JP3687864B2 - 活性化状態の活性化タンパク質cに対する安定性が増大された凝固v因子を特異的に検出する方法 - Google Patents

活性化状態の活性化タンパク質cに対する安定性が増大された凝固v因子を特異的に検出する方法 Download PDF

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Description

【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、活性化状態で活性化タンパク質Cに対する安定性が増大されている凝固V因子を特異的に検出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
第一に、血液中での凝固系は、血流をその供給されるべき組織に持続させることを確保するものであり;第二に、この系は創傷閉鎖を行って傷害に対して反応し、これによって生体の完全な状態を維持することを確保するものである。凝固が活性化されると、段階的にそれ自体活性化するプロテアーゼのカスケード様系によって、活性プロテアーゼトロンビンが最終的に形成される。トロンビンの形成は初めのうちは極めて低いが、タンパク質分解開裂により補因子V因子およびVIII因子をトロンビンが活性化するので、この形成はトロンビン自体により促進される。それぞれ、プロテアーゼXa因子およびIXa因子と共に、これらの活性化補因子はりん脂質表面で活性酵素/補因子複合体を形成し、しかもこれらの複合体の活性は個々のプロテアーゼの活性よりも約1000の係数で高いものである。
【0003】
この正のフィードバック機序はほぼ爆発的に生じて大量のトロンビンを形成する。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、普通には創傷閉鎖、創傷治癒が行われる。生命の危険がある凝固の拡大、ひいては生体の血管系の閉鎖、すなわち血栓症の誘起を防止するには、活性プロテアーゼの阻害、またプロテアーゼ供給阻止が必要である。体内では、活性プロテアーゼは共有結合複合体の形成によるプロテアーゼ阻害剤で作用中性化される。プロテアーゼ供給の阻止はトロンビン自体で開始される。このためには、トロンビンは膜タンパク質トロンボモジュリンに結合し、酵素前駆体タンパク質Cを活性プロテアーゼCa(APC)に変換する。APCはその一部では補因子タンパク質Sと共に複合体を形成し、この複合体は活性補因子VIIIa因子およびVa因子をタンパク質分解で開裂し、それによって不活性化する。このようにしてAPCはこれらの補因子がもたらす強力な促進効果を阻止する。
【0004】
上述したタンパク質C/タンパク質Sの系は重要な抗凝血機序を表わしている。このことは、遺伝性または後天性タンパク質Cまたはタンパク質Sの欠乏または欠損を有する人は血栓症、殊に再発性静脈血栓症に極めて罹りやすいと言う事実によって確認された(Esmon, C. T. TCM 2:212〜219、1992年)。
【0005】
タンパク質Cおよびタンパク質Sに加えて、その他の因子も系の活性に対して影響を及ぼすことができる。これらの因子にはフォンビルブラント因子および因子IXa(Rick, M. E. 等, Clin. Med. 115:415〜421, 1990年)が含まれ、これらの因子は因子VIIIaをタンパク質分解による分解から防護することができる。後天性欠損はまたルプス抗凝血剤(Lupus anticoagulants)の形成に因ることもある。これらは、りん脂質に対向し、かつプロテアーゼ/補因子複合体のりん脂質表面への結合(適切な機能のために必要である)を阻害する抗体である(Amer, L. 等, Thromb. Res. 57巻, 247〜258頁, 1990年)。
【0006】
V因子の変異体はごく最近に報告され、このものは活性化状態(Va因子)にある場合は最早APCで不活性化され得ないか、または少なくともごく低い程度で不活性化され得るだけである(Bertina, R. M. 等 Nature 369巻, 64〜67頁, 1994年)。この欠損は「F.V疾患」とも称され、APCで開裂される領域においてArg 506をGlnで置換することに因るものである。ごく最近に、血栓症の危険が増大する原因としてこの変異の重要さがいくつかの研究で確認されている。
【0007】
この改変されたV因子を検出するのに、従来から2種の方法が用いられてきた。このうちの一つは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるゲノム分析である。周知のとおり、この方法は精巧なものであり、専門家の実験室でのみ実施可能であり、比較的高価である。更にまた、この方法は、予め知られている変異を検出するのみである。しかし、その他の部位での変異もAPCによる開裂に対してVa因子を安定化することが考えられる。この理由から、極めて専門家されたPCR法を補う機能試験がぜひ必要とされている。
【0008】
この種の機能試験は、凝固研究で通常使用されているスクリーニング法である活性部分トロンボプラスチン時間(APTT)の既知の変法(Amer等、1990年)を基とし、すでに報告されている。この試験でAPTTを測定するには、血漿試料を例えば、シリカカオリンまたはガラスのような界面活性剤を含む試薬およびりん脂質の等容量と接触させる。この混合物を2、3分間+37℃でインキュベートする。この間に、カルシウム依存ではない凝固系の因子(XII因子、XI因子およびIX因子)が活性化される。カルシウムイオンを加えると、凝固カスケードの残りが活性化され、トロンビンが形成される。得られたトロンビン量を、天然基質フィブリノーゲンがクロットに変換されることによるか、または色素形成基質からの発色団の遊離により、測定する。Amer L.等(1990年)によるこのAPTT変法では、活性化タンパク質Cをカルシウムイオンと同時に添加することを伴っている。上述の如く、APCはVIIIaおよびVa補因子を破壊するので、タンパク質C/タンパク質S系の機能効率に依存しているトロンビンの形成の減速が生じてくる。
