JP2892828B2 - 血漿プロテインの検定方法 - Google Patents

血漿プロテインの検定方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液凝固および繊維素溶解系における成分の
アッセイ、特にこれらの系に包含されるある種の蛋白
質、すなわちプロテインＣおよびプロテインＳと呼ばれ
る血漿蛋白質の機能的活性の検定または定量に関する。
血液凝固または凝血過程の目的の一つは、出血を効果
的に停止させることにある。この過程は接触活性化、例
えば血管の傷害によって開始されるプロ酵素、因子XII
（因子の語は慣行に従い、以下Ｆと略す）の活性酵素F
XII a（接尾記号“a"は活性であることを意味し、この
表示方法は一般的に以下の記述に使用される）への酵素
活性化反応の複雑な、いわゆる酵素カスケードに関与し
ている。F XII aは以後のプロ酵素の酵素への活性化反
応を触媒し、凝血または血餅が一連の酵素活性化（カス
ケード）を介し、可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィ
ブリンへの変換によって最終的に形成される。多くの活
性化段階すなわちカスケード反応が迅速な止血を可能に
する急速な血餅の形式に寄与する。
逆の過程、すなわち形成された血餅の分解、いわゆる
繊維素溶解過程も類似の酵素反応カスケードからなり、
このカスケードの最終段階でプラスミンが形成される。
形成されたプラスミンは、蛋白分解作用により血餅すな
わちフィブリンを速やかに小さな可溶性フラグメントに
分解する機能を有する。
これらの系には以下に詳述するように、多数の因子が
組み込まれている。
後天的または先天的傷害による血液凝固および／また
は繊維素溶解系におけるこれらの血中因子の１種または
２種以上の量の増加または減少は、病的状態を招来する
ことが多く、これらは時に致命的であり、またその個体
群の症例では例えば動脈および／または静脈血栓（また
は血餅）形成の素因があることを意味する場合がある。
機能的に活性な抗トロンビンおよびプラスミノーゲン量
の減少ならびにF VII、フィブリノーゲンおよびプラス
ミノーゲン活性化因子インヒビター（PAI−１）量の増
加は、血栓（または血餅）を生じやすい障害の例であ
る。
最近、プロテインＣ（PC）およびプロテインＳ（PS）
と呼ばれる二つの新しい蛋白質が血漿中に同定された。
よく知られている抗トロンビンと同様に、これらのビタ
ミンＫ依存性の蛋白質は抗凝固活性を有し、プロテイン
Ｓ（分子量80kD）が活性化プロテインＣの活性を刺激す
るという形での両蛋白質の共同作用により両者で血餅形
成を妨害し、すでに形成された血餅の分解を促進する。
これらの蛋白質またはその一方の量の減少もまた、血液
凝固および繊維素溶解系における障害を招く。プロテイ
ンＳの重要性は、この蛋白質について実施された試験に
よって確認されている。これらの試験に基づき、深部静
脈血栓に罹患している50歳未満の患者の場合、その５〜
８％のプロテインＳの生来の欠損に由来するものである
と信じられている。一方、抗トロンビンの固有の欠損に
よると考えられる例は全症例の約３％に過ぎない。
したがって、これらの蛋白質の両者または一方の含量
を定常的に検定または定量することが可能であれば、各
自の血栓形成の素質をより容易に確立し、適切な時期に
予防的および／または治療的処置を施すことが可能にな
るので著しい利益が得られる。
これらの血漿蛋白質、PCおよびPSは共同してトロンビ
ン形成の実行に必要な補因子F V aおよびF VIII aを切
断することにより、F X aおよびトロンビンの形成に影
響する。プロテインＳおよびプロテインＣ（活性化され
た型）の機能の理解を容易にするために、以下に血液凝
固系の主要部分について簡単に説明する。そのうち、F
XIIの活性化以降の段階を系統図１に示す。
この系統図１から明らかなように、不活性蛋白質プロ
トロンビン（プロ酵素）は活性化F XすなわちF X a、Ca
2+、TF3と呼ばれ、活性化血小板の表面に出現するリン
脂質（血小板因子３）およびヘルパープロテインF Vの
活性型F V aの影響により、活性なトロンビン（酵素）
に変換される。トロンビンはフィブリノーゲンを酵素的
に切断してフィブリンを形成させ、これが酵素、F XII
aの助力で架橋することにより血餅の構造的骨格が形成
される。これらの過程は系統図１の一部でもある以下の
系統図２に例示する。
一方、F X aは不活性F XによりF IX aの作用とTF3、C
a2+および別のヘルパープロテインF VIIIの活性型F VII
I aの補助を介して形成されている。これらの過程は同
じく系統図１の一部でもある以下の系統図３に例示す
る。
これらの系統図から明らかなように、トロンビンは効
率的なトロンビン形成に必須な活性因子であるF V aの
活性化（系統図２）と同様に、F X aとともにF VIII a
の活性化（系統図３）にも寄与することにより、また以
下に述べるように活性化された型でプロテインＳととも
に因子F VIII aおよびF V aの切断によりトロンビン形
成を低下させるプロテインＣの活性化に寄与することに
