DE19724239A1 - Dysprothrombinämie - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer
Thrombophilie bei Patienten sowie einen Testkit, enthaltend die für die
Durchführung des Verfahrens benötigten Substanzen.
In einem Kollektiv von Patienten mit klinisch vermuteter angeborener
Thromboseneigung (Thrombophilie) können heute bei etwa 50% der
Patienten Störungen des Hämostasesystems als molekulare Ursache der
Thrombophilie identifiziert werden. Die Mehrzahl dieser molekularen Defekte
betrifft das Protein-C-System, das durch Bindung der Serinprotease
Thrombin an den endothelialen Kofaktor Thrombomodulin (TM) initiiert wird.
Durch Bildung eines Komplexes aus Thrombin und Thrombomodulin wird
nämlich Protein C aktiviert, welches dann antikoagulatorisch wirkt.
Thrombomodulin ist in dieser Reaktion nicht nur ein Cofaktor, der die
Substratumsetzung steigert, sondern verändert auch die Substratspezifität
des Thrombins in dem Sinne, daß Thrombin seine prokoagulatorischen
Eigenschaften verliert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Möglichkeit bereitzustellen,
bei Patienten eine Vorhersage zu treffen, ob ein erhöhtes Thromboserisiko
besteht. Hierbei wurde im Rahmen der Erfindung festgestellt, daß es
Thrombinmutanten gibt, die eine normale prokoagulatorische (gerinnungsför
dernde), aber eine eingeschränkte oder fehlende antikoagulatorische
Aktivität aufweisen. Durch Untersuchungen mit in-vitro generierten
Mutanten wurde nämlich herausgefunden, daß die molekularen Regionen
des Thrombinmoleküls, die zur Bindung an TM notwendig sind, nur partiell
identisch sind mit den Regionen, welche die Fibrinogeninteraktion vermit
teln. Zum Nachweis dieser postulierten Mutanten wurde daher ein
Testverfahren entwickelt, das spezifisch die antikoagulatorische Aktivität
von Thrombin bestimmt.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe daher durch ein Verfahren zum
Nachweis einer Thrombophilie bei Patienten, bei welchen die antikoagulato
rische Aktivität von Thrombin in Blut oder Blutplasma bestimmt wird.
Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die Erkenntnis, daß nicht die
Gesamtkonzentration von Thrombin für das Vorliegen einer Thrombophilie
maßgebend ist, sondern vielmehr die pro- und antikoagulatorischen
Aktivitäten des Thrombins zu betrachten sind, da Defekte bei der antikoagu
latorischen Aktivität allein bei ansonsten unveränderter prokoagulatorischer
Aktivität Ursache einer Thrombophilie sein können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird daher in zwei
getrennten Testansätzen zum einen die Gesamtkonzentration an Thrombin
und zum zweiten die Konzentration an antikoagulatorisch aktivem Thrombin
bestimmt.
Bevorzugt wird hierzu die Gesamtkonzentration von Thrombin im Blutplasma
bestimmt, nachdem die Thrombinbildung initiiert worden ist. Es ist zwar
auch denkbar, in die Bestimmung von Gesamt-Thrombin Prothrombin mit
einzubeziehen, vorteilhaft ist es aber, vor der Bestimmung der Konzentration
die Thrombinbildung zu veranlassen und dann die Konzentration zu messen.
Hierzu wird vorteilhaft dem aus Patientenblut gewonnenen Plasma Calcium,
Phospholipide und Tissue factor (TF) zugesetzt. Als Phospholipide werden
solche verwendet, die gerinnungsaktiv sind. Derartige Phospholipide sind
dem Fachmann bekannt.
Um einen ungünstigen Einfluß anderer im Plasma vorhandener Substanzen,
wie zum Beispiel Antithrombin oder Alpha-2-Makroglobulin, auszuschließen
bzw. so gering zu halten, daß er die Bestimmung nicht mehr behindert, wird
vorzugsweise vor der Initiierung der Thrombinbildung das Plasma im
Verhältnis 1 : 100 bis 1 : 500 verdünnt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die
antikoagulatorische Aktivität über die Aktivierung von Protein C untersucht.
Hierzu wird neben der Bestimmung der Gesamtkonzentration von Thrombin
im Plasma die Konzentration von antikoagulatorisch aktivem Thrombin
festgestellt, indem man dem vorzugsweise verdünnten Plasma Thrombomo
dulin und Protein C zufügt. Nachfolgend wird die Menge an gebildetem
aktiviertem Protein C bestimmt und hierüber auf die Konzentration von
antikoagulatorisch aktivem Thrombin geschlossen.
Bei den Konzentrationsbestimmungen gemäß der vorliegenden Erfindung,
also für Thrombin und aktiviertes Protein C, wird vorzugsweise die
Hydrolyse spezifischer chromogener Substrate als Indikator verwendet.
