JP4942872B2 - トロンビン阻害剤の濃度を測定する方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、生物から体液を抽出し、その体液にマイゾトロンビン(meizothrombin)またはマイゾトロンビン−デスフラグメント1(meizothrombin-des Fragment 1)(以下、Mtdesfg1)に分解する物質を添加することにより、トロンビン阻害剤の濃度を測定する方法に関する。トロンビン阻害剤として理解されるのは、トロンビンまたはトロンビン前駆体を直接阻害するすべての天然物質または合成物質である。天然トロンビン阻害剤の例としてヒルジンが挙げられ、これは医用ヒルの唾液から得ることができる。ヒルジンは、65個のアミノ酸から成り、分子量が7kDの極小タンパク質である。合成トロンビン阻害剤の例は、ヒルジンと類似または相同の部分配列を示すいわゆるヒロログ(Hirologe)のほか、トリペプチドPhe−Pro−Argまたは係るトリペプチドの誘導体、例えばホウ酸誘導体、クロロメチルケトン誘導体、ベンザミジン誘導体、アルギニン、アミノ酸修飾誘導体、等から成る、またはそれらを含むポリペプチドである。前記物質にはヒルジンと本質的に同じ作用機序が共通している可能性がきわめて高い。体液の提供生物としては、ヒトおよび哺乳動物、例えば齧歯動物が対象となる。体液の例は、特に血液または血液から調製される血漿である。しかし、プロトロンビンを含まない体液、例えば尿、羊水、唾液、腹水およびその他も対象となる。その場合には、発明の範囲でプロトロンビンを添加する。非混濁とは、著しい量の浮遊物が被験体液中に存在しないことを意味する。これは、必要であれば、例えば体液の遠心分離や上清の排出により達成することができる。
【0002】
発明の基礎となる理論的背景は以下の通りである。プロトロンビンのトロンビンへの転換は血液凝固の重要な因子である。トロンビンはフィブリノーゲンからのフィブリンモノマーの形成に対し、またフィブリンモノマーの重合に対し作用する。プロトロンビンは、活性化因子X、活性化因子V Ca++−イオンおよびリン脂質、例えば血小板因子3との協力下にトロンビンに転換される。この場合、多段の反応が起こり、比較的少量の中間物が形成される。しかし、例えばエカリン(Ecarin)または他のヘビ毒またはヘビ毒分画によって凝固を導入すると、それに対して「変則的な」中間物、例えばマイゾトロンビン、PIVKAマイゾトロンビンまたはマイゾトロンビン−デスフラグメント1(PIVKAはビタミンKアンタゴニストによる誘導されるタンパク質の略語である)。これらの変則的な中間物は興味深いことに例えばヒルジンでは不活性化するが、へパリン(IIa因子、IXa因子、XIIa因子および/または抗トロンビンの阻害剤)では不活性化しない。また、その他の点では、トロンビン形成やその後の凝固にもつながる。変則的な中間物とヒルジンおよび他の合成トロンビン阻害剤との親和性はきわめて高く(マイゾトロンビンではK1>10-10mol/l)、そのためトロンビン阻害剤の微小な変則的な中間物が短期的に結合される。
【0003】
上述の関係は、文献第US−A−5,547,850号に記載され、いわばトロンビン阻害剤の消費が凝固の遅延の測定によって理解される冒頭に挙げた種類の方法において利用される。トロンビン阻害剤の量が多ければ、凝固開始までの時間が長くなり、逆に少なければ短くなる。この方法は実際上、基本的に優秀であることが実証されている。しかし、フィビリノーゲン濃度が(あまりに)低く、またトロンビン阻害剤濃度が高いと凝固時間が長くなるため、フィブリノーゲン濃度が低い場合には品質低下が発生することが欠点であることがわかっている。
【0004】
本発明の技術的問題は、フィブリノーゲン濃度に関係なく正確な値を提供するトロンビン阻害剤の濃度を測定する方法を記載することである。
【0005】
この問題を解決するために、本発明は、非混濁体液または体液からの抽出物において、以下の方法ステップによりトロンビン阻害剤の濃度を測定する方法を開示する。すなわち、a)生物から体液を採取し、体液の混濁物を分離し、b)ステップa)で得られる非混濁体液にプロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原、または蛍光発生原基質およびマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へ、プロトロンビンを添加し、c)ステップb)で得られる溶液すなわち混合液を時間依存的に波長選択的な光吸収または光放出測定にかけ、d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少から体液中に含有するトロンビン阻害剤の量を、所定濃度のヒルジンについてそれぞれの時間単位で同じ条件下で測定された光吸収および光放出の標準曲線と比較することにより測定する。マイゾトロンビンまたはMtdesfg1分解物質中のプロトロンビンの代替または補充にマイゾトロンビンまたはMtdesfg1を添加することができる。さらに、本発明は、非混濁水性体液中の(発生したマイゾトロンビンまたはMtdesfg1を抑制するための)トロンビン阻害剤の(特異的)活性を測定する方法を以下の方法ステップにより開示する。すなわち、a)生物から体液を採取し、体液の混濁物を分離し、b)ステップa)で得られる非混濁液体に所定量のトロンビン阻害剤、場合により、プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原、または蛍光発生原基質およびマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へ、プロトロンビンを添加し、c)ステップb)で得られる溶液すなわち混合液を時間依存的に波長選択的な光吸収または光放出測定にかけ、d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少から体液中に含有するトロンビン阻害剤の量を、所定濃度のヒルジンについてそれぞれの時間単位で同じ条件下で測定された光吸収および光放出の標準曲線と比較することにより測定する。−色素原基質と呼ばれるのは、発色団を含有し、トロンビンから特異的に呈色分解される物質である。蛍光発生原基質は、トロンビンから特異的に蛍光を発生する物質の形成下に分解可能である物質である。当然のことながら、体液が十分にプロトロンビンを含有しないとき、例えばビタミンKが不足している場合、または予想されるトロンビン阻害剤の量もしくはトロンビン阻害剤の活性がこれを推奨するとき、または疾患中にプロトロンビン不足が発生しているとき、プロトロンビンを添加することができる。