よりその産生量を自己調節している。
F IX aは不活性F IXによりF XI aとCa2+の作用を介し
て形成される。F XI aはF XIによりF XII aの作用を介
して産生されている。F XII aは血管障害等の結果とし
てF XIIにより形成され、したがって凝血系における開
始因子になっている。これらの過程は同じく系統図１の
一部でもある以下の系統図４に例示する。
系統図２および系統図３＋４に開示された過程に加え
て、トロンビンの形成は組織因子、組織トロンボプラス
チンの介助によりヘルパープロテインおよびリン脂質を
供給する外的システムを経由するF IXおよびF Xのそれ
ぞれF IX aおよびF X aへの活性化により、並びにCa2+
の存在下における酵素F VII aの作用により促進され
る。
活性型の血液凝固および繊維素溶解系因子は、通常は
血中には存在せず、必要な場合にだけ生成する。血液は
多数の蛋白質いわゆる酵素インヒビターを含有し、これ
らが誤った活性化を防御している。よく知られた一つの
インヒビターに抗トロンビンがあり、これはトロンビン
に結合した蛋白分解作用を欠く複合体を形成する。
本発明が関与するプロテインＣ（PC）およびプロテイ
ンＳ（PS）は、インヒビターまたは抗凝固剤としても作
用し、これらの蛋白質の作用はプロテインＣのプロテイ
ンＳの介助によりF V aを切断する活性型プロテインＣ
（APC）への活性化に基づくものである。これはプロト
ロンビンのトロンビンへの変換（系統図５）を劇的に減
少させ、したがって血餅の形成を低下させる。
さらに、APCはPSとともにF VIII aに対して切断作用
を発揮し、これもF X aの生成を減らすことによりその
抗凝固作用を助けることになる。この過程は以下の系統
図６に例示する通りである。
これらの系統図から明らかなように、プロテインＣの
活性化は血餅形成を制限する目的でトロンビンが組み込
まれたある種のフィードバック機構によって制御されて
いる。血餅が血管内に形成されるとトロンビンは血餅か
ら血管壁に移動し、ここでトロンビンは内皮細胞の表面
に存在する蛋白質であるトロンボモジュリン（TM）に結
合する。結合するようになった後にトロンビンはもはや
凝固作用をもたない。すなわちトロンビンは最早フィブ
リノーゲンを切断することはできず、代わって複合体TM
/トロンビンがプロテインＣを急速にAPCに活性化し、こ
れがプロテインＳとの複合体の型でF V aとF VIII aを
切断することにより凝血を阻害する。すなわち、この後
者の複合体は重要な抗凝血作用を有する。
上述のように、APCは血餅の分解も促進する。これは
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）をインヒビ
ターの作用から保護することにより間接的に生じるもの
である。このやり方でｔ−PAの作用によるプラスミノー
ゲンのプラスミンへの高い変換率は維持される。プラス
ミンは血餅を小さな可溶性のフラグメントに切断するこ
とによりフィブリン血餅を溶解する。
プロテインＣおよび／またはプロテインＳの含量が著
しく低すぎると、トロンビン形成の調節が不十分になる
結果生じる血栓症の危険を伴うフィブリンの過剰産生に
より個体に血栓性疾患の素因を付与することになる。し
たがって、サンプル中のプロテインＣおよび／またはプ
ロテインＳのレベルを定常的様式で測定できて、血栓症
の予防的および／または治療的処置の改善を可能にする
簡単かつ安全な方法が求められている。プロテインＣ欠
損に罹患している全患者の約10％は、その機能的活性は
著しく低下しているかまたは完全に欠損しているにもか
かわらず、プロテインＣの免疫学的レベルは正常である
ことから、測定されるべき活性はプロテインＣおよび／
またはプロテインＳの特に機能的活性である。プロテイ
ンＳに関しては、その血漿内濃度は約22μg/mlである
が、その大部分約60％は補体系内の蛋白質、C4b−結合
蛋白質に結合していて、機能的には不活性である。血漿
内に遊離状態で存在する残りの約10μg/mlは生物活性を
発揮する。すなわち活性化プロテインＣに結合して活性
な複合体を形成する。プロテインＳ欠損に罹患している
患者も遊離プロテインＳは欠損しているかまたは著しく
低いレベルを示すにもかかわらず、結合プロテインＳの
レベルは正常であることから、測定されるべきレベルは
プロテインＳ欠損の場合も機能的活性である。
しかしながら、これまで主としてプロテインＳの機能
的活性を検定するための満足できる方法は開発されてい
ない。
プロテインＳの機能的活性は定常的に行えるものでは
ないが、確かに従来の検定方法の対象にはなっていた。
しかし既知の方法は、多様なレベルの生物活性間の識別
に関しては十分に信頼できるものではない。現在知られ
ている方法はフィブリン血餅が生成する時間の記録に基
づくものである。これらの方法はAPTT−ベースまたはF
X aベースの凝固法と呼ばれる。「APTT」は「活性化部
分トロンボプラスチン時間」の略である。この点におい
て血漿は最初の段階にリン脂質と接触活性化剤たとえば
カオリンまたはエラギン酸を含む試薬によって活性化さ
