JPH11225796A - サンプルの潜在的抗血液凝固能の測定法 - Google Patents
サンプルの潜在的抗血液凝固能の測定法Info
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- JPH11225796A JPH11225796A JP10315511A JP31551198A JPH11225796A JP H11225796 A JPH11225796 A JP H11225796A JP 10315511 A JP10315511 A JP 10315511A JP 31551198 A JP31551198 A JP 31551198A JP H11225796 A JPH11225796 A JP H11225796A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 短い測定時間および単一工程を用いてプロテ
インＣシステムの潜在能の測定を可能にし、同時にアン
チトロンビンIIIにおける障害も検出できる方法の開
発。 【解決手段】 血液凝固試験にトロンボモジュリンおよ
びトロンボプラスチンを添加することにより、サンプル
の抗血液凝固潜在能を測定または診断する方法。
インＣシステムの潜在能の測定を可能にし、同時にアン
チトロンビンIIIにおける障害も検出できる方法の開
発。 【解決手段】 血液凝固試験にトロンボモジュリンおよ
びトロンボプラスチンを添加することにより、サンプル
の抗血液凝固潜在能を測定または診断する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液凝固試験にお
いて、トロンボモジュリンおよびトロンボプラスチンを
添加してサンプルの潜在的抗血液凝固能を測定する方法
に関する。
いて、トロンボモジュリンおよびトロンボプラスチンを
添加してサンプルの潜在的抗血液凝固能を測定する方法
に関する。
【０００２】
【従来技術】血液凝固の活性化は、プロ酵素プロトロン
ビンの活性化プロテアーゼ、トロンビンへの変換を招
く。トロンビンはそれ自体、タンパク分解的切断によっ
て血液凝固Ｖ因子およびVIII因子を活性化することで、
その形成を促進する。これらの活性化された補因子は、
プロテアーゼの血液凝固Ｘａ因子およびIXａ因子それぞ
れとともに、リン脂質表面上に活性な酵素／補因子複合
体を形成し、その複合体の活性はそれら自身の上にある
プロテアーゼ活性よりファクタ−約１０,０００のオー
ダーまで高い。この正のフィ−ドバックは、ほぼ爆発的
に大量のトロンビンの形成を招来する。トロンビンはフ
ィブリノーゲンをフィブリンに変換し、これが通常、創
傷の閉鎖および創傷の治癒となる。生体の血管系の閉塞
すなわち血栓症を招く、生命の危険がある血液凝固への
進展を防止するために、活性プロテアーゼおよび他の活
性化プロテアーゼを阻害しなければならない。生体内に
おいては、活性プロテアーゼはプロテアーゼ阻害剤によ
り共有結合した複合体の形成によって中和される。最も
重要なプロテアーゼ阻害剤は、アンチトロンビンIIIで
あり、その抗血液凝固作用はヘパリン硫酸によって促進
される。活性血液凝固プロテアーゼの連続的な形成は、
フィードバック機構を介して作用するトロンビン自体に
よって中断される。トロンビンは、膜タンパク質、トロ
ンボモジュリンに結合し、その血液凝固促進作用たとえ
ば血小板の活性化またはフィブリノーゲンの変換作用が
失われる。カルシウムイオンの存在下では、トロンビン
／トロンボモジュリン複合体がプロ酵素のプロテインＣ
を活性なプロテアーゼ、プロテインＣａ（ＡＰＣ）に変
換する（作用Ａ）。さらにトロンボモジュリン自体その
グリコシル化、ヘパラン硫酸を介して抗血液凝固作用を
奏する。これは、不活性なトロンビン／アンチトロンビ
ンIII複合体が形成する速度を増大させる（Dittmann W
A, Majerus, PW, Blood, 1990；75：329-336；Bourin M
-C, Lindahl U, Biochem J., 1990；270：419-425）。
その補因子プロテインＳとともに、生成するＡＰＣは複
合体を形成し、これがタンパク分解的に切断して活性な
補因子、血液凝固VIIａ因子およびＶａ因子を不活性化
する。これにより、ＡＰＣはこれらの補因子による強力
な刺激、ならびに、血液凝固Ｘａ因子およびトロンビン
の形成を、さらに中断する。他の膜タンパク質、すなわ
ち内皮プロテインＣ受容体はトロンビン／トロンボモジ
ュリン複合体のプロテインＣ活性化活性を刺激するよう
に思われる。
ビンの活性化プロテアーゼ、トロンビンへの変換を招
く。トロンビンはそれ自体、タンパク分解的切断によっ
て血液凝固Ｖ因子およびVIII因子を活性化することで、
その形成を促進する。これらの活性化された補因子は、
プロテアーゼの血液凝固Ｘａ因子およびIXａ因子それぞ
れとともに、リン脂質表面上に活性な酵素／補因子複合
体を形成し、その複合体の活性はそれら自身の上にある
プロテアーゼ活性よりファクタ−約１０,０００のオー
ダーまで高い。この正のフィ−ドバックは、ほぼ爆発的
に大量のトロンビンの形成を招来する。トロンビンはフ
ィブリノーゲンをフィブリンに変換し、これが通常、創
傷の閉鎖および創傷の治癒となる。生体の血管系の閉塞
すなわち血栓症を招く、生命の危険がある血液凝固への
進展を防止するために、活性プロテアーゼおよび他の活
性化プロテアーゼを阻害しなければならない。生体内に
おいては、活性プロテアーゼはプロテアーゼ阻害剤によ
り共有結合した複合体の形成によって中和される。最も
重要なプロテアーゼ阻害剤は、アンチトロンビンIIIで
あり、その抗血液凝固作用はヘパリン硫酸によって促進
される。活性血液凝固プロテアーゼの連続的な形成は、
フィードバック機構を介して作用するトロンビン自体に
よって中断される。トロンビンは、膜タンパク質、トロ
ンボモジュリンに結合し、その血液凝固促進作用たとえ
ば血小板の活性化またはフィブリノーゲンの変換作用が
失われる。カルシウムイオンの存在下では、トロンビン
／トロンボモジュリン複合体がプロ酵素のプロテインＣ
を活性なプロテアーゼ、プロテインＣａ（ＡＰＣ）に変
換する（作用Ａ）。さらにトロンボモジュリン自体その
グリコシル化、ヘパラン硫酸を介して抗血液凝固作用を
奏する。これは、不活性なトロンビン／アンチトロンビ
ンIII複合体が形成する速度を増大させる（Dittmann W
A, Majerus, PW, Blood, 1990；75：329-336；Bourin M
-C, Lindahl U, Biochem J., 1990；270：419-425）。
その補因子プロテインＳとともに、生成するＡＰＣは複
合体を形成し、これがタンパク分解的に切断して活性な
補因子、血液凝固VIIａ因子およびＶａ因子を不活性化
する。これにより、ＡＰＣはこれらの補因子による強力
な刺激、ならびに、血液凝固Ｘａ因子およびトロンビン
の形成を、さらに中断する。他の膜タンパク質、すなわ
ち内皮プロテインＣ受容体はトロンビン／トロンボモジ
ュリン複合体のプロテインＣ活性化活性を刺激するよう
に思われる。
【０００３】上述のこのプロテインＣシステムは重要な
抗血液凝固機構を構成する。これは遺伝的なまたは後天
的なプロテインＣまたはプロテインＳの欠損または障害
を有する患者で血栓症特に反復性静脈血栓症が極めて起
こりやすいという事実により確認される。プロテインＣ
およびプロテインＳ以外の他の因子は、このシステムの
活性、たとえば血液凝固VIIIａ因子のタンパク分解的切
断を保護できるフォンウィレブランド因子および血液凝
固IXａ因子に影響する。後天的障害はまた、ループス抗
凝血剤の形成にそれらの起源を有することができる。こ
れらはリン脂質に対する抗体であり、プロテアーゼ／補
因子複合体の適切な機能に必要なリン脂質表面への結合
を妨害する。ＡＰＣによって全くまたは極めて弱くしか
活性化されない血液凝固Ｖ因子の突然変異体も記載され
ている。トロンビン／トロンボモジュリン複合体に関与
し、活性化プロテインＣの形成の減少を招く血液凝固因
子の突然変異、たとえばトロンボモジュリン自体、プロ
テインＣおよびトロンビンの突然変異も知られている。
抗血液凝固機構を構成する。これは遺伝的なまたは後天
的なプロテインＣまたはプロテインＳの欠損または障害
を有する患者で血栓症特に反復性静脈血栓症が極めて起
こりやすいという事実により確認される。プロテインＣ
およびプロテインＳ以外の他の因子は、このシステムの
活性、たとえば血液凝固VIIIａ因子のタンパク分解的切
断を保護できるフォンウィレブランド因子および血液凝
固IXａ因子に影響する。後天的障害はまた、ループス抗
凝血剤の形成にそれらの起源を有することができる。こ
れらはリン脂質に対する抗体であり、プロテアーゼ／補
因子複合体の適切な機能に必要なリン脂質表面への結合
を妨害する。ＡＰＣによって全くまたは極めて弱くしか
活性化されない血液凝固Ｖ因子の突然変異体も記載され
ている。トロンビン／トロンボモジュリン複合体に関与
し、活性化プロテインＣの形成の減少を招く血液凝固因
子の突然変異、たとえばトロンボモジュリン自体、プロ
テインＣおよびトロンビンの突然変異も知られている。
【０００４】アンチトロンビンIIIの障害または欠損
は、血栓形成の他の重要な原因である。一般に、アンチ
トロンビンIIIは、高度に希釈したサンプルにトロンビ
ンおよびヘパリンを添加し、ついで色素原基質またはフ
ィブリノーゲンを添加して変換速度またはフィブリン血
餅の形成を測定することによって、残ったトロンビンを
測定して定量される。
は、血栓形成の他の重要な原因である。一般に、アンチ
トロンビンIIIは、高度に希釈したサンプルにトロンビ
ンおよびヘパリンを添加し、ついで色素原基質またはフ
ィブリノーゲンを添加して変換速度またはフィブリン血
餅の形成を測定することによって、残ったトロンビンを
測定して定量される。
【０００５】プロテインＣシステムには多くの可能な障
害があることから、臨床的診断においてはこのシステム
の障害、すなわちその潜在的抗血液凝固能を一般的に指
示するスクリーニング試験を使用することは意味があ
る。これは特に、特殊な障害たとえば、フォンウィレブ
ランド因子、血液凝固IXａ因子、ループス抗凝血剤もし
くは血液凝固Ｖ因子の突然変異による障害の場合に該当
し、この領域で特に経験のある検査室で極めて手の込ん
だ方法でしか分析できない。これに加えて、プロテイン
Ｃシステムの潜在的能力を測定するスクリーニング試験
はたとえば急性相反応または炎症の影響のような原因に
よる障害も示すことが可能であり、個々の因子の測定結
果の集計から様々な因子の相互作用を結論的に確立する
ことはできないことから、詳細な分類はほとんど不可能
である。しかも、このようなスクリーニング試験では、
その原因が現時点でもまだ不明の障害を付随的に検出す
ることができる。したがって、このような試験は、血栓
症の危険の増大を招きうる単独または多重因子の障害に
ついて患者の検診に使用できる。
害があることから、臨床的診断においてはこのシステム
の障害、すなわちその潜在的抗血液凝固能を一般的に指
示するスクリーニング試験を使用することは意味があ
る。これは特に、特殊な障害たとえば、フォンウィレブ
ランド因子、血液凝固IXａ因子、ループス抗凝血剤もし
くは血液凝固Ｖ因子の突然変異による障害の場合に該当
し、この領域で特に経験のある検査室で極めて手の込ん
だ方法でしか分析できない。これに加えて、プロテイン
Ｃシステムの潜在的能力を測定するスクリーニング試験
はたとえば急性相反応または炎症の影響のような原因に
よる障害も示すことが可能であり、個々の因子の測定結
果の集計から様々な因子の相互作用を結論的に確立する
ことはできないことから、詳細な分類はほとんど不可能
である。しかも、このようなスクリーニング試験では、
その原因が現時点でもまだ不明の障害を付随的に検出す
ることができる。したがって、このような試験は、血栓
症の危険の増大を招きうる単独または多重因子の障害に
ついて患者の検診に使用できる。
【０００６】サンプル、すなわちプロテインＣシステム
および／またはアンチトロンビンIIIの抗血液凝固作用
の可能性を決定する試験の使用は個々の原因の決定以上
の成果をもたらし、血栓症の傾向の増大（血栓易発症
性）および、結果として、たとえばクマリン誘導体また
はヘパリン類を使用する抗血液凝固療法のような治療の
結果を認識するための臨床的実務における成功によりそ
れ自身の価値を達成する。したがって、抗血液凝固療法
のモニタリングおよび制御はこの試験の更なる適用であ
る。
および／またはアンチトロンビンIIIの抗血液凝固作用
の可能性を決定する試験の使用は個々の原因の決定以上
の成果をもたらし、血栓症の傾向の増大（血栓易発症
性）および、結果として、たとえばクマリン誘導体また
はヘパリン類を使用する抗血液凝固療法のような治療の
結果を認識するための臨床的実務における成功によりそ
れ自身の価値を達成する。したがって、抗血液凝固療法
のモニタリングおよび制御はこの試験の更なる適用であ
る。
【０００７】現在まで、個々の因子としてはプロテイン
