JP3137261B2 - 血しょうおよび血液の内因性トロンビンポテンシャルの測定方法と同方法に使用するキット - Google Patents

血しょうおよび血液の内因性トロンビンポテンシャルの測定方法と同方法に使用するキット

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、血しょうまたは血液中に存在するトロンビ
ンの量を測定する方法と該方法に使用するキットに関す
る。
従来技術 凝固システムの異常は、トロンビンとヘモフィールス
に帰着する。血栓症は、心筋梗塞および発作の様な病気
をもたらし、外科及び内科の病気として生じる合併症で
ある。トロンビンの形成は、止血と血栓症に中心的な役
割を果たしている。血栓症の防止と治療のために最も有
効な医薬品は、凝固する血液中に現れるトロンビンが少
なくなるように作用する薬剤である。後述はしないが、
トロンビンの形成と不活性化の概略を述べておくことが
先ず必要であろう。血液中、血小板を豊富に含む血しょ
う（PRP）中または血小板を僅かしか含まない血しょう
（LPP）に凝固が生じると、酵素プロトロビナーゼが生
成する。これは、色々な方法で、即ち、接触因子と第VI
I因子の活性化を介した内因性反応経路、または、組織
トロンボプラスチンによる第IX因子の活性化を介した外
因性反応経路により生成される。最初の極微量の発現ト
ロンビンにより活性化する第VIII因子と第Ｖ因子は、重
要な補助因子である。第IX a因子は、第VIII a因子およ
び凝固促進リン脂質と共に、第Ｘ因子を活性化する複合
体を形成する。前記第X a因子は、第V a因子およびリン
脂質と共に、複合体を形成し、この複合体がプロトロン
ビン（第II因子）をトロンビン（第II a因子）に転化す
る。
病理学によれば、トロンビンの不活性化が血栓を防止
する上で極めて重要である。AIIIIが正常量の半分より
少ない生物個体が未だ知られていないのは、多分、それ
が無ければ生きていられないからであろう。ATIIIが正
常量の略半分である遺伝条件を有する人達は、重い血栓
性疾病に苦しんでいる。トロンビンを減少させるため
に、プロトロンビナーゼを抑制するか、或いは、血液ま
たは血しょう中のプロトロンビンの濃度を減少させて、
トロンビンの生成程度または速度を減じる方法が可能で
ある。この方法は、ビタミンＫきっ抗薬を投与すること
により凝固プロセス（凝固因子）に必要とされる肝臓中
の血しょうタンパク質の合成を抑制するもので、経口投
与抗凝固治療に用いられる。酵素と基質の量が減じ、ト
ロンビンの形成速度が低下する。血液または血しょう中
のトロンビン量を減少させる第２の方法は、トロンビン
の不活性化を早めることである。血しょう中にトロンビ
ンが出現すると直ちにそれを不活性化するために数々の
プロセスが生じ、抗トロンビンIII（ATIII）、ヘパリン
補助因子II（HCII）、α２マクログロブリン（α２−
Ｍ）等のような自然抑制因子とトロンビン結合させ不活
性複合体を形成する。種々の製薬、中でも、種々なタイ
プのヘパリンまたはデルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ペ
ントサンポリ硫酸、ラクトバイオニック酸または例えば
ツチコパス・ジャポニカ（SJAMP）から得たムコ多糖類
等は、ATIIIおよび／またはHCIIの効果を増大させ、そ
の結果、トロンビンの不活性の速度を早める。ヒルジン
（StoneおよびHofsteengeによる＜生化学＞1986年、25
号、4622頁）の様な抑制血しょう蛋白質を必要とせずト
ロンビンに直接作用する物質およびMD850（クマダおよ
びアビコによる＜トロンビン＞1981年４号285頁）の様
な合成直接トロンビン抑制剤を投与することもまた可能
である。
不活性化速度は、トロンビンの存在量に比例する。ト
ロンビン形成速度が不活性速度を上回っている限り、血
しょう中のトロンビン濃度は増大する。プロトロンビン
が尽きれば、トロンビンの形成速度は低減し、不活性化
は、直ちに、優勢になり、最後には、活性トロンビンは
すべて無くなる（第６図の曲線Ａ）。なお、第６図は、
トロンビン生成曲線図で、曲線Ａはｔ＝０で凝固開始後
のトロンビン生成曲線の通常の変化を示し、曲線Ｂは、
抗血栓剤が存在する場合の同様の曲線を示す。曲線の下
方面積は、凝固血液または血しょう中にどれだけの時
間、どれだけの量のトロンビンが活性であったかを示し
ている。このトロンビンの濃度／時間の積分を、トロン
ビンポテンシャルと名づける。このポテンシャルは、凝
固期間中に存在するトロンビンの量が少なくなる、およ
び／または、トロンビンの存在期間が短くなれば、減少
する（第６図の曲線Ｂ）。上述の抗血栓剤による治療期
間中、トロンビン形成曲線は、下記の１点またはそれ以
上の点において変化する（第６図、曲線ＡおよびＢ）。
その曲線は遅れて始まり、即ち、トロンビンの爆発的な
形成が生じる前の潜伏時間が長くなり、ピークが下が
り、減少速度が早まり、その結果、存在するトロンビン
は早く活性を失う。（経口抗凝固剤の場合の）形成量の
減少並びに（ヘパリンによる治療の場合の）形成速度の
減少は、共に、抗血栓治療に有効である。両方の場合
共、トロンビン形成曲線の下方面積が小さくなってい
る。この面積、即ち、時間／温度の積分または内因性ト