Entsprechende chromogene Substrate sind dem Fachmann bekannt und
allgemein erhältlich.
Wiederum bevorzugt ist es, im erfindungsgemäßen Verfahren rekombinant
hergestellte Substanzen wie Tissue factor, Thrombomodulin oder/und
Protein C einzusetzen.
Obwohl für das Verfahren an sich nichts gegen die Verwendung von auf
konventionellem Weg hergestellter Substanzen spricht, haben rekombinant
hergestellte Zusätze möglicherweise den Vorteil größerer Reinheit, leichterer
Erhältlichkeit und damit eines geringeren Preises etc.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform wird die
antikoagulatorische Aktivität von Thrombin über die Fähigkeit zur Komplex
bildung mit Thrombomodulin bestimmt. Auch in einer gestörten Bindungs
aktivität von Thrombin mit Thrombomodulin kann eine Ursache für
verminderte antikoagulatorische Aktivität liegen. Die Komplexbildungsfähig
keit wird vorzugsweise ebenfalls nach Initiierung der Bildung von Thrombin
im Plasma und Bestimmung der Gesamtkonzentration an Thrombin
bestimmt.
Hierzu wird vorzugsweise wiederum durch Zugabe von Tissue factor initiiert
und danach, nach Bestimmung von Gesamt-Thrombin, Thrombomodulin
zugegeben. Der gebildete Komplex kann dann nach an sich bekannten
Methoden nachgewiesen werden.
Auch gemäß diesem Verfahren kann vorteilhaft rekombinantes Thrombomo
dulin eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist es, das Plasma in Kontakt zu bringen mit Festpha
sen-gebundenem Thrombomodulin. Danach kann besonders einfach das
Plasma abgetrennt werden und der Komplex besonders bevorzugt mittels
eines Sandwich-ELISA nachgewiesen werden.
In diesem Fall wird vorzugsweise ein Anti-Thrombin-Antikörper als
Nachweisantikörpereingesetzt. Dieser Antikörper kann beispielsweise selbst
eine Markierung tragen, ggf. auch eine indirekte Markierung, wie Konjuga
tion mit einem Enzym, dessen Anwesenheit wiederum über ein chromoge
nes Substrat nachgewiesen wird. Es ist anderseits aber auch möglich und
bevorzugt, an den vorhandenen Komplex aus Thrombomodulin, Thrombin
und Anti-Thrombin-Antikörper einen weiteren Antikörper binden zu lassen,
der gegen den Anti-Thrombin-Antikörper gerichtet ist. Derartige Anti-
Antikörper sind dem Fachmann geläufig. Ein solcher Antikörper würde dann
eine Markierung tragen, wobei alle hierfür dem Fachmann bekannten
Markierungen geeignet sind.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
zum Nachweis einer Thrombophilie sowohl die antikoagulatorische Aktivität
von Thrombin über die Aktivierung von Protein C als auch über die
Bindefähigkeit von Thrombin mit Thrombomodulin immunologisch festge
stellt. Durch eine derartige Kombination kann eine besonders relevante
Aussage über das Vorliegen einer Thrombophilie bei Patienten getroffen
werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zur
Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Ein derartiger Testkit
umfaßt alle wesentlichen, für die Durchführung des oder der Verfahren
nötigen Substanzen. Derartige Testkits können gegebenenfalls auch noch
Pufferlösungen und andere Substanzen enthalten.
Ein erfindungsgemäßer Testkit zur Bestimmung der antikoagulatorischen
Aktivität von Thrombin in Patientenblut oder -plasma enthält:
- a) Tissue factor, Calcium (vorzugsweise in Form eines Calciumsalzes) und gerinnungsaktive Phospholipide zur Initiierung der Thrombinbildung und
- b) Protein C und Thrombomodulin oder/und
- c) festphasengebundenes Thrombomodulin;
sowie gegebenenfalls geeignete Nachweissubstanzen für Thrombin oder/und
aktiviertes Protein C oder/und einen gebildeten Thrombin-Thrombomodulin-
Komplex.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit zum Nachweis von
Thrombin oder/und aktiviertem Protein C ein chromogenes Substrat.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit zum
Nachweis eines gebildeten Thrombin-Thrombomodulin-Komplexes einen
Anti-Thrombin-Antikörper.
Es ist hierbei möglich, daß ein markierter Anti-Thrombin-Antikörper
enthalten ist oder aber, bevorzugterweise, daß ein weitere Antikörper
vorhanden ist, der gegen den Anti-Thrombin-Antikörper gerichtet ist und
selbst eine nachweisbare Markierung trägt.