この変法を以下APC時間(APCT)と称する。
【0009】
従来用いられてきた形態では、APCTはAPCに対するV因子の安定性の増大を特異的に検出するのに適当ではない(実施例1参照)。活性化形態で外因的に加えられるタンパク質Cに加えて、タンパク質C/タンパク質Sの系の機能効率に影響を及ぼす試料からの他のすべての上述した因子も測定結果に入ってくる。それ故、V因子の変異は、特に患者がこの因子について異型接合である場合、タンパク質Sでの欠損または欠陥と区別することができない。タンパク質Sまたはタンパク質Cに対する抗体もこの結果を誤って似せるものとする。
【0010】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の基本的な目的は、APCによる分解に対する安定性を増大したV因子の検出に使用し得る方法を見い出すことにある。
この目的は特許請求の範囲に記載した実施態様を提供することによって達成される。
【0011】
意外にも血漿を、V因子が乏しく、かつタンパク質Sおよび凝固X因子およびプロトロンビンを含有する試薬で希釈すると、タンパク質Sの影響が除かれるが、APCに対するV因子の改変された安定性は測定結果に対して常に決定的なものであることが見い出された。これに加えて、ヘパリン添加試料およびマーキュラー療法中の患者からの試料を本願方法に使用することができ、これらは従来使用されていた機能試験では不可能だったものである。
最も簡単な場合、試料を希釈するのに用いる試薬はV因子を欠いているヒト血漿である。試料中のV因子を活性化した後、この因子を活性化タンパク質Cあるいは同様な挙動を示すプロテアーゼで破壊し、それから残留Va因子活性を測定する。
【0012】
最も簡単な場合、試料中のV因子の活性化、その破壊および検出反応は活性化タンパク質C(APC)を添加しながら試料の凝固開始を基とするものである。V因子欠損血漿(F.V−DP)で表わされる試料容量の割合を特別な試験法に対して最適化しなければならず、この割合は50〜95%、好ましくは60〜80%である。このことは、供試混合物合計について、血漿試料容量の割合は多くとも20%、好ましくは10%またはそれより少ない。それで、新規な方法は、凝固因子XII、XIおよびIXをまず活性化するAPTTの変法を基にすることができる。V因子を活性化するトロンビンの形成はAPCおよび塩化カルシウムの混合物を加えることにより開始される。APCの同時の存在の結果、Va因子が不活化され、凝血形成の速度の減速を生じる。V因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合を増加させると凝固時間の延長(V因子欠損血漿が原因である)を生じるが、タンパク質S欠損による影響の低下をきたす。それでV因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合が一旦約70%に達すると、正常血漿およびタンパク質S欠損血漿に対する凝固時間は同じであるが、正常血漿の凝固時間に関連する凝固時間の差異は、APCに対する安定性が増大する改変V因子を含む同型接合または異型接合血漿中であるとすれば、増加することが実施例2で実証される。このようにして、先行技術を用いる場合よりも二つの効果を識別することが実質的に一層容易になる。
【0013】
トロンボプラスチン時間(PT)をAPTTの代りに使用することもできる(実施例3)。PTを測定するのに用いるべき試薬はトロンボプラスチン、膜結合補因子、りん脂質および塩化カルシウムからなる混合物を含有する。この混合物を試料に添加すると、VII因子がまず自触反応で開裂してVIIa因子を形成する。VIIa因子は補因子としてのトロンボプラスチンと共にX因子の活性化の原因となり、次いでV因子を活性化する。この場合も、活性化タンパク質Cをトロンボプラスチン試薬として同時に加えると、凝固時間が延長される。しかし、Va因子がタンパク分解侵襲に対して更に抵抗性を有していると、この延長は左程著しいものではない。この短い活性化経路により凝固時間が非常に短いので、トロンボプラスチンの内容物を実施例3では希釈した。得られた凝固時間の延長はAPCの存在下に凝固時間の更に明瞭な延長をもたらす。これは正常血漿と改変血漿Vとを区別(シグナル/バックグラウンド比)する能力を改善する。実施例3では、またタンパク質S欠損により呈示される影響が、試料をV因子欠損血漿で希釈する程度を増大することにより作用中性化される。しかし、変法APTTによる場合よりも大きい程度に試料を希釈することが必要である。
【0014】
新規な方法はまたRVVT(ラッセルクサリヘビ毒液時間)の変法にも使用し得る。RVVTは蛇ラッセルクサリヘビの毒液からの酵素を用いることを基としている。この毒液は、タンパク分解で開裂することにより、ヒト凝固因子XおよびVを活性化するプロテアーゼを含有している。この方法はそれ自体既知であり、凝結の内外経路を迂回し、そして、ルプス診断およびX因子、V因子およびプロトロンビンの欠損の検出の両者に使用される(Thiagarajan, P. 等、1986年)。近年、タンパク質C/タンパク質Sの系での障害を測定するために、APTTを基とする試験と同様に、APCと関連した方法が使用されている。しかし、例えばタンパク質Sの欠損のような他の障害は、V因子の欠損で得られると同様の効果を生じ、その結果これらの異常はこの試験により相互に区別することができないというのも事実である。対照的に、実施例4では、異常は新規な方法を用いると特異的に区別することができ、この場合F.V−DPで表わされる試料容量の割合は好ましくは75%であることが実証されている。