ＣおよびプロテインＳに対する機能的検討が実施されて
きた。このためには、サンプルまたはサンプルから単離
されたプロテインＣを化学量論以下の量でプロテインＣ
欠損血漿に最初に添加する。ついで、プロテインＣをト
ロンビンもしくはトロンビンとトロンボモジュリンの添
加、または商品名 Protac(R)（Pentapharm, Basel, Swi
tzerland）のAgkistrodon contortrix蛇毒の添加のいず
れかによって活性化する。サンプル中に存在するプロテ
インＣは、サンプル中に存在するプロテインＣの抗血液
凝固作用による血液凝固時間の延長に基づきまたはトロ
ンビンに特異的な基質の変換のいずれかによって検出さ
れる。別法として、プロテインＣ活性はまたＡＰＣに特
異的な基質を用いることによりトロンビンまたは Prota
c(R)で活性化したのち、直接的な方法で色素原によって
測定できる。
ＣおよびプロテインＳに対する機能的検討が実施されて
きた。このためには、サンプルまたはサンプルから単離
されたプロテインＣを化学量論以下の量でプロテインＣ
欠損血漿に最初に添加する。ついで、プロテインＣをト
ロンビンもしくはトロンビンとトロンボモジュリンの添
加、または商品名 Protac(R)（Pentapharm, Basel, Swi
tzerland）のAgkistrodon contortrix蛇毒の添加のいず
れかによって活性化する。サンプル中に存在するプロテ
インＣは、サンプル中に存在するプロテインＣの抗血液
凝固作用による血液凝固時間の延長に基づきまたはトロ
ンビンに特異的な基質の変換のいずれかによって検出さ
れる。別法として、プロテインＣ活性はまたＡＰＣに特
異的な基質を用いることによりトロンビンまたは Prota
c(R)で活性化したのち、直接的な方法で色素原によって
測定できる。
【０００８】プロテインＳの定量はサンプルをＰＳ欠損
血漿と混合することによって実施される。ＡＰＣに対す
るプロテインＳの刺激作用は血液凝固時間の増大の決定
によって測定する。この目的で要求されるＡＰＣは添加
するかまたはＰＳ欠損血漿中に存在するプロテインＣを
Protac(R)で活性化する（Bertina, RM, Res Clin Lab,
1990；20：127-138)。Matschiner（US 5,525,478）は
トロンボモジュリンを用いるプロテインＳの定量方法を
記載している（下記参照）。
血漿と混合することによって実施される。ＡＰＣに対す
るプロテインＳの刺激作用は血液凝固時間の増大の決定
によって測定する。この目的で要求されるＡＰＣは添加
するかまたはＰＳ欠損血漿中に存在するプロテインＣを
Protac(R)で活性化する（Bertina, RM, Res Clin Lab,
1990；20：127-138)。Matschiner（US 5,525,478）は
トロンボモジュリンを用いるプロテインＳの定量方法を
記載している（下記参照）。
【０００９】トロンボモジュリンを用いるプロテインＣ
の既知の測定方法は、サンプルから吸着によりプロテイ
ンＣを単離することに基づいている。サンプルから単離
されたこのプロテインＣはついで、トロンビン／トロン
ボモジュリン複合体で活性化し、発生した活性なプロテ
インＣを色素原試験で検出する（Thiel W.ら、Blut,198
6；52：169-177）。この方法は複雑で、プロテインＣシ
ステムの全体の能力を決定しない。しかも、その使用は
色素原による方法に限定される。すなわち、この方法で
は、フィブリン血餅の形成に対する生理学的影響を測定
することは不可能である。
の既知の測定方法は、サンプルから吸着によりプロテイ
ンＣを単離することに基づいている。サンプルから単離
されたこのプロテインＣはついで、トロンビン／トロン
ボモジュリン複合体で活性化し、発生した活性なプロテ
インＣを色素原試験で検出する（Thiel W.ら、Blut,198
6；52：169-177）。この方法は複雑で、プロテインＣシ
ステムの全体の能力を決定しない。しかも、その使用は
色素原による方法に限定される。すなわち、この方法で
は、フィブリン血餅の形成に対する生理学的影響を測定
することは不可能である。
【００１０】EP 0 711 838 には、その活性化型が正常
な（野生型の）血液凝固Ｖａ因子によるよりもＡＰＣに
よってわずかしか不活性化されない血液凝固Ｖ因子の変
異体を機能的に測定する方法が記載されている。この測
定にはサンプルを、たとえば血液凝固因子欠損、ループ
ス抗血液凝固剤または治療的影響（経口的抗血液凝固ま
たはヘパリン）のような影響への干渉を排除するため、
血液凝固Ｖ因子欠損血漿と混合し、ついで活性化プロテ
インＣの存在下に血液凝固試験が行われる。
な（野生型の）血液凝固Ｖａ因子によるよりもＡＰＣに
よってわずかしか不活性化されない血液凝固Ｖ因子の変
異体を機能的に測定する方法が記載されている。この測
定にはサンプルを、たとえば血液凝固因子欠損、ループ
ス抗血液凝固剤または治療的影響（経口的抗血液凝固ま
たはヘパリン）のような影響への干渉を排除するため、
血液凝固Ｖ因子欠損血漿と混合し、ついで活性化プロテ
インＣの存在下に血液凝固試験が行われる。
【００１１】トロンボモジュリンの検出に元来用いられ
た方法は、トロンボモジュリンと活性な複合体を形成し
ないことをその特徴とするトロンビンの変異体の検出に
採用されていることも既に報告されている。このために
はサンプルを、当業者にはそれ自体知られている蛇毒か
らの酵素を用いてプロトロンビンを活性化してトロンビ
ンを形成させたのちにも、以後の測定を妨害する可能性
のある血餅が形成しないように希釈する。トロンボモジ
ュリンとプロテインＣを添加したのち、活性化プロテイ
ンＣの形成を色素原プロテインＣ基質の変換によってモ
ニタリングする。
た方法は、トロンボモジュリンと活性な複合体を形成し
ないことをその特徴とするトロンビンの変異体の検出に
採用されていることも既に報告されている。このために
はサンプルを、当業者にはそれ自体知られている蛇毒か
らの酵素を用いてプロトロンビンを活性化してトロンビ
ンを形成させたのちにも、以後の測定を妨害する可能性
のある血餅が形成しないように希釈する。トロンボモジ
ュリンとプロテインＣを添加したのち、活性化プロテイ
ンＣの形成を色素原プロテインＣ基質の変換によってモ
ニタリングする。
【００１２】これまでに引用した方法は、それぞれの場
合に個々に検討された因子によって生じるプロテインＣ
システムの障害の検出にのみ適している。上述の理由に
よりそれらはスクリーニング試験には適当でない。測定
方法が十分に実用的なものではないという事実は、広範
な最前線にわたるスクリーニング試験としてのそれらの
導入に著しい障害となる。
合に個々に検討された因子によって生じるプロテインＣ
システムの障害の検出にのみ適している。上述の理由に
よりそれらはスクリーニング試験には適当でない。測定
方法が十分に実用的なものではないという事実は、広範
な最前線にわたるスクリーニング試験としてのそれらの
導入に著しい障害となる。
【００１３】ＦＶの障害を測定するために、Amerら（Th
romb. Res., 1990；57：247-258）は活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を改良した。ＡＰＴＴは
血液凝固における障害を検出するための標準的方法、す
なわち出血傾向の診断に用いられる方法である。サンプ
ル血漿を活性化表面で活性化したのちでも、通常のＡＰ
ＴＴの場合のように塩化カルシウムの溶液の添加では血
液の凝固は開始せず、代わりにカルシウムイオンと同時
にＡＰＣを添加する。外因的に添加したＡＰＣの抗血液
凝固作用は血液凝固時間を延長する。したがって、この
試験では既に、ＡＰＣが外因的に添加されることから、
サンプル中のプロテインＣにおける障害または欠損以外
の多くのプロテインＣシステムの障害、またトロンボモ
ジュリンは存在しないことから、たとえばプロテインＣ
および／またはトロンビンとトロンボモジュリンの相互
作用に関連する障害が認識されている。
romb. Res., 1990；57：247-258）は活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を改良した。ＡＰＴＴは
血液凝固における障害を検出するための標準的方法、す
なわち出血傾向の診断に用いられる方法である。サンプ
ル血漿を活性化表面で活性化したのちでも、通常のＡＰ
ＴＴの場合のように塩化カルシウムの溶液の添加では血
液の凝固は開始せず、代わりにカルシウムイオンと同時
にＡＰＣを添加する。外因的に添加したＡＰＣの抗血液
凝固作用は血液凝固時間を延長する。したがって、この
試験では既に、ＡＰＣが外因的に添加されることから、
サンプル中のプロテインＣにおける障害または欠損以外
の多くのプロテインＣシステムの障害、またトロンボモ
ジュリンは存在しないことから、たとえばプロテインＣ
および／またはトロンビンとトロンボモジュリンの相互
作用に関連する障害が認識されている。
【００１４】DE 44 27 785 には、検討すべきサンプル
のプロテインＣ（内因性プロテインＣ）を、まず第一に
プロテインＣアクティベーターにより予め活性化するプ
ロテインＣシステムの障害の測定方法が記載されてい
る。生成したＡＰＣのトロンビン形成を遅延させる作用
が、ついで血液凝固試験で調べられる。既知のアクティ
ベーター、たとえば、蛇毒酵素［たとえば、Agkistrodo
n contortrix、商品名Protac(R)］、またはトロンビン
／トロンボモジュリン複合体がプロテインＣアクティベ
ーターとして使用される。トロンビンの形成は血餅形成
により（古典的方法）または色素原基質を用いて検出で
きる。プロテインＣシステムの抗血液凝固作用の測定の
基盤として用いられる血液凝固試験は、すべて当業者に
それ自体既知の方法、たとえば、ＡＰＴＴ、トロンボプ
ラスチン時間（ＰＴ）、ラッセルの蛇毒時間（ＲＶＶ
Ｔ）、あるいは活性化血液凝固因子もしくは蛇毒または
これらの毒液からの酵素の添加による方法からなり、最
終的にはトロンビンの形成、したがって活性化血液凝固
Ｖ因子の形成を招来する。従来の方法と比較して、この
方法は、トロンビンおよびトロンボモジュリンの変異体
を除くプロテインＣシステムのすべての障害を包含す
る。予め形成させたトロンビン／トロンボモジュリン複
合体を用いると、この方法でさらにトロンビン／トロン
ボモジュリン複合体への結合またはその活性化が障害さ
れているプロテインＣの変異体も検出することができ
る。
のプロテインＣ（内因性プロテインＣ）を、まず第一に
プロテインＣアクティベーターにより予め活性化するプ
ロテインＣシステムの障害の測定方法が記載されてい
る。生成したＡＰＣのトロンビン形成を遅延させる作用
が、ついで血液凝固試験で調べられる。既知のアクティ
ベーター、たとえば、蛇毒酵素［たとえば、Agkistrodo
n contortrix、商品名Protac(R)］、またはトロンビン
／トロンボモジュリン複合体がプロテインＣアクティベ
ーターとして使用される。トロンビンの形成は血餅形成
により（古典的方法）または色素原基質を用いて検出で
きる。プロテインＣシステムの抗血液凝固作用の測定の
基盤として用いられる血液凝固試験は、すべて当業者に
それ自体既知の方法、たとえば、ＡＰＴＴ、トロンボプ
ラスチン時間（ＰＴ）、ラッセルの蛇毒時間（ＲＶＶ
Ｔ）、あるいは活性化血液凝固因子もしくは蛇毒または
これらの毒液からの酵素の添加による方法からなり、最
終的にはトロンビンの形成、したがって活性化血液凝固
Ｖ因子の形成を招来する。従来の方法と比較して、この
方法は、トロンビンおよびトロンボモジュリンの変異体
を除くプロテインＣシステムのすべての障害を包含す
る。予め形成させたトロンビン／トロンボモジュリン複
合体を用いると、この方法でさらにトロンビン／トロン
ボモジュリン複合体への結合またはその活性化が障害さ
れているプロテインＣの変異体も検出することができ
る。
【００１５】FR 2 689 640 には、血液凝固診断におけ
る標準方法であるトロンボプラスチン時間に基づき、サ
ンプルにトロンボプラスチンおよびカルシウムを添加す
ることにより血液凝固を活性化する方法が記載されてい
る。トロンボモジュリンを同時に加えた場合には、生成
したトロンビンがサンプル中のプロテインＣ（内因性プ
ロテインＣ）を活性化する。ＡＰＣは、プロテインＣシ
ステムが機能する効率に依存する程度までトロンビンの
形成に拮抗する。１５分後、カルシウムイオンを封鎖し
て以後の血液凝固活性を中断し、形成したトロンビンを
特異的な色素原基質の変換によって測定する。形成した
トロンビンの量はプロテインＣシステムの操作性に間接
的に比例する。内因性プロテインＣおよび内因性プロト
ロンビンの両方が活性化されるので、サンプル中のプロ
テインＣシステムのすべての障害を検出することができ
る。しかしながら、この試験にはいくつかの欠点があ
る。第一に、この方法は、１６分の長い総測定時間のた
めにスクリーニング試験としてのルーチンな使用には不
適当である。第二に、活性化されたプロテインＣが実際