【0006】
本発明は、トロンビンから特異的に分解される色素原物質または蛍光発生原物質が、マイゾトロンビンまたはMtdesfg1からも特異的に分解可能であるという驚くべき認識に基づく。このことは、中間物質は必要な前段階を示すが、しかし当然のことながらトロンビンと同じ作用または反応を欠くため、予想されないことである。本発明による検出反応は呈色反応によってマイゾトロンビンまたはMtdesfg1阻害のモニタリングによってのみ起こることにより、検出はフィブリノーゲン濃度と完全に無関係である。それどころか、体液、特に血液または血漿の使用時には、凝固が阻止され、呈色反応の評価を妨害することがない。さらに、本発明によるトロンビン阻害剤の測定は、全範囲において高いフィブリノーゲン濃度での周知の方法による測定と少なくとも同じく正確である。また、場合により体液中に含有し、経口投与される抗凝固剤とは無関係に構成される。他の利点は以下の通りである。すなわち、通常の凝固自動装置(これは補正の目的で多くの場合、多波長で混濁を測定し、したがって通常、波長選択性および波長変動性の光吸収測定の可能性を示す)色素原チャネルにおいて数分以内の迅速な測定; 個別値のきわめて低いばらつきに基づく確認された値の高い再現性(信頼性区間は多数の試験により5%以下、通常2.2〜3.5%); 高い精度または再現性はさらにトロンビン阻害剤またはヒルジンの濃度がきわめて高い場合にも達成される; 前述の特徴に基づき、本発明による方法は国内および国際標準化に適している。
【0007】
本発明による方法は、一方では研究、すなわちトロンビン阻害剤の濃度を測定する必要がある研究のすべての分野、および(場合により高い能力の)予測的トロンビン阻害剤のスクリーニングにおいて使用される。後者の場合には、高い装入量により実際の作用に対する多数の合成予測的阻害剤を試験することができる。この場合、活性とは、果たして阻害が起こるかどうか、起こる場合は、運動力学または特異的活性がいかなるものかの確認を意味する。他方、臨床的使用、例えば、治療的理由から阻害剤が投与される患者におけるトロンビン阻害剤濃度のモニタリングにも提供される。簡単にかつ低コストに、トロンビン阻害剤の過小または過大投与が起こることの回避、すなわち、ほぼ連続的または非連続的なモニタリングが可能である。
【0008】
具体的にいえば、プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤は、「カルシウム複合体造形物、へパリン、へパリノイド、抗トロンビンIII、タンパク質C、フィブリン重合抑制物質およびこれらの物質の混合物」の群から選択することができる。その具体的な例が、ペンタファルムAG社(スイス、バーゼル)のペファブロック(Pefabloc)FGであり、これはテトラペプチド(Gly−Pro−Arg−Pro)であって、高い親和性によりフィブリノーゲン重合を阻止する。マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質中のプロトロンビンは、ヘビ毒およびヘビ毒分画、例えばDispholidus、Rhabdophis、Bothrops、Notechis、OxyuranusおよびRussel Vipernの群から選択することができる。便宜的にそれらから精製された分画を使用する。好ましくは、エカリン、Echis−carinatus毒素の高度に精製した分画またはMultisquamase、Echis multisquamatousからのプロトロンビン分解性酵素を使用する。係る物質、例えばエカリンは、スイスのペンタファルムAG社などから入手可能である。
【0009】
活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原基質は、p−ニトロアニリンの分解下に遊離し、光吸収測定は405nmで行うことができる。係る基質または他の基質の例は、クロモザイム(Chromozym)THまたはペファクロムTHの名称でクロモゲニックス社、べーリンガー社、ペンタファルム社から入手可能のトリペプチドである(ペファクロムTHは、H−D−ChG−Ala−Arg−pN.2AcOHである)。蛍光色素基質の例は、ペファ(Pefa)15865名称でペンタファルム社から入手可能のペファクロムTH蛍光発生原である。
【0010】
具体的にいえば、問題となる活性の場合、ステップC)において、最初の吸収または放出の測定が、マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へのプロトロンビンまたはマイゾトロンビンもしくはMtdesfg1の添加から0〜100s、好ましくは0〜50、最も好ましくは5〜15s後、2回目の測定がその後、10〜1000s、好ましくは50〜500s、最も好ましくは150〜300s後に行うことが推奨される。本発明による方法は、特にヒルジンの測定または合成トロンビン阻害剤すなわちヒルローゲンの濃度および/または活性の測定のためのものである。
【0011】