れ、カルシウム依存性凝固反応（系統図４参照）すなわ
ちF XII aおよびF XI aへの活性化が開始されている。
第二段階ではCa2+イオンが添加され、F IX、F Xおよび
プロトロンビンが様々な程度に活性化される。プロテイ
ンＳ活性を測定する目的では、既知量の１種もしくは２
種以上の凝固因子も添加される。
段階１で開始された活性化連鎖が最後まで進行し血餅
が形成される。血餅が形成されるのに要する時間（秒）
（APTT）が記録され、標準サンプルと比較してプロテイ
ンＳの機能的活性と関連づけられる。一般的に血漿中の
遊離プロテインＳ含量が増大するほど、凝固阻害APC/プ
ロテインＳ複合体が多量に形成されるので、血餅の形成
に要する時間は延長される。
これらの既知方法において系に添加される活性化凝固
因子は、活性化プロテインＣ（APC）とF X aである（P.
COMP ＆ C.ESMON,“Recurrent Venous Thromboembolism
in Patients with a Partial Deficiency of Protein
S",New Eng.J.Med.311,1525−1528,1984およびB.DHLB
ACK,“Inhibition of Protein Ca Cofactor Function o
f Human and Bovine Protein S by C4b−Binding Prote
in",1986参照）。A.d′ANGELO,S.VIGANO−ｄ′ANGELO,
C.EMSON ＆ P.COMP,“Acquired Deficiencies of Prote
in S.Protein S Activity During Oral Anticoagulatio
n,in Liver Dis−ease and in Disseminated Intravasc
ular Coagulation".J.Clin.Invest.81,1445−1454,1988
によればまず特異的モノクローナル抗体を用いて血漿中
遊離プロテインＳを抽出し、ついでその抽出蛋白質にAP
CおよびF X aが添加されている。K.SUZUKI ＆ J.NISHIO
KA,“Plasma Protein S Activity Measured Using Prot
ac,a Snake Venom Derived Activator of Protein C".T
hromb.Res.49,241−251,1988では、APCの代わりに血漿
中PCをAPCに活性化する物質、すなわちProtac Ｃ（Pen
tapharm,Switzerland）のAgkistrodon contortrixから
の選択的蛇毒酵素である活性成分を使用している。
しかしながら、これらの既知方法には幾つかの欠点が
ある。例えば分解能が低く、すなわち遊離プロテインＳ
のレベルの差の識別能に限界がある。通常、70〜200％
遊離プロテインＳの範囲内で凝固時間はわずか10秒まで
延長されるのみで、正常血漿すなわち遊離プロテインS
100％での凝固時間は用いられる方法に依存して40〜80
秒の範囲にある。更にこれらの方法はルーチンベースで
の実施、例えば凝固検査室での実施は困難で標準化が必
要であり、また正確度に関して欠陥がある。
したがって、本発明の目的は簡単に実施可能で、既知
方法に伴う欠点を実質的に回避した機能的に活性なプロ
テインＳまたはプロテインＣのレベルを検定する方法を
提供することにある。
本発明によればこの目的は、機能的に活性なプロテイ
ンＳまたはプロテインＣの含量を測定する血漿サンプル
に凝固酵素F X aの形成を促進する酵素である凝固酵素F
IX aを、更に任意の１種もしくは２種以上の凝固因子
とともに添加し、サンプルをインキュベートし、F X a
によって接触される過程でプロトロンビンから誘導され
るトロンビンの量を既知の方法で測定し、標品を用いて
既知の方法で測定されたトロンビンの量に基づいて、生
成したトロンビンの量に逆相関する機能的に活性なプロ
テインＳまたはプロテインＣの含量を測定することから
なる方法によって達成される。
すなわち、生成したトロンビンの量は、存在する機能
的な活性なプロテインＳまたはプロテインＣの量の尺度
になる。血漿中のトロンビン含量の検定方法はよく知ら
れていて、本発明はその特定の測定方法によって限定さ
れるものではない。現時点で知られているすべての方法
および将来考案されるであろう方法が利用可能である。
適当な測定方法の例には基質の切断に基づく好ましくは
光度測定法による方法、および凝固に基づく測定方法が
包含される。
本発明によれば、生成したトロンビン量に基づく機能
的活性なプロテインＳおよびプロテインＣの測定には、
基質切断光度測定法が適していること、そしてこの方法
は特にプロテインＳに関して既知の凝固に基づく方法で
達成される分解能に比べてかなり大きな分解能を与える
ことが明らかにされている。本発明の好ましい一態様に
おいてはしたがって、生成したトロンビン量の選択的ト
ロンビン基質好ましくは色素産生基質を用いる光度測定
法による測定が適用される。このような基質は通常、ア
ミノ酸好ましくはトロンビンによって容易に選択的に切
