DE69022425T2

DE69022425T2 - Verfahren zur Bestimmung der funktionellen Wirkung von freiem Protein S oder Protein C in einer Plasmaprobe.

Info

Publication number: DE69022425T2
Application number: DE69022425T
Authority: DE
Inventors: Steffen Rosen
Original assignee: Chromogenix AB
Current assignee: Chromogenix AB
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-04
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2010-07-05
Also published as: SE8902532L; WO1991001382A1; ATE127853T1; DE69022425D1; EP0486515A1; JP2892828B2; JPH04506603A; CA2063564A1; SE8902532D0; AU6053390A; DK0486515T3; NO920125D0; SE464135B; ES2079481T3; NO920125L; IE902431A1; US5439802A; EP0486515B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Analyse von Bestandteilen der Blutkoagulation und des Fibrinolyse-Systems und insbesondere das Analysieren oder die Bestimmung der funktionellen Wirkung bestimmter in diesen Systemen enthaltener Proteine, nämlich der Plasmaproteine, die als Protein C und Protein S bezeichnet werden.
Ein Zweck des Blutkoagulations- oder Gerinnungsprozesses ist es, das Bluten wirksam zu beenden. An diesem Prozeß ist eine komplizierte sog. enzymatische Kaskade von Enzym-aktivierenden Reaktionen beteiligt, die initiiert werden durch Kontaktaktivierung, z.B. durch ein verletztes Blutgefäß, eines Proenzyms, Faktor XII (das Wort Faktor wird im folgenden, wie es auch übliche Praxis ist, mit F abgekürzt), zu einem aktiven Enzym FXIIa (der Zusatz "a" steht für aktiv und dieses Kennzeichnungsverfahren wird im allgemeinen im folgenden Text verwendet). FXIIa katalysiert eine anschließende Aktivierungsreaktion eines Proenzyms zu einem Enzym und das Blutkoagulum oder Blutgerinnsel wird schließlich durch eine Serie (Kaskade) von Enzymaktivierungen durch die Umwandlung von löslichem Fibrinogen zu unlöslichem Fibrin gebildet. Die vielen Aktivierungsschritte, d.h. die Kaskade von Reaktionen, tragen zu der schnellen Bildung des Blutgerinnsels bei, um so das Bluten schnell zu beenden.
Der umgekehrte Prozeß, d.h. die Lyse des gebildeten Blutgerinnsels, die sog. Fibrinolyse, umfaßt auch eine ähnliche Enzymreaktions-Kaskade, wobei Plasmin in dem letzten Schritt der Kaskade gebildet wird. Das gebildete Plasmin arbeitet, um das Blutgerinnsel, d.h. das Fibrin, schnell durch Proteolyse in kleinere, lösliche Fragmente abzubauen.
Diese Systeme beinhalten, wie im folgenden ausführlicher beschrieben wird, eine große Anzahl von Faktoren.
Erhöhte oder verringerte Mengen eines oder mehrerer dieser Faktoren im Blut infolge erlangter oder vererbter Störungen in dem Koagulations- und/oder Fibrinolyse-System führen oftmals zu pathologischen Bedingungen, die fatal sein können, und die im Fall eines Individuums z.B. eine Prädisposition für die Bildung von arterieller und/oder venöser Thrombosen (oder Blutgerinnseln) bedeuten können. Verringerte Mengen an funktionell wirksamem Antithrombin und Plasminogen und erhöhte Mengen an FVII, Fibrinogen und Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren PAI-1 sind Beispiele von Störungen, die zu Thrombose (oder zu Blutgerinnseln) führen können.
Vor kurzem sind zwei neue Proteine, Protein C (PC) und Protein S (PS) bezeichnet, im Plasma identifiziert worden. Ähnlich wie das gut bekannte Antithrombin haben diese Proteine, die Vitamin K-abhängig sind, eine antikoagulierende Aktivität, wobei die Proteine derart zusammenwirken, daß das Protein S (Molekulargewicht 80 kD) die Aktivität des aktivierten Proteins C stimuliert und damit sowohl der Bildung des Blutgerinnsels entgegenwirken als auch den Abbau der Gerinnsel fördern, die bereits gebildet worden sind. Verringerte Mengen an diesen Proteinen oder eines dieser Proteine führen ebenfalls zu Störungen des Koagulations- und des Fibrinolyse-Systems. Die Bedeutung von Protein S ist durch Studien, die über dieses Protein durchgeführt worden sind, bestätigt worden. Auf der Grundlage dieser Studien nimmt man an, daß im Falle von Patienten, die mit schwerer venöser Thrombose geplagt sind und jünger als 50 Jahre alt sind, die klinisch manifestierte Thrombose in 5-8 % der Fälle durch einen vererbten Mangel an Protein S verursacht wird, während man annimmt, daß ein vererbter Mangel an Antithrombin nur für etwa 3 % aller Fälle verantwortlich ist.
Es wäre deshalb von beträchtlichem Nutzen, wenn es möglich wäre, den Gehalt an beiden oder einem dieser Proteine routinemäßig zu analysieren oder zu bestimmen, da dies ermöglichen würde, die Prädisposition eines Individuums für die Bildung einer solchen Thrombose leichter zu etablieren und eine Prophylaxe zu ermöglichen und/oder eine therapeutische Behandlung rechtzeitig durchzuführen.
Diese Plasmaproteine, PC und PS, beeinflußen die Bildung von FXa und Thrombin, indem sie zusammenwirken, um die Cofaktoren FVa und FVIIIa zu spalten, was für das Bewirken der Bildung von Thrombin erforderlich ist. Um ein Verständnis der Funktionen von Protein S und Protein C (in einer aktivierten Form) zu erleichtern, wird nachfolgend eine kurze Beschreibung der wesentlichen Teile des Koagulationssystems wiedergegeben, dessen Schritte von der Aktivierung von FXII an und diese einschließend im Schema 1 gezeigt werden: Schema 1 Protein Thrombin Prothrombin Fibrinogen Fibrin, löslich Fibrin-Gerinnsel aktivierend inhibierend
