ES2081618T5 - Metodo para diagnosticar anomalias de la coagulacion de la sangre. - Google Patents
Metodo para diagnosticar anomalias de la coagulacion de la sangre.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO IN VITRO QUE ES PARTICULARMENTE UTIL PARA EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES TROMBOEMBOLICAS, TAL COMO LA TROMBOFILIA HEREDITARIA O NO HEREDITARIA, Y PARA DETERMINAR EL RIESGO POR TROMBOSIS A PROPOSITO DE EMBARAZO, TOMA DE PILDORAS ANTICONCEPTIVAS, CIRUGIA, ETC. EL METODO SE CARACTERIZA EN QUE EL SISTEMA DE COAGULACION EN UNA MUESTRA SE ACTIVA TOTAL O PARCIALMENTE DE UN MODO CONOCIDO DE POR SI E INCUBADO CON PROTEINA C ACTIVADA, DESPUES DE LO CUAL SE DETERMINA EL PROCENTAJE DE REACCION DE CONVERSION DE SUSTRATO COMO COAGULACION O CONVERSION DE UN SUSTRATO CROMOGENICO. EL PORCENTAJE DE CONVERSION OBTENIDO SE COMPARA CON LOS VALORES OBTENIDOS PARA MUESTRAS DE PLASMA NORMAL. SI EL PORCENTAJE SE AUMENTA, ESO INDICA QUE EL INDIVIDUO DEL CUAL SE DERIVA LA MUESTRA PUEDE SUFRIR UNA ENFERMEDAD TROMBOEMBOLICA.
Description
Método para diagnosticar anomalías de la
coagulación de la sangre.
La presente invención se refiere a un nuevo
método apropiado para diagnóstico de enfermedades tromboembólicas,
p. ej. la trombofilia hereditaria. La invención se puede utilizar
también para determinar el riesgo de trombosis en mujeres
embarazadas, personas que se someten a cirugía, personas que toman
fármacos anticonceptivos, etc.
La coagulación de la sangre comprende un sistema
complejo de proenzimas interrelacionadas, enzimas y cofactores que
realizan su función en las superficies de las plaquetas y células
endoteliales activadas. Cuando el sistema se activa, el resultado
final es la formación de un coágulo de sangre que contiene fibrina
insoluble. La iniciación y terminación de la formación de fibrina
se regula cuidadosamente en la homeostasis normal. In vitro,
las plaquetas y las superficies de las células endoteliales se
reemplazan usualmente con fosfolípidos adecuados. Para la invención,
la parte importante del sistema de coagulación es:
La parte importante para la invención se refiere
a la Proteína C (=PC) y los efectos producidos por la acción de la
Proteína C activada (=APC) sobre el sistema de coagulación. La
proteína C es un zimógeno que puede ser activado in vitro
por la trombina (= Factor II_{a}) sola, la combinación
trombina-trombomodulina, ciertos venenos de
serpiente, tales como el de Agkistrodon contortrix
contortrix, o el Factor X_{a} purificado. La activación de la
proteína C endógena de una muestra o la adición de Proteína C
activada exógenamente a una muestra de plasma neutralizará los
Factores V_{a} y VIII_{a} (degradación) y conducirá a tiempos
prolongados para la coagulación de la sangre en muestras de plasma
de individuos sanos. Los factores V y VIII son activados por
pequeñas cantidades de trombina o Factor X_{a}. La Proteína S es
un cofactor para la Proteína C.
Se encuentran deficiencias heterocigóticas
hereditarias en Proteína C, Proteína S y Antitrombina III (ATIII,
un factor de coagulación que se opone a la coagulación) en
aproximadamente 10-15 o de los pacientes con
enfermedad tromboembólica diagnosticada antes de la edad de 40 años.
Las deficiencias homocigóticas de Proteína C y Proteína S
constituyen una amenaza para la vida y los individuos afectados
desarrollan trombosis microvascular generalizada y púrpura
fulminante en el período neonatal.
Las deficiencias en Proteínas C y S y en ATIII se
miden por métodos tanto funcionales como inmunológicos. Una manera
de determinar la actividad funcional de Proteína C implica las
etapas: mezcla de la muestra de plasma a ensayar con un exceso de
plasma humano deficiente en Proteína C y adición de un activador de
Proteína C y observación de la conversión del sustrato apropiado.
Se han realizado ensayos altamente específicos mediante el empleo
de sustratos específicos para Proteína C. Alternativamente, se han
utilizado también sustratos para enzimas, p. ej. trombina y Factor
X_{a}, actividades que se ven influenciadas por la actividad de
la Proteína C activada (es decir, actividades enzimáticas que son
generadas o moduladas por APC). En ciertos casos, los ensayos de
Proteína C han implicado el aislamiento del zimógeno y una
activación y adición subsiguientes del sustrato a la forma
activada. Se ha sugerido también llevar a cabo la medida de la
actividad de Proteína C en muestras de plasma directamente en la
muestra sin adición de plasma deficiente en Proteína C. Sin embargo,
tales métodos no discriminarán una anormalidad relacionada con la
Proteína C como tal procedente de un trastorno relacionado con
factores que interfieren con los efectos causados por la Proteína C
(documento WO-A-91/02812).
Se ha reivindicado que la adición de Proteína C
activada a una muestra de plasma de un paciente y el estudio del
efecto producido ha descubierto una molécula de Factor VIII_{a}
defectuosa que no es degradada por la Proteína C activada (B.
