JP2002536642A - トロンビン阻害剤の濃度を測定する方法 - Google Patents
トロンビン阻害剤の濃度を測定する方法Info
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Abstract
Description
bin)またはマイゾトロンビン−デスフラグメント1(meizothrombin-des Fragm
ent 1)(以下、Mtdesfg1)に分解する物質を添加することにより、トロ
ンビン阻害剤の濃度を測定する方法に関する。トロンビン阻害剤として理解され
るのは、トロンビンまたはトロンビン前駆体を直接阻害するすべての天然物質ま
たは合成物質である。天然トロンビン阻害剤の例としてヒルジンが挙げられ、こ
れは医用ヒルの唾液から得ることができる。ヒルジンは、65個のアミノ酸から
成り、分子量が7kDの極小タンパク質である。合成トロンビン阻害剤の例は、
ヒルジンと類似または相同の部分配列を示すいわゆるヒロログ(Hirologe)のほ
か、トリペプチドPhe−Pro−Argまたは係るトリペプチドの誘導体、例
えばホウ酸誘導体、クロロメチルケトン誘導体、ベンザミジン誘導体、アルギニ
ン、アミノ酸修飾誘導体、等から成る、またはそれらを含むポリペプチドである
。前記物質にはヒルジンと本質的に同じ作用機序が共通している可能性がきわめ
て高い。体液の提供生物としては、ヒトおよび哺乳動物、例えば齧歯動物が対象
となる。体液の例は、特に血液または血液から調製される血漿である。しかし、
プロトロンビンを含まない体液、例えば尿、羊水、唾液、腹水およびその他も対
象となる。その場合には、発明の範囲でプロトロンビンを添加する。非混濁とは
、著しい量の浮遊物が被験体液中に存在しないことを意味する。これは、必要で
あれば、例えば体液の遠心分離や上清の排出により達成することができる。
ンへの転換は血液凝固の重要な因子である。トロンビンはフィブリノーゲンから
のフィブリンモノマーの形成に対し、またフィブリンモノマーの重合に対し作用
する。プロトロンビンは、活性化因子X、活性化因子V Ca++−イオンおよび
リン脂質、例えば血小板因子3との協力下にトロンビンに転換される。この場合
、多段の反応が起こり、比較的少量の中間物が形成される。しかし、例えばエカ
リン(Ecarin)または他のヘビ毒またはヘビ毒分画によって凝固を導入すると、
それに対して「変則的な」中間物、例えばマイゾトロンビン、PIVKAマイゾ
トロンビンまたはマイゾトロンビン−デスフラグメント1(PIVKAはビタミ
ンKアンタゴニストによる誘導されるタンパク質の略語である)。これらの変則
的な中間物は興味深いことに例えばヒルジンでは不活性化するが、へパリン(I
Ia因子、IXa因子、XIIa因子および/または抗トロンビンの阻害剤)で
は不活性化しない。また、その他の点では、トロンビン形成やその後の凝固にも
つながる。変則的な中間物とヒルジンおよび他の合成トロンビン阻害剤との親和
性はきわめて高く(マイゾトロンビンではK1>10-10mol/l)、そのた
めトロンビン阻害剤の微小な変則的な中間物が短期的に結合される。
ロンビン阻害剤の消費が凝固の遅延の測定によって理解される冒頭に挙げた種類
の方法において利用される。トロンビン阻害剤の量が多ければ、凝固開始までの
時間が長くなり、逆に少なければ短くなる。この方法は実際上、基本的に優秀で
あることが実証されている。しかし、フィビリノーゲン濃度が(あまりに)低く
、またトロンビン阻害剤濃度が高いと凝固時間が長くなるため、フィブリノーゲ
ン濃度が低い場合には品質低下が発生することが欠点であることがわかっている
。
トロンビン阻害剤の濃度を測定する方法を記載することである。
出物において以下の方法ステップによりトロンビン阻害剤の濃度を測定する方法
を開示する。すなわち、a)生物から体液を採取し、必要に応じて体液の混濁物
を分離し、b)ステップa)で得られる非混濁体液にプロトロンビン/活性マイ
ゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に干渉しない凝固抑制剤、活性マイ
ゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原または蛍光発生原
基質およびマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のプロトロ
ンビのほか、任意にプロトロンビンを添加し、c)ステップb)で得られる溶液
すなわち混合液を時間依存的に波長選択的な光吸収または光放出測定にかけ、d
)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少から体液中に
含有するトロンビン阻害剤の量を求められた標準曲線と比較することにより測定
する。マイゾトロンビンまたはMtdesfg1分解物質中のプロトロンビンの
代替または補充にマイゾトロンビンまたはMtdesfg1を添加することがで
きる。さらに、本発明は、非混濁水性体液中の(発生したマイゾトロンビンまた
はMtdesfg1を抑制するための)トロンビン阻害剤の(特異的)活性を測
定する方法を以下の方法ステップにより開示する。すなわち、a)生物から体液
を採取し、必要に応じて体液の混濁物を分離または非混濁液体を人工的に作製し
、b)ステップa)で得られる非混濁液体に所定量のトロンビン阻害剤、場合に
より、プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に
干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分
解可能な色素原または蛍光発生原基質およびマイゾトロンビンまたはMtdes
fg1に分解する物質のプロトロンビンのほか、任意にプロトロンビンを添加し
、c)ステップb)で得られる溶液すなわち混合液を時間依存的に波長選択的な