に形成される前にサンプル中に血餅が生成し、その結
果、この方法は生成したトロンビンの変換を検出する色
素原測定方法との組合せでのみ使用できることである。
したがって、フィブリン血餅の形成を検出する旧来の測
定方法は最早、使用できない。Ducheminらによって開発
された方法では、したがって、サンプル中のフィブリノ
ーゲンを、生成する血餅による干渉を回避するため、検
討の前にたとえばフィブリン−切断酵素の添加によって
除去している。
る標準方法であるトロンボプラスチン時間に基づき、サ
ンプルにトロンボプラスチンおよびカルシウムを添加す
ることにより血液凝固を活性化する方法が記載されてい
る。トロンボモジュリンを同時に加えた場合には、生成
したトロンビンがサンプル中のプロテインＣ（内因性プ
ロテインＣ）を活性化する。ＡＰＣは、プロテインＣシ
ステムが機能する効率に依存する程度までトロンビンの
形成に拮抗する。１５分後、カルシウムイオンを封鎖し
て以後の血液凝固活性を中断し、形成したトロンビンを
特異的な色素原基質の変換によって測定する。形成した
トロンビンの量はプロテインＣシステムの操作性に間接
的に比例する。内因性プロテインＣおよび内因性プロト
ロンビンの両方が活性化されるので、サンプル中のプロ
テインＣシステムのすべての障害を検出することができ
る。しかしながら、この試験にはいくつかの欠点があ
る。第一に、この方法は、１６分の長い総測定時間のた
めにスクリーニング試験としてのルーチンな使用には不
適当である。第二に、活性化されたプロテインＣが実際
に形成される前にサンプル中に血餅が生成し、その結
果、この方法は生成したトロンビンの変換を検出する色
素原測定方法との組合せでのみ使用できることである。
したがって、フィブリン血餅の形成を検出する旧来の測
定方法は最早、使用できない。Ducheminらによって開発
された方法では、したがって、サンプル中のフィブリノ
ーゲンを、生成する血餅による干渉を回避するため、検
討の前にたとえばフィブリン−切断酵素の添加によって
除去している。
【００１６】類似の方法が Rijkersら（Rijkers DTS
ら、 Thromb Haemost, 1997；補遺；550 Abstract PS-2
251）および US 5,051,357 に記載されている。
ら、 Thromb Haemost, 1997；補遺；550 Abstract PS-2
251）および US 5,051,357 に記載されている。
【００１７】サンプル中の内因性プロトロンビンおよび
外因的に添加されたトロンボモジュリンを用いてサンプ
ル中のプロテインＣを活性化する前述のこれらの方法は
以下の特徴を有する。 １. 活性化されたプロテインＣの形成のためにプレイン
キュベーションを必要とし、 ２. 内因性トロンビンの活性化はフィブリン血餅の未熟
な形成を招来し、このため、サンプル中のフィブリノー
ゲンを分析前に破壊しなければならず、したがって、 ３. 色素原検出方法の使用のみが可能であり、 ４. これは、インキュベーション時間および／またはサ
ンプルの前処理により全体的に測定時間を長くする（１
０分以上）。
外因的に添加されたトロンボモジュリンを用いてサンプ
ル中のプロテインＣを活性化する前述のこれらの方法は
以下の特徴を有する。 １. 活性化されたプロテインＣの形成のためにプレイン
キュベーションを必要とし、 ２. 内因性トロンビンの活性化はフィブリン血餅の未熟
な形成を招来し、このため、サンプル中のフィブリノー
ゲンを分析前に破壊しなければならず、したがって、 ３. 色素原検出方法の使用のみが可能であり、 ４. これは、インキュベーション時間および／またはサ
ンプルの前処理により全体的に測定時間を長くする（１
０分以上）。
【００１８】しかしながら、プロテインＣシステムの潜
在能の分析に有利な方法は、現在用いられている凝固計
でのルーチンな測定を可能にし、すなわち短い（１０秒
未満）測定時間の使用およびフィブリン血餅の旧来の測
定方法の実施を可能にする方法である。
在能の分析に有利な方法は、現在用いられている凝固計
でのルーチンな測定を可能にし、すなわち短い（１０秒
未満）測定時間の使用およびフィブリン血餅の旧来の測
定方法の実施を可能にする方法である。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、旧来の方法および短い測定時間を用いてプロテ
インＣシステムの潜在能の測定をも可能にする方法を見
出すことであった。他の目的は、このような試験が同時
にアンチトロンビンIIIにおける障害も検出できること
であった。
目的は、旧来の方法および短い測定時間を用いてプロテ
インＣシステムの潜在能の測定をも可能にする方法を見
出すことであった。他の目的は、このような試験が同時
にアンチトロンビンIIIにおける障害も検出できること
であった。
【００２０】US 5,525,478 に Matschiner はプロテイ
ンＣの潜在能を測定する方法を記載している。この方法
では、サンプルは接触相アクティベーターとインキュベ
ートし、ついで塩化カルシウム単独に代えて塩化カルシ
ウムとトロンボモジュリンの混合物で活性化する。Mats
chiner は１Ｕの（ウサギ）トロンボモジュリン／mlを
添加した場合、ＡＰＴＴでの血液凝固時間は３６秒から
１５６秒に延長されると述べている。さらに Matschine
r は、これに由来し、この試験に使用する前にサンプル
をプロテインＣ欠損血漿またはプロテインＳ欠損血漿と
混合することによってプロテインＣおよびプロテインＳ
を測定する方法を記載している。本発明者ら自身の実験
では（実施例３参照）、ＡＰＴＴにおける血液凝固時間
を約３０秒から約１６０秒に延長するためには、５μg
の（ウサギ）トロンボモジュリン／ml（総試験アッセイ
に基づいて）の添加が必要であることを確認した。
ンＣの潜在能を測定する方法を記載している。この方法
では、サンプルは接触相アクティベーターとインキュベ
ートし、ついで塩化カルシウム単独に代えて塩化カルシ
ウムとトロンボモジュリンの混合物で活性化する。Mats
chiner は１Ｕの（ウサギ）トロンボモジュリン／mlを
添加した場合、ＡＰＴＴでの血液凝固時間は３６秒から
１５６秒に延長されると述べている。さらに Matschine
r は、これに由来し、この試験に使用する前にサンプル
をプロテインＣ欠損血漿またはプロテインＳ欠損血漿と
混合することによってプロテインＣおよびプロテインＳ
を測定する方法を記載している。本発明者ら自身の実験
では（実施例３参照）、ＡＰＴＴにおける血液凝固時間
を約３０秒から約１６０秒に延長するためには、５μg
の（ウサギ）トロンボモジュリン／ml（総試験アッセイ
に基づいて）の添加が必要であることを確認した。
【００２１】類似の測定はまた、組換えトロンボモジュ
リンを用いても実施された。期待されたように、血液凝
固時間は延長されることが見出された（Ohishiら、Thro
mb.Haemostas, 1993；70：423-426）。しかしながら興
味あることに、この作用はきわめて弱い（血漿中約１μ
gのトロンボモジュリン／ml；血漿中約１Ｕのトロンボ
モジュリン／mlにおいて約150秒)。しかしながら、この
作用は、この場合のように、トロンボモジュリン非添加
時の血液凝固時間がきわめて長い（450秒）場合にのみ
明らかである。これらの長い血液凝固時間に伴って、ト
ロンビン形成における遅延は血餅形成に対してし不均衡
な作用を有し、そのため、１５０秒までのこの延長は、
トロンボモジュリンの存在しない場合のはるかに短い基
本的な血液凝固時間に伴って起こる Matschiner によっ
て記載された延長と比較することはできない。この長い
血液凝固時間は塩化カルシウムできわめて高度に希釈さ
れたトロンボプラスチン試薬を用いることにより得られ
た。これらの長い血液凝固時間（300秒以上）は、測定
の精度がきわめて低いことから当業者によっては批判的
に見られている。血液凝固因子特に補因子ＶおよびVIII
はわずかな変動でも血液凝固時間の不均衡に大きな増大
を招来する。しかも長い測定時間は定常条件下における
サンプルの処理量を低下させるので、ルーチンの測定に
は実用的ではない。
リンを用いても実施された。期待されたように、血液凝
固時間は延長されることが見出された（Ohishiら、Thro
mb.Haemostas, 1993；70：423-426）。しかしながら興
味あることに、この作用はきわめて弱い（血漿中約１μ
gのトロンボモジュリン／ml；血漿中約１Ｕのトロンボ
モジュリン／mlにおいて約150秒)。しかしながら、この
作用は、この場合のように、トロンボモジュリン非添加
時の血液凝固時間がきわめて長い（450秒）場合にのみ
明らかである。これらの長い血液凝固時間に伴って、ト
ロンビン形成における遅延は血餅形成に対してし不均衡
な作用を有し、そのため、１５０秒までのこの延長は、
トロンボモジュリンの存在しない場合のはるかに短い基
本的な血液凝固時間に伴って起こる Matschiner によっ
て記載された延長と比較することはできない。この長い
血液凝固時間は塩化カルシウムできわめて高度に希釈さ
れたトロンボプラスチン試薬を用いることにより得られ
た。これらの長い血液凝固時間（300秒以上）は、測定
の精度がきわめて低いことから当業者によっては批判的
に見られている。血液凝固因子特に補因子ＶおよびVIII
はわずかな変動でも血液凝固時間の不均衡に大きな増大
を招来する。しかも長い測定時間は定常条件下における
サンプルの処理量を低下させるので、ルーチンの測定に
は実用的ではない。
【００２２】高度に希釈したＰＴに代えて正常なＰＴを
使用すると、きわめて大量を用いることによりトロンボ
モジュリンの抗凝固作用を証明することしかできない。
これは Takahashiら（Tromb Haemostas, 1995；73：805
-811）により実施された研究から明らかである。これに
よると、尿から濃縮したトロンボモジュリンを正常血漿
に加えて正常なＰＴを実施し、トロンボモジュリンなし
での血液凝固時間約１３秒を得ている。血液凝固時間は
きわめて高濃度の添加によって延長されたが、1000Ｕ／
mlでも血液凝固時間の延長は約１７秒にすぎなかった。
これは、正常人とプロテインＣシステムの欠損を有する
患者との間の識別には不適当である。
使用すると、きわめて大量を用いることによりトロンボ
モジュリンの抗凝固作用を証明することしかできない。
これは Takahashiら（Tromb Haemostas, 1995；73：805
-811）により実施された研究から明らかである。これに
よると、尿から濃縮したトロンボモジュリンを正常血漿
に加えて正常なＰＴを実施し、トロンボモジュリンなし
での血液凝固時間約１３秒を得ている。血液凝固時間は
きわめて高濃度の添加によって延長されたが、1000Ｕ／
mlでも血液凝固時間の延長は約１７秒にすぎなかった。
これは、正常人とプロテインＣシステムの欠損を有する
患者との間の識別には不適当である。
【００２３】驚くべきことに、コンドロイチナーゼＡＢ
Ｃを用いてヘパリン様グリコシル化を除去したトロンボ
プラスチンは、Matschiner によって記載された方法に
おいて血液凝固時間の著しい延長は示さないことが見出
された。
Ｃを用いてヘパリン様グリコシル化を除去したトロンボ
プラスチンは、Matschiner によって記載された方法に
おいて血液凝固時間の著しい延長は示さないことが見出
された。
【００２４】組換えによって製造されたトロンボモジュ
リンも、トロンビンがアンチトロンビンIIIによって不
活性化される速度を増大させる（作用Ｂ）のに適当なグ
リコシル化を欠き、すなわち、トロンビンに対する補因
子としてプロテインＣを活性化する性質（作用Ａ）のみ
を有する。
リンも、トロンビンがアンチトロンビンIIIによって不
活性化される速度を増大させる（作用Ｂ）のに適当なグ
リコシル化を欠き、すなわち、トロンビンに対する補因
子としてプロテインＣを活性化する性質（作用Ａ）のみ
を有する。
【００２５】したがって、本発明は抗血液凝固潜在能を
測定するためのスクリーニング方法を提供する目的に基
づくものであった。抗血液凝固潜在能とは、トロンビン
形成に基づく血液凝固試験において、トロンビンの直接
阻害および／またはトロンビンの形成の遅延により血液
凝固時間の延長をもたらす血漿の性質を意味するものと
理解すべきである。
測定するためのスクリーニング方法を提供する目的に基
づくものであった。抗血液凝固潜在能とは、トロンビン
形成に基づく血液凝固試験において、トロンビンの直接
阻害および／またはトロンビンの形成の遅延により血液
凝固時間の延長をもたらす血漿の性質を意味するものと
理解すべきである。
【００２６】スクリーニング方法には特殊な要件があ
る。それらは大量のサンプルをきわめて確実に、しかも
短時間に処理することを意図するため、それらの測定時
間は５分を越えてはならず、有利には、１工程アッセイ
で実施できる必要がある。１工程アッセイとは、試薬の
添加の間にプレインキュベーション時間を要しない試験
を意味するものと理解すべきである。比較的大きな集団