Dahlback y M. Carlsson, Thromb. Haemost. 65, Resumen 39, 658
(1991)). Sin embargo, los datos suministrados en la presente
memoria descriptiva indican sorprendentemente que el paciente en
cuestión no podía llevar consigo un Factor VIII/VIII_{a}
defectuoso.
Con objeto de determinar la actividad funcional
de Proteína S en una muestra de plasma, los métodos más comunes
implican mezclar la muestra de plasma con Proteína C activada, un
exceso de plasma deficiente en Proteína S y reactivos adicionales
necesarios para producir la coagulación (Waart et al.,
Thromb. Res. 48, 427-37 (1987); Suzuki et
al., Thromb. Res. 49, 251-51 (1988); Bertina
et al., Thromb. Haemost. 53, 268-72 (1985);
y Comp et al., J. Clin. Invest. 74, 2084-88
(1984)). Se ha propuesto también medir la Proteína S por incubación
de la muestra de plasma con Factor IX_{a} y Proteína C activada y
determinación del tiempo de coagulación o la conversión de un
sustrato de trombina cromógeno (KabiVitrum AB (S. Rosen), documento
WP-A-91.01382).
El autor de la presente invención ha comprobado
que existe un trastorno tromboembólico no reconocido hasta ahora que
pueden diagnosticarse por la adición de Proteína C activada a una
muestra de paciente que contiene factores de coagulación y medida
de una actividad enzimática que es influenciada por la APC añadida.
Los resultados experimentales presentados ahora indican que los
trastornos en cuestión son afines a uno o más factor(es) de
coagulación desconocidos hasta ahora o interacciones desconocidas
de factores conocidos. El factor desconocido no es Factor V_{a} o
VIII_{a}, que son resistentes a la degradación por APC, o un
inhibidor del tipo de las inmunoglobulinas para APC. Los trastornos
no están relacionados tampoco con la deficiencia en Proteína S. Por
razones de simplificación, se hará referencia al o a los
factor(es)/interacción(es) desconocido (s) como un
factor desconocido en este texto.
Las muestras ensayadas son muestras de plasma. La
invención se ilustrará con relación a muestras de plasma.
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere a un método in vitro para diagnosticar en un ser
humano enfermedades tromboembólicas causadas por, o para determinar
el riesgo para un ser humano de adquirir la manifestación de, un
trastorno de la coagulación de la sangre designado resistencia a APC
y reconocido por una respuesta anticoagulante anormalmente baja a
la Proteína C exógena activada (abreviada APC) incluso en presencia
de niveles normales de Proteína S funcional, Factores V_{a} y
VIII_{a}, que son degradados normalmente por APC, y ausencia de
anticoagulantes lupus, comprendiendo dicho método determinar para
una muestra de plasma que comprende factores de coagulación y
derivada de un ser humano, la actividad anticoagulante de APC
exógena por medida de la velocidad de conversión del sustrato
obtenida para una enzima de la coagulación de la sangre, cuya
actividad es influenciada por APC, por las etapas siguientes: (i)
incubar dicha muestra de plasma con
(1) APC exógena, o Proteína C exógena junto con
reactivos exógenos corrientes para transformar la Proteína C exógena
en APC, donde las concentraciones utilizadas en el medio de ensayo
final son 25 ng/ml-10 \mug/ml para APC humana, 10
ng/ml-50 \mug/ml para APC no humana, y 5
ng/ml-5 \mug/ml para APC de bovino utilizadas en
combinación con 100 ng/ml-20 \mug/ml de proteína S
de bovino;
(2) un reactivo (I) exógeno, que activa al menos
parcialmente el sistema de coagulación de la sangre de dicha muestra
y se selecciona de una manera conocida per se para causar la
activación de un factor de coagulación utilizado para la medición
en la etapa (ii);
(3) componentes, tales como fosfolípido(s)
y sal de Ca^{++}, que son necesarios para la reacción eficaz de
los factores de coagulación activados introducidos por la etapa (i)
(2); y, si se desea,
(4) un sustrato exógeno para una enzima, siendo
influenciada la actividad de dicha enzima por APC;
(ii) medir directamente dicha velocidad de
conversión del sustrato obtenida en (i), y
(iii) comparar la velocidad de conversión medida
en la etapa (ii) con un valor estándar obtenido a partir de
muestras procedentes de individuos normales, muestras que han sido
sometidas a las etapas (i) y (ii) esencialmente en las mismas
condiciones que la muestra de plasma procedente de dicho ser
humano; en cuyo método, una velocidad de conversión del sustrato
obtenido para una muestra de plasma en la etapa (ii), que es mayor
que el valor estándar indica que dicho ser humano padece o corre el
riesgo de adquirir la manifestación de dicho trastorno.
En el caso de que la velocidad de conversión del
sustrato no sea normal comparada con el estándar, el individuo del
que procede la muestra se clasifica como individuo que padece el
trastorno o que corre el riesgo de adquirir la manifestación del
trastorno. Una velocidad de conversión incrementada de la muestra
indica una enfermedad tromboembólica o un riesgo de dicha enfermedad
(en el caso de que el sustrato sea fibrinógeno, una velocidad de
conversión incrementada significa un tiempo de coagulación
acortado). El significado de una velocidad de conversión disminuida
no se conoce en el momento actual (con fibrinógeno como sustrato,
una velocidad de conversión disminuida significa un tiempo de
coagulación prolongado). Probablemente, el mismo no esté
relacionado con ninguna enfermedad.
El intervalo de la velocidad de conversión normal
puede ser muy amplio. Por consiguiente, podría, como complemento,
ser valioso para realizar las etapas (i)-(ii) sobre una muestra de
plasma procedente del individuo con exclusión de la incubación de
acuerdo con (i) (1) y comparar el resultado obtenido con el que se
obtiene de acuerdo con la invención.