ロンビンポテンシャルETPは、従って、抗血栓剤による
治療の有効性を決定するよい尺度となり得る。本発明の
方法は、凝固血液（血しょう）中に存在した活性トロン
ビン量とその活性存在時間を示す数（以後、内因性トロ
ンビンポテンシャルETPと称す）を定めるために用いら
れる。
公知の範囲において、ETPまたは比較し得るインポー
タンスの変量を測定する方法はない。トロンビン形成曲
線からETPを計算する方法はあるが、かなり煩雑で時間
を喰い、また、抗止栓剤による種々な種類の治療効果の
追試は数多いが、多かれ少なかれ特殊性を帯びている。
これらの試験は、本発明の方法とは明らかに異なり、ま
たより煩わしいものであるが、下記に概略を記述する。
ａ）組織トロンボプラスチンによる凝固時間（プロトロ
ンビン時間PT）の測定。この方法は、経口投与抗凝固薬
には敏感であるが、ヘパリンには不感である。
ｂ）接触活性化剤とリン脂質による凝固時間（活性化部
分トロンボプラスチン時間）（APTT）の測定（Teien,Ab
ilgaard,HookおよびLindahlによる論文、雑誌＜血栓症
の研究＞11号、107頁（1977年）;Bain,Forster:およびS
leighによる論文、米国臨床疫理学会誌、35号、668頁
（1980））。この方法は、ヘパリンおよび経口抗凝固に
は敏感であるが、しかし、低分子量のヘパリンまたはデ
ルマタン硫酸には不感かまたは実用上の感度を有しな
い。ヘプチストは、aPTT試験であり、X a分離因子を加
えることにより低分子量のヘパリンに対しては感度を増
すが、他の抗血栓剤に対する感度は低い。
ｃ）添加トロンビン（抗因子II aの消滅速度の測定（Ha
ndelandおよびAbilgaardの論文＜血栓の研究＞誌、35
号、627頁（1984年）:Bartl,Dosrch,LillおよびZiegenh
ornの論文＜血栓止血＞42号,1446頁（1980年））。この
方法は、非生理学的パラメータを測定するもので、低分
子量のヘパリンには不感である。血液（血しょう）に加
えたトロンビンと血液（血しょう）中に形成されたトロ
ンビンの挙動には根本的な違いがある。内因性トロンビ
ンは、AIIII（ヘパリン）の作用に対し感度がより低い
（F.K.Schattauer著“血栓と止血"GmbH出版社（シュト
ゥットガルト市）56号、９−17頁（1986年）、61号、30
−34頁（1989年））。
ｄ）添加Ｘ因子（抗X a因子）の消滅測定（Teien,Lieお
よびAbilgaardの論文、雑誌＜血栓症の研究＞８号,413
頁（1976年））。この場合、測定は、抗血栓性特徴との
関連性に乏しい。この方法は、ヘパリンにのみ適し、試
験管内において等しく活性な定量の非分割ヘパリン、低
分子量へパリン及び超低分子量（Ｐ形）ヘパリンの各々
につき、本質的に異なる結果をもたらす。さらに、デル
マタン硫酸およびその他の凝固剤の効果は、この抗X a
法では、単独またはヘパリン補助因子IIと共には測定出
来ない。
ｅ）ポリブレン（Polybrene）によるヘパリン効果の滴
定（HoffmannおよびMeulendijkの論文、臨床化学会会
報、87号417頁（1978年））。この方法は、たいへんに
手数を要し、ヘパリンにのみ適する。
ｆ）ヘパリンにより第X a因子を加える変形aPTT法（Den
sonおよびBonnarの論文、血栓素因性出血、30号471頁
（1973年）;Yin WesslerおよびButlerの論文、＜Lab.Cl
in.Ned＞誌、81号298頁（1973年）;Yinの論文、血栓素
因性出血、33号393頁（1975年）。この方法は、低分子
量のヘパリンにのみ適する。最も重要な点は、血しょう
中に生じ再び消えて行くトロンビンの量をどの方法も測
定しないことである。二次的作用が測定されるが、これ
は、主として薬品の凝固メカニズムの活性化に対する作
用であり、凝固時間測定時の潜伏時間中に生じた小量の
トロンビンにより惹起される（a,bおよびｆ）。
ｇ）Hemker,Beguin他は、凝固血しょう中のプロトロン
ビナーゼの生成と不活性化に対する抗血栓剤の作用を調
査する２つの方法を発明した。プロトンビナーゼの活性
を、トロンビン類似アミド溶解活性の生成から計算した
間接法と、残存プロトロンビン・レベルを直接測定する
直接法である。間接法の方が、精製がよく、速度も早い
（Hemker H.C.,Willems G.およびBeguin S.の論文、血
栓症とうっ血、56号９−17頁（1986年））。この方法
は、主に抗血栓ヘパリンの効果を調べるために用いられ
た（Beguin S.,Lindhout T.およびHemker H.C.の論文血
栓症とうっ血、56号９−17頁（1989年））。ヘパリンの
存在によるトロンビンの分解は、十分な近似性をもっ
て、二つの擬性一次反応の合計として既述出来る。その
一つは、トロンビンを完全に不活性化する（ATIIIおよ
び重要性のより低いトロンビン阻害因子による複合体の
形成）反応であり、もう一つは、アミド溶解活性を有す
る生成物（α２マクログロブリン／トロンビンの複合
体）を生じる反応である。ヘパリンが存在するか、また
は、存在しない場合のプロトロンビナーゼ活性の時間に
よる変化を計算することが可能であった。これらの計算
結果は、例えば、スタフィロコアゲラーゼを用いて直接
測定したプロトロンビンの費消速度と比較する。この方