Wie aus diesem Schema (1) ersichtlich ist, wird das inaktive Protein Prothrombin (Proenzym) in das aktive Thrombin (Enzym) umgewandelt durch den Einfluß des aktivierten FX, d.h. FXa, Ca²&spplus;, eines Phospholipids, das als TF3 (Thrombozytenfaktor 3) bezeichnet wird und auf der Oberfläche aktivierter Thrombozyten exponiert ist, und eines Helfer-Proteins FV in seiner aktivierten Form FVa. Das Thrombin spaltet das Fibrinogen enzymatisch, derart, daß Fibrin erhalten wird, das das strukturelle Grundgerüst des Blutgerinnsels bildet, indem es mit der Hilfe des Enzyms FXIIIa vernetzt wird. Diese Prozesse sind in dem folgenden Schema 2 veranschaulicht, das folglich einen Teil von Schema 1 bildet. Schema 2 Thrombin Prothrombin Fibrinogen Fibrin (löslich) Fibrin-Gerinnsel
Umgekehrt ist FXa durch die Wirkung von FIXa und mit der Hilfe von TF&sub3;, Ca²&spplus; und einem weiteren Helferprotein FVIII in der aktiven Form FVIIIa aus inaktivem FX gebildet worden. Diese Prozesse sind im folgenden Schema 3 veranschaulicht, das ebenfalls einen Teil des Schemas 1 bildet. Schema 3 Thrombin
Wie aus diesen Schemata ersichtlich ist, ist Thrombin bezüglich der gebildeten Menge selbstregulierend, indem es zu der Aktivierung von FV (Schema 2) und, zusammen mit FXa auch zu der Aktivierung von FVIII beiträgt (Schema 3), wobei diese aktiven Faktoren zur wirksamen Bildung von Thrombin erforderlich sind, und ebenfalls, indem es zu der Aktivierung von Protein C beiträgt, das in aktiver Form zusammen mit dem Protein S die Thrombinbildung durch Spalten der Faktoren FVIIIa und FVa, wie im folgenden hierin beschrieben wird, herabsetzt.
Das Enzym FIXa wird aus inaktivem FIX durch die Wirkung von FXIa und Ca²&spplus; gebildet. FXIa ist aus FXI durch die Wirkung von FXIIa erhalten worden. FXIIa ist als Ergebnis einer Gefäßverletzung oder dergleichen aus FXII gebildet worden, der folglich der initiierende Faktor des Gerinnungssystems ist. Dies wird im folgenden Schema 4 veranschaulicht, das ebenfalls einen Teil des Schemas 1 bildet. Schema 4 Trauma
Zusätzlich zu den Prozessen, die in Schema 2 und in den Schemata 3 und 4 offenbart sind, wird die Bildung von Thrombin gefördert durch die Aktivierung von FIX und FX zu FIXa bzw. FXa über das extrinsische System mit der Unterstützung eines Gewebefaktors, Gewebe- Thromboplastin, das Helferprotein und Phospholipid liefert, und durch die Wirkung des Enzyms FVIIa in Gegenwart von Ca²&spplus;.
Die aktivierten Formen der Koagulations- und Fibrinolyse-Faktoren treten normalerweise nicht im Blut auf, sondern werden nur gebildet, wenn sie benötigt werden. Das Blut enthält eine Anzahl von Proteinen, sog. Enzyminhibitoren, welche gegen irrtümliche Aktivierung schützen. Ein gut bekannter Inhibitor ist Antithrombin, das Thrombin in einem Komplex, dem proteolytische Aktivität fehlt, bindet.
Protein C (PC) und Protein S (PS), auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, wirken ebenfalls als Inhibitoren oder Antikoagulantien, wobei die Wirkung dieser Proteine auf der Aktivierung von Protein C zu aktivem Protein C, APC, basiert, das FVa mit der Unterstützung von Protein S spaltet. Dieses setzt die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin (Schema 5) und somit die Bildung der Blutgerinnsel dramatisch herab. Schema 5 Protein Thrombin Prothrombin
Außerdem übt APC zusammen mit PS eine spaltende Wirkung auf FVIIIa aus, der auch bei der Antikoagulationswirkung hilft durch herabgesetzte Bildung von FXa. Dieser Prozeß wird im folgenden Schema 6 veranschaulicht. Schema 6 Protein Thrombin
Wie aus diesen Schemata ersichtlich ist, wird die Aktivierung von Protein C durch eine Art von Rückkopplungs-Mechanismus kontrolliert, der Thrombin zum Zwecke der Beschränkung der Bildung von Blutgerinnseln beinhaltet. Wenn Blutgerinnsel in einem Blutgefäß gebildet werden, tritt Thrombin aus dem Gerinnsel zur Gefäßwand über, wo Thrombin durch Thrombomodulin (TM) gebunden wird, das ein Protein auf der endothelialen Zelloberfläche ist.
Nachdem es gebunden ist, hat Thrombin nicht länger mehr einen koagulierenden Effekt d.h. es ist nicht länger fähig, Fibrinogen zu spalten, und anstelle dessen aktiviert der Komplex TM/Thrombin schnell Protein C zu APC, das in Form eines Komplexes mit Protein S, die Koagulation durch Spalten von FVA und FVIIIa inhibiert. Der letztere Komplex hat somit eine wichtige Anti-Gerinnungs-Wirkung.
Wie zuvor erwähnt, fördert APC ebenfalls die Lyse von Blutgerinnseln. Dies findet indirekt durch Schutz des Gewebe-Plasminogen-Aktivators (t- PA) gegen die Wirkung der Inhibitoren statt. Auf diese Weise wird eine hohe Umwandlungsrate von Plasminogen zu Plasmin durch die Wirkung t-PA aufrechterhalten. Plasmin löst das Fibringerinnsel durch Spalten des Gerinnsels zu kleineren, löslichen Fragmenten.