【0015】
特別な区別を達成することに加えて、実施例5では、試料中のヘパリンはF.V−DPにヘパリン作用中和化物質を加えることにより作用中和化し得ることが実証されている。このことは、標準方法(APCT)と比較して、この方法の別の重要な利点である。それで、血栓症に罹っている患者に関する条件の関係を定めるのに特に関心がもたれている。しかし、これらの患者の大部分は抗凝血薬、通常ヘパリンで処置されている。
【0016】
ヘパリン投与後、血栓症に罹っている多くの患者にマーキュラー療法を施す。マーキュラー(marcurar=フェンプロクーモン)はビタミンK拮抗剤であり、この投与により凝固因子の不完全合成が誘起される。実施例6に記載の検討により、新規な方法はマーキュラー療法を受けている患者でのF.V欠損を検出するのに使用できる。
【0017】
活性化タンパク質Cを加える代替案として、タンパク質Cを非活性化形態で加えるか、あるいはV因子欠損血漿でタンパク質Cを用い、次にタンパク質Cが活性化される。この活性化は、ドイツ特許出願P 44 27 785.7(実施例7参照)にも開示されているように、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られたタンパク質C活性化剤を加えることによって起こさせることができる。
【0018】
例えばAPTT、PTおよびRVVTのような伝統的な凝固方法を用いる場合、凝固活性はクロット形成の機械的、機械光学的または光学的検出により測定する。新規な方法も例えば色素産生トロンビン基質の変換を測定することによるより最新の色素産生法と組み合わせることもできる。
【0019】
精製凝固因子からなる試薬系をF.V−欠損血漿の代りに使用することができる。第一の変換体と類似して、方法の原理は、Va因子がプロトロンビン活性化での律速因子であることに基づいている。APCが同時に存在していると活性化V因子が破壊されることとなり、結果として、凝固時間が延長される。従って、試料をV因子依存プロトロンビン活性化剤と接触させ、そして例えばラッセルクサリヘビの毒液から得られたV因子活性化剤と接触させ、そして添加プロトロンビンの活性化を例えばフィプリノーゲンの変換または色素産生方法の場合は色素産生トロンビン基質の変換のような凝固診断で知られている測定法を用いて測定する。
【0020】
例えば塩化カルシウムりん脂質のような凝固酵素にとって重要な補因子を供試混合物に加えるのが有用である。血漿中に存在するループス抗凝固剤(lupus anticoagulant)の効果を除くために、高濃度好ましくは0.3〜0.001%、特に好ましくは、0.001〜0.01%でりん脂質を加えるのもまた有用である。更に、りん脂質は、タンパク質Ca活性が発現するのを確保するのに、ホスファチジルエタノールアミンをある割合で含有していなければならない(Horie, S. 等1994年)。試料中のタンパク質Sの欠損および(または)欠損に因るものである測定結果との干渉を避けるために、タンパク質Sを0.1〜5U/ml(供試混合物を基として)の濃度範囲、特に好ましくは1〜2U/mlの範囲で含有することも試薬系には有用である。
【0021】
最後に、その濃度がつまるところ測定シグナルを調節する活性化タンパク質Cを加えることが必要である。普通、供試混合物中のAPC濃度は0.01〜1U/mlの範囲にある。それで、この試薬系は少なくとも成分、X因子、タンパク質S、プロトロンビン、凝固に必要なりん脂質、塩化カルシウム、活性化タンパク質Cあるいは非活性化タンパク質Cならびに、これとは別に、タンパク質C活性化剤を包含する。試薬系は単一試薬として組み合せて使用することもできるし、また、安定性を増大するために、例えば試薬1(X因子、タンパク質S、プロトロンビンおよびりん脂質からなる)および試薬2(活性化タンパク質Cおよび塩化カルシウムからなる)として別個の形態で使用することもできる。試料を試薬系と混合する。凝固は、APTTと同様に接触相の活性化の結果として、あるいはRVVを用いるX因子および(または)V因子の直接活性化により、あるいは例えば活性X因子もしくは蛇カーペットバイパー(Echis carinatus)の毒液からのエカリン(ecarin)のようなプロトロンビン開裂酵素の添加によるトロンビンの僅かな活性化により開始される。RVVまたはエカリンを用いて活性化を行った場合、これらの酵素は好ましくは出発試薬として試薬2でAPCおよび塩化カルシウムと一緒に使用する。次に、検出は、トロンビン特異的色素形成基質の変換によるトロンビン形成を測定することによって行うのが好ましい。
【0022】
更に、活性化タンパク質Cを用いる代りに、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られる活性化剤(この毒液は商品名ProtacR で商業上入手可能である)のような適当な活性化剤を用いて供試混合物中でまず活性化される非活性化タンパク質Cを使用することができる。それで、このような試薬系は例えば試薬1(タンパク質S、X因子、タンパク質C、プロトロンビンおよびりん脂質を含有する)および試薬2(ProtacR RVV、塩化カルシウムおよびトロンビン基質を含有する)からなる。試薬1は単にV因子欠損血漿であってもよく、この場合りん脂質は試薬2に含められる。内因性タンパク質Cの効果を拡充するために、試薬2を分割することもでき、試料および試薬1の混合物を試薬2a(ProtacR およびりん脂質からなる)と共にタンパク質Cを活性化させるためにプレインキュベートした後、RVVおよび塩化カルシウムを含む試薬2bを加えて凝固反応およびV因子安定性の検出反応を開始させることができる。この場合、りん脂質の添加は任意であり、そして色素産生性基質を更に加えるか否かは所望の評価技術にのみかかっている。
【0023】