Des weiteren ist es bevorzugt, daß die Substanzen Tissue factor oder/und
Protein C oder/und Thrombomodulin in rekombinanter Form vorhanden sind.
Als Antikörper werden besonders bevorzugt monoklonale Antikörper
verwendet.
Die folgenden Beispiele und Figuren sollen die Erfindung weiter erläutern:
Fig. 1 zeigt hierbei eine klare Korrelation zwischen der Menge an
gebildetem Thrombin und der Menge an gebildetem aktiviertem Protein C bei
gesunden Personen nach Durchführung der erfindungsgemäßen Bestimmung
über Aktivierung von Protein C.
Fig. 2 zeigt die Korrelation zwischen gemessenem aktiviertem Protein C
und erwartetem aktiviertem Protein C in einem Patientenkollektiv mit
vermuteter Thrombophilie.
In einem amidolytischen Testverfahren wird in zwei getrennten Testan
sätzen sowohl die Thrombinkonzentration als auch die Konzentration an
antikoagulatorisch aktivem Thrombin gemessen. Das eingesetzte Plasma
wird 1 : 200 vorverdünnt.
Durch Mischen mit einem rekombinanten und käuflichen Tissue factor in
Anwesenheit von Calcium und Phospholipiden wird die Thrombinbildung
initiiert. In einem Testansatz ist rekombinantes Thrombomodulin (rTM) und
rekombinantes Protein C (rPC) enthalten. Dabei sind die Konzentrationen so
gewählt, daß die Menge an gebildetem aktiviertem Protein C (APC) mit der
Menge an funktionell aktivem Thrombin korreliert. Das gebildete APC wird
durch Hydrolyse des chromogenen Substrats S2366 (Chromogenix AB,
Mölndal, Schweden, Art.-Nr. 41222) gemessen, während in dem Kontroll
ansatz die Menge an Thrombin durch Hydrolyse des Thrombinsubstrats
S2238 (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden, Art.-Nr. 41202) ermittelt
wird. Die Pipettierschemata beider Ansätze sind im folgenden dargestellt:
An einem Kollektiv von 50 gesunden Blutspendern konnte gezeigt werden,
daß eine klare Korrelation zwischen der Menge an gebildetem Thrombin und
der Menge an APC besteht (Fig. 1). Dementsprechend konnte aufgrund der
gemessenen Thrombinkonzentration die Menge an erwartetem gebildetem
APC extrapoliert werden. Mit dieser Methode wurden in einem Kollektiv von
57 Patienten mit klinisch vermuteter Thrombophilie bei 9 Patienten eine
statistisch signifikante Abweichung zwischen der Menge an erwartetem
APC und der tatsächlich gebildeten APC-Menge gemessen (Fig. 2).
Mit hoher Wahrscheinlichkeit besteht ein kausaler Zusammenhang zwischen
der erniedrigt gemessenen antikoagulatorischen Aktivität des Patienten-
Thrombins und der klinisch bestehenden Thromboseneigung. Ein mögliches
Erklärungsmodel für die verminderte antikoagulatorische Aktivität des
Thrombins ist das Vorliegen einer Mutation in der Thrombomodulinbindungs
sequenz oder das Vorhandensein eines anderen Störfaktors.
Das entwickelte Verfahren stellt einen kombinierten funktionellen immunolo
gischen Assay dar. Rekombinantes Thrombomodulin (rTM) wird auf einer
Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach Zugabe von verdünntem Plasma wird die
Thrombinbildung durch Zugabe von Tissue factor (rTF) initiiert und
anschließend die Menge an gebundenem Thrombin mit einem polyklonalen
Anti-Thrombin-Antikörper (Alexis Corporation, San Diego, CA, USA, Bestell-
Nr. 60 760-1) bestimmt. Der Assayvorgang im Einzelnen:
Beschichtung der Mikrotiterplatten:
100 µg rTM pro Vertiefung
100 µg rTM pro Vertiefung
Bildung von Thrombin:
50 µl Plasma (1 : 500/1 : 1000)
+ 25 µl rTF (Innovin 1 : 2)
+ 15 µl Calciumchlorid (25 mM)
+ 10 µl Phospholipide (2,5 µg/m)
50 µl Plasma (1 : 500/1 : 1000)
+ 25 µl rTF (Innovin 1 : 2)
+ 15 µl Calciumchlorid (25 mM)
+ 10 µl Phospholipide (2,5 µg/m)
Bestimmung von Thrombin:
Kaninchen-Anti-Thrombin (100 ng/ml)
Schwein-Anti-Kaninchen IgG, Peroxidase-konjugiert.
Kaninchen-Anti-Thrombin (100 ng/ml)
Schwein-Anti-Kaninchen IgG, Peroxidase-konjugiert.
