NO161079B - Reagens for optisk bestemmelse av blodkoaguleringsforholdet. - Google Patents

Abstract

Reagens for optisk bestemmelse av blodkoaguleringsforholdet (Quick-test) inneholder et syntetisk trombinsubstrat, buffer og ikke proteolytisk aktivt tromboplastin. Et ikke proteolytisk aktivt tromboplastin oppnås ved fremstilling av et acetontørrpulver fra hjerne, inkubasjon av en nøytral, vandig løsning av acetontørr-pulveret ved 25 til 40°C, utvinning av den uløselige fraksjon, behandling av en suspensjon av denne fraksjon i fortynnet saltløsning med et overflateaktivt middel i nærvær av formiat og tørking av den fraskilte, løse-lige fraksjon.

Description

Oppfinnelsen gjelder et reagens for optisk bestemmelse av blodkoaguleringsforholdet i det såkalte eksogene koaguleringssystemet (Quick Test).

Koaguleringsfysiologiske undersøkelser anvendes i syke-hus, legepraksis og laboratorier i stort omfang, blant annet for preoperative undersøkelser, for erkjennelse av en blød-nings- eller trombose-risiko, for overvåkning av antikoagulans-terapi hos trombosetruede pasienter og ved forløpskontroll av tallrike sykdommer, som f.eks. store infeksjoner, leverfunk-sjons-skader og maligne sykdommer.

De hyppigst gjennomførte koaguleringstester er global-tester, ved hvilke funksjonen til flere komponenter som deltar ved koaguleringen bestemmes samtidig. Som de viktigste glo-baltester gjelder den såkalte protrombin-tidstest (Quick-Test, A. J. Quick, Am. J. Physiol. 118, 260 (1937) og den såkalte aktiverte, partielle tromboplastin-tidstest (PTT). I det følgende forståes med Quick-Test" bestemmelsen av blodkoaguleringsforholdet i det eksogene koaguleringssystemet. Dette systemet initieres ved frigjøring av tromboplastin fra skadet vev. Quick-testen gir opplysning om funksjonstilstanden til de komponenter som regnes til det såkalte eksogene koagulerings-system, PTT-testen angir funksjonstilstanden til de komponenter som deltar i det endogene koaguleringssystemet, som utløses ved kontaktaktivering med faktor XII. Ved patologisk utfall av testene kan defekten til å begynne med ikke tilbakeføres til noen bestemt komponent. Dette må skje ved hjelp av en påfølgende bestemmelse av de enkelte koaguleringsfaktorene, hvortil det likeledes er kjent egnede testsystemer.

Ved gjennomføring av koaguleringsfysiologiske tester

er den vanlige målestørrelse for det meste koaguleringstiden. Derved registreres den tid som går etter tilsetning av reagenset til undersøkelsesvæsken og til dannelse av et koagulat. Uavhengig av arten av de koaguleringsfaktorer som skal bestemmes, er de kjente tester slik at overføringen av fibrinogen til fibrin til slutt utløses av enzymet trombin. Forvandlingen av fibrinogen (løselig) til fibrin (uløselig) tjener derfor som indikator-reaksjon, bortsett fra når fibrinogen selv skal bestemmes.

For måling av koaguleringsinntreden er flere metoder kjente. Hyppigst innføres en platinahake periodisk i koagule-

i

ringssatsen, som ved dannelsen av et koagulat trekker ut en fibrintråd fra løsningen. Dette tidspunkt registreres så som koagulerings-endepunktet. Registreringsfremgangsmåten foregår manuelt ved hjelp av et stoppeur eller elektrisk ved utløsning av en kontakt, når platinahaken tjener som elektrode. En automasjon i betydningen vanlige;klinisk-kjemiske analyser er ikke mulig ifølge dette system, da det ikke er mulig med noen kontinuerlig gjennomføring av prøver, koagulatet ikke kan ut-spyles automatisk og hakene ikke kan renses tilstrekkelig mellom analysene.