更にまた、精製因子からなる試薬系において、X因子は例えば蛇毒液から得られる活性化剤のようなヒト以外のVa因子依存性プロトロンビン活性化剤(詳しくは、Rosing, J. およびTans, G. 1991年参照)で置換することができる。このものは活性化タンパク質Cと組み合せて、または供試混合物で活性化されるタンパク質Cと組み合せて活性化タンパク質Cに因るタンパク分解性分解に対する安定性が増大している血漿試料中のV因子を特定して検出するのに適している。それで試薬系は次の成分からなっていてよい。試薬1はタンパク質S、タンパク質C、プロトロンビンおよびりん脂質からなり、また試薬2はProtacR RVVまたはRVV−V(V因子のみを活性化するRVVからのプロテアーゼ)、V因子依存性プロトロンビン活性化剤、塩化カルシウムおよびトロンビン基質からなり、あるいはまた試薬3としてトロンビン基質からなる。
【0024】
APTTを基とする試薬系は実施例8に述べるように試料中のVIII因子の濃度に依存している。意外にも、生理学的濃度(0.7〜1.4単位/ml)でVIII因子を含有しているV因子欠損血漿は、VIII因子を含有していない欠損血漿よりも試料中のVIII因子の濃度に左程依存していないことが見い出された。これによって、高含量でVIII因子を有する正常血漿と正常含量でVIII因子を有するV因子疾患血漿とを区別することが一層容易になる。この理由に因り、V因子欠損血漿および(または)VIII因子を0〜4U/mlの濃度、特に好ましくは0.7〜1.3U/mlの濃度で含有しているか、またはそのように補完した試薬を、APTTを基とする試薬系で使用するのが好ましい。
【0025】
【実施例】
次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、特許請求の範囲を限定するものではない。
次の略号を使用する。
APCT 活性化タンパク質C時間
APCV V因子欠損血漿と試料とを混合した時の活性化タンパク質C時間
APTT 活性化部分トロンボプラスチン時間
Arg アルギニン
F.V−DP ヒトV因子欠損血漿
F.V疾患 V因子中の506位でのアミノ酸交換Arg→Gln
Gln グルタミン
PC−DP ヒトタンパク質C欠損血漿
PS−DP ヒトタンパク質S欠損血漿
RVVT ラッセルクサリヘビ毒液時間
SHP 標準ヒト血漿(正常ヒト血漿のプール)
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
【0026】
実施例1
F.V疾患または類似の欠損症の機能的検出に関する先行技術の限界
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke;Behringwerke A.G., Marburgから入手)を用いて測定した。試薬はすべてBehrinhwerke AGから入手した。SHPを健康供血者からの血漿プールとして用いた。
APTTは次のプロトコールに従って測定した。ヒト胎盤から得られたりん脂質5mlについて、PathromtinR 1バイアルを界面活性剤としてカオリンの懸濁液5mlに溶解した。塩化カルシウム溶液(25mM)を使用前+37℃に加温した。次のものを測定管に連続して注入した。
PathromtinR 100μl
血漿試料 100μl
混合物を2分間+37℃でインキュベートし、塩化カルシウム溶液100μlを加えて凝固時間が開始した。凝固時間を405nmで測定した。
【0027】
APCTは、Behringwerkeから入手したAPC感作試薬を用いて測定した。APTTのときと同様にして活性化試薬を調製した。出発試薬は塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Cからなり、これを蒸留水5mlに溶解し、使用前に+37℃に加温した。
次のものを測定管に連続して注入した。
PathromtinR 100μl
血漿試料 100μl
混合物を2分間+37℃でインキュベートし、出発試薬100μlを加えて凝固時間が開始した。凝固時間を405nmで測定した。
【0028】
APTTおよびAPCTは次のとおりのヒトクエン酸添加血漿で測定した。すなわち、健康供血者(SHP)からのプール、タンパク質C欠損血漿(PC−DP)またはタンパク質S欠損血漿(PS−DP)、および同型接合F.V疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠損、すなわち血漿中のV因子の約50%が無傷の形態で存在し、約50%がF.V疾患形態で存在している欠損に擬するために、同型接合F.V疾患血漿をSHPと1:1で混合した。
【0029】
得られた凝固時間およびSHPで得られた凝固時間と比較したAPCTの差異を表1に示す。APTTについての値はいずれもAPCTを実施するのに必須の正常範囲(≦40)内にある。APCTにおいて、正常血漿で得られる凝固時間よりも短いこれらの凝固時間は病的である。このことはタンパク質C欠損の場合には適用されない。APCTでは活性化タンパク質Cを外因で加えるために、試料中のタンパク質Cは試験には効果を有するもとがない。一方、タンパク質Sの欠損は凝固時間の短縮を生じ、この時間はこの場合異型接合F.V疾患欠損の場合よりも更により顕著である。APCTの短縮は同型接合F.V疾患の場合最も著しい。タンパク質S欠損の効果と同型接合F.V疾患の効果との間にごく僅かの差異のみがある。実際のところ、この差異は更に一層ぼんやりとしてくる。その理由はV因子およびVIII因子の連続変性があり、その程度は血液サンプルの除去と測定との間に経過する時間に左右される。この因子変性により、観察される凝固時間の短縮を防げるような凝固時間の延長が生じる。
従って、従来利用可能な方法、すなわちAPCTは活性化タンパク質Cに対する安定性が増大するF.V疾患またはV因子中の類似の欠損を特異的に検出するのに適していない。
