CN110568117B

CN110568117B - 一种多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法

Info

Publication number: CN110568117B
Application number: CN201910884899.0A
Authority: CN
Inventors: 许哲; 邹旋; 管华诗
Original assignee: Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110568117A

Abstract

本发明公开了一种基于干血斑样本的多靶点抗血栓物质的液相色谱‑质谱筛选方法，属于药物筛选领域。所述方法包括以下步骤：再水化干血斑样本，任选几种血栓形成过程涉及的关键靶酶的底物，将几种底物标准溶液与待筛选物质混合后加入到所述再水化的干血斑样本中，反应溶液处理后进行液相色谱‑质谱联用分析以筛选得到具有多靶点抗血栓活性的物质。本发明的筛选方法操作简单快捷、准确性高、特异性强，可连续分析大量的样品，该筛选方法能同时筛选出对一个或者几个靶酶同时抑制的抗血栓物质，且筛选出的活性物质作用靶点明确，为后续的药物开发奠定了理论基础。使用试剂易于获得，操作自动化程度高，易于临床推广及普及，商业化价值高。

Description

一种多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法

技术领域

本发明涉及药物筛选领域，具体而言，涉及一种基于干血斑样本的多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法。

背景技术

据报道，中风、冠心病等血栓性疾病已成为威胁人类健康的主要杀手。研究显示，血小板异常激活导致血小板聚集以及一系列凝血因子相继被激活使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，之后结成网并网罗红细胞使血栓团块迅速增大，最终与血小板紧密结合形成一个牢固血栓，这是引起动脉血栓性疾病和静脉血栓性疾病的主要原因。从血栓形成机制来看，多种酶和受体都参与了血栓形成过程。理论上讲，其中的任何一种酶、受体或者其组合都可作为抗血栓药物的作用靶点。目前研究较多的有凝血酶、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、磷酸二酯酶、磷脂酶A₂、环氧合酶、二磷酸腺苷受体、血栓素A₂合成酶、血小板糖蛋白受体、维生素K环氧化还原酶、磷脂酰肌醇3-激酶等。

以酶和受体为靶点的抗血栓药物很多，包括以环氧化酶为靶点的抑制剂，如阿司匹林、磺吡酮等；P2Y₁₂受体拮抗剂，如氯吡格雷等；磷酸二酯酶抑制剂，如双嘧达莫等；血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)受体拮抗剂，如依替巴肽和替罗非班等；以及参与凝血过程的一系列凝血因子的抑制剂，如凝血酶抑制剂阿加曲班、凝血因子Xa抑制剂利伐沙班等。但是，上述药物均为单靶向药物，抑制单个靶点忽视了人体作为一个系统所具有的复杂性和稳健性，用药时容易因单个靶点发生突变导致药物失效；同时，药物与靶点之间高度亲和，使细胞正常的生理功能受到影响，从而可能导致严重的毒副作用。而多靶点药物可针对疾病网络系统中的多个靶点，同时调节疾病网络中的多个环节，从而达到增加疗效、降低毒副作用的临床效果，所以多靶点药物成为研究的热点，并已应用于很多复杂疾病的治疗(KnoxSS.等,Cancer Cell International,2010.10:11-24.)。为配合多靶点药物的研究，目前亟需建立能够快速、高通量筛选多靶点药物的方法。

已有少量文献报道了双靶点抑制剂筛选的方法，使用的方法包括气相色谱-质谱、液相色谱-基质辅助激光解吸电离质谱、电感耦合等离子体质谱、常压质谱以及毛细管电泳技术。

例如，Li等开发了基于双酶共固定化毛细管微反应器的毛细管电泳方法，用于同时筛选腺苷脱氨酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂(Li P.等,Journal of Separation Science.,2013.36:2538-2543.)。但是该方法只报道了双靶点抑制剂的筛选，并未涉及对多靶点的抑制剂的筛选。而且，该方法使用商品化的靶酶，酶反应体系中需要使用缓冲盐以维持商品化酶源的活性。而在线酶反应器毛细管电泳技术需要在入口端固定化毛细管微反应器，毛细管微反应器不适用于孵育缓冲液和分离缓冲液不同的酶反应系统。另外，固定化酶微反应器的制备复杂，不同的固定化方式法存在不同缺陷，这使得毛细管电泳技术不适用于多酶抑制剂的同时筛选。

Xu等采用液相色谱-质谱法同时对凝血酶和因子Xa进行双靶点抑制剂筛选(Xu Z.等,Analytica Chimica Acta,2017.990:1-10.)。但是，该文献的方法只实现了对双靶点抑制剂的筛选，没有涉及多靶点，例如3个靶点以上的抑制剂的筛选。而且，该方法采用的靶酶是商品化的标准酶。酶反应体系中需要使用非挥发的缓冲盐(Tris-HCl)用于维持商品化酶的活性，非挥发的缓冲盐不仅会影响质谱的灵敏度，还会残留在液相色谱-质谱中仪器中从而损伤仪器。所以，该方法中，反应溶液在进样分析之前必须进行除去缓冲盐的处理，不仅增加了操作步骤，还不可避免地使用了有机溶剂和化学填料，增大了试剂成本，对环境也不友好。

发明内容

本发明要解决的技术问题

鉴于上述现有技术存在的各种问题和不足，本发明的目的在于提供一种快速、简单、高通量、能够同时对多靶点抗血栓活性物质进行筛选的方法。本发明的筛选方法利用干血斑作为酶源，快速且便捷地将血栓形成过程中的多种关键靶酶建立在一个反应体系中，可以以较短的分析时间一次性筛选出对多个靶点具有抑制作用的活性物质，适用于多靶点抗血栓活性物质的筛选。