Zu geringe Gehalte an Protein C und/oder Protein S machen ein Individuum prädisponiert für thrombotische Krankheiten, was aus einer unzureichenden Mäßigung der Thrombinbildung resultiert, die zu exzessiver Fibrinbildung mit dem Begleitrisiko einer Thrombose führt. Demzufolge besteht ein Bedarf an einem einfachen und sicheren Verfahren, mittels dessen die Werte von Protein C und/oder S routinemäßig in einer Probe gemessen werden können, um so eine Prophylaxe zu ermöglichen und/oder eine therapeutische Behandlung von Thrombose zu verbessern. Es ist die funktionelle Wirksamkeit von Protein C und/oder Protein S, die insbesondere ermittelt werden soll, da etwa 10 % aller Individuen, die an einem Protein C-Mangel leiden, normale immunologische Werte von Protein C zeigen, trotz der Tatsache, daß die funktionelle Wirksamkeit stark herabgesetzt ist oder völlig fehlt. Was Protein S anbelangt, dessen Konzentration im Plasma etwa 22 ug/ml ist, so ist der größere Teil davon, etwa 60 %, an ein Protein innerhalb des Komplementsystems, das C4b-bindende Protein, gebunden und funktionell inaktiv. Das übrige, etwa 10 ug/ml, das in einem freien Zustand im Plasma vorhanden ist, ist für die biologische Aktivität verantwortlich, d.h. es wird an aktiviertes Protein C zur Bildung eines aktiven Komplexes gebunden. Da Individuen, die an einem Protein S-Mangel leiden, normale Werte an gebundenem Protein S zeigen, obwohi ihnen freies Protein S fehlt oder sie nur sehr geringe Werte an freiem Protein S zeigen, ist es die funktionelle Wirksamkeit, die ebenfalls im Falle eines Protein S- Mangels gemessen werden soll.
Bisher ist jedoch kein zufriedenstellendes Verfahren zum Analysieren der funktionellen Wirksamkeit von in erster Linie Protein S entwickelt worden.
Die funktionelle Wirksamkeit von Protein S ist zugegebenermaßen der Gegenstand früherer Analyseverfahren gewesen obwohl nicht routinemäßig, und die bekannten Verfahren sind nicht ausreichend verläßlich bezüglich der Unterscheidung zwischen verschiedenartigen Werten von biologischer Aktivität. Die derzeit bekannten Methoden basieren auf der Aufzeichnung der Zeit, zu der ein Fibringerinnsel auftritt. Diese Verfahren werden als APTT-basierende oder FXa- basierende Koagulationsverfahren bezeichnet, wobei die Abkürzung "APTF" für "Activated Partial Thromboplastin Time" (Aktivierte Partielle Thromboplastin Zeit) steht. Diesbezüglich wird Plasma in einem ersten Schritt mit einem Reagenz, das Phospholipid und einen Kontakt-Aktivator enthält, wie Kaolin oder Ellagsäure, aktiviert, wodurch die Calciumabhängigen Koagulations-Reaktionen (siehe Schema 4) d.h. FXIIa und FXIa, initiiert werden. Ca²&spplus;-Ionen werden in einem zweiten Schritt zugegeben, womit FIX, FX und Prothrombin in variierendem Maße aktiviert werden. Eine bekannte Menge eines oder mehrerer Koagulationsfaktoren wird ebenfalls zum Zweck der Bestimmung der Protein S-Aktivität zugegeben.
Die in Schritt 1 initiierte Koagulations-Abfolge schreitet auf diese Weise bis zum Abschluß fort so, daß ein Blutgerinnsel gebildet wird. Die Zeit (in Sekunden), die es bis zur Bildung des Gerinnsels (Pfropfes) dauert (APTT), wird aufgezeichnet und mit der Hilfe von Standardproben mit der funktionellen Wirkung von Protein S in Korrelation gebracht. Im allgemeinen erfordert ein ansteigender Gehalt an freiem Protein S im Plasma eine längere Zeit für die Bildung eines Blutgerinnsels, da größere Mengen des Koagulations-inhibierenden APC-Protein S-Komplexes gebildet werden.
Die aktivierten Koagulationsfaktoren, die zu dem System gegeben werden, sind in diesem bekannten Verfahren das aktivierte Protein C (APC) und FXa [siehe P. COMP. and C. ESMON, "Recurrent Venous Thromboembolism in Patients with a Partial Deficiency of Protein S", New Eng. J. Med. 311. 1525-1528 (1984), und B. DAHLBÄCK, "Inhibition of Protein Ca Cofactor Function of Human and Bovine Protein S by C4b-Binding Protein", (1986)]. Gemäß A. d'ANGELO, S. VIGANO-d'ANGELO, C. ESMON, P. COMP, "Acquired Deficiencies of Protein S. Protein S Activity During Oral Anticoagulation, in Liver Disease and in Disseminated Intravascular Coagulation". J. Clin Invest, 81, 1445-1454 (1988) wird zunächst freies Protein S im Plasma extrahiert mit der Hilfe eines spezifischen monoklonalen Antikörpers, wonach APC und FXa zu dem extrahierten Protein zugegeben werden. In K. SUZUKI und J. NISHIOKA, "Plasma Protein S Activity Measured Using Protac, a Snake Venom Derived Activator of Protein C", Thromb. Res. 49, 241 - 251, (1988), wird anstelle von APC eine Substanz, die PC im Plasma zu APC aktiviert, nämlich Protac C (von Pentapharm, Schweiz), verwendet, dessen aktiver Bestandteil ein selektives Schlangengiftenzym von Agkistrodon Contortrix contortrix ist. Diese bekannten Verfahren haben jedoch mehrere Nachteile. Zum Beispiel die geringe Auflösung, d.h. die Diskriminierung der verschiedenen Spiegel von freiem Protein S ist begrenzt. Typischerweise ist die Koagulationszeit innerhalb eines Bereichs von 70-200 % an freiem Protein S um lediglich 10 s verlängert, wobei die Koagulationszeit für normales Plasma, d.h. 100 % an freiem Protein S, innerhalb eines Bereiches von 40-80 s, abhängig von dem verwendeten Verfahren, liegt. Außerdem sind diese Verfahren routinemäßig schwer durchzuführen, z.B. in Koagulations-Laboratorien, und erfordern gründliche Standardisierung und sind hinsichtlich der Genauigkeit unzulänglich.
Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Analysieren der Spiegel an funktionell wirksamem Protein S oder Protein C in Blutplasma bereitzustellen, das einfach durchgeführt werden kann und das im wesentlichen die mit bekannten Verfahren verbundenen Nachteile umgeht.
Gemäß der Erfindung wird dieses Ziel mit einem Verfahren erreicht, das die folgenden Schritte umfaßt: Zugabe des Koagulationsenzyms FIXa, wobei dieses Enzym die Bildung des Koagulationsenzyms FXa fördert, wahlweise zusammen mit einem anderen Koagulationsreagenz bzw. Koagulationsreagenzien, zu einer Plasmaprobe, deren Gehalt an funktionell wirksamem Protein S oder Protein C bestimmt werden soll, Inkubieren der Probe und Messen der Menge an von Prothrombin stammendem Thrombin auf bekannte Weise, wobei dieser Prozeß durch FXa katalysiert wird, und Messen des Gehalts an funktionell wirksamem Protein S oder Protein C., der mit der Menge an gebildetem Thrombin invers korreliert, auf der Basis der gemessenen Menge an Thrombin, auf eine bekannte Weise mit Hilfe eines Standards.
