JPH06331628A - 抗リン脂質抗体の測定方法 - Google Patents

抗リン脂質抗体の測定方法

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JPH06331628A
JPH06331628A JP12605593A JP12605593A JPH06331628A JP H06331628 A JPH06331628 A JP H06331628A JP 12605593 A JP12605593 A JP 12605593A JP 12605593 A JP12605593 A JP 12605593A JP H06331628 A JPH06331628 A JP H06331628A
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JP
Japan
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measuring
clot formation
formation time
time
sample
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Pending
Application number
JP12605593A
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English (en)
Inventor
Yasuo Ono
安男 大野
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Sekisui Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Chemical Co Ltd
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Publication date
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アクチベーターの添加量を血餅形成時間が正
常血餅形成時間よりも延長されるように調整した生物学
的検体の血餅形成時間を測定し、また、正常血餅形成時
間を測定し、得られた2つの測定値を比較することを特
徴とする抗リン脂質抗体の測定方法である。 【効果】 抗凝固治療薬や低フィブリノゲン検体などの
場合でも抗リン脂質抗体を再現性よくかつ信頼性よく測
定でき、定量性のある測定が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、凝固時間の測定による
抗リン脂質抗体の測定方法に関し、さらに詳しくは、抗
体凝固治療薬や低フィブリノゲン検体などの場合でも再
現性よくかつ信頼性よく、定量性のある測定が可能な抗
リン脂質抗体の測定方法に関する。
【0002】
【発明の背景】従来より、全身性紅斑性狼瘡(SLE)
をはじめ、種々の膠原病において凝固異常が知られてお
り、この本体は疾患に由来する自己抗体であることから
ループスアンチコアグラント(LA)と呼ばれている。
最近に至り、LAは膠原病ばかりでなく、一見正常と思
われる人の血液中にも検出され、血栓形成あるいは流産
の一因と密接な関連性があると言われており、この点で
LAは抗リン脂質抗体とも呼ばれている。
【0003】抗リン脂質抗体の測定には、リン脂質抗原
(カルジオライピン、フォスファチジルセリンなど)を
マイクロタイター・プレートに固相化させたELISA
法の他、リン脂質依存性凝固反応の阻害を検出する目的
で考案されたものが利用されている。それらは正常血
漿と患者血漿の混合によるAPTT(活性部分トロンボ
プラスチン時間)、血小板を利用したplatelet neutr
alization procedure,PNP、トロンボプラスチンを
利用したtissue thromboplastin inhibition test,TT
IT、蛇毒酵素を利用したdiluted Russel Viper Ven
om test,DRVVTなどである(Thomas Exner et.al.Th
rombosis and Haemostasis 65(3),320-322(1993)参
照)。これらの凝固反応を利用した方法は、臨床検査の
分野において既に採用されている。
【0004】
【従来の技術】凝固反応を利用した方法としては前述の
如くAPTT(活性部分トロンボプラスチン時間)やP
T(プロトロンビン時間)などの凝固時間の測定を利用
したものがある。
【0005】しかし、これらの方法では、フィブリン塊
が生じるまでの時間を測定するため抗凝固治療薬や低フ
ィブリノゲン検体などでは凝固時間が見かけ上延長した
り、フィブリノゲンが少ないことにより凝固塊が形成し
にくいことがあり、フィブリン塊の検出は測定データに
影響を及ぼすばかりでなく定量性に問題があった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の点に
鑑み、抗凝固治療薬や低フィブリノゲン検体などの場合
でも抗リン脂質抗体を再現性よくかつ信頼性よく測定で
き、定量性のある測定が可能である抗リン脂質抗体の測
定方法を提供することを目的とするものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明による抗リン脂質
抗体の測定方法は、上記目的を達成すべく工夫された門
であり、血餅形成時間が正常血餅形成時間よりも延長さ
れるようにアクチベーターの添加量を調整した生物学的
検体の血餅形成時間を測定し、別途、正常血餅形成時間
を測定し、得られた2つの測定値を比較することを特徴
とするものである。
【0008】この測定方法の好ましい実施態様において
は、検体にトロンボプラスチン、カルシウムイオン、ヘ
パリンの阻害剤、およびトロンビンの発色性基質よりな
る試薬を混合した後、遊離発色団の至適吸収において所
定の変化量が得られるまでの時間を測定する。
【0009】もう1つの好ましい実施態様においては、
検体に血餅形成系のアクチベーター、好ましくはトロン
ボプラスチン、カルシウムイオン(2〜100mmol
/l)、ヘパリン中和物およびトロンビン活性検出用の
基質よりなる試薬を混合することにより血餅形成反応を
開始し、その試薬を添加してから遊離発色団の至適吸収
において所定の変化量が得られるまでの時間を測定す
る。
【0010】ヘパリン阻害剤としてはポリブレン(Polyb
