ES2157295T5 - Metodo para diagnosticar trastornos de la coagulacion de la sangre. - Google Patents
Metodo para diagnosticar trastornos de la coagulacion de la sangre.Info
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Abstract
SE PROPORCIONA UN METODO Y UN ACCESORIO PARA CRIBAR UN PLASMA SANGUINEO PARA UN COFACTOR APC. EL METODO COMPRENDE: (I) INCUBAR UNA PRIMERA PORCION DE LA MUESTRA CON (A) UN REACTIVO EXOGENO QUE CONTENGA FOSFOLIPIDO QUE ACTIVE EL MECANISMO DE CONTACTO EN LA COAGULACION INTRINSECA O UN REACTIVO EXOGENO QUE INICIE LA COAGULACION EXTRINSECA; E INCUBACION DE UNA SEGUNDA PORCION DE LA MUESTRA CON (B) EL REACTIVO DEL PASO (I) (A) Y UN ACTIVADOR DE PROTEINA C (PC) EXOGENA QUE PRODUZCA PC ACTIVADO (APC) A PARTIR DE LA PROTEINA C Y LA PROTEINA S ENDOGENO. (II) AÑADIR A CADA UNA DE LAS DOS PORCIONES UN AGENTE DE COAGULACION Y MONITORIZAR LA VELOCIDAD DE CONVERSION DE FIBRINOGENO A FIBRINA INSOLUBLE; Y (III) CALCULAR EL INDICE DE TIEMPO VELOCIDAD DE SEGUNDA PORCION DE LA MUESTRA CON LA VELOCIDAD DE LA PRIMERA PORCION Y COMPARAR ESTE INDICE CON EL INDICE CORRESPONDIENTE DE MUESTRAS DE SUJETOS NORMALES.
Description
Método para diagnosticar trastornos de la
coagulación de la sangre.
La presente invención se refiere a un nuevo
método útil para los estudios de detección y el diagnóstico de
enfermedades tromboembólicas, tales como la trombofilia hereditaria.
La invención se puede utilizar también para determinar el riesgo de
trombosis en mujeres embarazadas, pacientes sometidos a cirugía y
sujetos que toman fármacos anticonceptivos.
La coagulación de la sangre comprende un sistema
complejo de proenzimas, enzimas y cofactores interrelacionados que
reaccionan en las superficies de las plaquetas activadas y las
células endoteliales. Cuando el sistema se activa el resultado final
es la formación de un coágulo sanguíneo que contiene fibrina
insoluble. La iniciación y la terminación de la formación de
fibrina está cuidadosamente regulada en la homeostasis normal. In
vitro, las superficies de las plaquetas y las células
endoteliales se sustituyen habitualmente con fosfolípidos
adecuados. Para la invención, la parte relevante del sistema de
coagulación es la que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
La Proteína C es un zimógeno que puede ser
activado in vitro por la trombina (Factor IIa) sola, la
combinación trombina-trombomodulina, una fracción de
ciertos venenos de serpientes tales como Agkistrodon Contortrix
Contortrix o el Factor Xa purificado. La activación de la
Proteína C endógena de una muestra de plasma o la adición de
Proteína C activada de forma exógena a una muestra de plasma en
presencia de Proteína S (PS) y el cofactor de la Proteína C
Activada (abreviada APC, del inglés Activited Protein
C) neutraliza los Factores Va y VIIIa y conduce a tiempos de
coagulación sanguínea prolongados en las muestras de plasma de
individuos sanos. Los Factores V y VIII se activan mediante
pequeñas cantidades de trombina o Factor Xa. La Proteína S es un
cofactor de la Proteína C. Se encuentran deficiencias homocigóticas
o heterocigóticas hereditarias en Proteína C, Proteína S y
Antitrombina III (ATIII, un inhibidor de los factores XIa, IXa, Xa
y Trombina) en aproximadamente 10 - 15% de los pacientes con
enfermedad tromboembólica diagnosticada antes de los 40 años. Las
deficiencias homocigóticas en las Proteínas C y S suponen una
amenaza para la vida y los individuos afectados desarrollan
trombosis microvascular generalizada y púrpura fulminante en el
período neonatal.
