, w tym łańcuch lekki czynnika V_a o wielkości 74 kDa i większy (150 000) złożony z dwu fragmentów aktywacji. Pasmo to jest rozpoznawane przez antysurowicę przeciw lekkiemu łańcuchowi bydlęcego czynnika V_a(wyniki nie są przedstawione). Pasma o wielkości 130 000-150 000 zawierająN-końcową część czynnika V (łańcuch ciężki o wielkości 105 kDa oraz mniejszy złożony z dwu fragmentów akty

181 102 wacji) i reagują z antysurowicą przeciw łańcuchowi ciężkiemu bydlęcego czynnika V_a (wyniki nie są przedstawione).

Dodatkowe pasma o niższych masach cząsteczkowych nie reagujące z antysurowicąpoliklonalną dla czynnika V w próbach hybrydyzacji Westema były czasami widoczne, ale jeśli występowały, to ich krzywe eluowania podczas chromatografii na kolumnie S-300 nie odpowiadały aktywności czynnika V ani aktywności APC-kofaktora 2 (jak wynikało z analizy metodą SDS-PAGE). Inkubacja oczyszczonego białka z trombmą dawała fragmenty charakterystyczne dla czynnika V rozszczepionego trombiną, a przy okazji tracono aktywność w próbie na APC-kofaktor 2, co sugeruje, że aktywność APC-kofaktora 2 wykazuje tylko czynnik V a nie czynnik V_a. W procesie elektroforezy w żelu agarozowym, to oczyszczone białko migruje jako jedna substancja do pozycji alfa (fig. 2). Z tej pozycji żelu można eluować zarówno aktywność czynnika V jak i aktywność APC-kofaktora 2 (nie jest to uwidocznione).

Czynnik V jest szczególnie wrażliwy na proteolizę. Z tego względu w końcowym protokole uwzględniono cały szereg inhibitorów proteazy. Przy prowadzeniu procesu przy braku inhibitorów proteazy w wyniku procedury oczyszczania otrzymywano bardziej rozłożony produkt, nie zawierający substancji o masie cząsteczkowej 330 000, ale zawierający pasma o wielkości 220 000 i 130 000-150 000. Oczyszczony produkt wykazywał aktywność zarówno czynnika V jak i APC-kofaktora 2. Dla utrzymania stabilności czynnika V potrzebne są jony wapnia. Jeśli w procesie oczyszczania nie stosowano wapnia to aktywności czynnika V i APC-kofaktora 2 stopniowo zanikały.

Białko S-300 stosowano jako antygen w przykładzie 3 do produkcji przeciwciał monoklonalnych. Otrzymano siedemnaście takich przeciwciał. Wszystkie one reagowały jednołańcuchowym czynnikiem V o wielkości 330 000 i z produktami o wielkości 220 000 co wykazano w próbie Westema (fig. 2). Po rozszczepieniu czynnika V trombiną wszystkie przeciwciała reagowały z fragmentem aktywacji o wielkości 150000 (większy z dwu fragmentów aktywacji).

Jedno z przeciwciał (Master 30) immobilizowano na żelu Affigel i stosowano do chromatografii powinowactwa (fig. 3). Na kolumnę wprowadzano białko z kolumny S-300. Białko związane na kolumnie eluowano. Okazało się, ze wykazuje ono aktywność czynnika V i APCkofaktora 2. Krzywe eluowania obydwu tych aktywności były ze sobą zgodne ale wykazywały znaczne ślady. Inne warunki eluowania, takie jak wyższe lub niższe wartości pH albo użycie środków denaturujących były próbowane, ale me dały zadawalających wyników, gdyż zanikały wówczas obydwa rodzaje aktywności. Całość białka z kolumny S-300 podawano również na kolumny z immobilizowanymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciw ludzkiemu czynnikowi V albo przeciw fragmentom bydlęcego czynnika V_a. Aktywność czynnika V i APC-kofaktora 2 pozostająna kolumnach, ale denaturujące warunki wymagane do eluowania związanego białka powodują utratę obydwu tych aktywności biologicznych (wyników nie cytowano).