Somit bildet die Menge an gebildetem Thrombin ein Maß für die Menge an vorhandenem funktionell wirksamen Protein S oder Protein C. Verfahren zum Analysieren des Thrombingehalts im Plasma sind wohlbekannt, und die Erfindung ist nicht auf irgendein bestimmtes Meßverfahren beschränkt. Alle zur Zeit bekannten Verfahren und auch die Verfahren, die vielleicht in der Zukunft erdacht werden, sind einsetzbar. Beispiele geeigneter Meßverfahren schließen auf Substratspaltung basierende, vorzugsweise photometrische, Meßverfahren und auf Koagulation basierende Meßverfahren ein.
Gemäß der Erfindung ist gefünden worden, daß das photometrische Substratspaltungsverfahren gut zur Bestimmung der funktionellen Wirksamkeit von Protein S und Protein C auf der Basis der Menge an gebildetem Thrombin geeignet ist, und daß dieses Verfahren eine beträchtlich höhere Auflösung bereitstellt, als die, die mit bekannten auf Koagulation basierenden Verfahren erzielt wird, insbesondere in Hinsicht auf Protein S. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird daher eine photometrische Messung der Menge an gebildetem Thrombin angewandt, wobei ein selektives Thrombinsubstrat, vorzugsweise ein chromogenes Thrombinsubstrat verwandt wird. Derartige Substrate basieren normalerweise auf Aminosäuren oder vorzugsweise auf kurzen Peptiden, die mit einer Gruppe (Marker) bereitgestellt werden, der leicht und selektiv durch Thrombin gespalten wird und der leicht, z.B. photometrisch, gemessen werden kann, wenn ein chromogener Marker wie p-NA (p-Nitroanilin) verwendet wird. Diese Substrate sind kommerziell erhältlich, z.B. von Kabi Diagnostica, Mölndal, Schweden und/oder können leicht durch einen Fachmann dieses Gebietes hergestellt werden.
Gemäß der Erfindung ist auch überraschenderweise gefunden worden, daß durch geeignete Auswahl des selektiven Thrombinsubstrats das erfindungsgemäße Verfahren wahlweise entweder in zwei Schritten oder in einem einzigen Schritt durchgeführt werden kann. Es ist somit überraschend und vorteilhaft, daß das Verfahren in einem einzigen Schritt durchgeführt werden kann, wenn ein geeignetes selektives Substrat gewählt wird. Die Substrate, die ein Einzelschrittverfahren möglich machen, sind z.B. H-D-Ala-Pro-Arg-pNA (S-2846) (von KabiVitrum AB, Schweden) und H-D-CHG-Ala-Arg-pNA (Nycomed Th-1) (von Nycomed AS, Norwegen). Das bekannte Thrombinsubstrat H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238) (von KabiVitrum AB, Schweden), ist andererseits infolge von u.a. unzureichender Auflösung nicht für ein Einzelschrittverfahren geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch, die Menge an gebildetem Thrombin mit der Hilfe von Koagulationsverfahren in bekannter Weise festzustellen. Die Koagulationsabfolge wird damit bis zur Vollständigkeit fortschreiten gelassen und die Zeit, die es bis zur Bildung eines Gerinnsels dauert, wird an der Plasmaprobe gemessen und mit entsprechenden Zeiten von Plasma mit bekannter funktioneller Wirksamkeit an Protein S oder Protein C verglichen. Dieses Verfahren kann entweder in einem Schritt oder in zwei Schritten durchgeführt werden.
Das vorliegende Verfahren basiert auf einer Zugabe von FIXa zur Förderung der Aktivierung von FX zu FXa anstatt FXa direkt zuzugeben, wie dies oft der Fall ist wenn Verfahren nach dem Stand der Technik ausgeführt werden. Der erfindungsgemäß verwendete FIXa stammt normalerweise von Säugetieren, z.B. vom Rind. FIXa von Menschen oder Schweinen kann ebenfalls vorteilhaft verwendet werden.
Die Zugabe von FIXa gemäß der Erfindung bietet den Vorteil, daß es ermöglicht wird, die Aktivierung von FX zu FXa zu kontrollieren und es indirekt auch ermöglicht wird, den inaktivierenden Effekt von APC-PS auf gebildetes FVa und FVIIIa zu optimieren, was wiederum die Bildung von Thrombin stark beeinflußt. Der starke Einfluß von FIXa auf diesen Prozeß, z.B. im Vergleich mit der Zugabe von FXa bei entsprechenden Plasmagehalten, konnte nicht vorhergesehen werden. Noch ist die Zugabe von FIXa zum bei der Erfindung beabsichtigten Zweck früher beschrieben worden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch das Zugeben bestimmter anderer Koagulationsfaktoren zusätzlich zu FIXa weiter verbessert werden. So wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren ausgeführt, während aktiviertes Protein C, d.h. APC, zugegeben wird. Das verwendete APC stammt normalerweise von Säugetieren, wie vom Rind (Rinder-APC) oder von Schweinen (Schweine-APC) oder vorzugsweise von Menschen (menschliches APC). Verwendbares APC kann aus Plasma oder durch rekombinante Techniken hergestellt werden und ist normalerweise hoch gereinigt. Das zuvor erwähnte im Handel erhältliche Präparat Protac C, das ein Schlangengiftenzym enthält, kann anstelle von APC verwendet werden. Dieses Enzym aktiviert Protein C zu APC und fördert somit indirekt die Bildung des APC-PS-Komplexes, dessen Wirkung früher diskutiert worden ist. Gemäß einer weiteren geeigneten Ausführungsform der Erfindung wird auch FVa zu der Plasmaprobe zugegeben. Die Zugabe von FVa wird angewandt, um die Rate, mit der Thrombin gebildet wird, zu kontrollieren, und die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin kann schneller und effizienter durch die geeignete Zugabe von FVa bewirkt werden. Vorzugsweise wird ein FVa mit einer Herkunft von Säugetieren verwendet, wie eine Herkunft vom Menschen, vom Rind oder vom Schwein, und vorzugsweise einer Herkunft vom Rind, oder FVa, das aus Plasma oder über rekombinante Techniken hergestellt wird.