法は、プロトロンビンが消滅する合成速度の標準偏差が
９％と15％の間になるように計算した、大きい数値間の
差を計算することによりなる。間接法で計算された数値
は直接法で測定された数値とよく一致しており、数学的
近似法により、ヘパリンの存在および不在時にトロンビ
ンが活性化する速度の許容画像が得られる。データ分析
により0.232±0.004min-1のα２マグログロブリンに対
する一次トロンビン不活性化速度定数が得られ、この定
数は、ヘパリン濃度に依存しない。抗トロンビンIIIの
従属数である。血しょう中の形成トロンビンの阻害に対
する速度定数をヘパリン濃度の関数として描くこともま
た可能である。
目的 本発明は、前文に記載したタイプの方法を提供するこ
とを目的とする。この方法は、内因性トロンビンのポテ
ンシャルを測定することを特徴とする。本発明は、さら
に、上記の測定を実行するための装具一式を提供するこ
とを目的とする。本発明による方法を用いるとETPの測
定を容易にし、かつ、早め、それ故に、臨床および実験
動物における抗血栓治療の効果を測定するために用いる
ことが出来る。
構成 本発明は、上記目的を達成するために、内因性トロン
ビンのポテンシャルを測定することを特徴とする、凝固
血液または血しょうのサンプル中に存在したトロンビン
量並びにトロンビンの時間積分またはトロンビン・ポテ
ンシャルを測定すること、或いは、内因性トロンビンに
対する抑制を測定することを特徴とする、薬理学的作用
因子を用い血液または血しょう中のトロンビン生成の抑
制を測定すること、又は、トロンビン基質を、反応混合
剤に、トロンビン生成活性化剤、タンパク質分解酵素の
抑制制剤、および、望ましければ、被検薬剤と共に加え
ることを特徴とするものである。以下、本発明の実施例
に基いて説明する。
本発明の方法は、現在の諸方法とは、いずれにして
も、比較出来ない。全ての抗血栓薬に対して汎用出来、
凝固過程の間に血しょう中に存在する活性トロンビン量
の尺度を提供する単独の方法はこれまでに無かった。
本発明の方法は、ここで、内因性トロンビンポテンシ
ャルまたはETPとして定義する、凝固血液中のトロンビ
ン濃度の時間積分、即ち、トロンビン生成曲線の下方面
積を測定するための、非常に感度のよい、再現性に優れ
た簡単な試験法である。この方法は、凝固過程活性化
剤、Ca2+イオン源、天然抗血栓調剤およびトロンビン基
質を含んでいる溶液に、試験する反応混合剤を添加する
ことに基く。反応混合剤は、調剤（或は、複数の調剤）
での抗血栓症の治療を受けている患者（または、実験動
物）の血液、血小板に富む血しょう、血小板が少ない血
しょうまたは脱線維素血しょうまたは既知量の調剤を添
加した正常な血液または血しょうのいずれかのサンプル
である。天然の抗血栓剤は、ATIII（抗トロンビンIII）
またはHCII（ヘパリン補助因子II）のいずれかまたは両
方を含んでいる。付加ATIIIおよび／またはHCIIの存在
は、種々の目的に役立つ。トロンビンに対しては、これ
らの抑制物質の方が、副次反応を最少にするために、他
の抗血剤、例えば、α２−マクログロプリン（α２−
Ｍ）（M.Verstraten,J.Vermeylen,H.v.LynenおよびJ.Ar
nout編集血栓症および止血（1987年）、血栓症および止
血に関する国際学会、Leuven大学出版、Leuven（1987
年））より好ましい。結果として、この方法は、サンプ
ル中のATIIIおよび／またはHCIIの含有量とは実質的に
無関係になる。これに加えて、試験は、二つの抑制因子
のいずれかを選択することにより、特殊なタイプの薬に
対して特に感度よく実施出来る。ヘパリンは、例えば、
トロンビンとATIIIとの反応に触媒作用を及ぼし、デル
マタン硫酸は、トロンビンとHCIIの反応に触媒作用を及
ぼす。この特殊性は、他の抑制物質の（免疫）減退の結
果となってさらに増大する。試験されるサンプルを含有
する混合物をある一定時間、一定の条件下で恒温保持す
る。次に、トロンビン基質の量を直接測定するか、或い
は、不透明溶液の場合は、トロンビン抑制物質を加えて
反応を停止させ、混合物を、例えば、遠心沈澱で処理
し、生成物の量または消滅した基質の量を測定出来るよ
うにする。可能なトロンビン抑制物質はベンズアミド
（この物質を実施例において使用している）、ヒルジン
またはＮ−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−D.L
−アミジンフェニルアラニンピペリジン）、HCL（α−N
APAP）を含んでいる。光学的に透明な溶液の場合、生成
物の量を分光光度計で追跡することも可能であり、これ
は、測定曲線の最初の誘導曲線がサンプル中のトロンビ
ン生成の変動を示すので、特に重要である。
最初に、本発明の概要について説明すると、本発明
は、凝結液または血しょうサンプル中のトロンビンが、
どれだけの時間中にどれだけの量活性化したかを示す、
内性トロンビンポテンシャル（EPT）の測定方法に関す
るものであり、このETPは、任意のタイプの抗血栓剤に
よる治療の有効性を測定するのに用いることが出来る。
このEPTの測定は、サンプルにトロンビン基質、トロン
ビン形成活性化剤、タンパク質分解酵素抑制物質製剤お
よび必要ならば分析用製薬剤を添加することよりなる。