Las deficiencias en las Proteínas C y S y en
ATIII se miden tanto por métodos funcionales como inmunológicos. Un
medio de determinar la actividad de la Proteína C funcional implica
las etapas de mezclar la muestra de plasma a ensayar con un exceso
de plasma humano deficiente en Proteína C, añadir un activador de
la Proteína C y controlar la adecuada conversión del sustrato. Se
han utilizado sustratos alternativos para enzimas tales como la
trombina y el Factor Xa; sus actividades están influenciadas por la
actividad de la Proteína C activada (es decir, las actividades
enzimáticas que son generadas o moduladas por la APC). En
determinados casos los ensayos con Proteína C han implicado el
aislamiento del zimógeno y la subsecuente activación y adición al
sustrato de la forma activada.
Para determinar la actividad funcional de la
Proteína S en una muestra de plasma el método más común implica
mezclar la muestra de plasma con Proteína C activada, un exceso de
plasma deficiente en Proteína S y otros reactivos necesarios para
conseguir la coagulación (Waart et al., Thromb. Res. 48,
427-37 (1987); Suzuki et al., Thromb. Res.
49, 241-51 (1988); Bertina et al., Thromb.
Haemost. 53, 268-72 (1985); y Comp et al., J.
Clin. Invest. 74, 2084-88 (1984)). Se ha sugerido
también medir la Proteína S incubando la muestra de plasma con
Factor IXa y Proteína C activada y midiendo el tiempo de
coagulación o la conversión de un sustrato cromogénico de la
trombina (Documento
WO-A-9101382).
Además de las anormalidades de la Proteína C y la
Proteína S se ha demostrado (Dahlback B, Carlsson M y Svensson BJ.
Proc. Natl Acad Sci 1993; 90:1004-08) que la
anormalidad más común en la trombofilia hereditaria implica al
cofactor de la APC.
Este cofactor forma parte de la molécula del
Factor V acelerador, que forma con la APC un inhibidor que destruye
el Factor Va y el Factor VIIIa, regulando así el mecanismo de la
coagulación y previniendo la trombosis. La anormalidad en la
molécula del Factor V que predispone a la trombosis se debe
habitualmente a una mutación de transición que tiene como resultado
la sustitución de la Arg^{506} por Gln^{506}, conocida como
Factor V Leiden.
En la publicación anteriormente citada de
Dahlback et al. se describía una prueba in vitro
específica para la detección del cofactor de la APC en muestras de
plasma humano tal como se indica a continuación:
Una muestra de plasma obtenida del sujeto se
incubó durante 5 minutos con
- (a)
- un reactivo exógeno (1) que activa el mecanismo de coagulación intrínseco seguido de la adición de cloruro cálcico (2) para completar la reacción de coagulación, y separadamente con
- (b)
- el mismo reactivo exógeno (1) en el cual la reacción de coagulación se completó mediante la adición de cloruro cálcico que contenía una preparación exógena de APC (3).
La etapa (a) se conoce como un tiempo de
tromboplastina parcial activada (abreviado APTT debido a su
expresión en inglés Activated Partial
Thromboplastin Time) normal. La etapa (b) es un APTT
con la adición de APC. Éste último elude el mecanismo inhibitorio
que implica a la Proteína C y la Proteína S. Los tiempos de
coagulación de una muestra en la etapa (a) variarán entre 25
segundos y 45 segundos dependiendo del tipo de agente activador
exógeno (reactivo de APTT). En presencia del cofactor normal de la
APC el tiempo de coagulación en la etapa (b) se prolongará.
Dahlback expresó esto como una relación entre b/a, que es una
relación APC.APTT/APTT. En las personas normales la relación varía
de 2,0 a 4,0 y en los pacientes con defectos heterocigóticos u
homocigóticos en el cofactor de la APC la relación es menor que 2,0.
Así, para el diagnóstico de los diversos defectos en la trombofilia
en los que está implicada la Proteína C es necesario llevar a cabo
tres ensayos separados: un ensayo de Proteína C, un ensayo de
Proteína S y un ensayo del cofactor de la APC. El ensayo del
cofactor de la APC solo no detectará la presencia o ausencia de PS
y
PC.