La incubación de acuerdo con (i) (2) sirve para
introducir un factor de coagulación activado que puede utilizarse
para la medida en la etapa (ii). La expresión "parcialmente"
significa que la adición del reactivo (I) conduce a la presencia de
al menos el Factor IX_{a}. El reactivo (I) puede ser un cierto
factor de coagulación o un reactivo que activa el sistema por la
vía intrínseca o extrínseca. De acuerdo con ello, el reactivo (I)
puede ser Factor IX_{a} o Factor XI_{a} (vía intrínseca), Factor
XII_{a} (vía intrínseca), calicreína (vía intrínseca), un
activador del contacto (vía intrínseca) tal como caolín, Celite o
ácido elágico (vía intrínseca), un reactivo de Tiempo Parcial de
Tromboplastina Activada, APTT (del inglés Activated Partial
Thromboplastine Time; es decir un reactivo que contiene un
fosfolípido y un activador del contacto (vía intrínseca)),
tromboplastina tisular (reactivo PT, PT = Tiempo de Protrombina,
(vía extrínseca)). En los casos en que es aceptable una
especificidad reducida, el reactivo (I) puede ser también Factor
X_{a}.
La Proteína C (i) (1) pueden ser de orígenes
diversos. En el caso de que la Proteína C y la muestra sean
procedentes de especies diferentes, es altamente recomendable
incluir Proteína S (cofactor para la Proteína C activada) en la
mezcla de incubación. La Proteína C y la Proteína S deben ser
procedentes de la misma especie, por ejemplo la
Proteína C de bovino requiere Proteína S de bovino. La Proteína C se
activa preferiblemente antes de ser añadida, aunque la activación
puede realizarse también después que ha sido añadida a la muestra.
La activación debe tener lugar en condiciones estandarizadas y
definidas. Agentes de activación normales son los indicados en la
página 2. También se pueden utilizar formas biológicamente
funcionales de las Proteínas C y S producidas por medios
recombinantes.
Los componentes utilizados de acuerdo con la
etapa (i) (3) dependen del modo empleado y pueden requerir la
inclusión de inhibidores de la proteasa plasmática para enzimas
distintas de la enzima observada o de un inhibidor de la
polimerización de la fibrina. Ca^{2+} puede encontrarse en la
forma de una sal soluble en plasma que proporciona el ion Ca^{2+}
en forma libre no complejada, es decir que deben evitarse los
quelantes de Ca^{2+} potentes. En el medio de ensayo final, la
concentración de Ca^{2+} puede seleccionarse dentro de
0,5-50 mM, preferiblemente dentro de
5-15 mM, tal como 6-7 mM. Una
concentración demasiado alta puede inhibir el sistema de
coagulación.
El sustrato de acuerdo con (i) (4) es normalmente
un sustrato sintético para una enzima cuya actividad es influenciada
por la Proteína C activada, p. ej. trombina (= Factor Ii_{a}) y
Factor X_{a}. Los sustratos sintéticos adecuados son solubles en
agua y tienen preferiblemente estructura de oligopéptidos con tres,
cuatro o cinco restos de aminoácidos y un grupo terminal amino que
está protegido contra el ataque por las
amino-peptidasas. La protección se realiza sea por
medio de un grupo de protección o por tener un
D-aminoácido en el extremo amino. Con objeto de dar
una respuesta detectable, el extremo carboxilo de un sustrato
sintético se amida con un grupo que puede liberarse específicamente
y detectarse por la acción de la proteasa de la coagulación de la
sangre pertinente. El grupo a liberar se selecciona entre grupos
cromógenos, fluorógenos o quimioluminógenos y otros grupos
analíticamente detectables. Véase adicionalmente H.C. Hemker,
"Handbook of synthetic substrates for the coagulation and
fibrinolytic system", Martinus Nijhoff Publishers, 1983, y J.
Fareed et al., "Synthetic peptide substrates in hemostatic
testing", en la publicación CRC Critical Reviews in Clinical
Laboratory Sciences, Vol. 19, edición 2, 71-134
(1983).
El orden de adición y la incubación varían con el
modo de la invención. Por ejemplo, en el caso de que el reactivo
(I) sea un reactivo APTT (i) (2) y la conversión del sustrato a
observar sea de fibrinógeno en fibrina, se añade el reactivo (I) a
la muestra y se deja que el Factor XI se active al máximo a Factor
XI_{a}. Se añade luego Ca^{2+} (i) (3) y se mide el tiempo de
coagulación. La Proteína C activada de acuerdo con la etapa (i:b)
se introduce sea simultáneamente a, antes de o después de la
activación a Factor XI_{a}. Se lleva a cabo análogamente un
ensayo de PT con adición de tromboplastina tisular (en lugar del
reactivo APTT) a la muestra en una cantidad suficiente para la
activación de Factor X a Factor X_{a} o Factor IX a Factor
IX_{a}. Después de ello, se añade Proteína C activada (i) (1), y
por último se mide el tiempo de coagulación como en cualquier
ensayo APTT. En caso de que se utilice un sustrato sintético, el
mismo se puede añadir en cualquier etapa antes de o al comienzo de
la reacción que se observa. Con objeto de realizar la reacción que
se observa con especificidad alta, los inhibidores mencionados
anteriormente se pueden introducir en cualquier momento adecuado en
el medio de reacción. Por ejemplo, puede ser apropiado añadir un
inhibidor de trombina junto con un sustrato para Factor X_{a},
cuando se mide la actividad del Factor X_{a}. El mismo inhibidor
añadido antes de la adición del sustrato puede, sin embargo, afectar
desfavorablemente a la formación del Factor X_{a}.