トロンビン基質は、サンプル中に発生したトロンビン量
を完全には消費せず、存在トロンビンの量に比例した基
質の転換速度を有し、トロンビンによる転換の結果発生
する測定可能な転換生成物を有するように選択すること
が望ましい。転換生成物の量を測定することにより、EP
Tが測定される。活性化剤を選択することにより、内因
性または外因性凝固システムのいずれに効果があるかが
決定され、凝固機構の種々な部分に対する分析中の製薬
の効果を測定することが可能になる。
以下に記述する実験１において、血しょう中のアミド
溶解活性の変動を、ｐ−ニトロアニリンの発達に基づ
き、分光光度計を用い、405nmの波長で測定する。実験
２において、或る一定の反応時間経過後、測定を行い、
実験３において、或る一定の時間後に、トロンビン抑制
物質を加えて反応を止め、その後、反応混合物を（遠心
沈澱）処理し、反応生成物を測定出来るようにする。
本発明は、さらに以下の反応を含む。
（１）凝固因子（第Ｖ−VII因子）活性化物質のプロト
ロンビン化、 （２）プロトロンビン／プロトロンビナーゼ／トロンビ
ン、 （３）トロンビン＋抗血栓剤→不活性複合体、 （４）基質トロンビン信号分子 反応（２）と（３）は、不可逆性で、結果として、ト
ロンビンは反応混合密中に一時的にのみ存在する。トロ
ンビンは存在している間、反応（４）に参加し、その結
果、基質の転換度は、トロンビンがこの反応に触媒作用
した時間と量を示す。重要なことは、基質の量が、トロ
ンビンが消滅する以前に無くならないことである。理想
的な場合、反応速度が、任意の時点においてトロンビン
の濃度に比例すべきである。これは、反応開始時におい
て、基質濃度がトロンビンの場合の該基質のKmより数倍
大きく、基質の適当部分が消費され、最終濃度がKmより
評価出来るほど高ければ、実際に達成される。基質は、
トロンビンにより消費されるが、その消費速度は、該基
質の枯渇を防止するために、試験サンプルに付加できる
基質濃度を越えてはならない。この理由により、きわめ
て特異な物質S2238（HD−Phe−Pip−Arg−pNa）は、適
性において実施例に使用した基質より劣る。
基質は、原則として、“解離部”（基質とトロンビン
とが反応後切り離される群）が結合した１個のオリゴペ
プチドよりなる。このオリゴペプチドは一般に特異性を
決定し、“解離部”は、切り放され、測定可能な特性を
獲得する。他の基質例は、トシルアルギニンのメチルエ
ステルである。アルギニンは、トロンビンが個々の物質
に対し結合性を有していることを決定する。分離期間中
のＨ＋イオンの放出を信号として使用することが出来
る。ｐ−ニトロアニリンのような色素体群は解離しない
が、蛍光群は放出する物質も存在する。各々の基質の場
合、問題は探索を上手にしなければならないことであ
る。基質の転換速度とトロンビン存在量との間に直線的
な比例性が存在するなら、基質の分離量と第６図の曲線
下方面積、即ち、トロンビン・ポテンシャルとの間にも
直線的な比例性が存在する。基質の転換速度とトロンビ
ン存在量との間に直線的な比例性が存在しなければ、基
質の分離量とトロンビン・ポテンシャルとの間の比例性
はより複雑なものになる。試験期間中、血しょう内に存
在していたトロンビンの量は、未知であるが、しかし、
基質に対するトロンビンの作用パラメータKoat及びkmが
既知であるので、生成物（実施例の場合、ｐ−ニトロア
ニリン）の量から計算することが出来る。トロンビンの
時間曲線は、Hemker,Beguin及びWillemsが“血栓症と止
血"56号９頁（1986年）に記述の様にして得ることが出
来る。本方法の本質は、しかし、前記の曲線を全然測定
しないことにある。第６図は、理論的な根拠を説明する
目的のためだけに示した。本方法は、＜トロンビン−時
間＞曲線下方面積を測定するために用いられる（但し、
数学的分析式は与えられない）。第１図の実験曲線は、
生成物の生成速度がトロンビン量に比例しているので、
第６図の曲線の積分である。この故に、実験曲線の最終
レベルは、＜トロンビン−時間＞曲線の下方面積、即
ち、トロンビン・ポテンシャルに等しい。実際に、患者
への適用および薬理学的研究において、この最終レベル
は、測定される唯一のものであろう。トロンビンとα２
−マイクログロブリンとの複合体の低いがしかし持続す
る活性の故に、固定反応時間後の最終レベルを測定する
ことが必要であろう。本発明においては、トロンビン・
ポテンシャルは直接測定される。あらゆる場合に、分解
された基質量と薬剤（例えば、ヘパリンまたは他の薬
剤）の存在量の間には、相関関係がある。これは、正確
には、この方法により実験的に測定出来る関係である。
活性化剤を選択することにより、内因性または外因性
凝固系（システム）へのいずれの効果が測定出来るかが
決定される。トロンボプラスチンを用いると、プロトロ
ンビナーゼの形成（これが生じた場合）とトロンビンの
消滅に対する存在薬剤の複合作用が測定される。内因経
路を接触活性物質、例えば、リン脂質を持つかまたは持
たないカオリンで活性化すると、複合作用が再び測定さ
れるが、しかし、プロトンビナーゼの形成は、内因経路
においてのみ生じる、血液凝固第VIII因子に対するトロ
ンビンのフィードバック内活性に依存する。活性化剤を
目的に応じて選択することにより、凝固メカニズムの種
々の部分への薬の作用を試験することが可能となる。組