ren)がよく用いられる。
【0011】トロンビン活性検出用の基質としては
【化1】 [式中、RはC1 〜C5 のアルキルまたは−CH[CH
(CH3 2 ]COOCH3 なる基、XはH−D−Ph
e、Boc−Glyまたはトシル−Glyをそれぞれ意
味する]で示される化合物が好ましい。
【0012】血餅形成時間の測定法自体は公知である。
この測定法は、特に、血餅形成または発色性基質の転化
を介してプロトロンビンから遊離したトロンビンの量を
測定する方法であってよい。好ましい方法は発色性基質
を用いる方法であり、特に発色性のトロンビン基質、例
えばTos−Gly−Pro−Arg−pNA(ペンタ
ファーム社)や、Boc−Val−Pro−Arg−M
CA(タンパク質研究奨励会)などのトロンビン基質を
用いる方法が好ましい。
【0013】血餅形成時間は、発色性基質を用いる場合
には、好ましくは、試薬添加から、遊離される発色団の
至適吸収において一定の吸光度に達するまでの時間を測
定することにより求められる。特に、吸光度の変化量を
見る場合は、その変化が0.1生じるまでの時間から、
血餅形成時間の評価を行うのがよい。また、アクチベー
ターの添加量を血餅形成時間が正常血餅形成時間よりも
延長されるように調整した生物学的検体の血餅形成時間
(D−PT)と正常血餅形成時間(N−PT)との比、
即ち、LA値=D−PT/N−PTから血餅形成時間の
測定を行うのが有利である。生物学的検体は、好ましく
は、ヒトからの血漿とすることができ、この場合に未希
釈血漿を用いるのが好ましい。検体を速かに測定できな
い場合には、これを凍結保存することができるが、好ま
しくは、採血後速かに血漿分離して得た血漿を用いる。
【0014】遊離される発色団の至適吸収を測定する機
器としては、特別なものは必要でなく、連続的に吸光度
や蛍光強度が測定できるものであればよい。
【0015】血栓形成系のアクチベーター自体は公知で
ある。本発明で用いる好ましいアクチベーターはトロン
ボプラスチンである。これは一般に用いられているよう
にヒトあるいは動物の脳、胎盤や肺などに由来するトロ
ンボプラスチンであってよい。また、これはPT試薬と
して広く使用されているトロンボプラスチンであっても
よい。
【0016】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
【0017】実施例1 正常血漿として早期空腹時に静脈から採血したクエン酸
加血漿を用意した。ループスアンチコアグラント陽性血
漿としてコスモバイオ社製の血漿を用意した。おのおの
の試料は、使用するまで氷中に保存した。吸光度の変化
量はコバスファラ(ロッシュ社製)を用いて405nm
の吸収光度を連続的に測定することにより求めた。アク
チベーターとしてシンプラスチン(小野薬品製)を用い
た。
【0018】正常法では指示書どおりの試薬調製を行っ
た。一方、アクチベーター添加による希釈法ではシンプ
ラスチンを生理食塩水(大塚製薬製)により50倍希釈
して用いた。発色性基質としてはTos−Gly−Pr
o−Arg−pNA(ペンタファーム社製)を用いた
(100nmol/ml)。測定キュベットを予め37
℃に保温した。血漿を50μl分注し、次いでシンプラ
スチン液を200μl加えた直後から吸光度を連続的に
測定し、変化量が0.1になるまでの時間を測定した。
【0019】正常血漿の血餅形成時間(N−PT)は1
5.4秒、シンプラスチレン希釈血漿の血餅形成時間
(D−PT)は39.9秒であり、LA値=D−PT/
N−PTは2.6であった。一方、陽性血漿のLA値は
4.5であった。このように、LA陽性血漿ではLA値
が正常血漿の値に比較し大きかった。
【0020】実施例2 正常血漿にノボヘパリン(ノボ社)を1.0 IU/m
lとなるように加えたものを添加試料とした。ヘパリン
無添加の正常血漿と添加血漿をそれぞれ試料とした。以
下の測定操作は実施例1と同様に行った。ヘパリン無添
加血漿のD−PTは40.0秒、N−PTは14.5秒
であった(LA値=2.75)。一方、ヘパリン添加血
漿ではD−PTは54.0秒、N−PTは17.5秒
(LA値=3.08)であった。
【0021】アクチベーターにポリブレンを2μg/m
l含むものを用いて測定を行ったところ、LA値は2.
76(N−PT=14.6秒、D−PT=40.1秒)
であった。ヘパリンの存在する血漿では見かけ上N−P
T,D−PTは延長したが、アクチベーターにポリブレ
ンを含めた系では正常血漿のLA値になり変化は見られ
なかった。
【0022】
【発明の効果】本発明の抗リン脂質抗体の測定方法によ
れば、抗凝固治療薬や低フィブリノゲン検体などの場合
でも抗リン脂質抗体を再現性よくかつ信頼性よく測定で
き、定量性のある測定が可能である。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 凝固時間の測定による抗リン脂質抗体の
    測定方法において、血餅形成時間が正常血餅形成時間よ
    りも延長されるようにアクチベーターの添加量を調整し
    た生物学的検体の血餅形成時間を測定し、別途、正常血
    餅形成時間を測定し、得られた2つの測定値を比較する
    ことを特徴とする抗リン脂質抗体の測定方法。
  2. 【請求項2】 検体にトロンボプラスチン、カルシウム
    イオン、ヘパリンの阻害剤、およびトロンビンの発色性
    基質よりなる試薬を混合した後、遊離発色団の至適吸収
    において所定の変化量が得られるまでの時間を測定する
    請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 検体に血餅形成系のアクチベーター、2
    〜100mmol/lのカルシウムイオン、ヘパリン中
    和物およびトロンビン活性検出用基質よりなる試薬を混
    合することにより血餅形成反応を開始し、その試薬を添
    加してから遊離発色団の至適吸収において所定の変化量
    が得られるまでの時間を測定する請求項1記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2000062077A1 (en) * 1999-04-12 2000-10-19 South Eastern Sydney Area Health Service Procoagulant assay

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