In einem Konzentrationsbereich zwischen 0,04 und 2,5 U/ml Thrombin kann
die Bindung von Thrombin spezifisch gemessen werden. Die Koeffizienten
der Inter- und Intraassayvarianz lagen in allen Konzentrationsbereichen < 12
und < 10%. An dem oben erwähnten Patientenkollektiv (Beispiel 1) wurde
bei allen auffälligen Patienten eine verminderte TM-Bindung ermittelt (6
außerhalb des x-2s Bereiches und 3 grenzwertig erniedrigt).
Diese Daten untermauern die Hypothese, daß eine verminderte antikoagula
torische Aktivität von Thrombin durch eine eingeschränkte Bindung von
Thrombin an Thrombomodulin bedingt sein kann.
Claims (20)
1. Verfahren zum Nachweis einer Thrombophilie bei Patienten,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die antikoagulatorische Aktivität von Thrombin im Blut oder
Blutplasma bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß in zwei getrennten Testansätzen zum einen die Gesamtkonzen
tration an Thrombin und zum zweiten die Konzentration von antiko
agulatorisch aktivem Thrombin bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Gesamtkonzentration von Thrombin im Blutplasma bestimmt
wird, nachdem die Thrombinbildung initiiert worden ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Thrombinbildung durch Zugabe von Calcium, Phospholi
piden und Tissue factor zum Blutplasma initiiert.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Blutplasma vor der Initiierung der Thrombinbildung im
Verhältnis 1 : 100 bis 1 : 500 verdünnt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Bestimmung der Konzentration von antikoagulatorisch
aktivem Thrombin dem Blutplasma Thrombomodulin und Protein C
zufügt und nachfolgend die Menge an gebildetem aktiviertem Protein
C feststellt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet
daß man die Konzentration an Thrombin oder/und aktiviertem Protein
C über Hydrolyse chromogener Substrate bestimmt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man rekombinanten Tissue factor, rekombinantes Thrombomodu
lin oder/und rekombinantes Protein C verwendet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Bindefähigkeit des in Patientenblut oder -plasma
vorhandenen oder nach Initiierung dort gebildeten Thrombins an
Thrombomodulin bestimmt.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß man im Plasma die Thrombinbildung durch Zugabe von Tissue
factor initiiert, anschließend Thrombomodulin zugibt und die Bindung
an Thrombomodulin durch einen Sandwich-ELISA bestimmt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß man rekombinantes Thrombomodulin verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Plasma mit Festphasen-gebundenem Thrombomodulin
in Kontakt bringt und nach Entfernung des Plasmas gebundenes
Thrombin mittels eines Anti-Thrombin-Antikörpers nachweist.
13. Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß zum Nachweis ein weiterer, markierter und gegen den Anti-
Thrombin-Antikörper gerichteter Antikörper verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die antikoagulatorische Aktivität mittels eines Verfahrens
gemäß den Ansprüchen 2 bis 9 oder/und gemäß den Ansprüchen 9
bis 13 bestimmt.
15. Kit zur Bestimmung der antikoagulatorischen Aktivität von Thrombin
in Patientenblut oder -plasma,
dadurch gekennzeichnet,
daß er
- a) Tissue factor, Calcium und Phospholipide zur Initiierung der Thrombinbildung und
- b) Protein C und Thrombomodulin oder/und
- c) festphasengebundenes Thrombomodulin;
16. Kit nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß er zum Nachweis von Thrombin ein chromogenes Substrat
enthält.
17. Kit nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß er zum Nachweis von aktiviertem Protein C ein chromogenes
Substrat enthält.
18. Kit nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß er zum Nachweis des gebildeten Thrombin-Thrombomodulin-
Komplexes einen Anti-Thrombin-Antikörper enthält.
19. Kit nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Anti-Thrombin-Antikörper markiert ist.
20. Kit nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß zusätzlich ein markierter gegen den Anti-Thrombin-Antikörper
gerichteter Antikörper enthalten ist.
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DE1997124239 DE19724239A1 (de) | 1997-06-09 | 1997-06-09 | Dysprothrombinämie |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE1997124239 DE19724239A1 (de) | 1997-06-09 | 1997-06-09 | Dysprothrombinämie |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE19724239A1 true DE19724239A1 (de) | 1998-12-10 |
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Country Status (3)
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: POETZSCH, BERND, 35390 GIESSEN, DE HUND, SIMONE, 35625 HUETTENBERG, DE MUELLER-BERGHAUS, GERT, ., ZZ |
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Free format text: POETZSCH, BERND, 35390 GIESSEN, DE HUND, SIMONE, 35625 HUETTENBERG, DE MUELLER-BERGHAUS, GERT, 61239 OBER-MOERLEN, DE |
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8127 | New person/name/address of the applicant |
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