Con objeto de conseguir un resultado específico
con respecto al factor desconocido mencionado anteriormente, podría
intentarse mantener el contenido de muestra de plasma del paciente
del medio de ensayo final tan alto como sea posible. De acuerdo con
ello, el contenido de muestra de plasma del paciente en ensayos que
tengan una especificidad satisfactoria debe ser >10%, en
particular >20% o >35% (volumen/volumen).
Puede ser práctico vender y utilizar los
reactivos de acuerdo con (i) (1-4) en combinaciones
predosificadas que pueden haberse liofilizado por separado o como
mezclas que contengan al menos dos de los componentes dados en (i)
(1-4), preferiblemente en las dosis utilizadas para
el ensayo. Puede ser también práctico haber realizado la
liofilización en el vial a utilizar en el ensayo. Combinaciones
adecuadas son (los intervalos de concentración se refieren a valores
durante el ensayo, dándose los intervalos preferidos entre
paréntesis).
| 1. APC humana | 25 ng/ml-10 \mug/ml | |
| 2. Especie de APC (no humana) | 10 ng/ml-50 \mug/ml | |
| 3. APC de bovino/Proteína S de bovino, | (10 ng/ml-50 \mug/ml) | |
| procedente de otra especie no humana | APC: 5 ng/ml-5 \mu/ml | |
| Proteína S: | ||
| 100 ng/ml-20 \mug/ml | ||
| (10 ng/ml-20 \mug/ml) |
Todos los reactivos indicados arriba en
1-3 y destinados a ser utilizados en la invención
pueden liofilizarse en ausencia o presencia de Ca^{2+}. Si está
presente, la cantidad de Ca^{2+} debería dar una concentración de
Ca^{2+} de 0,5-30 milimoles/1 en el medio de
ensayo final. El fosfolípido se puede incluir en las preparaciones
liofilizadas.
| Factor IX_{a} | 0,05 ng/ml-2 \mug/ml | |
| Factor XI_{a} | 0,05 ng/ml-2 \mug/ml | |
| Factor XII_{a} | 0.05 ng/ml-2 \mug/ml | |
| Calicreína | 0.05 ng/ml-2 \mug/ml |
No existe limitación alguna en relación con las
especies. Se puede utilizar también FIX_{a} junto con cualquiera
de las combinaciones A 1-3 con inclusión de la
presencia o ausencia de Ca^{2+} y fosfolípido.
Combinaciones de acuerdo con A
1-3 con inclusión de inhibidor de la polimerización
de la fibrina (concentración >/= K_{i}, K_{i} = constante de
inhibición) y sustrato cromógeno (concentración >/= 0,1K_{m},
K_{m} = constante de Michaelis-Mentens).
Alternativamente, el sustrato cromógeno se liofiliza por separado o
en presencia de Ca^{2+} que está combinado opcionalmente a su vez
con un inhibidos de la polimerización de la fibrina. Como otra
alternativa, el sustrato se liofiliza junto con un inhibidor de la
polimerización de la fibrina pero en ausencia de Ca^{2+}. Los
constituyentes deben proporcionar tales condiciones que no tenga
lugar durante su reconstitución una hidrólisis perturbadora del
sustrato.
Combinaciones de reactivos como se ha indicado en
B y C.
Reactivos de acuerdo con A 1-3
combinados opcionalmente con Ca^{2+} y/o tromboplastina
tisular.
| Factor X_{a} | 0,02 ng/ml-0,5 \mug/ml |
El Factor X_{a} no está limitado en cuanto a
especies. El reactivo puede contener combinaciones de acuerdo con A
1-3 opcionalmente junto con Ca^{2+} y/o
fosfolípido.
Combinaciones de acuerdo con C y E anteriores
pero con tromboplastina en lugar de fosfolípido.
Reactivos de acuerdo con A 1-3
empleados en un ensayo estándar cromógeno de Factor VIII. Los
reactivos pueden haberse liofilizado junto con cualquiera de Factor
IX_{a} \pm Ca^{2+} \pm fosfolípido o Factor X \pm
Ca^{2+} \pm fosfolípido, con concentración de Factor X de 0,1
pg/ml-50 pg/ml. El reactivo puede comprender también
la inclusión de pequeñas cantidades de trombina y, cuando se
incluye Factor X, también Factor IX_{a}. Adicionalmente, puede
incluirse un sustrato cromógeno para Factor X_{a} en el
reactivo.
Reactivos de acuerdo con C y F con o sin
inclusión de protrombina (0,02 ng/ml-50 \mug/ml).
Se pueden incluir reactivos APTT en combinaciones
A-D, con tal que los mismos no se sometan a
liofilización juntamente con Ca^{2+}. Las enzimas activas y sus
sustratos pueden liofilizarse conjuntamente como se ha descrito
recientemente (documento
EP-A-318.571).
La invención tiene por objeto en primer lugar un
método con objeto de encontrar individuos que necesiten diagnóstico
adicional, pero comprende también ensayos de factores específicos
de acuerdo con los párrafos F, H e I anteriores. La selección
apropiada del reactivo (I) y la del sustrato a observar (i) (4)
afinan la posibilidad de encontrar en qué casos se encuentra un
trastorno diagnosticado en el sistema de coagulación. En principio,
el método de la invención detectará trastornos relacionados con
interacciones defectuosas entre la Proteína C activada y el Factor
V_{a}, Factor VIII_{a}. El método detectará también la
presencia de inhibidores de la Proteína C activada, y anormalidades
en interacciones no reconocidas hasta ahora y factores
influenciados por la activación de la Proteína C o la actividad de
la Proteína C activada.