光吸収または光放出測定にかけ、d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸
収または光放出の減少から体液中に含有するトロンビン阻害剤の量を求められた
標準曲線と比較することにより測定する。−色素原基質と呼ばれるのは、発色団
を含有し、トロンビンから特異的に呈色分解される物質である。蛍光発生原基質
は、トロンビンから特異的に蛍光を発生する物質の形成下に分解可能である物質
である。当然のことながら、体液が十分にプロトロンビンを含有しないとき、例
えばビタミンKが不足している場合、または予想されるトロンビン阻害剤の量も
しくはトロンビン阻害剤の活性がこれを推奨するとき、または疾患中にプロトロ
ンビン不足が発生しているとき、プロトロンビンを添加するができる。
質が、マイゾトロンビンまたはMtdesfg1からも特異的に分解可能である
という驚くべき認識に基づく。このことは、中間物質は必要な前段階を示すが、
しかし当然のことながらトロンビンと同じ作用または反応を欠くため、予想され
ないことである。本発明による検出反応は呈色反応によってマイゾトロンビンま
たはMtdesfg1阻害のモニタリングによってのみ起こることにより、検出
はフィブリノーゲン濃度と完全に無関係である。それどころか、体液、特に血液
または血漿の使用時には、凝固が阻止され、呈色反応の評価を妨害することがな
い。さらに、本発明によるトロンビン阻害剤の測定は、全範囲において高いフィ
ブリノーゲン濃度での周知の方法による測定と少なくとも同じく正確である。ま
た、場合により体液中に含有し、経口投与される抗凝固剤とは無関係に構成され
る。他の利点は以下の通りである。すなわち、通常の凝固自動装置(これは補正
の目的で多くの場合、多波長で混濁を測定し、したがって通常、波長選択性およ
び波長変動性の光吸収測定の可能性を示す)色素原チャネルにおいて数分以内の
迅速な測定; 個別値のきわめて低いばらつきに基づく確認された値の高い再現
性(信頼性区間は多数の試験により5%以下、通常2.2〜3.5%); 高い
精度または再現性はさらにトロンビン阻害剤またはヒルジンの濃度がきわめて高
い場合にも達成される; 前述の特徴に基づき、本発明による方法は国内および
国際標準化に適している。
する必要がある研究のすべての分野、および(場合により高い能力の)予測的ト
ロンビン阻害剤のスクリーニングにおいて使用される。後者の場合には、高い装
入量により実際の作用に対する多数の合成予測的阻害剤を試験することができる
。この場合、活性とは、果たして阻害が起こるかどうか、起こる場合は、運動力
学または特異的活性がいかなるものかの確認を意味する。他方、臨床的使用、例
えば、治療的理由から阻害剤が投与される患者におけるトロンビン阻害剤濃度の
モニタリングにも提供される。簡単にかつ低コストに、トロンビン阻害剤の過小
または過大投与が起こることの回避、すなわち、ほぼ連続的または非連続的なモ
ニタリングが可能である。
g1の転換を干渉しない凝固抑制剤は、「カルシウム複合体造形物、へパリン、
へパリノイド、抗トロンビンIII、タンパク質C、フィブリン重合抑制物質およ
びこれらの物質の混合物」の群から選択することができる。その具体的な例が、
ペンタファルムAG社(スイス、バーゼル)のペファブロック(Pefabloc)FG
であり、これはテトラペプチド(Gly−Pro−Arg−Pro)であって、
高い親和性によりフィブリノーゲン重合を阻止する。マイゾトロンビンまたはM
tdesfg1に分解する物質中のプロトロンビンは、ヘビ毒およびヘビ毒分画
、例えばDispholidus、Rhabdophis、Bothrops、
Notechis、OxyuranusおよびRussel Vipernの群
から選択することができる。便宜的にそれらから精製された分画を使用する。好
ましくは、エカリン、Echis−carinatus毒素の高度に精製した分
画またはMultisquamase、Echis multisquamat
ousからのプロトロンビン分解性酵素を使用する。係る物質、例えばエカリン
は、スイスのペンタファルムAG社などから入手可能である。
、p−ニトロアニリンの分解下に遊離し、光吸収測定は405nmで行うことが
できる。係る基質または他の基質の例は、クロモザイム(Chromozym)THまた
はペファクロムTHの名称でクロモゲニックス社、べーリンガー社、ペンタファ
ルム社から入手可能のトリペプチドである(ペファクロムTHは、H−D−Ch
G−Ala−Arg−pN.2AcOHである)。蛍光色素基質の例は、ペファ
(Pefa)15865名称でペンタファルム社から入手可能のペファクロムTH蛍
光発生原である。
または放出の測定が、マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質
へのプロトロンビンまたはマイゾトロンビンもしくはMtdesfg1の添加か
ら0〜100s、好ましくは0〜50、最も好ましくは5〜15s後、2回目の
測定がその後、10〜1000s、好ましくは50〜500s、最も好ましくは
150〜300s後に行うことが推奨される。本発明による方法は、特にヒルジ
ンの測定または合成トロンビン阻害剤すなわちヒルローゲンの濃度および/また
は活性の測定のためのものである。
非混濁抽出物におけるトロンビン阻害剤の濃度を測定するための検査キット、す
なわち、K1)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1
の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)活性マイゾトロンビンまたはM
tdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K3)マイゾト
ロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のトロンビンの溶液であって、