En annen mulighet fori registrering av koaguleringstider utgjøres av den uklarhet som inntrer ved dannelsen av koagulatet og som fremkommer ved dannelse av det uløselige fibrinet. Optisk registrerende koaguldmetere er kjente, som arbeider etter dette prinsipp. I praksis settes det imidlertid grenser for dette prinsipp, idet mange plasmaer oppviser en høy egen-klarhet, de reagenser som anvendes er selv til tider uklare og koaguleringen foregår så langsomt i et patologisk undersøkel-sesmateriale at det ikke oppstår noe entydig signal.

Den enkleste mulighet for å unngå uklarhetsproblemer er å arbeide ved høyere fortynning. Dette er imidlertid ikke uten videre mulig ved de kjente metodene, da samtidig med fortynningen også reaksjonstiden ved koaguleringstesten forlenges sterkt og den mulige fordel, med automasjon igjen oppheves ved den forlengede reaksjonstid. Fra en bestemt fortynning av, strekker heller ikke det fibrinogen som inneholdes i prøven til for indikator-reaksjonén, som består i forvandlingen av fibrinogen til fibrin. Plasma fortynnet 1:10 har f.eks. overfor ufortynnet plasma i Quick-testen en ca. 3-5 ganger så lang koaguleringstid. Målet på forlengelsen av koaguleringstidene ved fortynning er beskrevet kvantitativt blant annet av Biggs, Proceedings of the Royal Society (GB) 173, 421 - 441 (1969)

og Girolami, Blut 28, 351 - 360 (1974).

Særlig sterkt forlengede reaksjonstider oppnås når det utover prøvefortynning også foretas fortynning av reagensene (s. Biggs). En reagens-fortynning er imidlertid også en bestemt forutsetning for en. for uklarhetsproblenier fri optisk måling av koaguleringsprosessen. De reagenser som anvendes i koagu-leringsdiagnostikken har nemlig en egenuklarhet som er umid-delbart forbundet med deres funksjon. De vevstromboplastiner som anvendes for gjennomføring av Quick-testene er melkeaktig uklare suspensjoner fra pattedyrvev, f.eks. kaninhjerner.

Det er allerede beskrevet metoder og reagenser som er egnet for gjennomføring av globale koaguleringstester i fortynnet medium. De beror på anvendelse av syntetiske, kromogene peptidsubstrater for gjennomføring av indikator-reaksjonen,

da som nevnt fibrinogeninnholdet ikke strekker til ved for-fortynning. De syntetiske, kromogene substratene anvendes derved isteden for det naturlige substrat, fibrinogen. Det optiske signal oppstår ved spalting av substatet ved trombin, som frigjør et fragment som kan bestemmes optisk. (Sammenlign Paulsen et al. Thrombosis Research 15, 351-358 (1979) og

EP 0014039.)

En ulempe ved fremgangsmåten som anvender seg av et syntetisk substrat og av tromboplastin for den optiske Quick-test består deri at det ikke er mulig å skaffe et forhånds-blandet 1-komponent-reagens som inneholder samtlige substanser som er nødvendige for gjennomføring av testen. Tromboplastin oppviser nemlig en proteolytisk aktivitet som fører til spaltning av substratet og dermed forfalsker substratspaltningen av det dannede trombin. Dessuten ville et slikt reagens ikke kunne lagres.

Det er et formål med oppfinnelsen å løse dette problem, og skaffe et reagens som inneholder samtlige nødvendige substanser for gjennomføring av testene, som kan lagres og som gir riktige resultater.

Oppfinnelsen angår således et reagens for optisk bestemmelse av blodkoaguleringsforholdet (Quick-test), som inneholder tromboplastin erholdt fra acetontørrpulver fra hjerne, et syntetisk trombinsubstrat og buffer, hvilket reagens er kjennetegnet ved at det inneholder et tromboplastin som ikke er proteolytisk aktivt, som er fremstilt ved fremstilling av et acetontørrpulver fra hjerne, inkubasjon av en nøytral, vandig løsning av acetontørrpulveret ved 25 til 40°C, utvinning av den uløselige fraksjon, behandling av en suspensjon av denne fraksjon i fortynnet saltløsning med et overflateaktivt middel i nærvær av formiat og tørking av den fraskilte, løse-lige fraksjon.