断され、ｐ−NA（ｐ−nitroaniline）のような色素産生
マーカーを用いた場合、例えば光度測定法で容易に測定
できる基（マーカー）を与える短いペプチドに基づくも
のである。これらの基質は市販品を例えば、Kabi Diagn
ostica,Mlndal,Swedenから入手可能であるか、または
本技術分野の熟練者により容易に製造できるものであ
る。
また驚くべきことに本発明では、選択的トロンビン基
質を適当に選択すれば、本発明の方法を２段階でも１段
階でも任意に実施できることが見出されたのである。適
当な選択的基質を選んだならば、この方法を単一工程で
行えることは驚くべきことであり有利である。単一工程
方法を可能にする基質は、例えばＨ−Ｄ−Ala−Pro−Ar
g−pNA（Ｓ−2846）（KabiVitrumAB,Sweden）およびＨ
−Ｄ−CHG−Ala−Arg−pNA（Nycomed Th−１）（Nycome
d AS,Norway）である。他方、既知のトロンビン基質、
Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−pNA（Ｓ−2238）KabiVitrum A
B,Sweden）は、特に差の識別等が不十分なことから単一
工程には適当ではない。
本発明の方法ではまた生成したトロンビン量を既知の
様式での凝固方法を用いて確立することも可能である。
凝固連鎖を完結するまで進行させ、その血漿サンプルに
ついて血餅の生成に要する時間を測定し、プロテインＳ
またはプロテインＣの機能的活性が既知の血漿について
の相当する時間と比較する。この方法は１段階、２段階
のいずでも実施できる。
本発明の方法は多くの先行技術方法がその実施にあた
り直接F X aを添加するのに対して、F XのF Xaへの活性
化を促進するためにF IX aを添加することに基づくもの
である。本発明において使用されるF IX aは通常、哺乳
動物例えばウシ起源のものである。ヒトまたはブタから
F IX aも有利に使用できる。
本発明によるF IX aの添加はF XのF X aへの活性化の
調節を可能にするばかりでなく、トロンビンの生成に大
きな影響を与える形成されたF V aとF VIII aに対するA
PS/PSの不活性化作用を至適にすることが可能であると
いう間接的な利点も提供する。例えば相当する血漿内含
量でのF X aの添加の場合と比較して、この方法におけ
るF IX aの強力な影響は全く予期できないものであっ
た。また本発明の目的におけるF IX aの添加はこれまで
どこにも記載されていない。
本発明の方法はF IX aに加えて、ある種の他の凝固因
子を添加することによって更に改良することができる。
すなわち好ましい一態様によれば、本発明の方法は活性
化プロテインＣ、すなわちAPCを添加しつつ実施され
る。使用されるAPCは通常、哺動物起源のもの例えばウ
シ（ウシAPC）、ブタ（ブタAPC）、好ましくはヒト（ヒ
トAPC）からのものである。使用可能なAPCは血漿からま
たは組換え技術によって製造することが可能で、通常高
度に精製されている。上述の市販製品、蛇毒酵素を含む
Protac ＣをAPCの代わりに使用することもできる。こ
の酵素はプロテインＣをAPCに活性化し、したがって間
接的にAPS/PS複合体の生成を促進する。この複合体の作
用については既に述べた通りである。
本発明の別の適当な実施態様によれば、血漿サンプル
にF V aも添加される。F V aの添加はトロンビンの生成
速度の調節のために用いられ、F V aの適当な添加によ
りプロトロンビンのトロンビンへの変換は更に迅速に、
更に効果的に行うことができる。好ましくは哺乳動物起
源のF V a、例えばヒト起源、ウシ起源またはブタ起源
のもの、特に好ましくはヒト起源のものが、そして血漿
からまたは組換え技術によって製造されたF V aが用い
られる。
本発明の実施に際して、血漿サンプルに適当に添加で
きる他の凝固試験はリン脂質である。この添加はF XのF
X aへのおよびプロトロンビンのトロンビンへの活性化
を加速することができる。リン脂質の起源の選択につい
ては特に制限はない。例えば接触活性化剤例えばカオリ
ンまたはエラギン酸が添加されたまたは添加されていな
い市販の両APTT−試薬および合成リン脂質またはリン脂
質混合物は使用可能であることが見出されている。
プロトロンビン、F Xおよび／またはF VIIIの添加が
有利な場合もあることが見出されている。本発明で用い
られるすべての凝固蛋白質に関して、これらの凝固蛋白
質はその種起源によって限定されるものではなく、それ
らが血漿から抽出されるか、または組換え技術によって
製造された未変異体もしくはその分子生物学的に改変さ
れた変異体であるかには無関係であることを理解すべき
である。種起源に関しては、しかしながら通常は哺乳動
物起源のものが好ましく、特にヒト、ウシまたはブタ起
源のものが好ましい。
本発明を適用する場合に存在させる大部分の成分の比
率には、特に制限はない。しかしながら本発明の理解を
容易にするために、多数の成分についての適当な濃度範
囲を以下の表１に掲げる。
pHを好ましい範囲に維持するには、成分溶液は、慣用