La invención se ilustrará a continuación por
medio del descubrimiento del inventor de un paciente que padece un
nuevo trastorno en el sistema de coagulación de la sangre.
El individuo objeto del estudio es un varón
nacido en 1942. En 1961, presentó el primer episodio de trombosis
venosa profunda en una de sus piernas. Después de esto, se encontró
sano y sin presentar trombosis alguna durante casi 20 años. Entre
1980 y 1987 presentó episodios de trombosis múltiples, que
aparecían al menos una vez al año. Los sucesos trombóticos se
trataron con antagonistas de la vitamina K durante hasta tres
meses. Se comprobó positivamente un trombo con flebografía al menos
en dos ocasiones. El individuo objeto del estudio ha desarrollado un
síndrome post-trombótico en sus piernas. El mismo
no sufre ningún otro trastorno. En 1987, dejó de fumar y al mismo
tiempo comenzó a tomar diariamente aspirina. Durante
1987-1991, no ha sufrido ningún episodio
trombo-embólico. Tanto los miembros varones como las
hembras de la familia del paciente tienen historias similares con
episodios múltiples de trombosis venosa profunda. Un hermano suyo
10 años mayor había presentado trombosis venosa profunda en
múltiples ocasiones, la mayoría de las cuales ocurrieron entre las
edades de 45 y 50 años. El individuo objeto del estudio informa
también que un tío suyo de la rama materna ha tenido una historia
clínica con episodios múltiples de trombosis. La madre del paciente
nació en 1905, y ha presentado episodios en los cuales se ha
sospechado clínicamente la existencia de trombosis venosa profunda.
Dos hermanos más y una hermana han sufrido incidentes en los que se
ha sospechado trombosis.
Métodos de coagulación e inmunológicos conocidos
utilizados como complemento para el método de diagnosis de la
invención.
El tiempo parcial de tromboplastina activada
(APTT, Organon Technica), Owren's P&P, el tiempo de trombina y
el tiempo de reptilasa se determinaron con métodos estándar. La
antitrombina III se midió con un ensayo amidolítico (Coatestº ATIII,
Kabi Diagnostica, Mólndal, Suecia). Se determinaron los niveles de
antígeno de Proteína S y Proteína C total y libre con métodos
inmunoquímicos descritos previamente (Malm J. et al., Br. J.
Haemat. 68, 437-443 (1988). La actividad de la
función de Proteína C se analizó con un sustrato sintético después
de activación con el veneno de Agkistrodon contortrix
contortrix utilizando un estuche comercialmente asequible
(Coatest® Protein C, Kabi Diagnostica AB, Mölndal, Suecia).
La absorción de IgA, IgG e IgM se realizó como se
ha descrito previamente (Dahlbäck B. et al., Blood 62,
218-225 (1983).
Se llevó a cabo también un segundo ensayo de
Proteína C funcional como se ha descrito anteriormente (Hickton
C.M., Thromb. Res. 41 501-8, (1986)). El método
incluía absorción de plasma con citrato de bario. Las proteínas que
se fijaron al citrato de bario se eluyeron y el producto eluido se
incubó con un complejo trombina-trombomodulina para
activar la Proteína C. La cantidad de APC después de la activación
se cuantificó utilizando un ensayo de coagulación APTT.
1. Se utilizó un método basado en APTT para
determinar el efecto anticoagulante de APC purificada en el plasma
del paciente. En este método (ensayo APC-APTT) se
midió la prolongación mediada por APC del tiempo de APT como sigue:
se incubaron 0, 1 ml de plasma con 0, 1 ml de reactivo APTT durante
5 minutos a 37ºC antes de la adición de 0,1 ml de una mezcla
APC-Ca^{2\text{*}} (0-20 \mug/ml
de APC en Tris-HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, cloruro de
calcio 30 mM, pH 7,5, que contenía 0,1% de seroalbúmina de bovino
(BSA)) que inició la coagulación de la sangre. Se preparó la APC
como ha sido descrito previamente (Dahlbäck B. et al., J.
Biol. Chem. 261, 12022-12027 (1986)). El ensayo se
llevó a cabo con APC de bovino con o sin la presencia de Proteína S
de bovino.
Normalmente, los ensayos APTT se llevan a cabo
sin adición de NaCl. De acuerdo con ello, pero también debido a que
NaCl prolonga los tiempos de coagulación, se prefiere llevar a cabo
este modo de la invención sin adición de NaCl.
2. Con objeto de determinar el efecto de APC
sobre el Factor V del plasma, se añadieron concentraciones
crecientes de APC (10 \mul diluidos en Tris-HC1
10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5, que contenía 0,1% de BSA) a 0,09 ml de
plasma. Inmediatamente después de la adición de APC, se añadieron
0,1 ml de cefalina de cerebro de conejo (diluida en NaCl 0,15 M) y
0,1 ml de CaCl_{2} 30 mM. Después de incubación durante 15
segundos a 37ºC, se inició la coagulación con 0,1 ml de Factor
X_{a} (150 ng/ml diluidos en Tris-HC1 10 mM, NaCl
0,15 M, pH 7,5, que contenía 0,11^{0}5 de BSA). En ausencia de
APC, esta concentración de Factor X_{a} dio un tiempo de
coagulación aproximado de 30 segundos en el plasma testigo
utilizado. El Factor X_{a} se preparó como se ha descrito
anteriormente (Dahlb ck B. et al., J. Biol. Chem. 261,
12022-12027 (1986)).