をスクリーニングする目的では、可能な限り再現性よく
製造できる試薬、たとえば組換えタンパク質、この場合
にはたとえば組換えトロンボモジュリンを使用するのが
有利である。したがって、スクリーニング方法はまた、
その起源が何であれ、このような組換えトロンボプラス
チンで操作可能でなければならない。この目的は請求の
範囲に掲げる実施態様によって達成された。
る。それらは大量のサンプルをきわめて確実に、しかも
短時間に処理することを意図するため、それらの測定時
間は５分を越えてはならず、有利には、１工程アッセイ
で実施できる必要がある。１工程アッセイとは、試薬の
添加の間にプレインキュベーション時間を要しない試験
を意味するものと理解すべきである。比較的大きな集団
をスクリーニングする目的では、可能な限り再現性よく
製造できる試薬、たとえば組換えタンパク質、この場合
にはたとえば組換えトロンボモジュリンを使用するのが
有利である。したがって、スクリーニング方法はまた、
その起源が何であれ、このような組換えトロンボプラス
チンで操作可能でなければならない。この目的は請求の
範囲に掲げる実施態様によって達成された。
【００２７】
【課題を解決するための手段】本発明は、外因的に添加
したトロンボモジュリンの存在下にサンプルの抗血液凝
固潜在能を測定または診断する方法であって、 ａ) サンプル、好ましくは血漿サンプルに、以下の試
薬： ｉ) トロンビンと複合体を形成することができる外因性
トロンボモジュリン（この複合体はサンプル中のプロテ
インＣ、内因性プロテインＣもしくは外因的に添加され
たプロテインＣを活性化できる）、 ii) さらに中間インキュベーションを行わなくても、ト
ロンビンを形成するプロトロンビンの活性化を導くアツ
ティベーター（プロトロンビンは内因性プロトロンビン
または外因的に添加されたプロトロンビンのいずれでも
よい）、 iii) リン脂質、 iv) カルシウムイオン、および ｖ) 血液凝固試験の至適化に一般的に使用される他の付
加的試薬を添加する工程、 ｂ) プロトロンビンアクティベーター含有試薬の添加に
より反応を開始させる工程、および ｃ) フィブリン血餅形成までの時間の測定または標識ト
ロンビン基質の変換速度により決定する、トロンビン基
質の変換速度により測定することによりトロンビンの形
成を定量する工程からなる方法に関する。
したトロンボモジュリンの存在下にサンプルの抗血液凝
固潜在能を測定または診断する方法であって、 ａ) サンプル、好ましくは血漿サンプルに、以下の試
薬： ｉ) トロンビンと複合体を形成することができる外因性
トロンボモジュリン（この複合体はサンプル中のプロテ
インＣ、内因性プロテインＣもしくは外因的に添加され
たプロテインＣを活性化できる）、 ii) さらに中間インキュベーションを行わなくても、ト
ロンビンを形成するプロトロンビンの活性化を導くアツ
ティベーター（プロトロンビンは内因性プロトロンビン
または外因的に添加されたプロトロンビンのいずれでも
よい）、 iii) リン脂質、 iv) カルシウムイオン、および ｖ) 血液凝固試験の至適化に一般的に使用される他の付
加的試薬を添加する工程、 ｂ) プロトロンビンアクティベーター含有試薬の添加に
より反応を開始させる工程、および ｃ) フィブリン血餅形成までの時間の測定または標識ト
ロンビン基質の変換速度により決定する、トロンビン基
質の変換速度により測定することによりトロンビンの形
成を定量する工程からなる方法に関する。
【００２８】
【発明の実施の態様】サンプルとしては静脈または毛細
血管からの全血および血漿、好ましくは加クエン酸塩血
漿が使用できる。
血管からの全血および血漿、好ましくは加クエン酸塩血
漿が使用できる。
【００２９】中間インキュベーションを行わなくてもプ
ロトロンビンの活性化を導き、トロンビンを形成させる
プロトロンビンアクティベーターとしては、以下のもの
を使用するのが好ましい：血液凝固XａもしくはＶａ因
子またはＸａ／Ｖａ複合体、蛇毒からのプロトロンビン
アクティベーター、たとえば当業者にはそれ自体既知の
エカリンもしくはテキスタリン（Rosing J., Tans G.,
Thromb. Haemostas, 1991；65：627-630)、または血液
凝固Ｘ因子アクティベーターたとえば血液凝固IXａ因
子、VIIIａ因子もしくはIXａ／VIIIａ複合体、または蛇
毒からの血液凝固Ｘおよび／もしくはＶ因子アクティベ
ーター、たとえば、当業者にはそれ自体既知のラッセル
の蛇毒、しかしながら好ましくは、ウサギ脳もしくは肺
またはヒト胎盤からのトロンボプラスチン含有試薬たと
えば Thromborel S（Behring Diagnosticsより）または
組換え起源のたとえば Innovin（Dade社より）もしくは
Thromborel R（Behring Diagnostics社より）の添加に
よるものである。
ロトロンビンの活性化を導き、トロンビンを形成させる
プロトロンビンアクティベーターとしては、以下のもの
を使用するのが好ましい：血液凝固XａもしくはＶａ因
子またはＸａ／Ｖａ複合体、蛇毒からのプロトロンビン
アクティベーター、たとえば当業者にはそれ自体既知の
エカリンもしくはテキスタリン（Rosing J., Tans G.,
Thromb. Haemostas, 1991；65：627-630)、または血液
凝固Ｘ因子アクティベーターたとえば血液凝固IXａ因
子、VIIIａ因子もしくはIXａ／VIIIａ複合体、または蛇
毒からの血液凝固Ｘおよび／もしくはＶ因子アクティベ
ーター、たとえば、当業者にはそれ自体既知のラッセル
の蛇毒、しかしながら好ましくは、ウサギ脳もしくは肺
またはヒト胎盤からのトロンボプラスチン含有試薬たと
えば Thromborel S（Behring Diagnosticsより）または
組換え起源のたとえば Innovin（Dade社より）もしくは
Thromborel R（Behring Diagnostics社より）の添加に
よるものである。
【００３０】添加するリン脂質は、天然または合成起源
のいずれでもよく、好ましくはヒトもしくは動物起源の
胎盤、肺、脳もしくは血小板の組織抽出物から得られ、
また大豆のような植物からの抽出物も好ましい。リン脂
質は有利には、試験アッセイ中に０.００１％〜１.０％
（w／v）、好ましくは０.００５％〜０.５％、特に好ま
しくは０.０１５％〜０.１５％の濃度が得られる量が添
加される。
のいずれでもよく、好ましくはヒトもしくは動物起源の
胎盤、肺、脳もしくは血小板の組織抽出物から得られ、
また大豆のような植物からの抽出物も好ましい。リン脂
質は有利には、試験アッセイ中に０.００１％〜１.０％
（w／v）、好ましくは０.００５％〜０.５％、特に好ま
しくは０.０１５％〜０.１５％の濃度が得られる量が添
加される。
【００３１】この新規な方法は特定の血液凝固因子の欠
陥を選択的に測定するためにも使用できる。このために
は、その試験では一緒に検出されない血液凝固因子を含
有する溶液を、用いられるサンプルに、好ましくはサン
プルを試験に使用する前に添加する。特に興味がある血
液凝固因子は、たとえばＡＴ III、プロテインＳ、プロ
テインＣ、血液凝固Ｖ因子およびプロトロンビン、また
はそれらの変異体である。
陥を選択的に測定するためにも使用できる。このために
は、その試験では一緒に検出されない血液凝固因子を含
有する溶液を、用いられるサンプルに、好ましくはサン
プルを試験に使用する前に添加する。特に興味がある血
液凝固因子は、たとえばＡＴ III、プロテインＳ、プロ
テインＣ、血液凝固Ｖ因子およびプロトロンビン、また
はそれらの変異体である。
【００３２】ヘパリンによる干渉を除去するためには、
サンプル中に存在するヘパリンは、たとえばヘパリナー
ゼ、またはアミンたとえばポリリジン、ヘキサジメトリ
ン、スペルミン、スペルジミンもしくは硫酸プロタミン
を用いて分解もしくは中和できるし、また期待されるヘ
パリン濃度に比べて可能な限り大量な過剰、好ましく
は、試験アッセイに０.１〜１０Ｕ／ml、特に好ましく
は０.３〜３Ｕ／ml、特にきわめて好ましくは０.７Ｕ／
mlを添加することができる。
サンプル中に存在するヘパリンは、たとえばヘパリナー
ゼ、またはアミンたとえばポリリジン、ヘキサジメトリ
ン、スペルミン、スペルジミンもしくは硫酸プロタミン
を用いて分解もしくは中和できるし、また期待されるヘ
パリン濃度に比べて可能な限り大量な過剰、好ましく
は、試験アッセイに０.１〜１０Ｕ／ml、特に好ましく
は０.３〜３Ｕ／ml、特にきわめて好ましくは０.７Ｕ／
mlを添加することができる。
【００３３】異なるトロンボモジュリンの効果について
行った調査から、トロンビンの阻害はトロンボモジュリ
ンの数種の性質の一つのみではなく、プロテインＣシス
テムによる抗血液凝固活性の前提条件であることが結論
付けられた。この発見は新規である。さらに、トロンボ
モジュリンのグリコシル化がアンチトロンビンIIIの抗
血液凝固作用の促進に関与し、その結果、この新規な方
法はプロテインＣシステムに加えて他の重要な抗血液凝
固機構、すなわちアンチトロンビンIIIそれ自体を測定
する。したがって、本明細書には、血液凝固を調節する
重要な両機構を決定する方法がはじめて記載される。
行った調査から、トロンビンの阻害はトロンボモジュリ
ンの数種の性質の一つのみではなく、プロテインＣシス
テムによる抗血液凝固活性の前提条件であることが結論
付けられた。この発見は新規である。さらに、トロンボ
モジュリンのグリコシル化がアンチトロンビンIIIの抗
血液凝固作用の促進に関与し、その結果、この新規な方
法はプロテインＣシステムに加えて他の重要な抗血液凝
固機構、すなわちアンチトロンビンIIIそれ自体を測定
する。したがって、本明細書には、血液凝固を調節する
重要な両機構を決定する方法がはじめて記載される。
【００３４】この驚くべき作用の原因は、多分、トロン
ビンの阻害に伴うフィブリノーゲン切断の阻害である以
上に、血液凝固Ｖ因子活性化の阻害であろうと考えられ
る。血液凝固Ｖ因子の限りない活性化は、ファクター約
１０,０００のオーダーまで増大したトロンビンの供給
を招き、トロンボモジュリンは最早、このトロンビンを
効果的に捕獲することはできない。
ビンの阻害に伴うフィブリノーゲン切断の阻害である以
上に、血液凝固Ｖ因子活性化の阻害であろうと考えられ
る。血液凝固Ｖ因子の限りない活性化は、ファクター約
１０,０００のオーダーまで増大したトロンビンの供給
を招き、トロンボモジュリンは最早、このトロンビンを
効果的に捕獲することはできない。
【００３５】これらの新しい洞察に基づいて、正常血漿
に代えてアンチトロンビンIII欠損血漿を使用した場
合、トロンボモジュリンの存在下では、アンチトロンビ
ンIIIが、トロンボモジュリンと複合体化したトロンビ
ンの血液凝固促進活性を最早、中和できないので、血液
凝固時間の短縮化が期待される。プロテインＣシステム
に障害または欠損がある場合は、血液凝固時間の延長も
正常血漿に比べて顕著ではない。したがって、両システ
ムにおける障害は同じ方向に作用する。これは実施例６
にはじめて示された。
に代えてアンチトロンビンIII欠損血漿を使用した場
合、トロンボモジュリンの存在下では、アンチトロンビ
ンIIIが、トロンボモジュリンと複合体化したトロンビ
ンの血液凝固促進活性を最早、中和できないので、血液
凝固時間の短縮化が期待される。プロテインＣシステム
に障害または欠損がある場合は、血液凝固時間の延長も
正常血漿に比べて顕著ではない。したがって、両システ
ムにおける障害は同じ方向に作用する。これは実施例６
にはじめて示された。
【００３６】無傷のグリコシル化を有するトロンボモジ
ュリンは、したがって、プロテインＣシステムおよびア
ンチトロンビンIIIの生理学的機能を表わすために使用
されなければならない。すなわち、使用されるトロンボ
モジュリンはトロンビン阻害活性（活性Ｂ）およびプロ
テインＣ活性化活性（活性Ａ）の両方をもっていなけれ
ばならない。この洞察に基づき、トロンボプラスチン含
有試薬を使用して、血液凝固促進活性を測定することが
可能である。これは生理学的に関係がある外因性血液凝
固経路を表し、接触相を活性化するためにサンプルをプ
レインキュベートする必要がない（実施例３）。
ュリンは、したがって、プロテインＣシステムおよびア
ンチトロンビンIIIの生理学的機能を表わすために使用
されなければならない。すなわち、使用されるトロンボ
モジュリンはトロンビン阻害活性（活性Ｂ）およびプロ
テインＣ活性化活性（活性Ａ）の両方をもっていなけれ
ばならない。この洞察に基づき、トロンボプラスチン含
有試薬を使用して、血液凝固促進活性を測定することが
可能である。これは生理学的に関係がある外因性血液凝
固経路を表し、接触相を活性化するためにサンプルをプ
レインキュベートする必要がない（実施例３）。
【００３７】トロンボプラスチンに基づく方法を開発す
るためには、トロンボプラスチンの濃度を、トロンビン
の産生の進行がきわめて遅いので、この間に、活性化さ
れたプロテインＣが十分に形成され、血餅形成に必要な
トロンビンの産生が遅延するように選択されなければな