PC.
Para medir correctamente la relación
APC.APTT/APTT en pacientes que reciben tratamiento para trombofilia,
se ha propuesto, por ejemplo por Jorquera et al., Lancet
1994, vol. 344, pag. 1162-3, diluir la muestra de
plasma 1:5 en plasma empobrecido en Factor V.
La Proteína C puede ser activada por una fracción
del veneno de la serpiente A. Contortrix Contortrix, que es
conocido como un activador de la Proteína C (abreviado PCA, del
inglés Protein C Activator), y cuando se añade
PCA a plasma normal, el mecanismo inhibidor en el que están
implicadas la PC, la PS y el cofactor de la APC se inicia mediante
la PC, la PS y el cofactor de la APC endógenos. El documento WO
94/17415 describe un ensayo para la actividad de la APC que es
similar al ensayo del cofactor de la APC arriba descrito extraído
de la publicación de Dahlback et al., excepto en que se
añade una mezcla de PCA - cloruro cálcico para completar la reacción
de coagulación en lugar de una mezcla de APC - cloruro cálcico. El
documento EP-0236985 describe un método
espectrofotométrico para la determinación de la actividad de la
Proteína C o de la Proteína S en una muestra de plasma basado en la
medida de la cantidad de trombina producida en la activación de
Proteína C endógena con un PCA exógeno.
La presente invención proporciona un ensayo de la
presencia o ausencia del cofactor de la APC en muestras de plasma
humano en las que los niveles de PC y PS son normales según los
ensayos. Detectará también defectos homocigóticos de PC y PS y la
mayor parte, aunque no todos, los defectos heterocigóticos en la PC.
Las muestras analizadas son de plasma humano.
La invención proporciona un método de detección
in vitro para la exclusión de trastornos en el cofactor de la
APC como causa de trombofilia en un sujeto, como por ejemplo un
sujeto humano, o para determinar el riesgo de desarrollar
trombofilia en un sujeto.
De acuerdo con la invención, se proporciona un
ensayo de la deficiencia en el cofactor de la APC para determinar si
una muestra de plasma sanguíneo en la que los niveles de proteína C
y proteína S son normales según los ensayos es deficiente en el
cofactor de la APC, que comprende:
- (i)
- incubar una primera porción de la muestra, preferiblemente a 37ºC, con
- a)
- un reactivo exógeno que contiene un fosfolípido que activa el mecanismo de contacto en la coagulación intrínseca (un reactivo de APTT) o un reactivo exógeno que inicia la coagulación extrínseca (un reactivo de tiempo de protrombina (PT, del inglés Prothrombine Time)), e incubar una segunda porción de la muestra con
- b)
- el reactivo de la etapa (i) (a) y un activador exógeno de la Proteína C (PC) que produce PC activada (APC) a partir de Proteína C y Proteína S endógenas;
luego (ii)
\;añadir a cada una de las dos porciones incubadas un agente coagulante, tal como una sal divalente o trivalen-{}\hskip1,5cm te, preferiblemente cloruro cálcico, y controlar la velocidad de conversión del fibrinógeno en fibrina insolu-{}\hskip1,5cm ble por ejemplo manualmente o con un instrumento mecánico, fotoeléctrico o nefelométrico; y
- (iii)
- calcular la relación entre la velocidad de conversión en la segunda porción de la muestra y la velocidad de conversión en la primera porción y comparar esta relación con la relación correspondiente a las muestras de sujetos normales.
- Se alude a esta relación como la relación PCA.APTT/APTT o la relación PCA.PT/PT.
La invención es un método in vitro
utilizado como un ensayo de detección para eliminar defectos en el
cofactor de la APC que podrían dar lugar a la trombofilia. Los
defectos en el cofactor de la APC tienen una probabilidad de
aparición menor que 5% en la población normal. Se cree que el método
de la invención exhibe una discriminación mayor que los ensayos de
la técnica anterior, tales como el ensayo del cofactor de la
APC.