の緩衝系たとえばTris−緩衝液を用いた緩衝液中に調製
する。
本発明には、サンプルのインキュベーションが包含さ
れ、温度を18〜45℃、好ましくは35〜40℃、さらに好ま
しくは37℃として、短時間たとえば0.5〜15分、適当に
は１〜10分、とくに0.5〜６分行われる。次いで、プロ
テインＳまたはＣの機能的活性はすべて、いわゆる単一
工程法に従って測定される。著しく短い反応時間で行わ
れる系の場合、たとえば好ましくは凝固をベースとした
方法では、導入段階で、所望により凝固因子とともに、
サンプルを上述したと同じ温度に、短時間、通常２〜３
分間加熱するのが好ましく、次いでサンプルにF IX aお
よび任意の他の凝固因子が添加される。たとえば血漿サ
ンプル中のプロテインＣの活性化のためにProtac Ｃを
使用する場合のように、２回のインキュベーション期間
を導入した２段階法を適用するのが有利な場合もある。
本発明の方法においては、凝固因子に対するポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体を、この因子の影響を
除去するために使用することが有利な場合もある。たと
えば、F VIIIの生物活性は、抗−F VIII :C抗体の添加
によって遮断できる。
以上の記述は一般的に、プロテインＳの機械的活性の
検定の場合に当てはまる。本発明の方法をプロテインＣ
の機械的活性の検定に適用する場合には、一部の改変が
必要である。たとえば、上述のようにProtac Ｃで有利
に行われる血漿サンプル中のプロテインＣの活性化の前
または後に、好ましくはヒト起源のプロテインＳを血漿
サンプル中に添加する。F IX aおよび任意の他の凝固因
子はついで第二段階で添加される。
次に、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明
するが、これらは単に本発明を例示するものであって、
本発明の範囲を限定するものではない。これらの実施例
では、添付の図面も参照しながら説明する。図１は、F
IX aもしくはF X aの存在下における色素産生基質単一
工程法でのプロテインＳの検定を例示する。図２は、プ
ロテインＳを検定する場合における、抗−F VIII :C抗
体およびウシF Xの添加の効果を例示する。図３は、プ
ロテインＳを検定する単一工程法における各種の基質の
効果を例示する。図４は、F IX aの添加に基づくプロテ
インＳの単一工程凝固ベース検定法を例示する。図５
は、プロテインＣのF IX aベース色素産生基質法を例示
する。
例１ （ａ）血漿サンプルをTris−緩衝液Ｉに1:15に希釈し
た。その100μをTris−緩衝液Ｉに溶解したヒトAPC10
0μ、色素産生基質、Ｈ−Ｄ−Ala−Pro−Arg−pNA
（Ｓ−2846）（KabiVitrum AB,Sweden）200μ、なら
びにTris−緩衝液IIに溶解したヒトF IX a、CaCl2、Tri
s−緩衝液Ｉに溶解したウシF V a、および40％コレステ
ロール、40％ホスファチジルコリン、20％ホスファチジ
ルセリンからなるリン脂質混合物、計200μと混合し
た。
Tris−緩衝液Ｉは、pH7.4、イオン強度（Ｉ）0.15の
0.05mol/のTris−HClおよび0.2％ウシ血清アルブミン
（BSA）からなる。
Tris−緩衝液IIは、pH8.0、Ｉ＝0.15の0.05mol/のT
ris−HClおよび0.2％BSAからなる。開始溶液の濃度は、
各反応試薬について表１に与えられた最終濃度になるよ
うにした。
混合物を37℃で４分間インキュベートし、20％酢酸を
加えて、反応の進行を中断した。次いで、サンプルの40
5nmにおける吸収（A405）を、標準装置たとえばHitachi
100−20光度計を用いて測定した。A405は、正常血漿を
混合して調製したサンプルについても測定し、そのプロ
テインＳ含量を100％にセットし、プロテインＳ欠損血
漿のプロテインＳ含量を０％にセットした。A405は、そ
れぞれPS 100％およびPS 0％を含有する血漿についても
測定した。
図１には、得られたA405の値を％PSに対してプロット
した（−■−）。これらの値から明らかなように、極め
て良好な識別能が達成され、これは100％と０％におけ
る吸収の大きな差に反映されている。この差は、△A405
（０〜100％）と命令され、ほぼ0.85である。また図１
から、プロテインＳ含量は生成したトロンビン量と逆相
関すること、すなわちPS含量が増加するとトロンビンの
生成は著しく低下することがわかる。
（ｂ）例１（ａ）においては、検定は血漿サンプルにAP
Cを添加して行われた。比較のために、同じ検定をAPCを
添加しないで実施した。この場合は、かなり小さく、有
意ではない差、△A405（０〜100％）しか得られなかっ
た。すなわち、この試験での識別程度は低かった。これ
は図１にプロットした値（−□−）から明白である。例
１（ａ）による検定を、サンプルの初期インキュベーシ
ョンをプロテインＳに対する抗体（PS−Abで示す）とと
もに行い、PSの生物活性を排除し、それによりAPC/PS−
複合体も除去した場合には、測定された吸収値は実質的