【0030】
【表1】
Figure 0003687864
【0031】
実施例2
修正APTTに基づく新規な方法の最適化
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke;Behringwerke AG,Marburgから入手)を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。SHPを健康供血者からの血漿プールとして用いた。
【0032】
凝固時間を測定するために、PathromtinR 5ml入りの1バイアルをカオリン懸濁液5mlに溶解した。出発試薬はAPC感受性試薬(塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Cを含有)からなり、蒸留水5mlに溶解し、使用前+37℃に加温した。V因子欠損血漿を蒸留水1mlに溶解した。
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料 xμl
F.V−DP yμl
PathromtinR 100μl
【0033】
混合物を次いで+37℃で3分間インキュベートし、そして凝固時間は出発試薬100μlを加えて開始した。凝固時間を405nmで測定した。容量xおよびyを総量(x+y)が正確に100μlとなるように、選択した。凝固時間は次のとおりのヒトクエン酸添加血漿で測定した:健康供血者(SHP)からのプール、タンパク質C欠損血漿(PC−DP)またはタンパク質S欠損血漿(PS−DP)、および同型接合F.V疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠損、すなわち血漿中のV因子の約50%が無傷の形態で存在し、約50%がF.V疾患形態で存在する欠損に擬するために、同型接合F.V疾患血漿をSHPと1:1で混合した。
【0034】
得られた凝固時間ならびにSHPで得られた凝固時間と関連した凝固時間の差異を表2に列記する。F.V−DPで表わされる試料容量の比が増大するにつれた、V因子の欠損が増大するために、凝固時間がより長くなる。しかしながら、SHPとPC−DPとの差異が事実上変わらないままである間、SHPとPC−DPとの隔たりは連続して低減し、また供試混合物中のF.V−DPの比が一旦約70%に達すると、差異は最早や検知できなくなる。従って、試料中のタンパク質Sの欠損がF.V−DP中のタンパク質Sで十分になくなることになる。しかし、同型接合または(擬似)異型接合F.V疾患欠損を有する血漿は正しく反対の挙動とする。これらの場合、SHPで得られた凝固時間と比較した凝固時間の差異が増加する。それ故、新規な方法はPS欠損の効果をなくするだけでなく、F.V疾患によって生じる効果を増巾することが可能である。このことはまた、血漿試料を比較的長期間保存することに因る障害により、従前の方法を用いた事例の如く(実施例1)PS欠損とF.V欠損との差異が容易にはあいまいなものとならないことを意味している。更に、PS効果が当然になくなるので、抗−PS自己抗体がこの方法で作用中性化されることが期待される。更に、PCまたはPC/PSりん脂質複合体に対する自己抗体は、試料をF.V−DPで高度に希釈する場合、希釈の結果としてほとんど検出し得るものではない。
【0035】
【表2】
Figure 0003687864
【0036】
実施例3
修正トロンボプラスチン時間に基づく新規な方法の最適化
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A. Behringwerke;Behringwerke AG Marburgから入手)を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。SHPを健康供血者から血漿プールとして用いた。
凝固時間を測定するために、ThromboplastinR 、ヒト胎盤からのPT試薬を製造業者の指示に従って蒸留水に溶解し、この溶液を次に50mM tris/HCl、0.01%Phospholipon-25(大豆からのりん脂質混合物)、10mM塩化カルシウム、0.4U/ml APCからなるpH7.4の緩衝液で1:2000に希釈した。使用前試薬を+37℃に加温した。V因子欠損血漿を蒸留水1mlに溶解した。
【0037】
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料 xμl
F.V−DP yμl
ThromboplastinR 1:2000 100μl
混合物を次いで+37℃で3分間培養し、そして凝固時間は出発試薬100μlを加えて開始した。凝固時間を405nmで測定した。
容量xおよびyを、総量(x+y)が正確に100μlとなるように、選択した。このような状態では、F.V−DPの0μlを含有する可変体がトロンボプラスチン時間に基づくAPCTの可変体に対応する。凝固時間を実施例2と同じ試料で測定した。
表3には、得られた凝固時間およびSHPで得られた凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記する。
【0038】
F.V−DPで表わされる試料容量の比が増大するにつれて、V因子の欠損が増大するために凝固時間が長くなる。しかし、F.V−DPで表わされる試料容量の比が75%となったとしても、タンパク質Sの効果を完全に作用中性化することはできず、その結果更に高い濃度を使用しなければならなくなる。更に、緩衝化物質、イオン強度およびりん脂質濃度を適切に選択することによって、反応性を最適化する余地がなお存在する。それにも拘らず、PS−DPおよび同型接合と異型接合F.V疾患双方についての凝固時間の差異が更に大きくなること、およびそれ故に、新規な方法を用いた場合、PTを基にしていたとしても、タンパク質C/PS系の2種の障害に差異を生じることがより容易となることがわかる。