Ein Phospholipid ist ein anderes Koagulationsreagenz, das geeigneterweise zu der Plasmaprobe zugegeben werden kann wenn die vorliegende Erfindung ausgeführt wird. Diese Zugabe ist geeignet, die Aktivierung von FX zu FXa und Prothrombin zu Thrombin zu beschleunigen. Die Wahl der Phospholipidquelle ist nicht kritisch. Zum Beispiel hat man gefunden, daß sowohl kommerziell erhältliche APTT-Reagenzien, mit oder ohne Kontaktaktivator, wie Kaolin oder Ellagsäure, und synthetische Phospholipide oder Phospholipidgemische verwendbar sind.
In bestimmten Fällen ist gefunden worden, daß die Zugabe von Prothrombin, FX und/oder FVIII vorteilhaft ist. Es versteht sich, daß mit Bezug auf alle Koagulationsproteine, die gemäß dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, diese Koagulationsproteine nicht in Hinsicht auf ihre Spezies-Herkunft beschränkt sind, und, daß sie unabhängig davon, ob sie aus Plasma extrahiert oder durch rekombinante Techniken aus nativen oder molekularbiologisch-modifizierten Varianten davon hergestellt sind, durch die Erfindung umfaßt werden. Hinsichtlich der Spezies- Herkunft ist jedoch eine Herkunft von Säugetieren normalerweise bevorzugt, und dann insbesondere eine Herkunft von Mensch, Rind oder Schwein. Die Anteile, in denen die Mehrzahl der Bestandteile vorhanden sind, wenn das vorliegende Verfahren angewandt wird, sind nicht besonders kritisch. Um jedoch das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, sind geeignete Konzentrationsbereiche für eine Anzahl von Bestandteilen in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Bestandteil/Bedingungen Endgehalt im Test Plasma Phospholipide Thrombinsubstrat, z.B. Chromogen Ionenstärke (I) Protac C Prothrombin insbesondere vorzugsweise * Thrombinsubstrat-Veffahren, z.B. Chromogen-Verfahren. ** Koagulations-Verfahren*** Höhere Gehalte im Test Ohne Zugabe von FVIII und/oder FVA. **** Calcium kann in Form von CaCl&sub2; oder einigen anderen geeigneten Salzen zugegeben werden.
Um den pH in dem bevorzugten Bereich zu halten, werden unter Verwendung konventioneller Puffertypen, wie Tris-Puffer, die Lösungen der Komponenten in Pufferlösungen hergestellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet das Inkubieren der Probe bei einer Temperatur von 18-45 ºC, vorzugsweise 35-40 ºC und stärker bevorzugt bei 37 ºC für einen kurzen Zeitraum, z.B. 0,5-15 Minuten, geeigneterweise 1-10 Minuten, und insbesondere 0,5-6 Minuten, wonach die funktionelle Wirksamkeit von Protein S oder C gemessen wird, wobei dies alles in Übereinstimmung mit dem sog. Einzelschrittverfahren ist. Im Falle von Systemen mit deutlich kurzen Reaktionszeiten, wie vorzugsweise auf Koagulation basierenden Verfahren, ist es bevorzugt, die Probe in einem Anfangsschritt, wahlweise zusammen mit einem Koagulationsfaktor, für eine kurze Zeitperiode, normalerweise 2-3 Minuten, auf die gleichen Temperaturen wie die oben wiedergegebenen zu erwärmen, bevor FIXa und wahlweise auch andere Koagulationsfaktoren zu der Probe zugegeben werden. In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, ein Zweischritt- Verfahren anzuwenden, das zwei Inkubationszeiträume einschließt, z.B. wenn Protac C verwendet wird, um Protein C in der Plasmaprobe zu aktivieren.
Es kann auch günstig sein, im vorliegenden Verfahren polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen einen Koagulationsfaktor zu verwenden, mit der Absicht, den Einfluß dieses Faktors auszuschalten. Zum Beispiel kann die biologische Wirksamkeit von FVIII durch Zugeben von Anti- FVIII:C-Antikorpern gehindert werden.
Das zuvor Gesagte gilt in allgemeiner Weise für das Analysieren der funktionellen Wirksamkeit von Protein S. Wenn das vorliegende Verfahren zum Analysieren der funktionellen Wirksamkeit von Protein C angewandt wird, kann es notwendig sein, einige Modifikationen vorzunehmen. Zum Beispiel wird Protein S, vorzugsweise von menschlicher Herkunft, entweder vor oder nach Aktivierung von Protein C in der Plasmaprobe zu der Plasmaprobe zugegeben, wobei diese Aktivierung vorteilhafterweise mit Protac C, wie oben offenbart, bewirkt wird. FIXa und wahlweise andere Koagulationsfaktoren werden dann in einem zweiten Schritt zugegeben.
Die Erfindung wird ausführlicher mit der Hilfe der folgenden Beispiele, die allein zum Illustrieren der Erfindung ohne eine Einschränkung deren Schutzbereiches beabsichtigt sind, erklärt werden. Diese Beispiele schließen Bezugnahmen auf die begleitenden Zeichnungen ein, von denen Fig. 1 das Analysieren von Protein S mit einem chromogenen Einzelschrittverfahren in Gegenwart von FIXa oder FXa veranschaulicht. Fig. 2 veranschaulicht die Wirkung von Anti-FVIII:C-Antikörpern und FX vom Rind, wenn Protein S analysiert wird; Fig. 3 veranschaulicht die Wirkung verschiedener Substrate in einem Einzelschrittverfahren zum Analysieren von Protein S; Fig. 4 veranschaulicht ein Einzelschrittverfahren, das auf Koagulation basiert zum Analysieren von Protein S auf der Basis einer FIXa-Zugabe; und Fig. 5 veranschaulicht ein chromogenes Verfahren, das auf FIXa basiert, zum Analysieren von Protein C.