Wzrastające stężenia oczyszczonego metodąpowmowactwa APC-kofaktora 2/czynnika V dodawano do osocza AS i oznaczano odpowiedź antykoagulacyjną na APC. Obserwowano zależną od dawki antykoagulacyjnąodpowiedź na APC (fig. 4A). Aby uzyskać odpowiedź na APC w osoczu AS porównywalną do tej jaką daje normalne osocze (czasy koagulacji wobec APC wynoszące 90-110 sekund), należało dostarczyć około 25 mg/litr, co stanowi taki sam rząd wielkości stężenia w jakim występuje czynnik V w normalnym osoczu. Białko oczyszczone metodą powinowactwa było również aktywne w próbie na czynnik V, co wykazano stwierdzając skrócenie czasu koagulacji (fig. 4B).

PRÓBY NA OBECNOŚĆ SKŁADNIKÓW W UKŁADZIE APC-KOFAKTORA

W następujących przykładach wykazano, że utrzymując stałe poziomy dwóch składników w układzie APC-kofaktora zawierającego APC, czynnik V wykazujący aktywność APC-kofaktora 2 i białko S i zmieniając poziomy pozostałych składników, można uzyskać różne szybkości konwersji substratu. Nasuwa się więc wniosek, ze można zaprojektować metody analizy jak opisane powyżej dla każdego z tych składników. Próba z zastosowaniem osocza z deficytem aktywności APC-kofaktora 2 została ujawniona w sekcji: Materiały i Metody.

Przykład5. Działanie APC-kofaktora 2 w analizie z odczynnikiem chromogennym.

Zasada oznaczenia jest oparta na monitorowaniu rozkładu czynnika VIII_a przez APC na drodze zależnej od czynnika IX_a aktywacji czynnika X, w którym to układzie czynnik VłII_a służy jako ważny kofaktor dla czynnika IX_a. Tak więc, obniżony poziom czynnika VIII_a będzie powodował zmniejszenie wytwarzania czynnika X_a, co można oznaczyć przez hydrolizę czułego na czynnik X_a chromogennego substratu peptydowego.

I. Ilość 50 μΐ normalnego osocza w rozcieńczeniu 1:20 w buforze 50 milimoli/litr Tns HC1 (pH = 7,3), I = 0,15 i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), zawierającego wysoce oczyszczony koncentrat czynnika VIII (Octonativ M*, Kabi Pharmacia AB, Sztokholm, Szwecja) w ilości 2 jednostek międzynarodowych/ml mieszano z 50 μΐ trombiny bydlęcej o aktywności 0,06 nkat/ml (aktywność względem substratu S-2238 (Chromogenix AB, Mólndal, Szwecja)) w czasie 30 sekund w temperaturze 37°C.

II. Nastęnie, do powyższej mieszaniny dodano 100 μΐ mieszaniny reagenta (R) zawierającej 40 milimoli/litr Tris HC1 (pH = 7,3) i 0,15% BSA, 12 milimoli/litr CaCl₂ i 30 pmoli/litr fosfolipidów oraz inne składniki wymienione poniżej i prowadzi się inkubację w czasie 2 minut w temperaturze 37°C.

III. Z powyższej mieszaniny pobrano próbkę 25 μΐ i rozcieńczono ją ilością 1000 μΐ buforu Tns HC1 (pH = 7,3) o stężeniu 50 milimoli/litr. I = 0,15, z dodatkiem 0.2% BSA, po czym analizowano aktywność czynnika VIII w próbie o nazwie COATEST^R VIII postępując według zasad wykonywania tego testu (Chromogenix AB, Molndal, Szwecja).

IV Ilość 200 μΐ odczynnika zawierającego bydlęcy czynnik IX_a i bydlęcy czynnik X (COATEST FVIII^r, Chromogenix AB, Mólndal, Szwecja) oraz 30 pmoli/litr fosfolipidów mieszano z ilością 100 μΐ rozcieńczonej próbki pobranej z p. II i z ilością 100 μΐ CaCl₂ o stężeniu 25 milimoli/litr. Po 5 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C dodano 200 μΐ chromogemcznego substratu dla czynnika X_a o nazwie S-2765 (Chromogenix AB, Molndal, Szwecja) w stężeniu 0,9 milimoli/litr. Po dalszych 3 minutach inkubacji w temperaturze 37°C zatrzymano hydrolizę substratu przez dodanie 100 μΐ 20% kwasu octowego i odczytano absorbancję uwolnionego chromoforu pNA (p-nitroanilina) w fotometrze, przy długości fali 405 nm. W tym układzie, stężenie aktywnego czynnika VIII w próbce jest wprostproporcjonalne do absorbancji. Zawartości dodatkowych składników w różnych mieszaninach R były następujące:

A. nie było

B. APC, 0.4 pg/ml,

C. APC, 0.4 pg/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 0,3 jednostki/ml,

D. APC, 0.4 pg/ml + ludzkie białko S, 1 pg/ml

E. APC, 0.4 pg/ml + ludzkie białko S, 1 pg/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 0,3 jednostki/ml.

Normalne osocze zawiera około 10 pg/ml wolnego białka S, tak więc, rozcieńczenia próbek wnoszą 0.05 x 0.05 x 10 = 0.025 pg w etapie Π, co odpowiada jednej czwartej dodanej ilości oczyszczonego ludzkiego białka S. Zawartość aktywności APC-kofaktora 2 powinna być przyjmowana jako wartość szacunkowa, gdyż dotychczas nie istniejąilościowe metody oznaczania tej aktywności.

WYNIKI

Mieszanina R	Białko S stęż, w etapie II pg/ml	A 405	Wpływ aktywności APC-kofaktora 2 na aktywność APC wyrażona jako A 405
A	0.125	0.678
B	0.125	0 623
C	0.125	0 509	-0.114 (C-B)
D	0.625	0.559
E	0.625	0.389	-0.170 (E-D)

181 102

Wyniki wskazują, że dodanie aktywności APC-kofaktora 2 zwiększa aktywność APC na obydwu poziomach stężenia białka S, co jest zilustrowane zmniejszeniem wytwarzania czynnika X_a, a więc zwiększoną szybkością inaktywacji czynnika VIII_a w etapie Π.

Przykład 6. Działanie APC-kofaktora 2 w próbie aglutynacji.

Kofaktory V_a i VIII_a biorą udział w wytwarzaniu trombiny, enzymu odpowiedzialnego za powstawanie fibryny. Te kofaktory sądegradowane przez APC, a więc, aktywność APC jest wyrażona w próbie aglutynacji jak wydłużenie czasu potrzebnego do powstania skrzepu fibryny. Ponieważ białko C (PC) krąży we krwi jako proenzym, białko C aktywuje się w próbce przez dodanie enzymu z jadu żmiji, Protac C^R (Pentapharm, Bazylea, Szwajcaria). Przeprowadzono następujące doświadczenie:

I. Ilość 10 μΐ koncentratu czynnika VIII (Octonativ M, Kabi Pharmacia, AB, Sztokholm, Szwecja) o stężeniu 10 jednostek międzynarodowych/ml zmieszano ze 100 μΐ osocza z deficytem PC, 100 pl odczynnika APTT, 25 pl enzymu Protac C o stężeniu 1,5 jednostek/ml i do powyższej mieszaniny dodano 25 μΐ mieszaniny reagenta R zawierającej 50 milimoli/litr Tris HC1 (pH = 7.5), 1 = 0.15,0,2% BSA i dalsze składniki wymienione poniżej. Mieszaninę tę inkubowano w czasie 4 minut w temperaturze 37°C.

II. Do powyższej mieszaniny dodano następnie 100 μΐ CaCl₂ o stężeniu 22 milimole/htr i mierzono czas potrzebny do wytworzenia się skrzepu w temperaturze 37°C.

Dodatkowe składniki w mieszaninach R:

A. nie dodano

B. PC, 2 pg/ml,

C. PC, 2 pg/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 2,6 jednostek/ml,

D. PC, 4 pg/ml

E. PC, 4 pg/ml + aktywność APC-kofaktora 2, 2,6 jednostek/ml,

F. APC-kofaktor 2, 2,6 jednostek/ml.

Osocze z deficytem białka C współdziała wraz z innymi białkami osocza w procesie powstawania skrzepu, jak również z białkiem S, będącym kofaktorem dla APC. Końcowe stężenie aktywności APC-kofaktora 2 w etapie I wynosi około 0,2 - 0,3 jednostki/ml (patrz wyżej).

WYNIKI

Mieszanina R	Białko C stęż, w etapie I pg/ml	Czas aglutynacji sek.	Przedłużenie aktywności APC przez APC-kofaktora 2, sek.
A	0	42.3 ± 0.7 (n=5)
B	0.2	62.7 ± 1 2 (n=5)
C	0.2	71.4 ± 1.6 (n=3)	8,7
D	0.4	79 3 ± 2 9 (n=5)
E	0.4	104.5 ±8.6 (n=3)	25,2
F	0	45.9

Powyższe doświadczenia wyraźnie wskazują, że dodanie aktywności APC-kofaktora 2 zwiększa aktywność APC wyrażoną jako zwiększone wydłużenie czasu aglutynacji. Wpływ jako taki dodania preparatu APC-kofaktora 2 pj-zy braku białka C jest niewielki.