本発明はさらに、以下のキット構成要素により、非混濁体液または体液からの非混濁抽出物におけるトロンビン阻害剤の濃度を測定するための検査キット、すなわち、K1)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K3)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のトロンビンの溶液であって、構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を有する溶液で代替または補充が可能であるほか、以下のキット構成要素により非混濁体液または体液からの非混濁抽出物もしくは非混濁の非天然水性液体の活性を測定するための検査キット、すなわち、任意のK1)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K3)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質のトロンビン溶液であって、構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を有する溶液で代替または補充が可能である検査キットに関する。キット構成要素は互いに分離することができるが、単一の検査キットパックに予め準備されている。任意に代替可能な追加のキット構成要素として、プロトロンビンを有する溶液が予め準備することができる。
【0012】
いずれの場合にも、トロンビン、マイゾトロンビンまたはMtdesfg1および/またはマイゾトロンビンまたはMtdesfg1分解性物質の添加に際して、これらは明白な所定量で使用されることが理解される。同じことは基質についても該当する。
【0013】
スクリーニングのために特に適切な本発明による方法に基づき、本発明の対象も新しいトロンビン阻害剤が見出され、特徴づけられ、すなわち以下の方法のステップによって入手可能である。すなわち、A)予測的なトロンビン阻害剤の群の構成要素を所定の好ましくは同じ濃度で、その後のまたは個別に請求項2ないし8のいずれか1項に記載の方法に同時にかけ、B)それぞれの時間単位で光吸収または光放出の減少を各予測的なトロンビン阻害剤について算出し、ヒルジンの所定の好ましくは同じ濃度のそれぞれの時間単位で同じ条件下に測定された光吸収および光放出と比較し、C)それぞれの時間単位での光吸収または放出の減少がヒルジンを使用した場合の対応する減少の少なくとも10%に対応する予測的なトロンビン阻害剤を選択する。
【0014】
本発明による検査キットおよび本発明により見出されるトロンビン阻害剤には、本発明による方法に対する詳細な説明が合致する。
【0015】
マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を使用する限り、これは、例えばスイスのペンタファルムAG社から購入できるが、例えば文献第US−A−5,547,850号における規定により固定化エカリンで製造することもできる。
【0016】
発明の範囲で使用可能な装置は、例えばほとんど既存の半または全自動の凝固装置である。その場合に問題となるのは、例えばダーデ−ベーリング(Dade-Behring)社のSysmex CA−500型もしくはS2000型またはElectra 2000型である。CA−500では、LEDから放出される光はフィルタ(405nm)により送出され、引き続き試料により送出される。CA−500は色素原チャネルにおいて色素、例えばpNA(p−ニトロアニリン)の光吸収の変化または減少を測定する。試料中にヒルジンがある場合は、生成または添加されるマイゾトロンビンまたはMtdesfg1は、それにより阻害されるpNA遊離の結果、不活性化する。その点では別に反応(変化)する試料の光学的密度は光ダイオードによって受容され、評価される。観察される光吸収の変化は逆にヒルジンの活性に比例する。
【0017】
実施例
以下、完全に実施例で示された実験をもとにして本発明を詳しく述べる。
【0018】
標準曲線を測定するために、プールされたヒト保存血漿を所定量のヒルジン溶液とともに使用した。こうして得られた標準溶をCA−500で測定した。
【0019】
試薬として以下を導入した。
【0020】
試薬1[Inhib](室温): ペファブロックFG400μl(20mM;0.9%NaCl中で溶解)+トリス緩衝液2100μl。
【0021】
試薬2[Chrom](室温): ペファクロムTH(10μmol/バイアル)、3μmol/ml蒸留水に希釈。
【0022】
試薬3[Ecarin](15℃): Ecarin(50EU/バイアル)、0.3EU/mlに希釈(Ecarinバイアルの内容物は0.9%Nacl溶液5ml中に溶解し、使用直前に0.9%Nacl、1%プリノネックス(メルク)含有、および0.1M CaCl2溶液の混合液1:2で最終濃度に設定した。
【0023】
試験プロトコールは以下に再現されている。希釈緩衝液としてプロトロンビン16.6μl(精製;タンパク質含量:2.22mg/ml)およびトリス緩衝液(0.05M、pH8、37℃、+0.1M Nacl)900μlとプリオネックス(メルク)100μlの混合液984μlの混合液を使用した。
【0024】
【表1】
【0025】
図1には得られた標準曲線が再現されている。0.9977のきわめて優れた相関係数が注目される。実験では、完全に標準試料は測定すべき試料により代替され、図1における不明のヒルジン濃度は光学的密度の測定された減少をもとにして読み取られる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 実験により得られたヒルジン濃度を示す図である。
Claims (13)
- 非混濁体液または体液からの抽出物の濃度を測定する方法であって、以下の方法ステップ、すなわち
a)生物から採取された体液の混濁物を分離し、