【0039】
【表3】
Figure 0003687864
【0040】
実施例4
修正RVV時間に基づく新規な方法の最適化
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke;Behringwerke AG Marburgから入手)を用いて測定した。オーストラリア、Gradiporeからの試薬LA-ConfirmR をRVV試薬として用いた。その他の試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。
凝固時間を測定するために、LA-ConfirmR 2ml入りの1バイアルをAPC感受性試薬(塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Cを含有)からの出発物質2mlに溶解し、そしてこの溶液を使用前+37℃に加温した(=RVV/APC試薬)。V因子欠損血漿を蒸留水1mlに溶解した。
【0041】
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料 xμl
F.V−DP yμl
そして凝固時間はRVV/APC試薬100μlを加えて開始した。凝固時間を405nmで測定した。容量xおよびyを、総量(x+y)が正確に100μlとなるように、選択した。このような状態では、F.V−DPの0μlを含有する可変体がトロンボプラスチン時間に基づくAPCTの可変体に対応する。凝固時間を実施例2と同じ試料で測定した。
【0042】
表4に、得られた凝固時間およびSHPで得られた凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記する。その他の試験可変体の如く(実施例2および3)、試料容量中のF.V−DPの割合が増加するらにつれて、凝固時間が更に長くなる。タンパク質C欠損血漿は常にSHPと比べると長くなっている。SHPとタンパク質S欠損血漿との差異はF.V−DPの割合の増加に伴って小さくなるけれどもF.V疾患の効果はより大となる。PTに基づく試験可変体(実施例3)と同様に、タンパク質S欠損はここに列記されているF.V−DPの割合を用いては完全に作用中性化されず、その結果F.V−DPの割合は70%よりも大であるように選択されなければならない。しかし、F.V疾患(同型接合または異型接合のいずれでも)を有する血漿とタンパク質S欠損または欠陥を有する血漿との差異は更に顕著なものとなり、その結果更にRVVTを基として新規な方法により、タンパク質C/タンパク質Sの系の他の障害から活性化タンパク質Cに対してより安定なV因子を識別する能力が増大される。
【0043】
【表4】
Figure 0003687864
【0044】
実施例5
V因子欠損血漿に添加することによるヘパリンの作用中性化
ヘパリンはHoffman-La Roche, Grenzach-Wyhlen, (LiquemineR 25000)から入手し、PolybreneはEga-Chemie, Steinheimから入手した。その他の試薬および装置はBehringwerke AGから入手した。
【0045】
ヘパリンを標準ヒト血漿およびV因子疾患欠損を有する血漿に加え、試料容量中75%のF.V−DP割合を用いて、実施例2に記載の如く、凝固時間を新規な方法で測定した。更に、Polybreneを10μg/mlの比で試料中のヘパリンの作用中性化のためにV因子欠損血漿に加えた。表4には、ヘパリン0〜2U/mlの存在下様々の試験可変体で得られた凝固時間を列記する。F.V−DPがヘパリン作用中性化添加物を含有していない場合、ヘパリンが0.2U/mlより高い濃度で存在すると、凝固時間はヘパリン無しの試料の時間よりも著しくはずれたものとなる。F.V−DPにPolybrene 10μl/mlを添加すると、2U/mlまでのヘパリンの存在下でもV因子欠陥を測定することが可能となる。このことは、先行技術とは対照的に、ヘパリン添加試料中でも、F.V疾患欠損が測定可能となることを証するものである。
【0046】
【表5】
Figure 0003687864
【0047】
実施例6
マーキュマー(=フェンプロクーモン)療法を受けている患者の血漿中のF.V欠損の測定
マーキュマーまたはヘパリンを投与されていない患者からの9本の血漿および血栓症に伴うマーキュマー療法を受けている患者からの6本の血漿のAPCTを、実施例2による血漿試料のAPCVの如く、75%の試料容量中のF.V−DPの割合を用いて、実施例1に従って測定した。
【0048】
得られた凝固時間を表6に列記する。結果をSHPで得られた凝固時間(=100%)に関連して%に換算した。両方の試験で、100%限界以下にある試料は正である。両方の試験で、非マーキュマー投与血漿は正であった。すなわち、100%限界より下にあることがわかった;対照的に、マーキュマー投与血漿はいずれもAPCTで負であったが、6本のうち5本の血漿は新規な方法(APCV)ではこの限界よりも明らかに下であった。F.V−DPと混合した結果、マーキュマー投与血漿中のすべての欠損、ビタミンK依存性酵素を置換する。これらの血漿を正常の血漿と混合した場合にも、凝固時間が短縮された(表6)。しかし、このようにして置換が行われている試料を用いるAPCTで正の試料を同定可能とするのには、これは十分ではない。従って新規な方法は従来の方法よりもすぐれている。
【0049】
【表6】
Figure 0003687864
【0050】
実施例7
添加V因子欠損血漿中タンパク質Cの活性化によるF.V欠損の測定
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke;Behringwerke A.G., Marburgから入手)を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。