織からの小量トロンボプラスチンによる活性化は、おそ
らく生理学的に最適の近置をもたらすので特別に興味を
引く。蛇の毒（例えば、Oxyuranus scuellatus毒）、AT
IIIおよびHCIIの抑制作用に不感である合成プロトロン
ビン活性物質、および、ヘパリンの作用に不感の他の毒
を用いると、トロンビン・ポテンシャルの減少が、専
ら、トロンビンの加速分解によって、或は、生理的プロ
トロンビナーゼの抑制によって引き起こされたのかを調
べることが可能である。生理的プロトロンビン活性化物
質は、ある時はセンシティブで、ある時は不感である。
生理的プロトロンビナーゼの抑制が生じると、トロンビ
ン・ポテンシャルは、蛇の毒を用いた方が、生理的条件
下での場合より高く測定される。
本発明は、また、前記の方法によりトロンビン・ポテ
ンシャルの測定を日常実施するための装置と、大量の試
験サンプルを処理し得る自動化機器の運転を簡便にする
ために大量の試験成分源を供給することに関する。
この試験装置は、下記の作用物質を含有する容器（並
びに、要望があれば、指導書）よりなる。
−少なくともCa2＋イオンを含み（さらには、例えば、
トロンボプラスチン、接触活性化物質または蛇毒を加え
た）トロンビンの形成を開始する物質を一種またはそれ
以上、 −試験する薬品にセンシティブなトロンビン抑制調剤
（抗トロンビンIIIおよび／またはヘパリン補助因子I
I）、 −適切なトロンビン基質（例えば、S2222またはCH3OCO
−Gly−Pro−Arg−pNA.AcOH）、 −任意の可能な保存剤。
保管寿命を延ばすために、溶液を凍結乾燥させてお
き、使用する直前に規定量の水に溶解されることが可能
である。容器は、一定数の決定因子に適するように製作
出来るが、所望量の溶液を独立管またはキューペット内
で凍結乾燥させておき、水および／またはサンプルを加
えるだけでよい様にすることも出来る。
規定時間、規定温度に維持した後、測定を実施する
か、或いは、トロンビン抑制物質（例えば、ベンザアミ
ド、ヒルジンまたはα−NAPAP）を添加して反応を停止
させる。反応物は、次に、恐らく、生成物の量を測定可
能にするための処理（遠心沈澱、沈澱等）を受けねばな
らない。抑制液は、独立容器で、キットに加え、試験サ
ンプルが不透明であり、従って、トロンビン基質の量を
直接読み取ることが出来ない場合に使用する。
実 施 例 試薬： 緩衝液： 0.05MトリスHCI.pH7.35,0.1M NaCI,0.5％卵アルバミ
ン。
血液： 正常または抗凝固被検ヒト／動物の静脈穿刺により採
取した血液。0.13Mのクエン酸三ナトリウム（trisodium
citrate）１部に対し血液を９部の割合で採取した。
血小板に富む血しょう： 3000g及び室温で遠心沈澱後の無色血液上澄み液。
血小板が少ない血しょう： 血液を3000gおよび15℃で15分間２回遠心沈澱させ
た。３回目の遠沈は2300gおよび４℃で60分間実施し
た。
脱線維素血しょう： 血小板が少ない血しょうを0.1部のレプチラーゼ（rep
tilase）と共に37℃の温度で10分間定温保持し、次に、
10分間氷上に放置した。形成されたフィプリンを5000g
および０℃で10分間遠心沈澱させるか、或いは、へらに
巻き付けて除去した。
トロンボプラスチン： これは、OwrenとAasの方法（スカンジナビア臨床実験
研究誌、３号201頁（1951年））に従って調製した。使
用前に40倍に希釈した。
抗トロンビンIII: これは、ThalerおよびSchmerの方法（ブラジル、血液
学誌、31号233頁（1975年））に従って分離した。
その他の試薬： 市販のものを入手した。
装置： ピペット、管等。37℃の水槽。405nmの波長で光学濃
度を記録でき、温度調節が出来るキュペット・ホルダー
を有する分光計。
実施例1: 必要な限り、全ての試薬は前述の緩衝液に溶解する。
下記を含有する400マイクロリットルの溶液を準備し
た。
40マイクロリットルのS2222（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−
イソロイシン−Ｌ−グルタミルグリシル−Ｌ−アルギニ
ン−ｐ−ニトロアリニド.HCL）、濃度:L0.4mm、 トロンボプラスチン:1.25％ CaCl2:7.5mM ATIII:2.5マイクロモル／リットル この溶液を最低２分間水槽中で予熱する。種々異なる
量のヘパリンを含んでいる脱線維血しょう200μで反
応を開始する。405nmにおける光学濃度の増大パターン
を追跡する。分光光度計による分析結果を第１図に示
す。生成されたｐ−ニトロアニリン量の最終レベルは血
しょう中に存在したヘパリン量に比例して減少する。
第１図は、凝固期間中の基質の消費量を示す図で、同
図において、トロンビンポテンシャルの測定は、第１実
施例の試験における光学濃度変化を、上から下に、増大
するヘパリン濃度において得た。
第１図の曲線は、最初の派生物が古典的トロンビン生
成試験との類似を示しているので特に重要である。これ
は、これらの曲線をトロンビン生成曲線の測定に使用出
来、また、ETP並びに、特に低いレベル（例えば、10m
M）でトロンビンが生成される時点の両方を測定するた
めに使用出来ることを意味している。かように、典型的
な凝固時間に対応するシステムの潜伏時間を測定出来