らない。このために、試薬中のトロンボプラスチン濃度
は、トロンボモジュリンの不存在下における正常血漿の
血液凝固時間が少なくとも２０秒、最高でも３００秒、
好ましくは４０〜１５０秒になるように調整される。こ
れは、たとえば市販のトロンボプラスチン試薬を希釈す
ることによって達成される。血液凝固活性に必要なカル
シウムイオンを含有する溶液を希釈のために使用するこ
とが好ましい。
るためには、トロンボプラスチンの濃度を、トロンビン
の産生の進行がきわめて遅いので、この間に、活性化さ
れたプロテインＣが十分に形成され、血餅形成に必要な
トロンビンの産生が遅延するように選択されなければな
らない。このために、試薬中のトロンボプラスチン濃度
は、トロンボモジュリンの不存在下における正常血漿の
血液凝固時間が少なくとも２０秒、最高でも３００秒、
好ましくは４０〜１５０秒になるように調整される。こ
れは、たとえば市販のトロンボプラスチン試薬を希釈す
ることによって達成される。血液凝固活性に必要なカル
シウムイオンを含有する溶液を希釈のために使用するこ
とが好ましい。
【００３８】さらに、試薬を希釈する場合にはリン脂質
も適当量（0.001〜１％w/v）および（好ましくは組織抽
出物たとえば血小板、肺、胎盤もしくは脳からまたは植
物起源からの）もので置換されなければならない。これ
らの起源は通常、活性化プロテインＣの活性に重要なリ
ン脂質、ホスファチジルエタノールアミンを十分高い割
合で含有する。しかしながら、この化合物はまたトロン
ボモジュリンの活性ＡおよびプロテインＣシステムを刺
激するため必要に応じて添加することもできる。
も適当量（0.001〜１％w/v）および（好ましくは組織抽
出物たとえば血小板、肺、胎盤もしくは脳からまたは植
物起源からの）もので置換されなければならない。これ
らの起源は通常、活性化プロテインＣの活性に重要なリ
ン脂質、ホスファチジルエタノールアミンを十分高い割
合で含有する。しかしながら、この化合物はまたトロン
ボモジュリンの活性ＡおよびプロテインＣシステムを刺
激するため必要に応じて添加することもできる。
【００３９】トロンボプラスチン濃度とトロンボモジュ
リン濃度の至適な組合せを決定するためには、特定の濃
度のトロンボモジュリンの存在下または不存在下におい
て、トロンボプラスチンの希釈度に関連して、血液凝固
時間を測定し、この測定を異なるトロンボモジュリン濃
度で反復して、曲線ファミリーを構築する（実施例４参
照）。
リン濃度の至適な組合せを決定するためには、特定の濃
度のトロンボモジュリンの存在下または不存在下におい
て、トロンボプラスチンの希釈度に関連して、血液凝固
時間を測定し、この測定を異なるトロンボモジュリン濃
度で反復して、曲線ファミリーを構築する（実施例４参
照）。
【００４０】試験アッセイの最終容量に基づいて０.５
〜５０μg／mlのトロンボモジュリン濃度の使用が好ま
しく、特に１〜１０μg／mlの濃度が好ましい。この曲
線ファミリーから以下の組合せが適当であることが見出
された。すなわちトロンボモジュリンの存在下に正常血
漿で、３００秒未満、特に好ましくは１５０秒未満の血
液凝固時間を示し、トロンボモジュリンの不存在下にお
ける血液凝固時間との関連での差が、トロンボモジュリ
ンの不存在下でのこの血液凝固時間の少なくとも５０
％、好ましくは１００〜３００％の組合せである。
〜５０μg／mlのトロンボモジュリン濃度の使用が好ま
しく、特に１〜１０μg／mlの濃度が好ましい。この曲
線ファミリーから以下の組合せが適当であることが見出
された。すなわちトロンボモジュリンの存在下に正常血
漿で、３００秒未満、特に好ましくは１５０秒未満の血
液凝固時間を示し、トロンボモジュリンの不存在下にお
ける血液凝固時間との関連での差が、トロンボモジュリ
ンの不存在下でのこの血液凝固時間の少なくとも５０
％、好ましくは１００〜３００％の組合せである。
【００４１】トロンボプラスチンは天然起源たとえばヒ
トまたは動物起源の胎盤、肺または脳に由来するもので
よく、また組換え手段により製造することもできる。
トまたは動物起源の胎盤、肺または脳に由来するもので
よく、また組換え手段により製造することもできる。
【００４２】トロンボモジュリンは、当業者にはそれ自
体周知の方法を用いて、天然起源、たとえばヒトまたは
動物起源の胎盤、肺または脳から単離することが好まし
い。トロンボモジュリンの特徴的な性質は、トロンボモ
ジュリン含有分画が、プロテインＣの活性化の提示に加
えてアンチトロンビンIIIによって増強される抗トロン
ビン作用を示すことである。
体周知の方法を用いて、天然起源、たとえばヒトまたは
動物起源の胎盤、肺または脳から単離することが好まし
い。トロンボモジュリンの特徴的な性質は、トロンボモ
ジュリン含有分画が、プロテインＣの活性化の提示に加
えてアンチトロンビンIIIによって増強される抗トロン
ビン作用を示すことである。
【００４３】トロンボモジュリンを組換えによって調製
することも知られている。活性Ｂは非グリコシル化組換
えトロンボモジュリンに、トロンボモジュリンを生化学
的にまたは化学的にヘパリン硫酸にカップリングさせる
ことによって翻訳後に付加しなければならない。これは
また、トロンボモジュリンをグリコシル化細胞たとえば
ヒト起源の細胞内で発現させることによっても達成され
る。驚くべきことに、トロンボモジュリンに結合しない
ヘパリン硫酸を加えることによっても、必要な作用が達
成されることも見出された（実施例７）。
することも知られている。活性Ｂは非グリコシル化組換
えトロンボモジュリンに、トロンボモジュリンを生化学
的にまたは化学的にヘパリン硫酸にカップリングさせる
ことによって翻訳後に付加しなければならない。これは
また、トロンボモジュリンをグリコシル化細胞たとえば
ヒト起源の細胞内で発現させることによっても達成され
る。驚くべきことに、トロンボモジュリンに結合しない
ヘパリン硫酸を加えることによっても、必要な作用が達
成されることも見出された（実施例７）。
【００４４】既知の凝集阻害剤、たとえばフィブリノー
ゲンをシアノーゲンブロミド、プラスミン、エラスター
ゼまたは他の既知の酵素たとえば蛇毒（たとえばMarkla
nd FS Jr., Thromb. Haemostas., 1991；65：438-443参
照)で開裂して得られたフィブリン開裂生成物、あるい
はたとえば EP-A-O 456 152 に記載のようなＲＧＤ配列
を有する合成ペプチドを、未熟な血餅形成を回避するた
めに、試薬に添加することもできる。
ゲンをシアノーゲンブロミド、プラスミン、エラスター
ゼまたは他の既知の酵素たとえば蛇毒（たとえばMarkla
nd FS Jr., Thromb. Haemostas., 1991；65：438-443参
照)で開裂して得られたフィブリン開裂生成物、あるい
はたとえば EP-A-O 456 152 に記載のようなＲＧＤ配列
を有する合成ペプチドを、未熟な血餅形成を回避するた
めに、試薬に添加することもできる。
【００４５】当業者にはそれ自体周知の物質たとえばヘ
キサシアノ酸鉄カリウム、ビタミンＣ、グルタチオン、
尿酸、ハイドロキノン、トコフェロール、ブチルヒドロ
キシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニリン、
ユビキノンまたは酵素たとえばスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはカタラーゼを試薬中のトロンボモジュリ
ンまたはリン脂質の酸化を防止するための酸化保護に使
用できる。
キサシアノ酸鉄カリウム、ビタミンＣ、グルタチオン、
尿酸、ハイドロキノン、トコフェロール、ブチルヒドロ
キシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニリン、
ユビキノンまたは酵素たとえばスーパーオキシドジスム
ターゼもしくはカタラーゼを試薬中のトロンボモジュリ
ンまたはリン脂質の酸化を防止するための酸化保護に使
用できる。
【００４６】この新規な方法に基づき、抗血液凝固シス
テムの個々の部分を、試薬またはサンプルに添加するこ
とによって可視化することができる。すなわち、たとえ
ばプロテインＣシステムの障害のみを検出するようにア
ンチトロンビンIIIを加えることができる。逆に、プロ
テインＣシステムの障害を排除するためには、サンプル
を、たとえばアンチトロンビンIII欠損血漿と混合する
ことができる。さらに、プロテインＣシステムの１種以
上の因子を含まない血漿は、これが天然のたとえば先天
性の欠損血漿によるものであれ、これらの因子がたとえ
ば免疫吸着のような技術を用いて除去されたものであ
れ、混合に使用する血漿中に存在しない因子の障害のみ
が明らかになるように、サンプル血漿への添加に使用す
ることができる。リン脂質たとえば血小板からのリン脂
質も、抗リン脂質抗体たとえばループス抗血液凝固剤を
中和するため、試薬にまたは直接サンプルおよび／もし
くは欠損血漿に添加することができる。
テムの個々の部分を、試薬またはサンプルに添加するこ
とによって可視化することができる。すなわち、たとえ
ばプロテインＣシステムの障害のみを検出するようにア
ンチトロンビンIIIを加えることができる。逆に、プロ
テインＣシステムの障害を排除するためには、サンプル
を、たとえばアンチトロンビンIII欠損血漿と混合する
ことができる。さらに、プロテインＣシステムの１種以
上の因子を含まない血漿は、これが天然のたとえば先天
性の欠損血漿によるものであれ、これらの因子がたとえ
ば免疫吸着のような技術を用いて除去されたものであ
れ、混合に使用する血漿中に存在しない因子の障害のみ
が明らかになるように、サンプル血漿への添加に使用す
ることができる。リン脂質たとえば血小板からのリン脂
質も、抗リン脂質抗体たとえばループス抗血液凝固剤を
中和するため、試薬にまたは直接サンプルおよび／もし
くは欠損血漿に添加することができる。
【００４７】プロテインＣシステムによる血液凝固活性
の明瞭に認識可能な遅延を生じさせためには、トロンボ
モジュリンの抗血液凝固作用（活性Ｂ）が必要であると
いう観察は、炭水化物部分の生物学的重要性および診断
的使用に関して新しい解釈を導く。糖タンパク質の炭水
化物部分の真の生物学的な意味はこれまで不明である。
一般に、考察は循環中における半減期に対する影響の可
能性のみに集中している（Paulson JC, TIBS, 1989；1
4：272-275)。しかしながら、糖尿病が比較的高頻度の
血栓症を特に動脈血管系に示すことは知られている。こ
こで得られた結論に基づくと、トロンビンに対する抗血
液凝固作用がプロテインＣの抗血液凝固活性の前提要件
であり、他方、炭水化物部分の適切な合成の障害が糖尿
病においても起こり得ることが知られていることから、
糖尿病におけるトロンボモジュリンの抗トロンビン活性
の喪失は血栓症の危険の増大を招来する病理学的機構に
重要な役割を果たしているものと推察される。
の明瞭に認識可能な遅延を生じさせためには、トロンボ
モジュリンの抗血液凝固作用（活性Ｂ）が必要であると
いう観察は、炭水化物部分の生物学的重要性および診断
的使用に関して新しい解釈を導く。糖タンパク質の炭水
化物部分の真の生物学的な意味はこれまで不明である。
一般に、考察は循環中における半減期に対する影響の可
能性のみに集中している（Paulson JC, TIBS, 1989；1
4：272-275)。しかしながら、糖尿病が比較的高頻度の
血栓症を特に動脈血管系に示すことは知られている。こ
こで得られた結論に基づくと、トロンビンに対する抗血
液凝固作用がプロテインＣの抗血液凝固活性の前提要件
であり、他方、炭水化物部分の適切な合成の障害が糖尿
病においても起こり得ることが知られていることから、
糖尿病におけるトロンボモジュリンの抗トロンビン活性
の喪失は血栓症の危険の増大を招来する病理学的機構に
重要な役割を果たしているものと推察される。
【００４８】これはトロンボモジュリンのグリコシル化
または活性Ａ（抗トロンビン作用）の活性Ｂ（プロテイ
ンＣ活性化）との関連での検出は、血管表面におけるプ
ロテインＣの抗血液凝固潜在能の診断のための重要なマ
ーカーであり、したがって血栓症、特に動脈血管系血栓
症の危険の評価に使用できることを意味する。この分析
は、内皮に対する障害の進行を決定するため、糖尿病ま
たはメチオニン代謝の障害（高ホモシステイン血症）に
冒されている患者に行うのが好ましい。この分析はま
た、内皮の代謝における障害を伴う他の疾患たとえば腫
瘍、動脈硬化、自己免疫疾患または他の炎症疾患の場合
に重要で、予後判定または治療に有用な情報を提供でき
る。
または活性Ａ（抗トロンビン作用）の活性Ｂ（プロテイ
ンＣ活性化）との関連での検出は、血管表面におけるプ
ロテインＣの抗血液凝固潜在能の診断のための重要なマ
ーカーであり、したがって血栓症、特に動脈血管系血栓
症の危険の評価に使用できることを意味する。この分析
は、内皮に対する障害の進行を決定するため、糖尿病ま
たはメチオニン代謝の障害（高ホモシステイン血症）に
冒されている患者に行うのが好ましい。この分析はま