Beispiel

(a) eine Plasmaprobe wurde 1:15 in Tris-Pufter I verdünnt. 100 ul davon wurden gemischt mit 100 ul von in Tris-Puffer I gelöstem menschlichen APC, 200 ul eines chromogenen Substrates H-D-Ala- Pro-Arg-pNA (52846) (von KabiVitrum Diagnostica, Schweden) und insgesamt 200 ul von in Tris-Puffer II gelöstem menschlichen FIXa, CACl&sub2; in Tris-Puffer I gelöstem Rinder-FVa und einem Phospholipidgemisch, das 40 % Cholesterin, 40 % Phosphatidylcholin und 20 % Phosphatidylserin umfaßt.
Der Tris-Puffer I umfaßte 0,05 mol/l Tris-HCl mit einem pH von 7,4 und einer Ionenstärke (I) von 0,15, und 0,2 % Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin, BSA).
Der Tris-Puffer II umfaßte 0,05 mol/l Tris-HCl, pH 8,0, I = 0,15 und 0,2 % BSA. Die Konzentrationen der Ausgangslösungen waren derart, um die Endkonzentrationen, die für die Reaktanten in Tabelle 1 gegeben sind, zu erhalten. Tabelle 1 Bestandteil Zugegebenes Volumen Endgehalt Plasma menschliches APC Phospholipid (Gesamtvolumen)
Das Gemisch wurde für 4 Minuten bei 37 ºC inkubiert, wonach 20 %-ige Essigsäure zugegeben wurde, mit der Absicht, die Reaktionsprozesse zu unterbrechen. Die Absorption der Probe wurde dann 405 nm (A&sub4;&sub0;&sub5;) mit einer Standardausrustung, wie einem Photometer, z.B. Hitachi 100-20 bestimmt. A&sub4;&sub0;&sub5; wurde auch für Standardproben bestimmt, die durch Mischen normalen Plasmas, dessen Protein S-Gehalt zu 100 % gesetzt wurde, und von Protein S-defizientem Plasma, dessen Protein S-Gehalt als 0 % gesetzt wurde, hergestellt wurden. A&sub4;&sub0;&sub5; wurde auch für solches Plasma gemessen, wie das, das 100 % PS bzw. 0 % PS enthielt.
Die für A&sub4;&sub0;&sub5; erhaltenen Werte wurden in Fig. 1 (- -) gegen % PS aufgetragen. Es ist aus diesen Werten ersichtlich, daß eine sehr gute Auflösung erreicht wurde, was sich in der großen Differenz zwischen der Absorption bei 100 % und bei 0 % wiederspiegelt. Wobei dieser Unterschied als ΔA&sub4;&sub0;&sub5; (0-100 %) bezeichnet wird, nämlich ungefähr 0,85. Es ist auch aus Fig. 1 ersichtlich, daß sich der Protein S-Gehalt in umgekehrter Korrelation zu der Menge an gebildetem Thrombin befindet, d.h. daß steigende Mengen von PS in einer beträchtlichen Reduzierung bei der Bildung von Thrombin resultieren.
(b) In Beispiel 1(a) wurde die Analyse/der Assay mit der Zugabe von APC zu der Plasmaprobe durchgeführt. Zum Vergleich wurde eine analoge Analyse ohne Zugabe von APC durchgeführt, wobei ein wesentlich kleinerer, nicht signifikanter Unterschied ΔA&sub4;&sub0;&sub5; (0-100 %) erhalten wurde, d.h. der Test hatte einen geringen Grad an Auflösung. Dies ist in Fig. 1 aus den aufgetragenen Werten (- -) offensichtlich. Die gemessene Absorption blieb im wesentlichen unverändert auf einem hohen Wert, wenn die Analyse gemäß Beispiel 1 (a) im Anschluß an eine erste Inkubation der Probe mit Antikörpern gegen Protein S (bezeichnet PS-Ab) durchgeführt wurde, wobei die biologische Wirksamkeit von PS, und damit ebenfalls des APC-PS-Komplexes ausgeschaltet wurde. Die erhaltenen Werte wurden ebenfalls in Fig. 1 aufgetragen (-x-).
(c) Zum Vergleich mit bekannten Techniken wurde auch eine Analyse analog zu 1 (a) oben durchgeführt mit der Zugabe von menschlichem APC und ohne die Zugabe von menschlichem APC, aber mit dem Austausch von FIXa mit Rinder-FXa (Endkonzentration 0,4 pmol/l und eine 5 min.-Inkubation). Die erhaltenen A&sub4;&sub0;&sub5;-Werte sind ebenfalls in Fig. 1 aufgetragen (- - bzw. -Δ-). Es ist hieraus ersichtlich, daß keine signifikanten Werte für A&sub4;&sub0;&sub5; (100-0 %) erhalten wurden und, daß die Bildung von Thrombin konstant relativ gering war.
Obwohl die Inkubatinonszeit etwas verkürzt war, wenn die FXa- Zugabe auf ein endgültiges Verhältnis von 40 pmol/l erhöht wurde, war die Auflösung weiterhin beeinträchtigt. Ein leicht besseres Ergebnis wurde erhalten, wenn die Menge an der Zugabe von APC erhöht wurde, obwohl nicht einmal eine dreifache Erhöhung in der Zugabe von APC ein ΔA&sub4;&sub0;&sub5; (0-100 %)-Wert ergab, der höher als 30 % des gemäß Beispiel 1 (a) erhaltenen Wertes war.
Beispiel 1 veranschaulicht ein chromogenes Einschrittverfahren zum Analysieren der funktionellen Wirksamkeit von PS im Plasma. Die überraschend hohe Wirkung, die erreicht wurde, wenn FIXa zu der Probe zugegeben wurde, ist deutlich aus den erhaltenen Ergebnissen (aufgeführt in Fig. 1) offensichtlich. Es ist zugegebenermaßen bekannt, daß APC die Cofaktoren FV und FVIII über eine proteolytische Spaltung abbaut (W. KIESIEL, W. CANFIELD, L. ERICSSON, E. DAVIE, Anticoagulant Properties of Bovine Plasma Protein C Following Activation by Thrombin. Biochemistry 16, 5824-5831 (1977); und R. MARLAR, A. KLEISS, J. GRIFFIN, "Mechanism of Action of Human Activated Protein C, a Thrombin-Dependent Anticoagulant Enzyme". Blood 59, 1067-1072 (1982)), wobei dieser Prozeß jedoch nicht wirksam ist, bevor FV und FVIII zu FVa bzw. FVIIIa durch Thrombin und/oder FXa aktiviert worden sind. Demzufolge ist es sehr überraschend, daß die Zugabe eines zuvor gebildeten FXa in einer beträchtlich geringeren APC/PS-Wirksamkeit resultiert, als die Zugabe von FIXa (gemäß der Erfindung), was die Bildung von FXa während der Inkubation unterstützt, da die Aktivierung von FVIII über den Einfluß von FXa/Thrombin in beiden Fällen stattfinden kann. Das folgende Beispiel veranschaulicht die Bedeutung des Cofaktors FVIIIa für die Bildung von Thrombin durch ein Blockieren der Aktivität des Cofaktors.

Beispiel 2

Ein Volumen eines normalen Plasmas (100 % PS) wurde bei 37 ºC für 15 Minuten mit einem Volumen von 0,2 ug/ml der monoklonalen Anti- FVIII:C-Antikörpern 2A3 (von Kabi AB, Schweden) präinkubiert. Diese Antikörper binden spezifisch an FVIII, der dadurch inaktiviert wird. In analoger Weise zu Beispiel 1 (a), aber mit einem Plasmagehalt von 1,7 % und mit einer Zugabe an FIXa, wurde A&sub4;&sub0;&sub5; für Plasmaproben mit 0, 50 bzw. 100 % PS nach Inkubation für 4 Minuten bei 37 ºC, und mit einer Zugabe (Endgehalt 0,02 U/ml) von Rinder-FX oder ohne eine derartige Zugabe bestimmt. Die erhaltenen Werte wurden in Fig. 2 aufgetragen. Hieraus ist es offensichtlich, daß in Abwesenheit von FVIIIa APC-PS noch einen Effekt herbeiführt, wenn FX (- -) zugegeben wird, nämlich durch den Einfluß von APC-PS auf das bereitgestellte FVa.
In Vergleich mit Beispiel 1 (c), das die direkte Zugabe von FXa (Fig. 1; - -) umfaßt, würde es wiederum vorteilhaft erscheinen, FXa während des Inkubationszeitraums aus FX zu bilden, das zugegeben worden ist anstelle von einem Zugeben von FXa direkt zu dem System (Fig.2; - -).