に変化せず、高いレベルに止まった。得られたこの値
も、図１にプロットする（−×−）。
（ｃ）既知の方法と比較するために、ヒトAPCを添加し
または添加しないで、ただしF IX aの代わりにF X
a（最終濃度0.4pmol/，インキュベーション時間５
分）を用い、上記１（ａ）とほぼ同様の検定を実施し
た。得られた△A405値も図１にプロットする（それぞれ
−▲−および−△−）。この場合は有意な△A405（０〜
100％）の値は得られず、トロンビンの生成は常に比較
的低い値を示すことが明らかである。
F X aの添加を最終比率で40pmol/に増大させた場合
はインキュベーション時間はある程度短縮したが、差の
識別能はさらに悪くなった。APCの添加量を増加させる
と、わずかながら結果は改善されるが、APCの添加量を
３倍に増加させても、△A405（０〜100％）は例１
（ａ）によって得られた値の30％を越える程度であっ
た。
例１は、血漿中のPSの機能的活性の一工程色素産生基
質検定法の例示である。サンプルにF IX aを添加した場
合に達成される驚くべき高い効果は、得られた結果（図
１に示した）により明白に証明されている。APCが蛋白
分解的切断によって補因子F VおよびF VIIIを分解する
ことは一般によく知られている（W.KISIEL,W.CANFIELD,
L.ERICSSON ＆ E.DAVIE,Anticoagulant Properties of
Bovine Plasma Protein C Following Activation by Th
rombin.Biochemistry 16,5824−5831,1977およびR.MARL
AR,A.KLEISS ＆ J.GRIFFIN,“Mechanism of Action of
Human Activated Protein C,a Thrombin−Dependent An
ticoagulant Enzyme".Blood 59,1067−1072,1982）。し
かしながら、この過程は、F VおよびF VIIIがトロンビ
ンおよび／またはF X aによってそれぞれF V aおよびF
VIII aに活性化される前に無効である。したがって、予
め形成されたF X aの添加の方が、インキュベーション
時においてF X aの生成を助けるF IX aの添加（本発
明）よりもかなり低いAPC/PS活性しか生じないことは、
いずれの場合もF X a/トロンビンの影響を介してF VIII
の活性化が起こることを考慮すれば、全く驚くべきこと
である。
以下の実施例は、トロンビンの生成に対する補因子F
VIII aの意義を、その補因子の遮断によって例示するも
のである。
例２ 正常血漿（100％PS）１容を、0.2μ/mlのモノクロ
ーナル抗−F VIII :C抗体2A3（Kabi AB,Sweden）１容と
37℃で15分間プレインキュベートした。これらの抗体は
F VIIIに特異的に結合して、それを不活性化する。例１
（ａ）と同様に、ただし血漿含量1.7％でF IX aを添加
して、それぞれPS 0、50および100％の血漿サンプルに
ついて、ウシF X（最終含量0.02U/ml）を加えてまたは
加えないで37℃において４分間インキュベーションした
のち、A405を測定した。得られた値は図２にプロットす
る。図から明らかなように、APC/PSは、F VIII aの不存
在下でもF Xを添加すると（−■−）、供給されたF V a
に対するAPC/PSの影響を介して、依然として効果を発揮
する。
F X aの直接添加からなる例１（ｃ）（図1;−▲−）
と比較すると、この場合も、系へのF X aの直接添加に
代えて、予め添加したF Xからインキュベーション時にF
X aを生成させた方が有利であることがわかる（図2;
（−■−）。
例３ 例１（ａ）と同様にして、正常血漿（100％PS）、な
らびにプロテインＳ欠損血漿（０％PS）についてA405を
測定した。しかしながら、APCを使用する代わりに、37
℃で２分間インキュベートするとプロテインＣをAPCに
活性化するProtac Ｃ（最終含量0.17U/ml）を用い、一
方、12pmol/のF IX aを使用し、インキュベーション
時間4.5分を適用した。得られた結果を表２に示す。
これらの値から、プロテインＳはAPCの存在下に高い
活性を示すことがわかる。APCはProtac Ｃの作用によ
ってin vitroで形成されるので、はじめにAPCを供給す
る必要はない。
例４ 最終濃度18μmol/の合成リン脂質混合物を用いたほ
かは例１（ａ）と同様にして、正常血漿およびプロテイ
ンＳ欠損血漿についてA405を測定した。同様の検定を、
リン脂質混合物の代わりに、同様の接触活性化剤すなわ
ちエラギン酸を含有するAPTT−剤、この場合はウシ脳の
抽出物からなるCephotest （Nycomed AS,Norway）を使
用しても行った。得られた値は表３に掲げる。
これらのA405値は良好な一致を示し、互いに異なる組
成の合成リン脂質、また互いに異なる接触活性化剤を含
めて、様々なリン脂質源が使用できることを示してい
る。
例５ 例１（ａ）と同様にして、様々な百分率のPSを含有す