b)ステップa)で得られる非混濁体液にプロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原、または蛍光発生原基質およびマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へ、プロトロンビンを添加し、
c)ステップb)で得られる溶液または混合液を時間依存的に波長選択的な光吸収または光放出測定にかけ、
d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少から体液中に含有するトロンビン阻害剤の量を、所定濃度のヒルジンについてそれぞれの時間単位で同じ条件下で測定された光吸収および光放出の標準曲線と比較するステップにより測定する方法。 - 非混濁水性液体中のトロンビン阻害剤の活性を測定する方法であって、以下の方法ステップ、すなわち
a)生物から採取された体液の混濁物を分離し、
b)ステップa)で得られる非混濁液体に所定量のトロンビン阻害剤、および/または、プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換に干渉しない凝固抑制剤、活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原、または蛍光発生原基質およびマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へ、プロトロンビンを添加し、
c)ステップb)で得られる溶液すなわち混合液を時間依存的に波長選択的な光吸収または光放出測定にかけ、
d)それぞれの時間単位でステップc)の光吸収または光放出の減少からトロンビン阻害剤の活性を、所定濃度のヒルジンについてそれぞれの時間単位で同じ条件下で測定された光吸収および光放出の標準曲線と比較することにより測定するステップで測定する方法。 - プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤が、「カルシウム複合体造形物、へパリン、へパリノイド、抗トロンビンIII、タンパク質C、フィブリン重合抑制物質およびこれらの物質の混合物」の群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- プロトロンビンを添加して該プロトロンビンをマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質が、ヘビ毒およびヘビ毒分画の群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- プロトロンビンを添加して該プロトロンビンをマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質がEcarinである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解可能な色素原基質が、p−ニトロアニリンの分解下に遊離し、光吸収測定は405nmで行うことができる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ステップC)において、最初の吸収または放出の測定が、マイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質へのプロトロンビンまたはマイゾトロンビンもしくはMtdesfg1の添加から0〜50s、または5〜15s後、2回目の測定がその後、50〜500s、または150〜300s後に行われる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- トロンビン阻害剤がヒルジン、ヒロログまたは合成トロンビン阻害剤である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 非混濁体液または体液からの抽出物におけるトロンビン阻害剤の濃度を測定するための検査キットであって、以下のキット構成要素、すなわち、K1)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液と、K2)活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K3)プロトロンビンを添加して該プロトロンビンをマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質の溶液であって、構成要素K3)はK3a)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を有する溶液で代替または補充が可能である構成要素で測定するための検査キット。
- 非混濁体液または体液からの抽出物におけるトロンビン阻害剤の活性を測定するための検査キットであって、以下のキット構成要素、すなわち、K1)活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1により分解する色素原または蛍光発生原基質と、K2)プロトロンビンを添加して該プロトロンビンをマイゾトロンビンまたはMtdesfg1に分解する物質の溶液であって、構成要素K2)はK2a)マイゾトロンビンまたはMtdesfg1を有する溶液で代替または補充が可能である構成要素で測定するための検査キット。
- K3)プロトロンビン/活性マイゾトロンビンまたはMtdesfg1の転換を干渉しない凝固抑制剤の溶液をキット構成要素として備えることを特徴とする請求項10記載の検査キット。
- 構成要素は互いに分離されるが、単一検査キットパックで準備される、請求項9〜11のいずれか1項に記載の検査キット。
- 代替可能な追加のキット構成要素としてプロトロンビンを有する溶液が準備される請求項9〜12のいずれか1項に記載の検査キット。
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