た、内皮の代謝における障害を伴う他の疾患たとえば腫
瘍、動脈硬化、自己免疫疾患または他の炎症疾患の場合
に重要で、予後判定または治療に有用な情報を提供でき
る。
【００４９】２つの活性の比は、血漿中に自然に生じる
トロンボモジュリンの分解生成物の使用および患者の自
然の組織の分析による両方法のいずれでも検出できる。
２つの活性は、たとえば Preissnerら（J. Biol. Che
m., 1990；265：4915-4922）に記載されたように、色原
体試験で別個に測定される（実施例１参照）。測定を行
う前に、トロンボモジュリンは残ったマトリックス（た
とえば、血漿構成成分）から分離することが好ましい。
トロンボモジュリンに対する抗体で被覆された固相、た
とえばマイクロタイタープレート、試験ストリップまた
は試験モジュールからなる試験キットがこの目的に適し
ている。最初のインキュベーション工程において、トロ
ンボモジュリンは固相に結合し、ついで干渉するマトリ
ックスは洗浄によって除去される。その後に、２つの活
性の比率が別個の試験アッセイにおいて色原体試験によ
り測定される。
トロンボモジュリンの分解生成物の使用および患者の自
然の組織の分析による両方法のいずれでも検出できる。
２つの活性は、たとえば Preissnerら（J. Biol. Che
m., 1990；265：4915-4922）に記載されたように、色原
体試験で別個に測定される（実施例１参照）。測定を行
う前に、トロンボモジュリンは残ったマトリックス（た
とえば、血漿構成成分）から分離することが好ましい。
トロンボモジュリンに対する抗体で被覆された固相、た
とえばマイクロタイタープレート、試験ストリップまた
は試験モジュールからなる試験キットがこの目的に適し
ている。最初のインキュベーション工程において、トロ
ンボモジュリンは固相に結合し、ついで干渉するマトリ
ックスは洗浄によって除去される。その後に、２つの活
性の比率が別個の試験アッセイにおいて色原体試験によ
り測定される。
【００５０】さらに、患者の血液または組織から単離さ
れたトロンボモジュリンがグリコシル化されている程度
は、当業者には周知の方法を用いて直接測定することが
できる。それらの結果、たとえば活性Ａと活性Ｂの比ま
たはその逆は、合成における障害の重篤度の指標として
および／または血栓症の危険の増大のインディケーター
として有用である。
れたトロンボモジュリンがグリコシル化されている程度
は、当業者には周知の方法を用いて直接測定することが
できる。それらの結果、たとえば活性Ａと活性Ｂの比ま
たはその逆は、合成における障害の重篤度の指標として
および／または血栓症の危険の増大のインディケーター
として有用である。
【００５１】
【実施例】以下の実施例は本発明の例示のみを意図する
ものであり、本発明を限定するものではない。特に指示
がない限り、使用した試薬および装置は、Behring Diag
nostics GmbH から入手した。
ものであり、本発明を限定するものではない。特に指示
がない限り、使用した試薬および装置は、Behring Diag
nostics GmbH から入手した。
【００５２】実施例 １ トロンボモジュリン活性Ａ（プロテインＣ活性化）の色
素原測定 トロンボモジュリンの活性の色素原測定は Salemら、Jo
urnal of BiologicalChemistry, 259巻, 19号, 12246-1
2251頁（1984）に基づくものである。試験はBehring Co
agulation Timer（Behring Diagnostics社製）を用いて
実施した。すなわち５０μlのサンプルを５０mM Ｔris-
ＨＣl、２００mM ＮaＣl、５mM ＭnＣl2、１％ウシ血清
アルブミン、ｐＨ ７.３中５０μgのプロテインＣ／ml
および６μgのトロンビン／mlからなる５０μlの試薬１
と混合して，全体を５分間インキュベートした。この間
に，トロンビンはサンプル中に存在するトロンボモジュ
リンとともに作用して、プロテインＣを活性化して活性
化プロテインＣを形成する。この活性化は，阻害剤カク
テル（50mM Tris-HCl、100mM NaCl、５mM EDTA、pH 7.4
中50ＵのアンチトロンビンIII／ml、５アンチトロンビ
ン単位のヒルジン／ml、および１Ｕの非分画化ヘパリン
／ml）の添加により中断し、その３０秒後に、５０μl
の色素原プロテインＣ基質（Berichrom protein C；Beh
ringDiagnostics社製から構成される）を加える。発色
を４０５nmで３０秒間モニターし、これから１分間あた
りの吸光度の変化（ΔＵ/分）を計算する。この変化は
サンプル中のトロンボモジュリンの量に比例する。表１
に掲げる値は、ウサギトロンボモジュリン（American D
iagnostics社製；タンパク質 1000Ｕ/mlから）によって
得られた。 表１は、色素原試験によるトロンボモジュリン活性の測
定結果を示す（TM deglyc.＝コンドロイチナーゼ処理ト
ロンボモジュリン；実施例２参照）。
素原測定 トロンボモジュリンの活性の色素原測定は Salemら、Jo
urnal of BiologicalChemistry, 259巻, 19号, 12246-1
2251頁（1984）に基づくものである。試験はBehring Co
agulation Timer（Behring Diagnostics社製）を用いて
実施した。すなわち５０μlのサンプルを５０mM Ｔris-
ＨＣl、２００mM ＮaＣl、５mM ＭnＣl2、１％ウシ血清
アルブミン、ｐＨ ７.３中５０μgのプロテインＣ／ml
および６μgのトロンビン／mlからなる５０μlの試薬１
と混合して，全体を５分間インキュベートした。この間
に，トロンビンはサンプル中に存在するトロンボモジュ
リンとともに作用して、プロテインＣを活性化して活性
化プロテインＣを形成する。この活性化は，阻害剤カク
テル（50mM Tris-HCl、100mM NaCl、５mM EDTA、pH 7.4
中50ＵのアンチトロンビンIII／ml、５アンチトロンビ
ン単位のヒルジン／ml、および１Ｕの非分画化ヘパリン
／ml）の添加により中断し、その３０秒後に、５０μl
の色素原プロテインＣ基質（Berichrom protein C；Beh
ringDiagnostics社製から構成される）を加える。発色
を４０５nmで３０秒間モニターし、これから１分間あた
りの吸光度の変化（ΔＵ/分）を計算する。この変化は
サンプル中のトロンボモジュリンの量に比例する。表１
に掲げる値は、ウサギトロンボモジュリン（American D
iagnostics社製；タンパク質 1000Ｕ/mlから）によって
得られた。 表１は、色素原試験によるトロンボモジュリン活性の測
定結果を示す（TM deglyc.＝コンドロイチナーゼ処理ト
ロンボモジュリン；実施例２参照）。
【００５３】
【表１】
【００５４】実施例 ２ トロンボモジュリンの炭水化物部分の除去 トロンボモジュリンのヘパリン部分の除去の目的のため
に、３０μlのコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液（10Ｕ/m
l、Sigmaから）を５０mM Ｔris−ＨＣl、ｐＨ８.０中、
ウサギトロンボモジュリン（American Diagnosticsか
ら)３０μg／mlを含む溶液１mlに加え、混合物を＋３７
℃で一夜インキュベートした。処理したトロンボモジュ
リンを実施例１からの試薬緩衝液中、０.５μg／mlに希
釈して試験した。０.５μg／mlでは前処理したトロンボ
モジュリンは０.６μgの非処理トロンボモジュリン／ml
に相当する活性を示した。すなわち、プロテインＣ活性
化活性は低下せず、逆にわずかながら上昇した。
に、３０μlのコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液（10Ｕ/m
l、Sigmaから）を５０mM Ｔris−ＨＣl、ｐＨ８.０中、
ウサギトロンボモジュリン（American Diagnosticsか
ら)３０μg／mlを含む溶液１mlに加え、混合物を＋３７
℃で一夜インキュベートした。処理したトロンボモジュ
リンを実施例１からの試薬緩衝液中、０.５μg／mlに希
釈して試験した。０.５μg／mlでは前処理したトロンボ
モジュリンは０.６μgの非処理トロンボモジュリン／ml
に相当する活性を示した。すなわち、プロテインＣ活性
化活性は低下せず、逆にわずかながら上昇した。
【００５５】実施例 ３ トロンボモジュリンの添加によるＡＰＴＴの延長 Matschiner（US 5,525,478）の記載のように、接触相を
活性化するために、正常ドナーからの血漿プール５０μ
lに、ＡＰＴＴ試薬（アクチン；Dade社から入手）５０
μlを加え、混合物を＋３７℃で１２０秒間インキュベ
ートした。５０μlのトロンボモジュリン（ウサギか
ら；生理食塩溶液中 15μg/ml）を、ＡＰＴＴの場合に
は添加される塩化カルシウムに代えて加え、その後にの
み塩化カルシウム（25mmol／L）を加えて血液凝固を誘
導した。結果は表２に掲げる。結果はまず第一に、トロ
ンボモジュリンが存在する場合、血液凝固時間が正常サ
ンプルに比べて延長することを示している。これは Mat
schiner のデータに一致する。
活性化するために、正常ドナーからの血漿プール５０μ
lに、ＡＰＴＴ試薬（アクチン；Dade社から入手）５０
μlを加え、混合物を＋３７℃で１２０秒間インキュベ
ートした。５０μlのトロンボモジュリン（ウサギか
ら；生理食塩溶液中 15μg/ml）を、ＡＰＴＴの場合に
は添加される塩化カルシウムに代えて加え、その後にの
み塩化カルシウム（25mmol／L）を加えて血液凝固を誘
導した。結果は表２に掲げる。結果はまず第一に、トロ
ンボモジュリンが存在する場合、血液凝固時間が正常サ
ンプルに比べて延長することを示している。これは Mat
schiner のデータに一致する。
【００５６】しかしながら、プロテインＣ欠損血漿の場
合は、たとえもっと小さくても、類似の延長が認められ
る。この場合、本発明者らは、これは抗血液凝固補因子
VIIIａおよびＶａの不活性化（活性Ａ）に対するよりも
むしろトロンビンに対するトロンボモジュリンの阻害作
用（活性Ｂ）によるものと考えている。この実施例のよ
うに、グリコシル化を除去したトロンボモジュリンを用
いればこれは明瞭になる。驚くべきことに、除去された
活性Ｂによる血液凝固の延長のみでなく、活性Ａによる
の血液凝固の延長もほとんど完全に消失する（トロンボ
モジュリンの存在および不存在下のプロテインＣ欠損血
漿の間の差＝約２０秒）。これは以前には明らかにされ
ていなかった。活性Ｂは生理的条件（フィブリン形成）
下には活性Ａの必須要件であり、したがって、無傷のグ
リコシル化を有するトロンボモジュリンのみが血液凝固
試験に使用できるとの結論に導く。表２は、正常血漿お
よびプロテインＣ欠損血漿のＡＰＴＴに対するトロンボ
モジュリン(試験アッセイ中3.75μg/ml）の影響を示
す。与えられた値は血液凝固時間(秒)である。ＴＭ＝ト
ロンボモジュリン、Intact＝天然のグリコシル化された
トロンボモジュリン、Deglyc＝コンドロイチナーゼＡＢ
Ｃ処理後（実施例２参照）。
合は、たとえもっと小さくても、類似の延長が認められ
る。この場合、本発明者らは、これは抗血液凝固補因子
VIIIａおよびＶａの不活性化（活性Ａ）に対するよりも
むしろトロンビンに対するトロンボモジュリンの阻害作
用（活性Ｂ）によるものと考えている。この実施例のよ
うに、グリコシル化を除去したトロンボモジュリンを用
いればこれは明瞭になる。驚くべきことに、除去された
活性Ｂによる血液凝固の延長のみでなく、活性Ａによる
の血液凝固の延長もほとんど完全に消失する（トロンボ
モジュリンの存在および不存在下のプロテインＣ欠損血
漿の間の差＝約２０秒）。これは以前には明らかにされ
ていなかった。活性Ｂは生理的条件（フィブリン形成）
下には活性Ａの必須要件であり、したがって、無傷のグ
リコシル化を有するトロンボモジュリンのみが血液凝固
試験に使用できるとの結論に導く。表２は、正常血漿お
よびプロテインＣ欠損血漿のＡＰＴＴに対するトロンボ
モジュリン(試験アッセイ中3.75μg/ml）の影響を示
す。与えられた値は血液凝固時間(秒)である。ＴＭ＝ト
ロンボモジュリン、Intact＝天然のグリコシル化された
トロンボモジュリン、Deglyc＝コンドロイチナーゼＡＢ
Ｃ処理後（実施例２参照）。
【００５７】
【表２】
【００５８】実施例 ４ トロンボプラスチンおよびトロンボモジュリンの濃度に
依存する、トロンボモジュリンによる正常血漿のＰＴの
延長 新規な方法においては、プロテインＣシステムのスクリ
ーニング試験に適当な血液凝固時間の延長（20〜300
秒）を達成するためには、トロンボモジュリンの与えら
れた濃度に対する、トロンボプラスチン含有ＰＴ試薬の
適当な濃度を探さなければならない。このためには、１
部のトロンボモジュリン含有試薬（0.025％大豆リン脂
質を含むまたは含まない５０mM Ｔris−ＨＣl、ｐＨ７.