Se ha encontrado que la relación PCA.APTT en
individuos normales es superior a 2,0 y puede llegar hasta 10,0,
mientras que las relaciones PCA.APTT en caso de defectos en el
cofactor de la APC varían entre 2,0 y 1,0. Estos valores pueden
presentar ligeras variaciones con diferentes reactivos de APTT y
diferentes instrumentos, y el límite inferior de normalidad puede
ser una relación de 2,2 a 2,5.
La invención proporciona también un ensayo de
mayor grado de definición para la resistencia a la APC. Un problema
potencial con la prueba del cofactor de la APC es que los pacientes
con trombofilia pueden recibir una terapia anticoagulante que
conduce a la reducción de los Factores II, IX y X. Esto da como
resultado que la prueba del cofactor de la APC descrita
anteriormente muestre una relación PCA.APTT/APTT o una relación
PCA.PT/PT mayor de la que debería mostrar, dando lugar a un
diagnóstico erróneo potencial de los pacientes resistentes a la APC
como normales. De acuerdo con este segundo aspecto de la invención,
los Factores II, IX y X se normalizan en la muestra de plasma (que
puede ser resistente o sensible a la APC) diluyéndola con plasma
empobrecido en Factor V. Además, la dilución con Factor V normaliza
los niveles de PC y PS en la muestra diluida, independientemente de
los niveles en la muestra sin diluir. Preferiblemente, el plasma se
diluye 1:5 ó 1:10 con el plasma empobrecido en Factor V. La
relación PCA.APTT/APTT o PCA.PT/PT se determina entonces en
consonancia con el aspecto amplio de la invención descrito más
arriba.
La actividad como cofactor de la APC y la
actividad como coagulante del Factor V forman parte ambas de la
molécula del Factor V y se encuentran ausentes, por tanto, del
plasma empobrecido en Factor V. En consecuencia, la dilución
mantiene en la muestra de plasma el equilibrio entre el Factor V
coagulante y el cofactor de la APC anticoagulante.
Los factores intrínsecos de coagulación y la PC y
la PS están al mismo nivel aproximadamente en cualquier muestra
diluida; así, el intervalo de valores de PCA.APTT/APTT o PCA.PT/PT
observado en las muestra de plasma de pacientes normales es más
estrecho que el intervalo correspondiente en los ensayos en los que
se usa plasma no diluido.
El reactivo exógeno de APTT utilizado en la etapa
(i) (a) puede incluir sílice micronizada (preferiblemente a
concentraciones de alrededor de 0,06% en agua y tampón), caolín
(preferiblemente a concentraciones que varían de 0,25 a 10 mg/ml),
bentonita, ácido elágico o cualquier sustancia que active el
mecanismo de contacto de la coagulación intrínseca, o bien cualquier
líquido comercial o reactivo de APTT liofilizado. El fosfolípido
puede ser un sustituto de las plaquetas tal como un extracto de
cerebro o un fosfolípido relativamente puro.
El reactivo de PT exógeno utilizado en la etapa
(i) (a) implicado en la ruta extrínseca puede ser tromboplastina de
cerebro bovino o cualquier otro tipo de órgano que dé lugar a un
tiempo de coagulación prolongado con plasma normal en presencia de
PCA. Preferiblemente, el reactivo de PT es el sobrenadante
resultante de centrifugar, preferiblemente a alrededor de 500 g, una
solución al 4% de cerebro bovino deshidratado en acetona y activado
en solución salina. La tromboplastina humana o la de conejo no son
satisfactorias.
El activador de Proteína C utilizado en la etapa
(i) (b) puede provenir de componentes humanos o animales o de
fracciones de venenos de serpiente o ser cualquier otro activador
exógeno de la Proteína C. El PCA utilizado en la etapa (i) (b) se
combina con activador exógeno en forma líquida o liofilizada. Los
autores de la invención utilizaron una fracción de A. Contortrix
Contortrix (Exner T y Vaasjoki R. Thromb. Haemost.
59:40-44 (1988)). La concentración preferida de
activador de la PC oscila de 0,25.10^{-8} M a 2,5.10^{-8} M,
siendo lo más preferible 1,25-10^{-8} M.