3. Se utilizó una modificación de un ensayo
comercial de Factor VIII (Coatest® Factor VIII, Kabi Diagnostica AB,
Mólndal, Suecia) para analizar el efecto de APC sobre el Factor
VIII del plasma. El plasma del paciente o plasma testigo (25 pl
1/125 a 1/400 en Tris-HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, pH
7,5, que contenía 0,1 w de BSA) se incubó con 75 pl del reactivo
del estuche que contenía Factor IX_{a}, Factor X, fosfolípido y
Ca^{l*}. Inmediatamente antes del ensayo, se añadieron a este
reactivo concentraciones crecientes de APC (0, 1--100 pg/ml) .
Después de 20 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 50 pl de
una mezcla del sustrato sintético (2,7 nM)
(Bz-Ile-Glu(y-OR)-GlyArg-pNA
= S-2222, Kabi Diagnostica, Mólndal, Suecia) y el
inhibidor de trombina (60 pM)
(N-dansil-(p-guanidino)-Phe-piperidida
= I-2581, Kabi Diagnostica AB, Mölndal, Suecia).
Después de incubación durante 10 minutos más a 37ºC, la reacción se
interrumpió por la adición de 150 pl de ácido cítrico (1 M) y se
midió la absorbancia a 405 nm. Se construyó una curva estándar para
el Factor VIII utilizando plasma normal diluido desde 1/100 a
1/800.
El tiempo de APT junto con los valores para ATIII
y Proteína S eran normales y el paciente no mostraba indicación
alguna de la presencia de anticoagulantes del lupus. El nivel de
Proteína C en plasma era normal, tanto cuando se midió con el método
inmunológico como con el ensayo funcional, que incluía activación de
la Proteína C con veneno de serpiente y cuantificación de APC con
un sustrato sintético.
El ensayo de Proteína C funcional con citrato de
bario dio consistentemente valores de Proteína C más bajos para el
producto eluido cuando se diluyó en relación 1:10 en comparación
con 1:40. Esto podría indicar la presencia de un inhibidor para APC.
Con objeto de comprobar este punto, se empleó el ensayo
APC-APTT de la invención. El tiempo de coagulación
obtenido era siempre más corto que para el plasma testigo. Con
objeto de descartar un inhibidor del tipo de las inmunoglobulinas,
el plasma del paciente se agotó por completo en IgA, IgG, o IgM por
absorción. El tiempo de coagulación acortado no desapareció. Los
resultados encontrados podrían ser debidos a una deficiencia en
Proteína S funcional. Sin embargo, esta posibilidad se desechó dado
que la APC de bovino, cuando se añade con o sin Proteína S de bovino
es considerablemente menos eficaz en la prolongación del tiempo de
APT del plasma del individuo objeto del estudio en comparación con
la prolongación en el plasma testigo.
Un tercer mecanismo posible para la resistencia
observada a APC fue que el Factor V_{a} o el Factor VIII_{a}
del individuo objeto del estudio podrían ser resistentes a la
escisión por APC. Para esclarecer esta posibilidad, se idearon
ensayos que medían directamente la inhibición de los Factores
V_{a} y VIII_{a} del plasma por APC. Utilizando el ensayo de
coagulación basado en el Factor X_{a} (descrito anteriormente), se
encontró que la inhibición del Factor V_{a} del paciente por APC
era normal, lo cual sugería que el Factor V_{a} en el plasma del
paciente se degradara de una manera normal por la adición de APC
exógena. Este experimento descartó la posibilidad de un anticuerpo
inhibidor de la Proteína C que explicara la resistencia a APC. Para
ensayar la posibilidad restante, es decir que APC no pudiera
degradar el Factor VIII_{a} del individuo objeto del estudio, se
ensayó el efecto de APC añadida en un ensayo de Factor VIII_{a}.
Sin embargo, se encontró que el Factor VIII_{a} del individuo
objeto del estudio era degradado normalmente por la APC añadida
cuando se comparó con plasma testigo. Este descubrimiento es
contrario a la publicación anterior del autor de la invención (B.
Dahlbäck y M. Carlsson, Thromb. Haemost. 65, Resumen 39, 658
(1991)).
Para investigar si el efecto de APC era
hereditario, se analizaron 18 miembros de la familia utilizando el
ensayo APC-APTT. Diez (varones y hembras) de los 18
miembros de la familia ensayados no respondían a APC con
prolongación normal de sus tiempos de coagulación, lo cual sugiere
que la molécula del factor responsable del efecto es resistente a
APC. Este resultado demuestra que la molécula defectuosa se
heredaba y estaba presente en los miembros de la familia que no
daban una prolongación normal de sus tiempos de coagulación. Es
digno de mención que, en ausencia de APC añadida, los tiempos de
APT de estos individuos y del individuo objeto del estudio eran más
cortos que en el caso de los testigos. Esto puede sugerir una
degradación parcial de las moléculas factor pertinentes durante los
ensayos APTT de plasma normal. Para ensayar la sensibilidad de la
prueba APC-APTT en cuanto a la presencia de
resistencia a APC, se analizaron mezclas de plasma del individuo
objeto del estudio y normal (1:1, 1:10 y 1:100). Cuando se añadió a
la mezcla 1:1, APC era igualmente ineficaz en la prolongación del
tiempo de coagulación que cuando se añadió al plasma de individuo
objeto del estudio. Se observó la mitad de la prolongación normal
cuando se ensayó la mezcla 1:10, mientras que la mezcla 1:100 se
comportó como el plasma testigo. Así pues, el ensayo
APC-APTT no discriminaba entre la presencia de 50% y
100% de moléculas factor resistentes a APC, lo que sugería que el
método era un método de escrutinio útil para la identificación de
estados portadores.