構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を有する溶
液で代替または補充が可能であるほか、以下のキット構成要素により非混濁体液
または体液からの非混濁抽出物もしくは非混濁の非天然水性液体の活性を測定す
るための検査キット、すなわち、任意のK1)プロトロンビン/活性マイゾトロ
ンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)
活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解する色素原または蛍光
発生原基質と、K3)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質
のトロンビン溶液であって、構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたは
Mtdesfg1を有する溶液で代替または補充が可能である検査キットに関す
る。キット構成要素は互いに分離することができるが、単一の検査キットパック
に予め準備されている。任意に代替可能な追加のキット構成要素として、プロト
ロンビンを有する溶液が予め準備することができる。
よび/またはマイゾトロンビンまたはMtdesfg1分解性物質の添加に際し
て、これらは明白な所定量で使用されることが理解される。同じことは基質につ
いても該当する。
も新しいトロンビン阻害剤が見出され、特徴づけられ、すなわち以下の方法のス
テップによって入手可能である。すなわち、A)予測的なトロンビン阻害剤の群
の構成要素を所定の好ましくは同じ濃度で、その後のまたは個別に請求項2ない
し8のいずれか1項に記載の方法に同時にかけ、B)それぞれの時間単位で光吸
収または光放出の減少を各予測的なトロンビン阻害剤について算出し、ヒルジン
の所定の好ましくは同じ濃度のそれぞれの時間単位で同じ条件下に測定された光
吸収および光放出と比較し、C)それぞれの時間単位での光吸収または放出の減
少がヒルジンを使用した場合の対応する減少の少なくとも10%に対応する予測
的なトロンビン阻害剤を選択する。
、本発明による方法に対する詳細な説明が合致する。
イスのペンタファルムAG社から購入できるが、例えば文献第US−A−5,5
47,850号における規定により固定化エカリンで製造することもできる。
装置である。その場合に問題となるのは、例えばダーデ−ベーリング(Dade-Beh
ring)社のSysmex CA−500型もしくはS2000型またはElec
tra 2000型である。CA−500では、LEDから放出される光はフィ
ルタ(405nm)により送出され、引き続き試料により送出される。CA−5
00は色素原チャネルにおいて色素、例えばpNA(p−ニトロアニリン)の光
吸収の変化または減少を測定する。試料中にヒルジンがある場合は、生成または
添加されるマイゾトロンビンまたはMtdesfg1は、それにより阻害される
pNA遊離の結果、不活性化する。その点では別に反応(変化)する試料の光学
的密度は光ダイオードによって受容され、評価される。観察される光吸収の変化
は逆にヒルジンの活性に比例する。
液とともに使用した。こうして得られた標準溶をCA−500で測定した。
;0.9%NaCl中で溶解)+トリス緩衝液2100μl。
ル)、3μmol/ml蒸留水に希釈。
、0.3EU/mlに希釈(Ecarinバイアルの内容物は0.9%Nacl
溶液5ml中に溶解し、使用直前に0.9%Nacl、1%プリノネックス(メ
ルク)含有、および0.1M CaCl2溶液の混合液1:2で最終濃度に設定
した。
16.6μl(精製;タンパク質含量:2.22mg/ml)およびトリス緩衝
液(0.05M、pH8、37℃、+0.1M Nacl)900μlとプリオ
ネックス(メルク)100μlの混合液984μlの混合液を使用した。
相関係数が注目される。実験では、完全に標準試料は測定すべき試料により代替
され、図1における不明のヒルジン濃度は光学的密度の測定された減少をもとに
して読み取られる。
Claims (13)
- 【請求項1】 非混濁体液または体液からの非混濁抽出物の濃度を測定する
方法であって、以下の方法ステップ、すなわち a)生物から体液を採取し、必要に応じて体液の混濁物を分離し、 b)ステップa)で得られる非混濁体液にプロトロンビン/活性マイゾトロン
ビンまたはMtdesfg1の転換に干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロン
ビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原または蛍光発生原基質およ
びマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のトロンビンほか、
任意にプロトロンビンを添加し、 c)ステップb)で得られる溶液または混合液を時間依存的に波長選択的な光
吸収または光放出測定にかけ、 d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少から体液
中に含有するトロンビン阻害剤の量を、求められた標準曲線と比較するステップ
により測定する方法。 - 【請求項2】 非混濁水性液体中のトロンビン阻害剤の活性を測定する方法
であって、以下の方法ステップ、すなわち a)生物から体液を採取し、必要に応じて体液の混濁物を分離または非混濁液
体を人工的に作製し、 b)ステップa)で得られる非混濁液体に所定量のトロンビン阻害剤、場合に
より、プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に
干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分
解可能な色素原またはflourogen(蛍光発生原)基質およびマイゾトロ
ンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のトロンビンほか、任意にプロト
ロンビンを添加し、 c)ステップb)で得られる溶液すなわち混合液を時間依存的に波長選択的な
光吸収または光放出測定にかけ、 d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少からトロ
ンビン阻害剤の活性を求められた標準曲線と比較することにより測定するステッ
プで測定する方法。 - 【請求項3】 プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesf
g1の転換を干渉しない凝固抑制剤が、「カルシウム複合体造形物、へパリン、
へパリノイド、抗トロンビンIII、タンパク質C、フィブリン重合抑制物質お
よびこれらの物質の混合物」の群から選択される、請求項1または2に記載の方
法。 - 【請求項4】 マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質の
プロトロンビンが、ヘビ毒およびヘビ毒分画の群から選択される、請求項1〜3
のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項5】 マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質の
プロトロンビンがEcarinである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方
法。 - 【請求項6】 活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可
能な色素原基質が、p−ニトロアニリンの分解下に遊離し、光吸収測定は405
nmで行うことができる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 ステップC)において、最初の吸収または放出の測定が、マ
イゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へのプロトロンビンまた
はマイゾトロンビンもしくはMtdesfg1の添加から0〜100s、好まし
くは0〜50、最も好ましくは5〜15s後、2回目の測定がその後、10〜1
000s、好ましくは50〜500s、最も好ましくは150〜300s後に行
われる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】 トロンビン阻害剤がヒルジン、ヒロログまたは合成トロンビ
ン阻害剤である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】 非混濁体液または体液からの非混濁抽出物におけるトロンビ
ン阻害剤の濃度を測定するための検査キットであって、以下のキット構成要素、
すなわち、K1)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg
1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)活性マイゾトロンビンまたは
Mtdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K3)マイゾ
トロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のプロトロンビン溶液であっ
て、構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を有す
る溶液で代替または補充が可能である構成要素で測定するための検査キット。 - 【請求項10】 非混濁体液または体液からの非混濁抽出物におけるトロン
ビン阻害剤の活性を測定するための検査キットであって、以下のキット構成要素
、すなわち、任意にK1)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtd
esfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)活性マイゾトロンビ
ンまたはMtdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K3
)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1中のプロトロンビンに分解する物質
の溶液であって、構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたはMtdes
fg1を有する溶液で代替または補充が可能である構成要素で測定するための検
査キット。 - 【請求項11】 構成要素は互いに分離されるが、単一検査キットパックで
準備される、請求項9または10に記載の検査キット。 - 【請求項12】 任意に代替可能な追加のキット構成要素としてプロトロン
ビンを有する溶液が準備される請求項9〜11のいずれか1項に記載の検査キッ
ト。 - 【請求項13】 以下の方法ステップ、すなわち A)予測的なトロンビン阻害剤の群の構成要素を所定のかつ好ましくは同じ濃
度で、その後のまたは個別に請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法に同時に
かけ、 B)それぞれの時間単位で光吸収または光放出の減少を各予測的なトロンビン
阻害剤について算出し、ヒルジンの所定のかつ好ましくは同じ濃度のそれぞれの
時間単位で同じ条件下に測定された光吸収および光放出と比較し、 C)それぞれの時間単位での光吸収または放出の減少がヒルジンを使用した場
合の対応する減少の少なくとも10%に対応する予測的なトロンビン阻害剤を選
択するステップにより入手可能であるトロンビン阻害剤。
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