４中ウサギトロンボモジュリン）を１部のサンプルに加
え、異なる希釈度のＰＴ試薬で血液凝固反応を誘導した
（この場合、たとえば Thromborel S, Behring Diagnos
tics；２５mM塩化カルシウム溶液で希釈)。比較のため
に、トロンボモジュリンを添加しないで血液凝固時間を
測定した。
依存する、トロンボモジュリンによる正常血漿のＰＴの
延長 新規な方法においては、プロテインＣシステムのスクリ
ーニング試験に適当な血液凝固時間の延長（20〜300
秒）を達成するためには、トロンボモジュリンの与えら
れた濃度に対する、トロンボプラスチン含有ＰＴ試薬の
適当な濃度を探さなければならない。このためには、１
部のトロンボモジュリン含有試薬（0.025％大豆リン脂
質を含むまたは含まない５０mM Ｔris−ＨＣl、ｐＨ７.
４中ウサギトロンボモジュリン）を１部のサンプルに加
え、異なる希釈度のＰＴ試薬で血液凝固反応を誘導した
（この場合、たとえば Thromborel S, Behring Diagnos
tics；２５mM塩化カルシウム溶液で希釈)。比較のため
に、トロンボモジュリンを添加しないで血液凝固時間を
測定した。
【００５９】表３に記録された例は、トロンボモジュリ
ンの低濃度では、初期には血液凝固時間は、トロンボプ
ラスチンの希釈度を上昇させてもトロンボモジュリンを
加えない場合のＰＴの値と同じままであり、差は高希釈
度（この場合、１：1000）でのみ得られる。他方、トロ
ンボモジュリンの高濃度を選択した場合には、差は低希
釈度で既に認めることができる。この実験には，トロン
ボプラスチンの低希釈度では差が小さすぎることから、
トロンボモジュリン１.７μg／mlの存在下におけるトロ
ンボプラスチンの希釈度１：１００での最適な組合せが
選択される（実施例５も参照)。１：１００の希釈度で
は、１.４μg／mlの存在下の差は多少小さすぎて、一方
２.０μg／mlの存在下では多少大きすぎる。したがって
この方法は、Matschiner の方法の場合よりも試験アッ
セイに著しく低量のトロンボモジュリンを要求し、この
点で後者に比べて優れている。高希釈度では、リン脂質
が置換されなかった場合には、リン脂質が置換された場
合に比べてＴＭの存在および不存在下に長い血液凝固時
間が得られる（表４参照）。リン脂質が置換されない場
合、トロンボモジュリンを加えない対照試験とトロンボ
モジュリンを加えた実際のスクリーニング試験の間の差
は多少劣る。リン脂質が置換された場合には、これがこ
の方法におけるループス抗血液凝固剤に対する感度を低
下させるという事実を考慮しなければならない。
ンの低濃度では、初期には血液凝固時間は、トロンボプ
ラスチンの希釈度を上昇させてもトロンボモジュリンを
加えない場合のＰＴの値と同じままであり、差は高希釈
度（この場合、１：1000）でのみ得られる。他方、トロ
ンボモジュリンの高濃度を選択した場合には、差は低希
釈度で既に認めることができる。この実験には，トロン
ボプラスチンの低希釈度では差が小さすぎることから、
トロンボモジュリン１.７μg／mlの存在下におけるトロ
ンボプラスチンの希釈度１：１００での最適な組合せが
選択される（実施例５も参照)。１：１００の希釈度で
は、１.４μg／mlの存在下の差は多少小さすぎて、一方
２.０μg／mlの存在下では多少大きすぎる。したがって
この方法は、Matschiner の方法の場合よりも試験アッ
セイに著しく低量のトロンボモジュリンを要求し、この
点で後者に比べて優れている。高希釈度では、リン脂質
が置換されなかった場合には、リン脂質が置換された場
合に比べてＴＭの存在および不存在下に長い血液凝固時
間が得られる（表４参照）。リン脂質が置換されない場
合、トロンボモジュリンを加えない対照試験とトロンボ
モジュリンを加えた実際のスクリーニング試験の間の差
は多少劣る。リン脂質が置換された場合には、これがこ
の方法におけるループス抗血液凝固剤に対する感度を低
下させるという事実を考慮しなければならない。
【００６０】表３は、リン脂質の一定濃度において、ト
ロンボモジュリンの不存在下および様々な濃度の存在下
の正常血漿のＰＴに対するトロンボプラスチン濃度の影
響を示す。与えられた値は、秒単位での血液凝固時間お
よびアッセイにおけるトロンボモジュリンの不存在下で
の血液凝固時間と比較した差である。ＴＭ＝トロンボモ
ジュリン、ＰＬ＝リン脂質、Diff.＝TMの存在下と不存
在下の血液凝固時間の差。また、表４はトロンボモジュ
リンの一定濃度(0.7μg/ml)において、リン脂質の不存
在下および様々な濃度の存在下の正常血漿のＰＴに対す
るトロンボプラスチン濃度の影響を示す。与えられた値
は、秒単位での血液凝固時間およびアッセイにおけるト
ロンボモジュリンの存在下および不存在下の血液凝固時
間の差である。ＴＭ＝トロンボモジュリン、ＰＬ＝リン
脂質。
ロンボモジュリンの不存在下および様々な濃度の存在下
の正常血漿のＰＴに対するトロンボプラスチン濃度の影
響を示す。与えられた値は、秒単位での血液凝固時間お
よびアッセイにおけるトロンボモジュリンの不存在下で
の血液凝固時間と比較した差である。ＴＭ＝トロンボモ
ジュリン、ＰＬ＝リン脂質、Diff.＝TMの存在下と不存
在下の血液凝固時間の差。また、表４はトロンボモジュ
リンの一定濃度(0.7μg/ml)において、リン脂質の不存
在下および様々な濃度の存在下の正常血漿のＰＴに対す
るトロンボプラスチン濃度の影響を示す。与えられた値
は、秒単位での血液凝固時間およびアッセイにおけるト
ロンボモジュリンの存在下および不存在下の血液凝固時
間の差である。ＴＭ＝トロンボモジュリン、ＰＬ＝リン
脂質。
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】実施例 ５ 新規な方法における抗血液凝固システムに障害を有する
血漿の挙動 アクティベーター試薬（この場合，トロンボプラスチ
ン）とトロンボモジュリンの最適な組合せを、実施例４
に記載のようにして測定した曲線ファミリーから決定し
た。表５には、このような組合せについて、プロテイン
Ｃシステムに障害を有する異なる血漿の反応を示す。Th
romborel S を実施例４の場合と同様に塩化カルシウム
で１：１００に希釈した。トロンボモジュリン試薬はト
ロンボモジュリン５.０μg／ml（試験アッセイにおける
1.7μg/mlに相当）およびリン脂質（0.025％）を含有し
た。以下の血漿、すなわち正常血漿プール、プロテイン
Ｃ欠損血漿、プロテインＳ欠損血漿および血液凝固Ｖ因
子疾患血漿を試験した。表５の結果は、これらの条件下
では病的サンプルの血液凝固時間がトロンボモジュリン
の存在下において正常血漿に比較して短縮したことの証
拠を提供する。これは、血液凝固時間の延長の著しい低
下が見られないので、トロンボモジュリンの存在下にお
ける希釈ＰＴに基づく試験が、プロテインＣシステムの
障害を指示することを示している。表５は、新規な方法
において正常血漿プールと比較した場合のプロテインＣ
システムに障害を有する様々な血漿の血液凝固時間(秒)
を示す。ＴＭ＝トロンボモジュリン。
血漿の挙動 アクティベーター試薬（この場合，トロンボプラスチ
ン）とトロンボモジュリンの最適な組合せを、実施例４
に記載のようにして測定した曲線ファミリーから決定し
た。表５には、このような組合せについて、プロテイン
Ｃシステムに障害を有する異なる血漿の反応を示す。Th
romborel S を実施例４の場合と同様に塩化カルシウム
で１：１００に希釈した。トロンボモジュリン試薬はト
ロンボモジュリン５.０μg／ml（試験アッセイにおける
1.7μg/mlに相当）およびリン脂質（0.025％）を含有し
た。以下の血漿、すなわち正常血漿プール、プロテイン
Ｃ欠損血漿、プロテインＳ欠損血漿および血液凝固Ｖ因
子疾患血漿を試験した。表５の結果は、これらの条件下
では病的サンプルの血液凝固時間がトロンボモジュリン
の存在下において正常血漿に比較して短縮したことの証
拠を提供する。これは、血液凝固時間の延長の著しい低
下が見られないので、トロンボモジュリンの存在下にお
ける希釈ＰＴに基づく試験が、プロテインＣシステムの
障害を指示することを示している。表５は、新規な方法
において正常血漿プールと比較した場合のプロテインＣ
システムに障害を有する様々な血漿の血液凝固時間(秒)
を示す。ＴＭ＝トロンボモジュリン。
【００６４】
【表５】
【００６５】実施例 ６ 新規な方法におけるアンチトロンビンIII欠損血漿の挙
動 先天性アンチトロンビンIII障害を有するが、他の血液
凝固因子は正常範囲の血漿（＜0.01ＵのＡＴ III／ml；
Milan Analytica AG, Switzerlandから）を実施例５に
記載のように新規な方法に使用した。実施例５とは異な
り、トロンボモジュリン試薬は、実施例４に示すように
最適反応を達成するためにトロンボモジュリン７.０μg
／ml（試験アッセイにおける２.３μg／mlに相当）を含
有した。表６に示した結果は、アンチトロンビン欠損血
漿の血液凝固時間が、トロンボモジュリンの存在下に正
常血漿と比較し短縮したことの証拠を提供する。この短
縮は抗血液凝固潜在能が正常血漿に比較して不完全であ
ることを指示する。したがって、新規な方法は、重要な
抗血液凝固システムすなわちプロテインＣシステムおよ
びアンチトロンビンIIIシステムの両者における障害を
検出することをはじめて可能にする。表６は、新規な方
法において正常血漿プールと比較した場合のアンチトロ
ンビンIII障害（＜0.001Ｕ／ml）を有する様々な血漿の
血液凝固時間(秒)を示す。与えられた値は、トロンボモ
ジュリンの存在下および不存在下における血液凝固時間
およびまた２つの血液凝固時間の間の差および比であ
る。ＴＭ＝トロンボモジュリン。
動 先天性アンチトロンビンIII障害を有するが、他の血液
凝固因子は正常範囲の血漿（＜0.01ＵのＡＴ III／ml；
Milan Analytica AG, Switzerlandから）を実施例５に
記載のように新規な方法に使用した。実施例５とは異な
り、トロンボモジュリン試薬は、実施例４に示すように
最適反応を達成するためにトロンボモジュリン７.０μg
／ml（試験アッセイにおける２.３μg／mlに相当）を含
有した。表６に示した結果は、アンチトロンビン欠損血
漿の血液凝固時間が、トロンボモジュリンの存在下に正
常血漿と比較し短縮したことの証拠を提供する。この短
縮は抗血液凝固潜在能が正常血漿に比較して不完全であ
ることを指示する。したがって、新規な方法は、重要な
抗血液凝固システムすなわちプロテインＣシステムおよ
びアンチトロンビンIIIシステムの両者における障害を
検出することをはじめて可能にする。表６は、新規な方
法において正常血漿プールと比較した場合のアンチトロ
ンビンIII障害（＜0.001Ｕ／ml）を有する様々な血漿の
血液凝固時間(秒)を示す。与えられた値は、トロンボモ
ジュリンの存在下および不存在下における血液凝固時間
およびまた２つの血液凝固時間の間の差および比であ
る。ＴＭ＝トロンボモジュリン。
【００６６】
【表６】
【００６７】実施例 ７ 脱グリコシル化トロンボモジュリンへのヘパリン硫酸の
添加による天然のグリコシル化の置換 実施例２に記載のようにウサギのトロンボモジュリンを
コンドロイチナーゼを用いて脱グリコシル化した（TM d
eglyc)。実施例４の場合と同様 Thromborel S を２５mm
ol／Lの塩化カルシウムにより１：１００に希釈した。
トロンボモジュリン試薬はトロンボモジュリン１０μg
／ml（試験アッセイ中３.３μg/mlに相当）および大豆
リン脂質（0.05％）を含有した。この新規方法では、表
７に正常血漿プールについて示すように、脱グリコシル
化により、きわめてわずかな血液凝固時間の延長しか達
成されない。トロンボモジュリン含有試薬にヘパリンを
添加した場合には（１Ｕ/ml；試験アッセイ中0.33Ｕ/ml
に相当；Liquemin，Hoffmann LaRoche, Switzerlandよ
り)、トロンボモジュリンの不存在下における血液凝固
時間も抗血液凝固反応の阻害により延長され、他方、ト
ロンボモジュリンの存在下には血液凝固時間は数倍に延
長される。これはプロテインＣシステムに障害を有する
血漿（異型接合血液凝固Ｖ因子障害血漿）を用いた場合
には，これらの２つの血液凝固時間の間の差または比が
はるかに小さくなるので，ヘパリンの添加によって回復
されたトロンボモジュリンの抗血液凝固活性によるもの
である。したがって、新規な方法はまた、非グリコシル
化トロンボモジュリンたとえば組換えによって調製され
たトロンボモジュリンを用い、試験アッセイにヘパリン
を添加することによっても実施できる。表７は、新規な
方法においてグリコシル化トロンボモジュリン（gly）
または脱グリコシル化トロンボモジュリン（degly）を
用い、ヘパリン１Ｕ／mlの非添加(−)または添加（he
p）下に測定した正常血漿およびプロテインＣシステム
に障害（異型接合血液凝固Ｖ因子障害）がある血漿の血
液凝固時間(秒)を示す。示された値は、トロンボモジュ
リンの存在下および非存在下における血液凝固時間なら
びに２つの血液凝固時間の間の差および比である。ＴＭ
＝トロンボモジュリン。
添加による天然のグリコシル化の置換 実施例２に記載のようにウサギのトロンボモジュリンを
コンドロイチナーゼを用いて脱グリコシル化した（TM d
eglyc)。実施例４の場合と同様 Thromborel S を２５mm
ol／Lの塩化カルシウムにより１：１００に希釈した。
トロンボモジュリン試薬はトロンボモジュリン１０μg
／ml（試験アッセイ中３.３μg/mlに相当）および大豆
リン脂質（0.05％）を含有した。この新規方法では、表
７に正常血漿プールについて示すように、脱グリコシル
化により、きわめてわずかな血液凝固時間の延長しか達
成されない。トロンボモジュリン含有試薬にヘパリンを
添加した場合には（１Ｕ/ml；試験アッセイ中0.33Ｕ/ml
に相当；Liquemin，Hoffmann LaRoche, Switzerlandよ
り)、トロンボモジュリンの不存在下における血液凝固
時間も抗血液凝固反応の阻害により延長され、他方、ト