る。
第２図は、基質消費の抑制剤を示す図で、同図におい
て、ETPへパリン濃度の測定は、第１図において、添加
ヘパリン量の関数として測定した基質転化の抑制であ
り、同図は、ｐ−ニトロアリニンの最終レベルとサンプ
ル中の存在したヘパリン量との間に直線的な相関関係が
あることを示している。
この実施例において、安定して分光光度計データを得
るために、血しょうは、レプチラーゼを添加して線維素
を除去したが、実際には、これは不要である。血小板の
少ない血しょう（LPP）または血小板に富む血しょう（P
RP）または完全な血液を用いることが出来るが、しか
し、混合物は、後で、測定前に遠心沈澱させねばならな
い。
この実験においては、ヘパリンを添加した正常な血し
ょうを使用した。実際に、このタイプの一連のヘパリン
濃度は、標準曲線を得るのに使用できる。ヘラピンによ
る治療を受けている患者の血液または血しょうを試験す
る場合、前記患者から採取したサンプルで得た曲線を標
準曲線と比較することが出来る。かようにして、患者か
ら採取したサンプル中に存在するヘパリン量に等しいヘ
パリン量を発見することが出来る。他の製薬を用い、同
様な方法を採用することが出来る。
第X a因子用の特別な基質として知られているS2222
を、トロンビン基質として、この実験に使用しているこ
とを指摘して置かねばならない。これは、トロンビンの
濃度が第X a因子の濃度よりかなり高く、その結果、該
因子の活性が測定された総基質の転換に殆どなんの貢献
もしていないので、可能である。
実施例２ 前記の緩衝液に下記の物質を加える。
−0.75nM AcGPRpNA（CH3OCO−GLY−Pro−Argp−ニトロ
アニリド.HCI）、 −２％ トロンボプラスチン、 −7.5mM CaCl2、 −3mM抗トロンビンIII 時間０の時点において、400マイクロリットルの脱線
維索血しょうを、400マイクロリットルの混合物に添加
する。添加した血しょうは、低い分子量を有するヘパリ
ン（フラキシパリン）を種々の濃度で含んでいる。６分
後に、光学濃度を405nmの波長において測定する。
その時点における毎分当りの光学濃度（OD）を測定
し、その値の６倍値を、ｔ＝６分における光学濃度より
差し引く。このようにして、光学濃度の変化を、トロン
ビン生成プロセスの開始後、アミド溶解活性とは無関係
に測定する。かようにして得た値の抑制百分率と添加フ
ラキシパリン量を第３図に示す。なお、第３図は、第２
実施例のデータにより新旧の方法を比較したもので、低
分子量ヘパリン（Fraxiparine）が一連の異なる濃度で
存在する場合につき、従来の方法（○印）と新しい方法
（●印）で得たトロンビン生成曲線からETPを算定した
例を示す。同図において、同じ濃度のフラキシパリンに
よる抑制は、＜トロンビン−時間＞曲線の下方面積によ
り与えられ、この発明により得られた数値は、トロンビ
ン・ポテンシャルと事実、直接的に比例していることを
示している。第４図には、旧い方法と本方法により得た
数値を直接比較して示されている。
実施例３ 実施例２と同じ溶液を使用する。４人の健康な有志と
長期にわたり抗凝固治療を受けたいる24人の患者より静
脈穿刺で採取した血液400マイクロリットルを前記溶液
の400マイクロリットルに加える。６分後に、0.15MのNa
Clにベンザアミジン（10mM）を加えた溶液を400マイク
ロリットル加えて反応を停止させる。サンプルを遠心沈
澱させ、光学濃度（OD）の増加を405nm波長において測
定する。この増分を、同じ血しょうを用い、色素物質を
含まない溶液を時間ｔ＝０の時点で加えたこと以外は同
一処理をして実施した対照試験で得た数値と比較する。
かようにして読み取った数字を、トロンビン・ポテンシ
ャルの直接尺度として使用する。第５図に、得られた結
果を同じサンプルのトロンビン含有量と比較してある。
なお、第５図は、内因性トロンビン・ポテンシャル及び
経口投与抗凝結を示す図で、E.T.P及び経口投与抗凝固
は、第３実施例において測定されたETPを同じ患者から
採取した血しょうのプロトロンビン含有量と比較して示
す。これらの患者のプロトロン含有量は、抗凝固治療の
効果の尺度と見なすことが出来るので、この試験は、本
方法により測定されたトロンビン・ポテンシャルは、抗
凝固治療の強さの尺度であることを示している。
効 果 以上の説明から明らかなように、本発明によると、全
ての抗血栓薬に対して汎用出来、凝固過程の間に血しょ
う中に存在する活性トロンビン量の尺度を提供する単独
の方法を提供することができる。また内因性トロンビン
ポテンシャルまたはETPとして定義する、凝固血液中の
トロンビン濃度の時間積分、即ち、トロンビン生成曲線
の下方面積を測定するための、非常に感度のよい、再現
性に優れた簡単な試験方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、凝固期間中の基質の消費を示す図で、同図に
おいてトロンビンポテンシャルの測定結果は、第１実施
例の試験における光学濃度の変化を記録したものであ
り、上から下に、増大するヘパリン濃度において得られ
た結果を示す。 第２図は、基質消費の抑制を示す図で、同図において、
E.T.P及びヘパリンの濃度は、第１図において添加した
ヘパリンの量の関数として測定した基質転化の抑制を示