Dado que la carencia encontrada de prolongación
sustancial del tiempo de coagulación no está relacionada con los
Factores VIII_{a} y V_{a} o con un inhibidos de la Proteína C
del tipo de las inmunoglobulinas o una interacción Proteína
S-APC defectuosa, el efecto debe asociarse con toda
probabilidad a un factor de coagulación no reconocido hasta
ahora.
El ensayo APC-APTT de acuerdo con
la invención se ha llevado también sobre muestras de plasma de
aproximadamente 100 pacientes con trombosis diagnosticada.
Aproximadamente el 10% de los pacientes dieron acortamiento de sus
tiempos de coagulación en comparación con el estándar. No pudo
observarse carácter hereditario aparente alguno. Ninguno de los
pacientes se había encontrado positivo en otros ensayos para la
determinación de trastornos de la coagulación.
Se ha llevado a cabo un método
APC-APTT similar al método 1 bajo el encabezamiento
Métodos de la Invención 1 dado anteriormente sobre muestras de
plasma de pacientes deficientes en Proteína S. En este modo
específico, la cantidad de APC se ajustó de tal manera que los
plasmas normales acumulados dieran como resultado una prolongación
del tiempo de coagulación de 40 segundos. El nuevo tipo de
pacientes que ha detectado el autor de la invención dieron entonces
una prolongación del tiempo de coagulación de 0-15
segundos, mientras que el plasma de pacientes con deficiencia
diagnosticada de proteína S dieron un tiempo de prolongación que
estaba próximo al normal. Con objeto de comprobar ulteriormente la
influencia de la deficiencia en Proteína S se ensayó también plasma
normal que se había hecho deficiente en Proteína S por
inmuno-adsorción. El tiempo de prolongación decrecía
aproximadamente en un 50%, lo cual indica que la prolongación
medida para el nuevo grupo de pacientes del autor de la invención
no está causada por deficiencia en Proteína S. Se ha añadido
también proteína S a plasma procedente del nuevo grupo de pacientes
y se ha llevado a cabo el método de la invención sobre dicho
plasma. El resultado ha sido que la prolongación del tiempo de
coagulación no está normalizada, lo cual soporta adicionalmente que
el método de la invención no mide la Proteína S.
Por variación del contenido de plasma en el medio
de ensayo se comprobó experimentalmente que deben evitarse
concentraciones de plasma demasiado bajas en el medio de ensayo
final.
ADN procedente de tres familiares (el individuo
objeto del estudio, su madre y uno de sus hermanos) que eran
sospechosos de llevar un gen responsable del trastorno se sometió a
PCR con multiplicación del gen del Factor VIII y escisión
subsiguiente con Bcl 1 como se ha descrito anteriormente (Kogan
et al., N. Engl. J. Med. 317, 985-90
(1987)).
En la población humana, este tratamiento conduce
a dos fragmentos diferentes (142 kb y 91 kb, respectivamente). El
ADN de un individuo llevará genes que den ambos fragmentos o
solamente uno de los fragmentos. El ADN de la madre daba ambos
fragmentos de 142 kb y 91 kb, mientras que uno de sus hijos daba
solamente el fragmento de 142 kb y el otro sólo el fragmento de 91
kb. Esto es una indicación clara de que los hijos han recibido de
su madre genes del Factor VIII diferentes. El trastorno investigado
no pudo asociarse por consiguiente a un gen perteneciente a un
cromosoma X.
Claims (23)
1. Un método in vitro para diagnosticar en
un ser humano enfermedades tromboembólicas causadas por, o para
determinar el riesgo para un ser humano de adquirir la manifestación
de, un trastorno de la coagulación de la sangre designado
resistencia a APC y reconocido por una respuesta anticoagulante
anormalmente baja a la Proteína C exógena activada (abreviada APC)
incluso en presencia de niveles normales de Proteína S funcional,
Factores Va y VIIIa, que son degradados normalmente por APC, y
ausencia de anticoagulantes del lupus, comprendiendo dicho método
determinar para una muestra de plasma que comprende factores de
coagulación y derivada de dicho ser humano, la actividad
anticoagulante de APC exógena por medida de la velocidad de
conversión del sustrato obtenida para una enzima de la coagulación,
cuya actividad es influenciada por APC, por las etapas
siguientes:
siguientes:
(i) incubar dicha muestra de plasma con
(1) APC exógena, o Proteína C exógena junto con
reactivos exógenos corrientes para transformar la Proteína C exógena
en APC, donde las concentraciones utilizadas en el medio de ensayo
final son 25 ng/ml-10 \mug/ml para APC humana, 10
ng/ml-50 \mug/ml para APC no humana, y 5
ng/ml-5 \mug/ml para APC de bovino utilizadas en
combinación con 100 ng/ml-20 \mug/ml de proteína S
de bovino;
(2) un reactivo (I) exógeno, que activa al menos
parcialmente el sistema de coagulación de la sangre de dicha muestra
y se selecciona de una manera conocida per se para causar la
activación de un factor de coagulación utilizado para la medición
en la etapa (ii);
(3) componentes que son necesarios para la
reacción eficaz de los factores de coagulación activados
introducidos por la etapa (i)(2), es decir, fosfolípido(s) y
sal de Ca^{++}, dando una concentración de Ca^{2+} de
0,5-30 mmoles/l en el medio de ensayo final; y, si
se desea,
(4) un sustrato exógeno para una enzima, siendo
influenciada la actividad de dicha enzima por APC;
(ii) medir directamente dicha velocidad de
conversión del sustrato obtenida en (i), y
(iii) comparar la velocidad de conversión medida
en la etapa (ii) con un valor estándar obtenido a partir de
muestras procedentes de individuos normales, muestras que han sido
sometidas a las etapas (i) y (ii) en las mismas condiciones que la
muestra de plasma procedente de dicho ser humano;
en cuyo método, una velocidad de conversión del
sustrato obtenida para una muestra de plasma en la etapa (ii), que
es mayor que el valor estándar indica que dicho ser humano padece o
corre el riesgo de adquirir la manifestación de dicho trastorno.