る血漿を、３種の異なる基質を用い、ウシF IX aを添加
して一工程法でインキュベートした。
最終サンプルは、血漿含量1.1容量％、基質含量0.3mm
ol/で、F IX a0.1nmol/、F V a75pmol/およびAPC
2nmol/を含有した。試験した基質は、Ｓ−2846とＳ−
2238（いずれもKabiNitrum Diagnostica,Sweden）、お
よびNycomed Th−１であり、インキュベーション時間は
それぞれ４分、５分、および４分とした。
結果は図３に示す。これらの結果から、S2846 はＳ−2238（−◆−）よりも、はるかに優れた基質であ
ることがわかる。図３からはまた、基質Nycomed Th−１
（−○−）（（Nycomed AS,Oslo,Norway）でも良好な結
果が得られることがわかる。
比較の目的で、上述の方法を、基質としてＳ−2846と
Ｓ−2238を用い、二段階法で実施した。すなわち、APC
を添加した血漿サンプルは、基質の添加前にインキュベ
ートされた。二段階法で得られた△A405（０〜100％）
値はそれぞれ0.8および0.6であった。すなわち、有効性
には著しい差は認められなかった。以下の基質について
も一段階法で試験され、有用なことが見出された〔△A
405（０〜100％）＝0.2〜0.5〕。
Chromozym Th:Tosyl−Gly−Pro−Arg−pNA（Pentapha
rm AB,Basel Switzerland） Spectrozym Th:H−Ｄ−Ala−But−Arg−pNA（America
n Diagnostica,Greenwich,U.S.A.） CBS 34.47:H−Ｄ−CHG−But−Arg−pNA（Diagnostica
Stago,Asnieres,France） BehringのThrombin基質:H−Ｄ−CHA−But−Arg−pNA
（Behringwerke AG,Marburg,Federal Republic of Germ
any） 上に用いられた記号の意味は次の通りである。
CHT＝シクロヘキシルチロシン CHG＝シクロヘキシルグリシン But＝α−アミノ酪酸 CHA＝シクロヘキシルアラニン pNA＝ｐ−ニトロアニリン Tosyl＝ｐ−トルエンスルホニル 例６ 0.9％NaCl溶液に1:1に希釈した血漿サンプル100μ
にヒトAPC 100μを加え、サンプルを37℃で２分間イ
ンキュベートした。ついで、計100μのウシF IX a、
ウシF V a、Cephotest およびCaCl2を加えた。用いた
開始溶液の内容は以下の最終濃度が得られるようにし
た。
表 ４ 成 分 最終含量 APC 15nmol/ F IX a 0.4nmol/ F V a 75pmol/ Cephotest 4.2容量％ Ca2+ 4.2mmol/ 検定には、０、50および100％PSの血漿サンプル、す
なわちプロテインＳ欠損血漿（０％）、正常血漿（100
％）およびそれらの1:1混合物を使用し、これを単一工
程の凝固ベースの方法で実施した。これらのサンプルの
凝血時間を記録し、％PSに対してプロットする（図4;−
■−）。
上述の方法と同様にして、APCで活性化しなかった血
漿サンプルについても凝血時間を記録した（図4;−△
−）。
図４から明らかなように、100％PSでは０％PSに比較
して、凝血時間にほぼ60秒の延長が達成された。この結
果は、血漿含量に関して上述の方法に最も近い既知方法
（P.Comp et al,前出;B.Dahlbck,前出）で得られた結
果に対して著しい改善である。上記の方法でAPSの不存
在下には、０％と100％PSの間の凝血時間には差（すな
わち延長）は認められない（−△−）。
例７ ヒトプロテインＳを添加した血漿サンプルをTris−緩
衝液Ｉで1:15に希釈した。このサンプル100μに、Pro
tac C 100μを、プロテインＣを活性化する場合その
濃度が0.17U/mlであるように混合し、ついでPCを活性化
するために、サンプルを37℃で５分間インキュベートし
た。
次に、200μのトロンビン基質Ｓ−2846を、計200μ
のTris−緩衝液II中ウシF IX a、Tris−緩衝液Ｉ中ウ
シF V a、Cephotest およびCaCl2とともに加えた。濃
度は、以下に示す最終濃度が得られるようにした。得ら
れた試験溶液は37℃で６分間インキュベートし、ついで
20％酢酸200μを加えて反応を中断させた。
この方法は、以下に示す含量のサンプル、添加成分の
最終含量で実施した。
０％PC＝プロテインＣ欠損血漿 50％PC＝正常血漿とプロテインＣ欠損血漿の等部混合
物 100％PC＝正常血漿 成 分 含 量 添加プロテインＳ 0.11μg/ml F IX a 16pmol/ml F V a 75pmol/ml Cephotest 4.2容量％ Ca2+ 4.2mmol/ これらの血漿について、A405を測定し、得られた値は
図５に、PC含量（％）に対してプロットする。図から明
らかなように、良好な識別能、すなわち、0.65の高い△
A405（０〜100％）値が得られた。
また、この図は生成したトロンビン量が血漿中のプロ