凝固時間を測定するために、Behringwerkeからのタンパク質C試薬用のタンパク質活性化物質試薬1バイアルをPathromtinR SL(シリカをベースとするAPTT試薬;5.5ml)1バイアルの内容物に溶解した。この試薬および塩化カルシウム溶液(25mM)を使用前に+37℃に加温した。V因子欠損血漿を蒸留水1mlに溶解した。
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料 xμl
F.V−DP yμl
タンパク質C活性化物質/PathromtinR SL混合物100μl
【0051】
次に混合物全体を3分間+37℃でインキュベートし、そして出発試薬100μlを加えて凝固時間を開始させた。凝固時間を405nmで測定した。
容量xおよびyを総容量(x+y)が正確に100μlとなるように選択した。このような状態では、F.V−DPの0μlを含む可変体は、ドイツ特許出願P 44 27 785.7に記載の如く、タンパク質C/タンパク質Sの系の障害についての新規なスクリーニング試験に相当する。凝固時間は実施例2と同じ試料で測定した。
【0052】
表7には、得られた凝固時間およびSHPで得られた凝固時間に関連した凝固時間の差異を列記する。その他の試験可変体の如く(実施例2〜4)、試料容量中のF.V−DPの割合が増大するにつれて、凝固時間が更に長くなった。F.V−DPの割合が増大するにつれてSHPとタンパク質S欠損血漿との差異がより小さくなるが、F.V疾患の効果はより大となる。タンパク質Sの不足の効果は、試料容量中のF.V−DPの割合が70%であるときに、作用中性化される。これらの結果は、実施例2〜4で実証した新規な方法の適用と同等の状態にあるが、この場合活性化タンパク質Cを添加しなかったけれども、代りに非活性化タンパク質Cを加え、次に供試混合物中で活性化した。
【0053】
【表7】
Figure 0003687864
【0054】
実施例8
VIII因子をV因子欠損血漿に添加することによるAPTT依存法での試料中のVIII因子の効果の低減
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke;Behringwerke AG Marburgから入手)を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。BeriateR、すなわちBehringwerkeからのヒトVIII因子の濃縮物をVIII因子の源として用いた。
試験は、試料とV因子欠損血漿とを25:75の比で混合して、実施例2に記載の方法で実施した。加熱不活性化ヒト血漿をV因子欠損血漿として用いた。V因子およびVIII因子共にこの不活性化で破壊された。比較のために、この血漿を溶解後BeriateR を用いて1単位/mlの濃度にVIII因子を補完した。更に、SHPをBeriateR からVIII因子を補完し、その結果SHP中のVIII因子の含量は1〜4単位/mlとなった。異型接合V因子疾患欠損を伴うヒト血漿を比較のために新規な方法で測定した。
【0055】
表8には、凝固時間およびVIII因子補完を伴うかまたは伴わないV因子欠損血漿を用いて得られた、VIII因子1単位/ml含有SHPで得られた凝固時間に関連して凝固時間の差異を列記する。VIII因子を含有しない欠損血漿を用いると、正常血漿での凝固時間は血漿中のVIII因子の含量が増加するにつれて短くなり、V因子疾患欠損を伴うが、VIII因子の正常な含量を有する血漿で得られる凝固時間に近くなる。一方、V因子欠損血漿がすでにVIII因子1U/mlを含有していると、試料中のVIII因子の含量に因る凝固時間の短縮は無視してよいものとなる。
このことは、APTTを基とする試験デザインでは、VIII因子の添加によるか、あるいはVIII因子含有試薬の使用によるVIII因子のレベルの上昇に因って試料が誤って正と同定されるのを防止し得ることを実証するものである。
【0056】
【表8】
Figure 0003687864

Claims (43)

  1. 生物体液の試料でタンパク分解性分解に対する活性化凝固V因子の安定性を定性検出し、また定量測定する方法において、次の工程
    a) 試料を、正常ヒト血漿と比較して機能性V因子の含量が減少している試薬Aと混合し、
    b) 試料のV因子活性化のための試薬Bを添加し、
    c) 試料の活性化V因子をタンパク分解性分解のための試薬Cを添加し、
    d) Va因子残留活性を、トロンビンを形成するプロトロンビンの活性化により、測定するための試薬を添加し、
    而して試料容量で表わされる総試験容量の割合が多くとも20%であるものとする、
    を包含することを特徴とする上記方法。
  2. 試薬Aがヒトまたは動物由来のV因子欠損血漿である請求項1記載の方法。
  3. V因子の欠損が機能欠損と解され、これにより実際に減少しているV因子の含量を有する血漿およびV因子を含有するものの、そのV因子が使用される活性化操作で活性化されない血漿の両者が可能となる請求項1または2の少なくとも一項記載の方法。
  4. 血漿中のV因子の含量の減少が供給者の遺伝上の欠損または欠陥に因る請求項3記載の方法。
  5. 血漿中のV因子の含量の減少が、適当な高親和性の結合パートナーへの吸着により生じる請求項3記載の方法。
  6. 使用する血漿のV因子がV因子を変性する熱処理を使用することにより不活性化される請求項3記載の方法。
  7. 使用する血漿の機能性V因子が、V因子またはVa因子を特異的に不活性化するタンパク分解酵素による処理によって減少されている請求項3記載の方法。
  8. 血漿中に存在するV因子が試薬Bにより活性化されない請求項3記載の方法。