181 102

Czas aglutynacji (sekundy) Absorbancja przy 280

FIG.1

Numery frakcji

181 102

FIG.3

Numer frakcji

181 102

F1G.4A

ο 10 20 30 40 50

Dodane białko (Llg/ml)

Dodane białko ( ąg/ml)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywności wybranego składnika koagulacji krwi, do diagnozowania zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych krwi, zwłaszcza zaburzeń zakrzepowo-zatorowych a także określania skłonności do tych zaburzeń u osobników, korzystnie u ssaków zwłaszcza u ludzi, związanego z układem antykoagulacyjnym białka C i obejmującym białko C, aktywne białko C (APC), białko S lub antykoagulacyjny czynnik V w oparciu o powiązanie tej aktywności funkcjonalnej z konwersją specyficznego dla APC substratu, w obecności wspomnianych składników układu antykoagulacyjnego białka C, znamienny tym, że do roztworu testowego zawierającego próbkę i substrat dla APC dodaje się jedną lub dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tę aktywność, mierzy się szybkość powodowanej przez APC konwersji substratu, oraz wykonuje się korelację zmierzonej wielkości z aktywnością oznaczanego składnika, przy czym, gdy badanym składnikiem jest białko C/APC lub białko S, do medium testowego dodaje się co najmniej czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjnąlub inhibitor blokujący tę aktywność, i diagnozuje się na podstawie poziomu substancji analizowanej w próbce od osobnika skłonności do zaburzeń koagulacyjnych i antykoagulacyjnych a także ocenia się skłonność do zaburzeń zakrzepowo-zatorowych.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodaje się do medium testowego dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tę aktywność.
3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że dodaje się jednąlub dwie substancje inne niż oznaczany składnik, albo inhibitor jego aktywności, wybrane spośród a) APC, b) białka S lub inhibitora, który blokuje aktywność białka S, oraz c) posiadającego antykoagulacyjną aktywność czynnika V albo inhibitora, który blokuje tę aktywność, każdą w ilości wystarczającej do dostosowania do zmiennego poziomu wspomnianych substancji, korzystnie wspomnianą substancję dodaje się w nadmiarze.
4. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że oznacza się antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC.
5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że oznacza się antykoagulacyjny czynnik V związany z opornością na APC.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się aktywność antykoagulacyjną czynnika V w obecności dodanego białka S, albo inhibitora blokującego pochodzącą z próbki aktywność białka S.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku gdy oznacza się białko C po aktywacji do APC lub APC, do medium testowego dodaje się czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjną albo inhibitor blokujący aktywność pochodzącą z próbki i białko S lub inhibitor blokujący pochodzącą z próbki aktywność białka S.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku gdy oznacza się białko S, do medium testowego dodaje się czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjnąalbo inhibitor blokujący aktywność pochodzącą z tej samej próbki oraz APC.
9. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że do medium testowego dodaje się czynnik VIII i/lub czynnik VIIIa.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku gdy stosuje się białka koagulacyjne do pomiaru substratowej konwersji APC, a substrat dla APC zawiera czynnik Va i/lub