La dilución óptima en el reactivo de APTT o PT es
la que da lugar en la etapa (ii), efectuada sobre el producto de la
etapa (i) (b), a la prolongación máxima del tiempo de coagulación de
plasma normal mezcla de muestras de distintos orígenes. Se pueden
usar concentraciones más altas o más bajas pero en ambos casos los
tiempo de coagulación son más cortos, las relaciones referentes al
PCA son más bajas y la sensibilidad es menor.
Preferiblemente, los reactivos están en forma
liofilizada y se reconstituyen con agua u otro diluyente.
El cloruro cálcico de la etapa (ii) está, de
forma opcional, a 25 mM, pero se pueden utilizar concentraciones de
10 mM a 50 mM. Las concentraciones por encima de 25 mM pueden ser
inhibitorias y las concentraciones por debajo de 10 mM pueden ser
insuficientes para que tenga lugar la coagulación. Se pueden
incorporar magnesio y otros cationes divalentes y trivalentes.
En la técnica anterior, se utiliza solución
salina en la preparación de la porción de muestra en la cual se mide
el tiempo APC.APTT. Se prefiere la utilización de solución salina
tanto en la medida del APTT como en la del PCA.APTT para asegurar
que los tiempos de coagulación observados sean debidamente
comparables. Preferiblemente, la concentración de la solución salina
varía entre 0,075 M y 0,15 M.
Preferiblemente, el reactivo exógeno contiene de
0,01 a 0,2%, preferiblemente 0,04%, de fosfolípido sin tratar. El
tiempo de incubación óptimo en (i) es de 5 a 10 minutos tanto para
el reactivo de APTT como para el de PT, pero se pueden utilizar
tiempos de hasta 2 minutos como límite inferior y de hasta 15
minutos como límite superior. Tiempos de incubación más prolongados
pueden dar lugar al deterioro de los componentes de la muestra de
plasma.
También de acuerdo con la invención se
proporciona un kit para llevar a cabo el método de la
invención que contiene un reactivo de APTT o un reactivo de PT y, de
forma separada, el mismo reactivo con un activador de la PC. El
kit contiene además un agente de coagulación, preferiblemente
una sal divalente o trivalente, siendo lo más preferible cloruro
cálcico. Preferiblemente, el kit contiene cloruro sódico,
que se puede combinar con el activador de coagulación. La
concentración preferida de la solución de cloruro sódico varía
entre 0,075 M y 0,15 M.
Un APTT llevado a cabo con y sin la inclusión del
reactivo PCA.
Es preferible la sangre tratada con citrato pero
se pueden usar como anticoagulantes oxalato o EDTA. El plasma se
obtiene por centrifugación a 3000 g. Los autores de la invención han
llevado a cabo el ensayo de forma manual y, en el modo APTT, con el
instrumento ACL del Instrumentation Laboratory, Milán, Italia. Se
pueden utilizar otros instrumentos comerciales. Se va a describir
el método manual.
Método (i): Se coloca plasma (0,1 ml) en un tubo
de coagulación a 37ºC, seguido por el reactivo de APTT (reactivo de
APTT Diagen de sílice micronizada, Thame, Oxon, Reino Unido) (0,1
ml). Los contenidos se mezclan e incuban durante 5 minutos. Se añade
entonces una mezcla de 1 parte de cloruro cálcico 50 mM y una parte
de solución salina fisiológica (0,15 M) (0,1 ml) y se determina el
tiempo de coagulación mediante el método del tubo de inclinación
variable. Éste es el APTT normal; los tiempos de coagulación
normales varían entre 30 segundos y 45 segundos. El ensayo se
repite con el mismo reactivo de APTT que contiene PCA a
1,25.10^{-8} M (reactivo de PCA.APTT Diagen). El tiempo normal de
coagulación oscilará entre 65 y 300 segundos y al dividirlo por el
APTT normal, dará relaciones de 2,0 a 10,0.
Método (ii): Se coloca plasma (0,1 ml) en un tubo
de coagulación a 37ºC seguido por tromboplastina bovina
(tromboplastina bovina Diagen, Thame, Oxon, Reino Unido) (0,1 ml).