Beispiel 3

In analoger Weise zu Beispiel 1 (a) wurde A&sub4;&sub0;&sub5; für normales Plasma (100 % PS) und Protein S-defizientes Plasma (0 % PS) bestimmt. Anstatt APC zu verwenden, wurde jedoch Protac C (Endgehalt 0,17 U/ml) verwendet, das nach Inkubation für 2 Minuten bei 37 ºC Protein C zu APC aktiviert, und während 12 pmol/l FIXa verwendet werden und eine Inkubationszeit von 4,5 Minuten angewandt wird. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 A&sub4;&sub0;&sub5;+ Protac C - Protac C Protein S-defizientes Plasma (0 % PS) Normales Plasma (100 % PS)
Es ist aus diesen Werten ersichtlich, daß Protein S eine hohe Aktivität in Gegenwart von APC zeigt. Es ist nicht notwendig, zu Beginn für APC zu sorgen, da APC in vitro durch die Wirkung von Protac C gebildet werden kann.

Beispiel 4

A&sub4;&sub0;&sub5; wurde für normales Plasma und Protein S-defizientes Plasma in analoger Weise zu Beispiel 1 (a) analysiert, obwohl mit einem Endanteil von 18 umol/l des synthetischen Phospholipidgemisches. Analoge Analysen wurden auch mit der Hilfe von einem APTT-Reagenz, Cephotest (von Nycomed AS, Norwegen), gemacht, das auch einen Kontaktaktivator, nämlich Ellagsäure, einschloß anstelle des Phospholipid-Gemisches, das in diesem Falle einen Extrakt aus Rinderhirn umfaßte. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 VERGLEICH ZWISCHEN CEPHOTEST UND DEM SYNTHETISCHEN PHOSPHOLIPIDGEMISCH (PL) A&sub4;&sub0;&sub5; % Protein S Cephotest PL-Gemisch
Diese A&sub4;&sub0;&sub5;-Werte zeigten eine gute Übereinstimmung, was anzeigt daß verschiedene Phospholipidquellen verwendet werden können, einschließlich von gegenseitig verschiedenen Zusammensetzungen von synthetischen Phospholipiden und auch von gegenseitig verschiedenen Kontakt aktivatoren.

Beispiel 5

In analoger Weise zu Beispiel 1 (a) wurde Plasma, das verschiedene Prozentsätze an PS enthielt, in einem Einzelschrittverfahren unter Verwendung von drei verschiedenen Substraten und Zugaben von Rinder- FIXa inkubiert.
Die endgültige Probe hatte einen Plasmagehalt von 1,1 Vol.-%, einen Substratgehalt von 0,3 mmol/l und enthielt 0,1 nmol/l FIXa, 75 pmol/l FVa und 2 nmol/l APC. Die getesteten Substrate bestanden aus S-2846 und S-2238 (beide von KabiVitrum Diagnostica, Schweden) und Nycomed Th-1, wobei die Inkubationszeiten 4 min., 5 min. bzw. 4 min. waren.
1sdie Ergebnisse sind in Fig. 3 wiedergegeben. Es ist aus diesen Werten ersichtlich, daß S-2846 (- -) ein weit besseres Substrat ist als S-2238 (- -). Es ist auch aus Fig. 3 ersichtlich, daß eine gute Wirkung auch mit dem Substrat Nycomed Th-1 (- -) (von Nycomed AS, Oslo, Norwegen) erhalten wurde.
Zu Vergleichszwecken wurde das o.g. Verfahren auch als ein Zweischrittverfahren unter Verwendung der Substrate S-2846 und S-2238 durchgeführt, d.h. die Plasmaprobe, zu der APC zugegeben wurde, wurde vor der Substratzugabe inkubiert. In dem Zweischrittverfahren waren die erhaltenen ΔA&sub4;&sub0;&sub5; (0-100 %)-Werte 0,8 bzw. 0,6, d.h. es wurde kein deutlicher Unterschied in der Wirksamkeit beobachtet. Die folgenden Substrate wurden ebenfalls in einem Einschrittverfahren getestet und als nützlich befunden (ΔA&sub4;&sub0;&sub5; (0-100 %) = 0,2-0,5).
Chromozym Th: Tosyl-Gly-Pin-Arg-pNA (von Pentapharm AB, Basel, Schweiz).
Spectrozym Th: H-D-CHT-Ala-Arg-pNA (von American Diagnostica, Greenwich, USA).
CBS 34.47: H-D-CHG-But-Arg-pNA (von Diagnostica Stago, Asnieres, Frankreich).
Thrombinsubstrat von Behring: H-D-CHA-But-Arg-pNA (von Behringwerke AG, Marburg, Bundesrepublik Deutschland).
wobei
CHT = Cyclohexyltyrosin
CHG = Cyclohexylglycin
But = α-Aminobuttersäure
CHA = Cyclohexylalanin
pNA = p-Nitroanilid
Tosyl = p-Toluolsulfonyl

Beispiel 6

100 ul menschliches APC wurden zu 100 ul einer Plasmaprobe gegeben, die 1:1 in einer 0,9 %-igen NaCl-Lösung verdünnt war und die Probe wurde für 2 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Dann wurden 100 ul von insgesamt Rinder-FIXa, Rinder-FVa, Cephotest und CACl&sub2; zugegeben. Die Gehalte der verwendeten Ausgangslösungen waren derart, daß die folgenden Endkonzentrationen erhalten wurden: Tabelle 4 Bestandteil Endgehalt Cephotest
Plasmaproben mit 0, 50 und 100 % PS, d.h. Protein-S-defizientes Plasma (0 %), normales Plasma (100 %) und ein 1:1-Gemisch (50 %) davon wurden bei der Analyse verwendet, die als ein Einzelschrittverfahren, das auf Koagulation basiert, durchgeführt wurde. Die Koagulationszeiten dieser Proben sind registriert und gegen % PS für die Probe aufgetragen (Fig. 4; - -).
In analoger Weise zu dem Vorhergehenden wurde die Koagulationszeit ebenfalls aufgezeichnet für Plasmaproben, die nicht mit APC aktiviert worden sind (siehe Fig. 4; -Δ-).
Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, wurde eine Ausdehnung der Koagulationszeit von fast 60 Sekunden für 100 % PS im Vergleich mit 0 % PS erreicht, wobei diese Wirkung eine beträchtliche Verbesserung der mit früher bekannten Verfahren erzielten Wirkung ist, die hinsichtlich der Plasmagehalte am nächsten zu dem oben beschriebenen Verfahren liegen (P. Comp et al., loc cit; B. Dahlbäck, loc cit). In Abwesenheit einer APC-Zugabe (-Δ-) wird kein Unterschied (d.h. keine Ausdehnung) in der Koagulationszeit zwischen 0 und 100 % PS bei dem obigen Verfahren erhalten.