181 102 czynnik VIIIa i próbka pochodzi od osobnika, do medium testowego dodaje się białko S albo inhibitor białka S, z tym, że jeśli próbka pochodzi od osobnika leczonego antagonistami witaminy K lub z deficytem innego pochodzenia zależnych od witaminy K czynników koagulacji, wówczas modyfikuje się aktywności tych czynników zależnych od witaminy K w próbce przez dodanie co najmniej jednego czynnika koagulacji zależnego od witaminy K w formie aktywnej lub nieaktywnej, ewentualnie w połączeniu z białkiem S.
11. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że do medium testowego dodaje się takąilość wybranej substancji aby poziom jej aktywności funkcjonalnej był stały w porównywalnych próbkach.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że do badanego medium testowego wprowadza się fiinkcjonalny nadmiar wybranej substancji w porównaniu z poziomem tej substancji występującym w samej próbce.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako inhibitor stosuje się przeciwciało wiążące się swoiście z epitopem związanym z aktywnością APC, lub z antykoagulacyjnąaktywnością czynnika v związaną z opornością na APC.
14. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, znamienny tym, że jako próbkę stosuje się krew albo próbkę pochodzącąz krwi, zwłaszcza próbkę osocza.
15. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, znamienny tym, że jedną albo dwie dodawane substancje wprowadza się w postaci osocza z deficytem oznaczanej substancji.
16. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6, albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, znamienny tym, że do medium testowego dodaje się prawidłowe osocze z deficytem oznaczanej substancji.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik v jako kofaktor dla APC, a osocze z deficytem oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika v.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik v związany z opomościąna APC, a osocze wolne od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od Czynnika V.
19. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6. albo 7, albo 8, albo 12, albo 13, albo 17, albo 18, znamienny tym, że w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC lub związany z opomościąna APC do medium testowego dodaje się czynnik koagulacji krwi lub odczynnik, który aktywuje układ koagulacji krwi na drodze zewnętrznej lub wewnętrznej.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że dodaje się ponadto koagulacyjne czynniki krwi wybrane z grupy obejmującej czynnik VIl/VIIa, czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X/Xa, czynnik Π, czynnik XIa, czynnik XHa oraz aktywator kontaktowy lub czynnik tkankowy.
21. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 6, albo 7, albo8,albo 12,albo 13,albo 17,albo 18, znamienny tym, że gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V posiadający aktywność antykoagulacyjnąjako kofaktor dla APC lub związany z opomościąna APC, dodaje się osocze z deficytem aktywności antykoagulacyjnej, które to osocze stanowi osocze ludzkie, pozbawione tej aktywności, albo też osocze ludzkie od jednego lub więcej osobników, których osocze jest pozbawione takiej aktywności.
22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się poziom aktywności antykoagulacyjnej czynnika v jako kofaktora dla APC.
23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się poziom aktywności antykoagulacyjnej czynnika v związanego z opomościąna APC.
24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność antykoagulacyjnąoznacza się w sposób dostosowany do pomiaru aktywności antykoagulacyjnej czynnika V jako kofaktora dla APC, albo w sposób dostosowany do oznaczania antykoagulacyjnego czynnika V związanego z odpornością na APC.
25. Sposób według zastrz. 22, albo 23, znamienny tym, że antykoagulacyjną aktywność czynnika V oznacza się metodą immunologiczną.
26. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność antykoagulacyjną czynnika V jako ko faktora dla APC oznacza się w próbce w oparciu o próbkę koagulacji, w której to próbie (i) jednąporcję próbki inkubuje się przy nieobecności dodanego APC, ale ewentualnie w obecności innych składników układu krzepnięcia krwi, umożliwiających pomiar konwersji substratu przez APC i (ii) jednąporcję próbki inkubuje się w obecności dodanego APC i ewentualnie w obecności innych składników układu krzepnięcia krwi, umożliwiających pomiar konwersji substratu przez APC, i wyniki prezentuje się jako czas aglutynacji, ewentualnie po odpowiedniej konwersji, przy czym wyniki poniżej ustalonej wartości „odcięcia” przyjętej w oparciu o pomiar czasów aglutynacji wykonany w ten sam sposób u normalnych osobników, wskazują na niedobór aktywności antykoagulacyjnej czynnika v.
27. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do medium testowego dodaje się prawidłowe osocze wolne od oznaczanej substancji.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC, a osocze wolne od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika V.
29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V związany z odpornością na APC, a plazmę wolną od oznaczanej substancji stanowi osocze wolne od czynnika V.
30. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V jako kofaktor dla APC lub związany z opornością na APC do medium testowego dodaje się czynnik koagulacji krwi lub odczynniki, które aktywują układ krzepnięcia krwi na drodze wewnętrznej lub zewnętrznej. '
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że dodaje się inne składniki koagulacji krwi, które to składniki wybrane są z grupy obejmującej czynnik VH/VHa, czynnik IX, czynnik IXa, czynnik X/Xa, czynnik II, czynnik XIa, czynnik XIIa oraz odczynnik, taki jak aktywator kontaktowy lub czynnik tkankowy.
32. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku gdy oznaczaną substancję stanowi antykoagulacyjny czynnik V, posiadający aktywność antykoagulacyjną jako kofaktor dla APC, lub związany z opornością na APC, dodaje się osocze wolne od tej aktywności antykoagulacyjnej, które to osocze stanowi osocze ludzkie, które zostało pozbawione tej aktywności, albo też osocze ludzkie od jednego lub więcej osobników, których osocze było pozbawione takiej aktywności.

* * *