ロンボモジュリンの存在下には血液凝固時間は数倍に延
長される。これはプロテインＣシステムに障害を有する
血漿（異型接合血液凝固Ｖ因子障害血漿）を用いた場合
には，これらの２つの血液凝固時間の間の差または比が
はるかに小さくなるので，ヘパリンの添加によって回復
されたトロンボモジュリンの抗血液凝固活性によるもの
である。したがって、新規な方法はまた、非グリコシル
化トロンボモジュリンたとえば組換えによって調製され
たトロンボモジュリンを用い、試験アッセイにヘパリン
を添加することによっても実施できる。表７は、新規な
方法においてグリコシル化トロンボモジュリン（gly）
または脱グリコシル化トロンボモジュリン（degly）を
用い、ヘパリン１Ｕ／mlの非添加(−)または添加（he
p）下に測定した正常血漿およびプロテインＣシステム
に障害（異型接合血液凝固Ｖ因子障害）がある血漿の血
液凝固時間(秒)を示す。示された値は、トロンボモジュ
リンの存在下および非存在下における血液凝固時間なら
びに２つの血液凝固時間の間の差および比である。ＴＭ
＝トロンボモジュリン。
【００６８】
【表７】
Claims (36)
- 【請求項１】 外因的に添加したトロンボモジュリンの
存在下にサンプルの潜在的抗血液凝固能を測定する方法
であって、 ａ) サンプル、好ましくは血漿サンプルに、以下の試
薬： ｉ) トロンビンと複合体を形成することが可能で、この
複合体はサンプル中のプロテインＣ、内因性プロテイン
Ｃもしくは外因的に添加されたプロテインを活性化でき
る外因性トロンボモジュリン、 ii) さらに中間インキュベーションなしにトロンビンの
活性化を誘導する、内因性プロトロンビンもしくは外因
的に添加されたプロトロンビンのいれのプロトロンビン
に対しても作用可能なアクティベーター、 iii) リン脂質、 iv) カルシウムイオン、および ｖ) 血液凝固試験の最適化に一般的に使用される他の付
加的試薬を添加する工程、 ｂ) プロトロンビンアクティベーター含有試薬の添加に
より反応を開始させる工程、ならびに ｃ) フィブリン血餅形成までの時間の測定または標識ト
ロンビン基質の変換速度によって決定されるトロンビン
基質の変換速度を測定することによりトロンビンの形成
を定量する工程を包含する方法。 - 【請求項２】 測定された変換速度は、活性化プロテイ
ンＣは形成も添加もされない血液凝固時間の測定のため
の試験アッセイにおける変換速度と関連させる請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 測定された変換速度は、請求項１記載の
方法と同様に行うがトロンボモジュリンは添加しない試
験アッセイにおける変換速度と関連させる請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】 プロテインＣ活性化活性（ＰＣaＡ）に
加えて、アンチトロンビンIII（ＡＩＴＡ）によるトロ
ンビンの阻害を加速する作用も有するトロンボモジュリ
ンを使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 工程ａ）ii）におけるアクティベーター
の濃度が、トロンボモジュリンの不存在下における正常
血漿の血液凝固時間が少なくとも２０秒、最高３００
秒、好ましくは３０〜１５０秒になるように選択される
請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 工程ａ）ii）におけるアクティベーター
として、それ自体は熟練者に周知であり、天然のヒトま
たは動物起源のたとえば胎盤、肺臓もしくは脳から得ら
れるかまたは組換え技術によって製造されるトロンボプ
ラスチン試薬を使用する請求項１〜５のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項７】 トロンボモジュリンは別個の試薬中に、
アクティベーターを含有する試薬とは別個に、サンプル
に添加される請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 用いられるトロンボモジュリンが、ヒ
ト、動物、組換えまたは合成起源のいずれでもよく、好
ましくはヒトまたはウサギ起源、特に好ましくはウサギ
起源である請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 組換えによって調製されるトロンボモジ
ュリンの場合において、トロンビン不活性化作用はグリ
コサミノグリカン好ましくはヘパリン硫酸に連結させる
ことによって回復される請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 組換えによって調製されるトロンボモ
ジュリンの場合において、トロンビン不活性化作用はグ
リコサミノグリカン好ましくはヘパリン硫酸を添加する
ことによって回復される請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 連結は組換えまたは合成によって行わ
れる請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 試薬中のトロンボモジュリンの量が、
トロンボモジュリンの存在下において正常血漿での血液
凝固時間が３００秒未満、特に好ましくは１５０秒未満
であり、トロンボモジュリンを添加しない場合の血液凝
固時間と比較した差がトロンボモジュリンを添加しない
場合のこの血液凝固時間の少なくとも４０％、好ましく
は１００〜３００％になるように選択される少なくとも
請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 トロンボモジュリンの濃度が、試験ア
ッセイの最終容量に基づいて０.５〜５０μg／ml、好ま
しくは１〜１０μg／mlである請求項１〜１２のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１４】 血餅の形成を遅延させるため、既知の
凝集阻害剤が試験操作中に添加される請求項１〜１３の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】 プロテインＣシステムまたはアンチト
ロンビンIIIシステムの機能には関与しない精製血液凝
固因子が、試薬（単数または複数）への添加により置換
される請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１６】 フィブリノーゲン、血液凝固VII因
子、血液凝固IX因子、血液凝固Ｘ因子および／またはプ
ロトロンビン（血液凝固II因子）を試薬（単数または複
数）に、サンプルに基づいて濃度５０〜２００％、好ま
しくは７０〜１５０％に達するような濃度で添加される
請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 サンプル中のアンチトロンビンIIIの
欠損または障害を排除するため、アンチトロンビンIII
を、１種または２種以上の試薬中に、サンプルの量に基
づいて濃度５０〜２００％、好ましくは７０〜１５０％
に達するように存在させる請求項１５記載の方法。 - 【請求項１８】 単一または多重障害を選択的に決定す
るために、試験において一緒に検出されない血液凝固因
子を含有する溶液が、この方法に使用される前に血漿サ
ンプルに添加される請求項１記載の方法。 - 【請求項１９】 タンパク質の障害または欠損を選択的
に診断するために、サンプルを、この方法に使用する前
に、このタンパク質５％未満を含有する血漿で１：２〜
１：２０、好ましくは１：３〜１：５、特に好ましくは
１：４に前希釈する請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 数種のタンパク質の障害または欠損を
選択的に診断するために、サンプルをこの方法に使用す
る前に、これらのタンパク質それぞれの５％未満を含有
する血漿で１：２〜１：２０、好ましくは１：３〜１：
５、特に好ましくは１：４に前希釈する請求項１８記載
の方法。 - 【請求項２１】 抗−リン脂質抗体を選択的に診断する
ために、サンプルを方法に使用する前に、リン脂質およ
び／または血小板を０.０１〜１％の濃度で含有する水
溶液により１：２〜１：２０、好ましくは１：３〜１：
５、特に好ましくは１：４の比に前希釈する請求項１８
記載の方法。 - 【請求項２２】 アンチトロンビンIIIの抗血液凝固活
性を測定するために、サンプルをアンチトロンビンIII
欠損血漿で１：２〜１：１０、好ましくは１：４の比に
前希釈する請求項１８記載の方法。 - 【請求項２３】 サンプルの基質変換速度がトロンボモ
ジュリンの存在下および不存在下に測定され、この差ま
たは２つの値の商を正常血漿または血漿プールで得られ
た差または商と関連させる請求項１記載の方法。 - 【請求項２４】 血栓症の危険が高い患者の同定のため
の請求項１記載の方法の使用。 - 【請求項２５】 抗血液凝固療法のモニタリングのため
の請求項１記載の方法の使用。 - 【請求項２６】 患者サンプル中のプロテインＣ活性化
活性（ＰＣaＡ）およびトロンボプラスチンのアンチト
ロンビンIII（ＡＩＴＡ）によるトロンビンの阻害の促
進をもたらす活性の比の測定によって患者のトロンボモ
ジュリンのグリコシル化を検出および定量化するための
請求項１記載の方法の使用。 - 【請求項２７】 トロンボモジュリンの２つの活性が、
サンプル中で直接測定される請求項２６記載の使用。 - 【請求項２８】 ２つの活性が測定される前に内因性の
トロンボモジュリンをサンプルから単離する請求項２６
記載の使用。 - 【請求項２９】 ａ）サンプルと接触させる、トロンボ
モジュリンに対する抗体で被覆された試験ストリップ、
ｂ）インキュベートした試験ストリップを洗浄する洗浄
溶液、ｃ）プロテインＣの活性化を測定するための試
薬、およびｄ）トロンビンの不活性化を測定するための
試薬からなる請求項２６記載の方法に使用する試験キッ
ト。 - 【請求項３０】 プロテインＣを活性化するために試験
ストリップをその中で最初にインキュベートする１つの
試薬中はトロンビン、プロテインＣおよび塩化カルシウ
ムからなり、第２の試薬はトロンビンを不活性化し、形
成されたプロテインＣの量を試験ストリップの着色の強
度によって測定するための、アンチトロンビンIII、ヘ
パリンおよび／またはヒルジンならびに色素原プロテイ
ンＣ基質からなる請求項２９記載のプロテインＣ活性化
を測定するための一連の試薬。 - 【請求項３１】 試験ストリップを導入する１つの試薬
は、アンチトロンビンIIIからなり、ついでトロンビン
を加え、インキュベーション期間の後、残ったトロンビ
ン活性を色素原トロンビン基質の添加により試験ストリ
ップの着色強度を測定する方法で決定する請求項２９記
載のトロンビンの不活性化を測定するための一連の試
薬。 - 【請求項３２】 試験ストリップの代わりにトロンボモ
ジュリンに対する抗体で被覆されたマイクロタイタープ
レートを使用する請求項２６〜３１のいずれかに記載の
試験キット。 - 【請求項３３】 糖尿病もしくはホモシステイン血症の
患者からの血液、血漿または組織中のトロンボモジュリ
ンのグリコシル化の程度を、その疾患および／または血
栓易発症性の重症度を評価するために測定する請求項２
６記載の方法の使用。 - 【請求項３４】 動脈硬化症の患者からの血液、血漿ま
たは組織中のトロンボモジュリンのグリコシル化の程度
を、その疾患および／または血栓易発症性の重症度を評
価するために測定する請求項２６記載の方法の使用。 - 【請求項３５】 サンプルのＡＴ III活性およびプロテ
インＣシステム活性を、外因的に添加したトロンボモジ
ュリンの存在下に測定する方法であって、以下の工程： ａ) サンプル、好ましくは血漿サンプルに以下の試薬： ｉ) プロテインＣの活性化活性（ＰＣaＡ）に加えて、
アンチトロンビンIII（ＡＩＴＡ）によるトロンビンの
阻害を促進する作用を有するか、あるいはそれにＡＩＴ
Ａ作用を再構築するためにヘパリンを添加した外因性の
トロンボモジュリン、 ii) さらに中間インキュベーションを行わなくても、プ
ロトロンビンの活性化を誘導してトロンビンを形成し、
内因性プロトロンビンもしくは外因的に添加したプロト
ロンビンのいずれのプロトロンビンに対しても作用可能
な少なくとも１種のアクティベーター、 iii) リン脂質、 iv) カルシウムイオン、および ｖ) 血液凝固試験の最適化に一般的に使用される他の付
加的試薬を添加する工程、および ｂ) フィブリン血餅形成までの時間または標識トロンビ
ン基質の変換速度を測定することによって決定される、
トロンビン基質の変換速度を測定することによってトロ
ンビンの形成を決定する工程を包含する方法。 - 【請求項３６】 サンプルを正常ＡＴ III活性５％未満
を含有する血漿により１：２〜１：２０、好ましくは
１：３〜１：５、特に好ましくは１：４の比にに希釈し
て、ＡＴ III活性を選択的に測定する請求項３５記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19749197:9 | 1997-11-07 | ||
| DE19749197A DE19749197A1 (de) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11225796A true JPH11225796A (ja) | 1999-08-24 |
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Family
ID=7847900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31551198A Expired - Fee Related JP4361980B2 (ja) | 1997-11-07 | 1998-11-06 | サンプルの潜在的抗血液凝固能の測定法 |
Country Status (8)
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