テインＣの比率と明瞭に逆相関することを示している。
これはまた、期待されたように、血漿サンプルを、Prot
ac Ｃで活性化する前にポリクローナル抗−PC抗体と５
分間プレインキュベートすると、APC活性は全く得られ
なかったという事実によっても支持される。
例８ 例１（ａ）の方法を正常プロテインＳ含量を示す被検
者からの血漿および血栓症患者からの血漿について行
い、この方法を臨床的に検討した。比較の目的で、遊離
プロテインＳ含量は、慣用のRIA−法（「ラジオイムノ
アッセイ」）でも測定した。
本発明を実施して得られた結果はそれぞれ115％PSお
よび53％PSであり、RIAによって値、それぞれ100％PSお
よび41％PSとよく一致する。

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】遊離プロテインＳまたはプロテインＣの機
    能的活性をヒト血漿サンプル中で定量する方法におい
    て、その方法が （ｉ）プロテインＳを定量する場合には血漿サンプルに
    プロテインＣを活性化する蛇毒酵素または活性化プロテ
    インＣを添加し、そしてプロテインＣを定量する場合に
    はプロテインＣを活性化する蛇毒酵素およびヒトプロテ
    インＳを添加し、次に （ii）凝固酵素F IX aを加え、次いでインキュベート
    し、 （iii）生成するトロンビンの量を知られた方法で測定
    し、 （iv）標品を用いて知られた方法で測定したトロンビン
    の量に基づいて、生成したトロンビンの量に逆相関する
    初期血漿サンプル中の機能的に活性なプロテインＳまた
    は活性化プロテインＣの含量を求める ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】プロテインＳを定量する場合に活性化プロ
    テインＣを添加し、そしてプロテインＣを定量する場合
    にヒトプロテインＳを添加することを特徴とする請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】工程（ｉ）と工程（ii）の間にインキュベ
    ーションを行うことを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】方法は一段階または二段階に行い、トロン
    ビンの測定は基質の切断に基づく方法または凝固に基づ
    く方法によって行うことを特徴とする請求項１〜３のい
    ずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】光度測定法で色素産生トロンビン基質の変
    換を求めることによりトロンビンを測定することを特徴
    とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】方法を一段階で行うことを可能にする色素
    産生トロンビン基質を使用することによりトロンビンを
    光度測定法で測定することを特徴とする請求項１〜５の
    いずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】方法を一段階で行うことを可能にする色素
    産生トロンビン基質を使用することによりトロンビンを
    光度測定法で測定し、その基質はＨ−Ｄ−Ala−Pro−Ar
    g−pNA、Ｈ−Ｄ−CHG−Ala−Arg−pNA、Tosyl−Gly−Pr
    o−Arg−pNA、Ｈ−Ｄ−CHT−Ala−Arg−pNAおよびＨ−
    Ｄ−CHG−But−Arg−pNAから選択されることを特徴とす
    る請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】基質の切断に基づく方法によりトロンビン
    を測定し、そして最終血漿含量が0.02〜10容量％好まし
    くは0.1〜２容量％であることを特徴とする請求項４〜
    ７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】リン脂質混合物および場合によりF V、F V
    a、F VIII、F VIII a、F Xおよびプロトロンビンから
    選択される少なくとも１種の凝固因子を添加し、次いで
    インキュベートさせてからトロンビンを測定することを
    特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】添加するF IX aおよび他の凝固蛋白質は
    哺乳動物由来のもの、例えばウシ、ヒトもしくはブタ由
    来のものであることを特徴とする請求項１〜９のいずれ
    か１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】F VIIIを不活性化するために、血漿サン
    プルをF VIIIに対する抗体とプレインキュベートするこ
    とを特徴とする請求項１〜10のいずれか１項に記載の方
    法。
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