Enhver fremstilling av et aceton-tørrpulver fra vevs-materialet kan foregå ifølge.kjente metoder for fremstilling av aceton-tørrpulver. En egnet fremgangsmåte er eksempelvis beskrevet i R. Biggs, "Human Blood Coagulation, Haemostasis and Thrombosis", Blackwell Scientific Publication Oxford, 1976, side 663.

Aceton-tørrpulveret suspenderes i en nøytral, vandig løsning og inkuberes under omrøring ved den angitte temperatur. Foretrukket er en temperatur, mellom 35 og 40°C. Under disse betingelser varer inkubasjonen ca. en halv time. Derved kan pH-verdien ligge mellom 6,0 og 8,0, fortrinnsvis mellom 6,7

og 7,3. Hensiktsmessig holdes den konstant ved hjelp av en egnet buffer. Den uløselige fraksjon lar seg skille ut ved sentrifugering, eksempelvis ved 2500 g. Det ved sentrifuge-ringen oppnådde bunnfall suspenderes på nytt i en fortynnet saltløsning og behandles fortrinnsvis med et overflateaktivt middel av cholesyre-gruppen i nærvær av formiat. Saltløsningen er fortrinnsvis laget av NaCl. Egnede konsentrasjoner ligger mellom 0,2 og 2,0 fortrinnsvis 0,5 og 1,0 %. Konsentrasjonen av overflateaktive midler ligger fortrinnsvis mellom 0,01 og 0,2 %, spesielt når de foretrukne cholatene anvendes. Det kan imidlertid også anvendes andre overflateaktive midler.

Som formiat kommer alkali- og jordalkali-formiatene i første linje i betraktning. : Særlig foretrukket er kalsiumformiat. Konsentrasjonen ligger fortrinnsvis mellom 0,005 og 0,05 mol/l. Behandlingen gjennomføres fortrinnsvis i tempera-turområdet mellom 25 og 40°e, tidsvarigheten tilsvarer den som anvendes for inkubasjonen av tørrpulveret. Tilslutt avsentri-

i

fugeres, eksempelvis ved 2500 x g, og den oppnådde suspensjon av et ikke mer proteolytisk i aktivt tromboplastin, eventuelt etter tidligere tilsetning åv de andre bestanddelene i reagenset ifølge oppfinnelsen,I frysetørkes. Reagenset kan imidlertid også sammenblandes av de faste, tørre substansene i de ønskede mengdeforhold.

Som syntetisk trombinsubstrat kan prinsipielt ethvert kjent syntetisk trombinsubstrat anvendes. Tallrike slike trombinsubstrater finnes i handelen. Foretrukket er substratet Tos-Gly-Pro-Arg-pNA såvel som det under betegnelsen S-2238 solgte H-D-Phe-Pip-Arg-pNA. Disse substrater gir fargede spaltningsprodukter ved den enzymatiske spaltning, som lett lar seg bestemme optisk kvantitativt.

Reagenset ifølge oppfinnelsen inneholder tromboplastin i en konsentrasjon på 3 til 20 vol%, fortrinnsvis 6 til 10 vol%, med en aktivitet som beskrevet i eksempel 1. Syntetisk trombinsubstrat i en mengde på 2 x 10 -5 til 20 x 10 -5 mol/l såvel som buffer av pH 7,2 til 8,5. Bufferkonsentrasjonen ligger fortrinnsvis mellom 0,05 og 0,25 mol/l. I prinsipp er enhver buffer som er virksom i det angitte pH-område egnet, særlig foretrukket er imidlertid trisbuffer. De beste resultater oppnås med 0,1 mol/l buffer av pH 8,1. Den spesielt foretrukne substratkonsentrasjon ligger på ca. 5x10 -5 mol/l.