す。 第３図は、トロンビン・ポテンシャルを示す図で、同図
において、新旧法の比較は、第２実施例よりのデータに
て行い、低分子量ヘパリン（Fraxiparine）が一連の異
なる濃度で存在する場合につき、従来の方法と新しい方
法で得たトロンビン生成曲線からETPを算定した。 第４図は、フランキパリンによりトロンビンポテンシャ
ルの抑制を示す図で、同図において、新法と旧法の比較
は、第２実施例よりのデータにて行い、両方法によっ
て、第３図から得られたデータが比較されている。 第５図は、内因性トロンビン・ポテンシャル及び経口投
与抗凝結を示す図で、同図において、E.T.P及び経口投
与抗凝固は、第３実施例において測定されたETPを同じ
患者から採取した血しょうのプロトロンビンレベルと比
較されている。 第６図は、トロンビンの生成線を示す図で、同図におい
て、曲線Ａは、ｔ＝０で凝固開始後のトロンビン生成曲
線の通常の変化を示し、曲線Ｂは、抗血栓剤が存在する
場合の同じ曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スゼット ルセット ベグイン オランダ、6221 シーエル マーストリ ヒト、アカーストラート 12ビー (56)参考文献 特開 昭55−124071（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/56 G01N 33/86 G01N 33/52

Claims (42)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】凝固血液又は血しょうのサンプル中の内因
    性トロンビンポテンシャルを測定する方法において、 トロンビン生成活性化因子をトロンビン基質と共にサン
    プルに加えて、 トロンビン基質の量は、サンプル中で生成されるトロン
    ビン量が、前記トロンビン基質を完全には消費し得ない
    ようしてにして選択され、 前記トロンビン基質から転換生成物を生成し、このよう
    にして生成された転換生成物の量を測定し、これにより
    凝固血液または血しょう中に存在した活性トロンビン量
    とその活性存在時間の積分値を定めることによりサンプ
    ル中の内因性トロンビンポテンシャルを測定することを
    特徴とするトロンビンポテンシャルの測定方法。
  2. 【請求項２】トロンビン基質を、反応混合剤に、トロン
    ビン生成活性化剤、タンパク質分解酵素の抑制制剤、お
    よび、望ましければ、被検薬剤と共に加えることを特徴
    とする、請求項の第１項による方法。
  3. 【請求項３】測定を、血液または血小板を豊富に含む血
    しょうまたは血小板が少ない血しょうのいずれかにおい
    て行うことを特徴とする、請求項の第１項第２項のいず
    れか１による方法。
  4. 【請求項４】血しょうが線維素を除去したものであるこ
    とを特徴とする、請求項の第１項乃至第３項のいずれか
    １による方法。
  5. 【請求項５】線維素重合を抑制することを特徴とする、
    請求項の第１項乃至第３項のいずれか１による方法。
  6. 【請求項６】前記基質の転換速度がトロンビンの存在量
    に比例するように該基質を選択することを特徴とする、
    請求項の第１項乃至第５項のいずれか１による方法。
  7. 【請求項７】分割基質の量がトロンビン・ポテンシャル
    に直接比例するように選択することを特徴とする、請求
    項の第６項による方法。
  8. 【請求項８】前記基質の転化速度がトロンビン存在量に
    直接的には比例しないように該基質を選択することを特
    徴とする、請求項の第６項による方法。
  9. 【請求項９】S2222（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシ
    ル−Ｌ−グルタミルグリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニ
    トロアリニド.HCL）を基質として使用することを特徴と
    する、請求項の第１項乃至第７項のいずれか１による方
    法。
  10. 【請求項１０】AcGPRoNe（CH3OCO−GLy−Pro−Arg−ｐ
    −ニトロアリニド.HCL）を基質として使用することを特
    徴とする、請求項の第１項乃至第７項のいずれか１によ
    る方法。
  11. 【請求項１１】使用する基質がトロンビンに対して特異
    性を有する部分と、トロンビンと反応後解離する“解離
    部”よりなることを特徴とする、請求項の第１項乃至第
    10項のいずれか１による方法。
  12. 【請求項１２】測定可能な特性を有する“解離部”を使
    用することを特徴とする、請求項の第10項による方法。
  13. 【請求項１３】“解離部”が蛍光活性を有している基質
    を使用することを特徴とする、請求項の第12項による方
    法。
  14. 【請求項１４】前記蛍光活性を分光光度分析により測定
    することを特徴とする、請求項の第12項による方法。
  15. 【請求項１５】トロンビン抑制因子を不透明溶液に加え
    ることを特徴とする、請求項の第14項による方法。