Los contenidos se mezclan e incuban durante 5 minutos. Se añade
entonces cloruro cálcico 25 mM (0,1 ml) y se determina el tiempo de
coagulación por el método del tubo de inclinación variable. Éste es
tiempo normal de protrombina (PT); los tiempos normales de
coagulación varían entre 27 segundos y 42 segundos. El ensayo se
repite con el mismo reactivo de tromboplastina bovina que contiene
PCA a 2,5.10^{-8} M (reactivo PCA de tromboplastina bovina
Diagen). El tiempo de coagulación con PCA oscilará entre 45 y 60
segundos y, al dividirlo por el PT normal, dará relaciones de 1,6 a
2,5.
Ha de preferirse el método (i) debido al mayor
incremento en los tiempos de coagulación en presencia de PCA. Esto
confiere mayor sensibilidad en la detección de anormalidades.
Se analizaron con el ensayo del PCA.APTT y con el
ensayo del cofactor de la APC de Chromogenix (Quadratech, Epsom,
Surrey, Reino Unido) muestras de plasma de cuatro pacientes con
defectos conocidos en el cofactor de la APC, 57 muestras de plasma
normal y 58 muestras consecutivas de pacientes que requerían la
detección de una posible trombofilia. El límite del intervalo de
anormalidad para ambos ensayos se fijó en un valor para la relación
de 2,1 o inferior. Los cuatro individuos con defectos conocidos en
el cofactor de la APC dieron relaciones menores que 2,1 con ambos
ensayos. De las 57 muestras de plasma normal, tres dieron relaciones
menores que 2,1 con ambos ensayos, indicando un defecto en el
cofactor de la APC. De los 58 pacientes sometidos a detección de una
posible trombofilia, tres dieron relaciones menores que 2,1 con
ambos ensayos, cuatro dieron relaciones menores que 2,0 con el
ensayo de PCA.APTT, pero relaciones de 2,1, 2,2, 2,4 y 2,6 con el
ensayo de APC.APTT. Los cuatro mostraron una PC normal. Se sospechó
que estas muestras podían ser heterocigóticas para el defecto en el
cofactor de la APC; el DNA genómico obtenido de tres de estos
pacientes se sometió a amplificación mediante el método de la
reacción en cadena de la polimerasa y resultaron ser
heterocigóticos para la mutación del Factor V Leiden. La muestra de
un paciente dio una relación de 2,5 con la prueba de APC.APTT, pero
un valor anormal de 1,7 para la relación de PCA.APTT. Un ensayo
específico para la PC mostró que la muestra tenía sólo 29% de la PC
media normal. Todas las demás muestras anormales tenían PC y PS
normales según las pruebas. Una muestra
inmuno-deprimida en PS dio una relación de APC.APTT
de 1,7 y un valor de PCA.APTT de sólo 1,3. Así, el método del PCA
ha demostrado detectar todos los defectos en el cofactor de la APC
detectados por el método de la APC y también en la PC y la PS. Las
muestras que eran normales dieron generalmente valores de las
relaciones más altos con el método del PCA y siete muestras
anormales de nueve dieron valores de las relaciones más bajos con el
método del PCA. Esto, junto con el reconocimiento de cuatro muestras
anormales extra, puede simplemente estar reflejando un mayor grado
de discriminación del ensayo del PCA. El ensayo debe de mostrar ser
un ensayo útil para la resistencia a la APC en la práctica
hospitalaria rutinaria. El uso del ensayo de PCA.APTT puede servir
también para descubrir cualesquiera otros posibles Factores o
cofactores que puedan estar implicados en la formación endógena de
la APC.
En los métodos de acuerdo con el segundo aspecto
de la invención, cuando el paciente está o puede estar recibiendo
tratamiento por trombofilia, la metodología es la misma que para el
ensayo general, pero la muestra de plasma se diluye inicialmente
entre 1:5 y 1:10 en plasma empobrecido en Factor V. Los valores de
las relaciones PCA.APTT/APTT o PCA.PT/PT se determinan entonces de
la misma manera que para el plasma sin diluir; se puede confiar en
los resultados como un buen indicador de la deficiencia en el
cofactor de la APC. Así, en el ejemplo precedente, la muestra de
0,1 ml de plasma contendría 20 \mul de plasma del paciente y 80
\mul de plasma empobrecido en Factor V.