Fortrinnsvis inneholder reagenset ifølge oppfinnelsen dessuten Ca-salt i en konsentrasjon på 2 til 10 mmol/1, som lik det som er angitt ovenfor, er beregnet på ferdig reagens-løsning. Som Ca-salt egner seg ethvert lett vannløselig Ca-salt, eksempelvis et halogenid, acetat eller lignende. Foretrukket er kalsiumklorid.

Foretrukket inneholder reagenset dessuten ytterligere 0,5 til 3 vekt% urea. Spesielt foretrukket er 1,4 til 1,6 %.

Et reagens ifølge oppfinnelsen med ovenstående sammen-setning utgjør i bruksferdig form et fortynnet system, men reaksjonsvarigheten like overfor de kjente testene i et ufortynnet system forlenges bare uvesentlig. Bestemmelsen varer med normalplasma ca. 30 sek., med plasma fra personer, som under tromboseprofylaks får orale antikoaguleringsmidler, fra ca. 60 til 120 sek. Ved de kjente ufortynnede Quick-testene med de ovenfor omtalte ulemper ligger de tilsvarende tider for normalplasma på ca. 15 sek., ved de nevnte patologiske plasmaer på 30 til 60 sek. Like overfor dette behøver de kjente testene, som når det gjelder fortynningen kan sammenlignes med reagenset ifølge oppfinnelsen, omtrent fem ganger så lang reaksjonstid. Reagenset ifølge oppfinnelsen anvendes hensiktsmessig slik, at tiden for oppnåelse åv en bestemt absorpsjon ved gitt bølgelengde måles. Det er imidlertid også mulig med en kine-tisk verdiangivelse, hvorved det da hensiktsmessig legges en justeringskurve til grunn for'verdiangivelsen. Den vesentlig formihskede bestemmelsestid like overfor de kjente optiske Quick-testene på basis av syntetiske substrater tilbakeføres til en synergistisk virksomhet av ionestyrken og pH-verdien

t

som ligger utenfor det fysiologiske område og substratkonsen-trasjonen som ligger under KM;.

Følgende eksempler forklarer oppfinnelsen ytterligere:

Eksempel 1

A) Fremstilling av ikke proteolytisk aktivt tromboplastin:

Fra nyutvunnet kaninhjerne fremstilles et tørrpulver ved acetonbehandling ifølge fremgangsmåten til R. Biggs, "Human Blood Coagulation, Haemostasis and Thrombosis", Blackwell Scientific Publications Oxford 1976, s. 663 og pulveret tørkes inntil konstant vekt oppnås.

2,5 g av det ovennevnte pulver suspenderes i 50 ml 0,1 mol/l natriumacetat-buffer, pH 7, og røres i 30 minutter ved 37°C. Deretter sentrifugeres i 15 min. ved 2500 g og bunn-fallet omrøres på nytt i 30 min. ved 37°C i 50 ml 0,7 %-ig NaCl-løsning som inneholder 0,05 % natrium-deoxycholat og har 0,0125 mol/l kalsiumformiat.: Deretter sentrifugeres i 15 min. ved 2500 g.

i

Den overstående væske inneholder tromboplastin som ikke har proteolytisk aktivitet.

Aktiviteten til tromboplastinsuspensjonen bestemmes ved hjelp av Quick-testen, som gjennomføres etter DIN 58910. Et normalt handelsplasma fremstilt etter DIN 58910 oppviser en koaguleringstid på 12 t 2 sek.

B) Fremstilling av en reagensblanding for gjennomføring av en

optisk Quick-test:

Løsning 1: 0,1 mol tris/HCl, pH 8,1, inneholdende 2 % glycin Løsning 2: vandig løsning av Tos-Gly-Pro-Arg-pNA-acetat,

397 mg/dl

Løsning 3: Tromboplastinsuspensjon fremstilt ifølge A.

10 volumdeler av løsning 1 blandes med 4 volumdeler av løsning 3 og 1 volumdel av løsning 2 og 3 ml alikvoter av blandingen lyofiliseres.