  9. V因子の活性化可能な機能含量がヒト血漿の<1と50%との間である請求項2記載の方法。
  10. 試料と混合後のV因子欠損血漿の割合が50〜95%の範囲にある請求項1および2記載の方法。
  11. V因子欠損血漿がヘパリンの作用中性化のための添加物を含有することができる請求項1および2記載の方法。
  12. V因子欠損血漿がPolybreneを2〜50mg/リットルの間の濃度で含有する請求項11記載の方法。
  13. 試料と混合する試薬がV因子と同一ではない個々の酵素もしくは補助因子、または酵素および補助因子のいくつかを含む水、生理食塩水、または適当な緩衝液である請求項1記載の方法。
  14. 反応試薬がタンパク質Sの適当な濃縮物を、試料と混合後の濃度を基にして0.1〜5U/mlの濃度範囲で含有する請求項13記載の方法。
  15. 反応試薬がX因子の適当な濃縮物を、試料と混合後の濃度を基にして0.2〜5U/mlの濃度範囲で含有する請求項13記載の方法。
  16. 反応試薬が適当な濃度のプロトロンビンを、試料と混合後の濃度を基にして0.5〜10U/mlの濃度範囲で含有する請求項13記載の方法。
  17. 試薬がりん脂質を、試料と混合後の濃度を基にした濃度が0.3〜0.001%の範囲で含有する請求項13記載の方法。
  18. 試料と混合する試薬が請求項14〜17記載の添加物の1種またはそれより多くを含有する請求項1および13〜17のいずれか一項記載の方法。
  19. 試料のV因子を直接または間接に活性化することができる請求項1記載の方法。
  20. V因子をヒトまたは動物由来の適当に活性化する酵素を添加することにより直接活性化することができる請求項19記載の方法。
  21. トロンビンをヒト由来の酵素として使用する請求項20記載の方法。
  22. 蛇毒液からのV因子活性化剤をヒト以外の由来の酵素として使用する請求項20記載の方法。
  23. 試料のV因子を、活性化部分トロンボプラスチン時間の原理に従って、界面活性剤、りん脂質およびカルシウムイオンを用いて接触相を活性化することによって凝固カスケードを作動させることにより、間接的に活性化することができる請求項19記載の方法。
  24. 試料のV因子を、トロンボプラスチン時間の原理に従って、トロンボプラスチン、りん脂質およびカルシウムイオンの添加により凝固カスケードを作動させることにより間接的に活性化することができる請求項19記載の方法。
  25. 試料のV因子を、例えば蛇カーペット・バイパー(Echis carinatus)の毒液から得られるトロンビン活性化物質の添加によりプロトロンビンを活性化することによって間接的に活性化することができる請求項19記載の方法。
  26. 試料中の活性化V因子をヒトまたは動物由来のタンパク分解酵素の添加により分解する請求項1記載の方法。
  27. 活性化V因子をヒトタンパク質Cにより分解する請求項26記載の方法。
  28. ヒトタンパク質Cを、すでに活性化された形態であるとき、供試混合物に供試混合物を基にして0.01〜1U/mlの濃度で添加する請求項27記載の方法。
  29. ヒトタンパク質Cを非活性化形態で加えるか、またはV因子欠損血漿中のタンパク質Cを供試混合物で最初に活性化する請求項2および27の少なくとも一項記載の方法。
  30. 試薬の少なくとも1種がタンパク質C活性化酵素を含有し、この酵素が試料およびヒト、非活性タンパク質Cと接触し、後者を活性化する請求項1または29の少なくとも一項記載の方法。
  31. マムシ(Agkistrodon)属の蛇の毒液からの酵素をタンパク質Cの活性化に好ましく使用する請求項30記載の方法。
  32. 供試混合物中のVa残留活性を、トロンビンを形成するプロトロンビンの活性化を測定することにより測定する請求項1記載の方法。
  33. トロンビン活性を機械的、光学的または光学機械的方法を用いてフィブリノーゲンの変換を測定することによって測定し、そしてフィブリノーゲンは試料または試料を混合する試薬から由来する請求項1および32の少なくとも一項記載の方法。
  34. トロンビン活性を、トロンビン特異性で色素産生基質の変換を光学的検出により測定することによって測定する請求項33記載の方法。
  35. プロトロンビンを、Va因子により刺激されることができるプロトロンビン活性化剤によって開裂する請求項1、13〜18および32の少なくとも一項記載の方法。
  36. 使用されるプロトロンビン活性化剤がヒトおよびヒト以外の由来であることができる請求項35記載の方法。
  37. X因子がヒトプロトロンビン活性化剤として使用する請求項36記載の方法。
  38. ウシプロトロンビン活性化剤をヒト以外のプロトロンビン活性化剤として使用する請求項36記載の方法。
  39. 請求項1記載の工程を得られた混合物をインキュベートする期間中断するか、あるいはインキュベーション相が工程内で生じることができる請求項1記載の方法。
  40. 試薬を結合することにより、試料が3種の試薬、2種の試薬、または必要成分全てを含有する1種の試薬と接触する請求項1記載の方法。
  41. 蛇毒液からのプロトロンビン活性化剤をヒト以外のプロトロンビン活性化剤として使用する請求項36記載の方法。
  42. 請求項3〜7のいずれか一項記載の方法に従って調製されたV因子欠損血漿がVIII因子を0〜4U/mlの濃度範囲で含有するか、あるいは精製VIII因子を添加することによってかかる濃度が得られるよう補完する請求項3〜7のいずれか一項記載の方法。
  43. 試薬が、試料と混合後0.01〜2単位/mlの濃度範囲にある濃度でVIII因子を含有し、ここで1単位とは正常ヒト血漿1ml中に存在する量と定義される請求項13記載の方法。
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