Claims (18)
1. Un ensayo de la deficiencia en el cofactor de
la APC para determinar si una muestra de plasma sanguíneo en el que
los niveles de proteína C y proteína S son normales según los
ensayos es deficiente en el cofactor de la APC, que comprende:
- (i)
- incubar una primera porción de la muestra con
- (a)
- un reactivo exógeno que contiene un fosfolípido que activa el mecanismo de contacto en la coagulación intrínseca o un reactivo exógeno que inicia la coagulación extrínseca; e incubar una segunda porción de la muestra con
- (b)
- el reactivo de la etapa (i) (a) y un activador exógeno de la Proteína C (PC) que produce Proteína C activada (APC) a partir de Proteína C y Proteína S endógenas;
luego (ii)
\;añadir a cada una de las dos porciones incubadas un agente de coagulación y controlar la velocidad de {}\hskip1.5cm conversión del fibrinógeno en fibrina insoluble; y
- (iii)
- calcular el valor de la relación entre la velocidad de conversión de la segunda porción de la muestra y la velocidad de conversión de la primera porción y comparar esta relación con la relación correspondiente para muestras de sujetos normales.
2. Un ensayo de la deficiencia en el cofactor de
la APC que comprende las etapas (i) a (iii) de la reivindicación 1,
en el que la muestra de plasma se diluye inicialmente con plasma
empobrecido en Factor V.
3. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que la dilución de la muestra de plasma en plasma empobrecido
en Factor V varía de 1:5 a 1:10.
4. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el agente de coagulación
añadido en la etapa (ii) es una sal divalente o trivalente,
preferiblemente cloruro cálcico.
5. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las porciones se incuban con
un reactivo exógeno, en el que el cloruro sódico se añade a los
productos de la etapa (i) (a) y la etapa (i) (b).
6. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que la concentración salina de los productos varía entre 0,075
M y 0,15 M.
7. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo de la etapa (i)
(a) es un reactivo de APTT.
8. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la velocidad de conversión
controlada en la etapa (ii) se controla por la formación de
coágulos.
9. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el activador exógeno de la
Proteína C es cualquier activador exógeno de la Proteína C o de la
Proteína S.
10. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los reactivos están en forma
liofilizada y se reconstituyen con agua u otro diluyente.
11. Un kit para utilizar en un ensayo de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que
comprende:
un reactivo exógeno que contiene un fosfolípido
que activa el mecanismo de contacto en la coagulación intrínseca o
un reactivo exógeno que inicia la coagulación extrínseca; y,
separadamente, el mismo reactivo exógeno con un activador exógeno de
la Proteína C (PC) que produce PC activada (APC) a partir de
Proteína C y Proteína S endógenas, y
un agente coagulante, preferiblemente una sal
divalente o trivalente, siendo lo más preferible cloruro
cálcico.
12. Un kit de acuerdo con la
reivindicación 11 para utilizar en un ensayo de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 3 o con cualquiera de las reivindicaciones 4 a
10 cuando dependa de la reivindicación 2 ó 3, que comprende además
plasma empobrecido en Factor V.
13. Un kit de acuerdo con la
reivindicación 11 ó 12, en el que al menos uno de los reactivos está
en forma liofilizada.
14. Un kit de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 13, que comprende un reactivo exógeno que
comprende además solución de cloruro sódico.
15. Un kit de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que la concentración de cloruro sódico
varía entre 0,075 M y 0,15 M.
16. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 o un kit de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 15, en el que el reactivo exógeno
contiene de 0,01 a 0,2%, preferiblemente 0,04% de fosfolípido
bruto.
17. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y 16 o un kit de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el reactivo
exógeno es el sobrenadante resultante de centrifugar una solución
al 4% de cerebro bovino deshidratado en acetona y activado en
solución salina.
18. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, 16 y 17 o un kit de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la
concentración de PCA en el reactivo exógeno que contiene PCA varía
entre 0,25.10^{-8} M y 2,5.10^{-8} M, siendo preferiblemente
1,25.10^{-8} M.
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