2. El método de la reivindicación 1, en el cual
el medio de ensayo final tiene un contenido de muestra de plasma
del paciente de al menos 10% (volumen/volumen).
3. El método de la reivindicación 1, en el cual
el medio de ensayo final tiene un contenido de plasma del paciente
de al menos 20% (volumen/volumen).
4. El método de la reivindicación 1, en el cual
el medio de ensayo final tiene un contenido de plasma del paciente
de al menos 35% (volumen/volumen).
5. El método de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4,
en el cual el reactivo (I) es un reactivo de tiempo parcial de
tromboplastina activada (APTT) que comprende fosfolípido(s) y
un activador de contacto de la vía intrínseca.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual la muestra de plasma se incuba
con los componentes de (i) (1), (i) (3) y, en caso deseado, (i) (4)
después de una preincubación de la muestra con reactivo (I) durante
un tiempo suficiente para activar el sistema de coagulación de la
sangre de la muestra.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el cual la APC exógena de (i) (1) está
constituida por APC humana purificada.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el cual la APC exógena de (i) (1) está
constituida por APC de bovino.
9. El método de la reivindicación 8, en el cual
la APC de bovino se añade a la muestra junto con proteína S de
bovino.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 16, en el cual la muestra de plasma se incuba en
la etapa (i) con Proteína C exógena humana o Proteína C no humana,
p. ej. de bovino.
11. El método de la reivindicación 10, en el cual
la Proteína S derivada de la misma especie que la Proteína C se
utiliza como aditivo ulterior en la etapa (i).
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el cual la muestra de plasma se incuba
con los componentes de (1) a (3) en la etapa (i) después de lo cual
se mide la conversión del fibrinógeno endógeno en fibrina en la
etapa (ii) por la vía de la formación de coágulo.
13. El método de la reivindicación 1, en el cual
el reactivo (I) es
- a)
- los componentes necesarios para activar el sistema de coagulación de la sangre de la muestra por la vía intrínseca, tales como un reactivo APTT, un activador del contacto, Factor IX_{a}, Factor XI_{a}, Factor XII_{a} y/o calicreína, y/o
- (b)
- los componentes necesarios para activar el sistema de coagulación de la sangre por la vía extrínseca, p.ej. tromboplastina tisular,
y los componentes de acuerdo con (i) (1), (i) (3)
e (i) (4) se añaden simultáneamente con o, en caso apropiado,
después que se ha dejado incubar el reactivo (I) con la muestra
durante un tiempo suficiente para activar la vía intrínseca o la vía
extrínseca.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual el reactivo (I) es Factor X_{a} exógeno o Factor
IX_{a} exógeno.
15. El método de la reivindicación 14, en el cual
la incubación se realiza en presencia de protrombina exógena.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual el reactivo (I) es Factor X exógeno en exceso con
relación al Factor X endógeno de la muestra y en combinación con
Factor IX_{a} exógeno, posiblemente junto con trombina.
17. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicación 1 y 13 a 16, en el cual está presente sustrato
exógeno y se mide su conversión, si es necesario junto con un
inhibidor de la polimerización de la fibrina.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
17, en el cual el sustrato exógeno es específico para Factor
X_{a} y está presente junto con un inhibidor de la polimerización
de la fibrina.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
17, en el cual el sustrato exógeno es específico para la trombina y
está presente un inhibidor de la polimerización de la fibrina.
20. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 13 a 19, en el cual está presente un inhibidor
de la polimerización de la fibrina junto con el sustrato exógeno
durante la incubación y en el cual se mide la conversión del
sustrato exógeno, siendo dicho sustrato exógeno un péptido
sintético que comprende un grupo detectable.
21. El método de la reivindicación 20, en el cual
dicho péptido está constituido por menos de cinco restos de
aminoácidos y un grupo que se libera específicamente y se hace
analíticamente detectable por acción de la enzima, p.ej. por acción
de trombina o Factor X_{a}, estando fijado dicho grupo en un
enlace amídico al extremo carboxilo del péptido y seleccionándose
de grupos cromógenos, fluorógenos y quimiluminógenos (= sustrato
cromógeno).
22. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en el cual al menos uno de los materiales
de (i) (1) a (i) (4) está presente en forma liofilizada que se
reconstituye en conexión con el ensayo.
23. El método de la reivindicación 1, en el cual,
en la etapa (iii) se compara también la velocidad de conversión
medida para la muestra de plasma en la etapa (ii) con la velocidad
de conversión obtenida para una muestra de plasma derivada de dicho
ser humano, muestra que se ha sometido a la etapa (i) y (ii) en las
mismas condiciones que la primera muestra de plasma, pero en
ausencia del o de los componentes de (i) (1).
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