Eksempel 2

Gjennomføring av en optisk Quick-test.

For gjennomføring av testen oppløses 3 ml av lyofili-satet fra eksempel 1 B i 30 ml tris/HCl-buffer, pH 8,1, som i tillegg inneholder 1,5 % urea og 6 mmol/1 CaCl2. Reaksjons-blandingen bringes på 37°C.

Fotometerdata: måltemperatur 37°C, bølgelengde 405 nm.

Det anvendes prøver på hver 50 yl (citratplasma, hen-holdsvis fortynning av citratplasma i fysiologisk NaCl) og reaksjonen startes med 750 yl reaksjonsblanding. Samtidig startes en skriver (10 cm/min).

Det oppnås de kurver som vises i fig. 1 på den medsendte tegning, når det etter hverandre anvendes ufortynnet og 1:2, 1:4 og 1:10 forfortynnet plasma.

Eksempel 3

Fra de kurver som oppnåddes i eksempel 2 uttas tiden

for oppnåelse av en ekstinksjon som er 30 mE høyere enn ut-gangsekstinksjonen. Disse tider oppføres mot de resiproke plasmafortynningene. Det oppnås en rett linje. Den forut-satte ekstinksjon på 30 mE kan varieres innen vide områder, f.eks. fra 10 til 150 mE. Det oppnås alltid en rett linje.

Eksempel 4

Tilsvarende eksempel 2 testes 60 plasmaer fra pasienter som står under oral antikoagulasjons-terapi, ufortynnet og tiden for oppnåelse av en ekstinksjon som ligger 30 mE overfor utgangsverdien registreres. De samme plasmaer testes ved hjelp av den vanlige Quick-test under anvendelse av et koagulometer etter Schnitker og Gross og koaguleringsmetodene registreres. Dataene fra begge systemer underkastes en lineær regresjons-analyse. Det fremkommer en korrelasjonskoeffisient på r = 0,96.

Eksempel 5

Tilsvarende eksempel 1 B fremstilles reagensblandinger under anvendelse av et ifølge eksempel 1 A fremstilt, ikke proteolytisk aktivt tromboplastin såvel som et handelsvanlig tromboplastin (Thromboplastin a, Boehringer Mannheim). Rea-gensblandingene fortynnes med tris/HCl-buffer, pH 8,1, tilsvarende eksempel 2 til ferdig; reaksjonsblanding og denne lagres ved romtemperatur (ca. 20°C). I bestemte tidsavstander måles egenekstinksjonen for reaksjonsblandingene ved 405 nm. Resultatene vises i tabell 2. 1 det handelsvanlige trombo-plastinet finner man en rask ekstinksjonsstigning, som beror på en spaltning av det tilsatte, kromogene peptidsubstratet.

Claims (4)

1. Reagens for optisk bestemmelse av blodkoaguleringsforholdet (Quick-test), som inneholder tromboplastin erholdt fra acetontørrpulver fra hjerne, et syntetisk trombinsubstrat og buffer, karakterisert ved at det inneholder et tromboplastin som ikke er proteolytisk aktivt, som er fremstilt ved fremstilling av et acetontørrpulver fra hjerne, inkubasjon av en nøytral, vandig løsning av aceton-tørrpulveret ved 25 til 40°C, utvinning av den uløselige fraksjon, behandling av en suspensjon av denne fraksjon i fortynnet saltløsning med et overflateaktivt middel i nærvær av formiat og tørking av den fraskilte, løselige fraksjon.

2. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder ikke proteolytisk aktivt tromboplastin i en konsentrasjon på 3 til 20 vekt%, 2 x 10~<5> mol/l syntetisk trombinsubstrat, 0,05 til 0,25 mol/l buffer av pH 7,2 til 8,5 og 2 til 10 mmol/1 Ca-salt.

3. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at det i tillegg inneholder 0,5 til 3% urea.

4. Reagens ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at det inneholder trisbuffer.