  16. 【請求項１６】ベンズアミジン、ヒルジンおよび／また
    はｎ−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−D,L−ア
    ミジンフェニルアラニンピペリジン.HCL（α−NAPAP）
    をトロンビン抑制因子として使用することを特徴とす
    る、請求項の第14項による方法。
  17. 【請求項１７】色素体群を“解離部”として使用するこ
    とを特徴とする、請求項の第12項による方法。
  18. 【請求項１８】蛍光群を“解離部”として使用すること
    を特徴とする、請求項の第12項による方法。
  19. 【請求項１９】H+イオンを“解離部”として放出する基
    質を使用することを特徴とする、請求項の第12項による
    方法。
  20. 【請求項２０】オリゴペプチドをトロンビンに対して特
    異性を有する部分として使用することを特徴とする、請
    求項の第11項による方法。
  21. 【請求項２１】アルギニン含有オリゴペプチドを使用す
    ることを特徴とする、請求項の第20項による方法。
  22. 【請求項２２】トシルアルギニンのメチルエステルを基
    質として使用することを特徴とする、請求項の第19項及
    び第21項による方法。
  23. 【請求項２３】ATIIIおよび／またはHCIIをタンパク質
    分解酵素として、共に使用することを特徴とする、請求
    項の第２項乃至22項のうちの１による方法。
  24. 【請求項２４】動物に由来するATIIIおよび／またはHCI
    Iを使用することを特徴とする、請求項の第23項による
    方法。
  25. 【請求項２５】宿主細胞の組換えDNAの発現により得ら
    れたATIIIおよび／またはHCIIを使用することを特徴と
    する、請求項の第23項による方法。
  26. 【請求項２６】製薬の効果を測定する凝固過程のセクシ
    ョンをトロンビン生成活性化因子の選択により定めるこ
    とを特徴とする、請求項の第１項乃至第25項のいずれか
    １による方法。
  27. 【請求項２７】Ca2＋イオンをトロンビン生成活性化因
    子として、任意の他の活性化因子と組み合わせて使用す
    ることを特徴とする、請求項の第26項による方法。
  28. 【請求項２８】ATIIIに対しセンシティブでない活性化
    因子を選択することを特徴とする、請求項の第28項また
    は第26項による方法。
  29. 【請求項２９】HCIIに対しセンシティブでない活性化因
    子を選択することを特徴とする、請求項の第28項または
    第27項による方法。
  30. 【請求項３０】オキシウラヌス、スクテラチス毒を使用
    することを特徴とする、請求項の第28項または第29項に
    よる方法。
  31. 【請求項３１】接触活性化体を活性化因子として使用す
    ることを特徴とする、請求項の第26項による方法。
  32. 【請求項３２】トロンボプラスチンを活性化因子として
    使用することを特徴とする、請求項の第26項による方
    法。
  33. 【請求項３３】抗血栓因子を被検薬剤として使用するこ
    とを特徴とする、請求項の第２項乃至第32項のいずれか
    １による方法。
  34. 【請求項３４】ヘパリンを抗血栓因子として使用するこ
    とを特徴とする、請求項の第33項による方法。
  35. 【請求項３５】デルマタン硫酸を項血栓因子として使用
    することを特徴とする、請求項の第33項による方法。
  36. 【請求項３６】特別な調薬による抗血栓治療を受けてい
    る患者（または実験動物）より採取した血しょうまたは
    血液のいずれかを反応混合剤として使用することを特徴
    とする、請求項の第２項乃至第35項のいずれか１による
    方法。
  37. 【請求項３７】関係する調薬の既知量を加えた正常な血
    液または血しょうのいずれかを反応混合剤として使用す
    ることを特徴とする、請求項の第２項乃至第26項のいず
    れか１による方法。
  38. 【請求項３８】下記の作用物質、即ち、 １）トロンビンの生成を活性化する１種類以上の物質、 ２）トロンビン抑制製薬、 ３）適当なトロンビン基質、および ４）任意の使用可能な保存剤、 を含有する溶液入りの容器を特徴とする、請求項の第１
    項乃至第37項のいずれか１による方法を実施するための
    キット。
  39. 【請求項３９】関連するインストラクションを含んでい
    ることを特徴とする、請求項の第38項によるキット。
  40. 【請求項４０】作用物質の量が、前記キットを多数の測
    定に使用できる量であることを特徴とする、請求項の第
    38項または第39項によるキット。
  41. 【請求項４１】作用物質の量が、前記キットを１回の測
    定に使用できる量であることを特徴とする、請求項の第
    38項または第39項によるキット。
  42. 【請求項４２】凍結乾燥試薬を含んでいることを特徴と
    する、請求項の第38項乃至第41項のいずれか１によるキ
    ット。
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