Beispiel 7

Eine Plasmaprobe, zu der menschliches Protein S zugegeben worden war, wurde 1:15 mit Tris-Puffer I verdünnt. 100 ul der Probe wurden vermischt mit 100 ul Protac C bei einer Konzentration derart, daß der Gehalt 0,17 U/ml war, wenn Protein C aktiviert wurde, wonach die Probe bei 37 ºC für 5 Minuten zur Aktivierung von PC inkubiert wurde.
200 ul Thrombinsubstrat S-2846 wurden dann zusammen mit insgesamt 200 ul Rinder-FIXa in Tris-Puffer II, Rinder-FVa in Tris-Puffer I, Cephotest und CaCl&sub2;, zugegeben, wobei die verwendeten Konzentrationen derart waren, daß die unten angegebenen Endkonzentrationen erhalten wurden. Die erhaltene Testlösung wurde für 6 Minuten bei 37 ºC inkubiert, wonach die Reaktion durch Zugeben von 200 ul 20 %-iger Essigsäure unterbrochen wurde.
Dieses Verfahren wurde mit Plasmaproben durchgeführt, die die im folgenden angegebenen PC-Gehalte und Endgehalte der enthaltenen Bestandteile besitzen:
0 % PC = Protein C-defizientes Plasma.
50 % PC = Ein Gemisch an gleichen Teilen von normalem Plasma und Protein C-defizientem Plasma.
100 % PC = Normales Plasma Bestandteil Gehalt zugegebenes menschliches Protein S Cephotest
A&sub4;&sub0;&sub5; wurde für diese Plasmen gemessen und die erhaltenen Werte wurden gegen die PC-Gehalte (%) in Fig. 5 aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß eine gute Auflösung erhalten wurde, d.h. ein hoher Wert von ΔA&sub4;&sub0;&sub5; (0-100 %) von 0,65.
Die Figur zeigt auch, daß die Menge an gebildetem Thrombin deutlich und umgekehrt mit dem Anteil an Protein C im Plasma korreliert. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, daß wie erwartet überhaupt keine APC-Wirksamkeit erhalten wurde, wenn Plasmaproben mit polyklonalen Anti-PC-Antikörpern für 5 Minuten vor dem Aktivieren mit Protac C präinkubiert wurden.

Beispiel 8

Das Verfahren ist klinisch erprobt worden, wo das Verfahren gemäß Beispiel 1 (a) mit Plasma von einem Individuum mit normalem Protein-S- Gehalt und mit Plasma von einem Thrombose-Patienten durchgeführt worden ist. Zu Kontrollzwecken wurde auch der freie Protein-S-Gehalt durch ein konventionelles RIA-Verfahren ("Radio Immuno Assay") analysiert.
Die erzielten Ergebnisse waren, wenn die Erfindung ausgeübt wurde, 115 % PS bzw. 53 % PS, was in guter Übereinstimmung mit den RIA- Werten von 100 % PS bzw. 41 % PS ist.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der funktionellen Wirkung von freiem Protein S oder Protein C in einer menschlichen Plasmaprobe, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch

(i) Zugeben von Protac C oder aktiviertem Protein C, wenn Protein S zu bestimmen ist, und von Protac C und menschlichem Protein S, wenn Protein C zu bestimmen ist, zu der Plasmaprobe, und dann

(ii) Zugeben des Koagulations-Enzyms FIXa, gefolgt von einer Inkubation, und

(iii) Messen der Menge an gebildetem Thrombin in bekannter Weise,

(iv) Bestimmen des Gehalts an funktionell wirksamem Protein S oder aktiviertem Protein C in der ursprünglichen Plasmaprobe, auf der Basis der gemessenen Menge an Thrombin, in bekannter Weise mit Hilfe eines Standards; wobei der Gehalt an Protein S oder Protein C in umgekehrter Beziehung zu der Menge an gebildetem Thrombin steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aktiviertes Protein C zugegeben wird, wenn Protein S zu bestimmen ist, und menschliches Protein S, wenn Protein C zu bestimmen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Inkubation zwischen die Schritte (i) und (ii) eingeschoben wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in ein oder zwei Stufen durchgeführt wird und wobei das Messen von Thrombin mittels eines Verfahrens, das auf Substratspaltung basiert, oder eines Verfahrens, das auf Koagulation basiert, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß Thrombin durch photometrisches Verfolgen der Umwandlung eines chromogenen Thrombinsubstrats gemessen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß Thrombin photometrisch gemessen wird durch Verwendung eines chromogenen Thrombinsubstrats, was ermöglicht, das Verfahren einstufig durchzuführen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß Thrombin photometrisch gemessen wird durch Verwendung eines chromogenen Thrombinsubstrats, was ermöglicht, das Verfahren einstufig durchzuführen, wobei das Substrat ausgewählt wird aus H-D-Ala-Pro-Arg-pNA, H-D-CHG-Ala-Arg-pNA, Tosyl-Gly-Pro-Arg- PNA, H-D-CHT-Ala-Arg-pNA und H-D-CHG-But-Arg-pNA.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-7, dadurch gekennzeichnet, daß Thrombin mittels eines Verfahrens gemessen wird, das auf Substratspaltung basiert, und, daß der endgültige Plasmagehalt 0,02- 10 Vol-%, vorzugsweise 0,1-2 Vol-%, beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Phospholipid-Gemisch und wahlweise mindestens ein Koagulationsfaktor ausgewählt aus FV, FVa, FVIII, FVIIIa, FX und Prothrombin zugegeben und inkubieren gelassen werden, bevor Thrombin gemessen wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß FIXa und andere zugegebene Koagulationsproteine von Säugetieren, wie Rind, Mensch oder Schwein, stammen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmaprobe mit einem Antikörper gegen FVIII präinkubiert wird, um FVIII zu inaktivieren.