同时，液相色谱-质谱联用仪可同时分离分析多种物质，自动化进样系统可以连续分析大量的样品，能较好的应用于多靶点酶抑制剂的筛选；检测灵敏度高，仅使用少量试剂即可完成筛选，降低了筛选的经济成本。

解决技术问题的方法

为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种多靶点抗血栓物质的筛选方法，其特征在于，所述方法以干血斑作为抗血栓相关靶酶的酶源，采用液相色谱-质谱进行筛选，所述的筛选方法包括如下步骤：

(1)再水化干血斑样本；溶解干血斑样本并进行孵育，离心，吸取上清，获得干血斑样本溶液；

(2)配制血栓形成过程涉及的关键靶酶所对应底物的标准溶液，将干血斑样本溶液与上述底物的标准溶液以及待筛选化合物混合后，使其反应完全，得到待筛选溶液；用溶解干血斑样本的溶剂代替待筛选化合物作为空白对照；

(3)待筛选溶液进行除蛋白处理；

(4)除蛋白处理后的待筛选溶液加入内标溶液后，进行液相色谱-质谱分析：测得所述靶酶酶反应产物的峰面积，以抑制率为评价标准：抑制率＝1-(待筛选化合物的质谱响应峰面积/空白对照的质谱响应峰面积)，筛选出具有抗血栓作用的活性物质。

上述步骤(1)中,孵育例如可以在30-40℃水浴中进行，时间可以是例如5-20分钟。

上述方法中，抗血栓靶酶可以选择抗凝靶点以及引起血小板活化的酶和受体。具体地，所述抗血栓靶酶选自凝血酶、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、磷酸二酯酶3和磷酸二酯酶5中的一种或多种。

上述方法中，抗血栓靶酶为2个以上，优选为3-7个，例如可以是3、4、5、6或7个。

上述方法中，干血斑来自非人类健康哺乳动物的EDTA全血制备，优选健康小鼠、兔或羊的EDTA全血。

上述方法中，干血斑制备载体为扩散小，不会使蛋白质变性的滤纸，优选普通化学定量滤纸、Whatman型滤纸卡，更优选Whatman 903型滤纸卡。

上述方法中，用于制备干血斑的EDTA全血用量为10-80μL，优选30μL。

上述方法中，干血斑样本再水化溶液为水，优选去离子水、蒸馏水、纯水中的一种或多种。

上述方法中，所述步骤(4)中靶酶酶反应产物可为对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷。

上述方法中，所述步骤(4)中液相色谱的条件包括：分析色谱柱为反相色谱柱，流动相为甲醇-甲酸水溶液。优选流动相流速为0.1-0.5mL·min^-1；进样量为1-10μL；分析时间为3-8分钟。

步骤(4)中，质谱采用电喷雾质谱正离子模式，优选干燥气温度为300-350℃，雾化器压力为15-60psi，毛细管电压为3000-4500V，毛细管出口电压为50-200V，干燥气流速为4-12L·min^-1。

本发明还提供了液相色谱-质谱分析在多靶点抗血栓物质筛选中的用途，所述筛选采用干血斑作为抗血栓靶酶的酶源，所述抗血栓靶点选择抗凝靶点以及引起血小板活化的酶和受体。

本发明还将筛选出的活性物质进行凝血试验测定，验证了上述方法筛选结果准确性高。

有益的效果

本发明将多个靶酶建立在一个反应体系中，通过同时测定干血斑中多种酶活性来筛选出具有多靶点抗血栓作用的抑制剂，筛选出的多靶点抑制剂药物在治疗血栓性疾病方面比单靶点抑制剂药物具有更好的效果。该方法有助于筛选出更好疗效的抗血栓药物。

与采用商品化的标准酶不同，本发明采用干血斑样本，采样简单、易于储存和运输，而且，不需要使用缓冲盐，可以采用水作为溶解样本的溶剂，不仅节省了试剂成本，也避免了在液相色谱-质谱分析前为了除去缓冲盐而进行的色谱柱分离步骤。

本发明利用了质谱的高特异性、高灵敏度和强稳定性，保证了所建立筛选方法的抗干扰能力强，灵敏度高，精确度高和重现性好。而且质谱法的高特异性和自动化进样使得该筛选方法可以以并行方式同时筛选多个靶酶的抑制剂，连续分析大量的样品，节省了分析时间和试剂成本。

该筛选方法利用干血斑样本提供了血栓形成过程中所有关键酶，可以同时针对干血斑中的多个靶点进行抗血栓活性物质的筛选，对大批量的化合物库进行筛选，且筛选出的活性物质的作用靶点明确，而获得的多靶点抑制剂可以通过抑制途径中的多个信号通路具有更好的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明的针对血栓疾病的多靶点抗血栓活性物质的筛选方法的流程图。

图2为实施例1中产物对硝基苯胺的标准曲线；横坐标表示对硝基苯胺浓度，纵坐标表示对硝基苯胺与内标N-甲基对硝基苯胺质谱响应比值。

图3为实施例1中产物7-氨基-4-甲基香豆素的标准曲线；横坐标表示7-氨基-4-甲基香豆素浓度，纵坐标表示7-氨基-4-甲基香豆素与内标香豆素质谱响应比值。

图4为实施例1中产物5’-单磷酸腺苷的标准曲线；横坐标表示5’-单磷酸腺苷浓度，纵坐标表示5’-单磷酸腺苷与内标腺苷质谱响应比值。

图5为实施例1中产物5’-单磷酸鸟苷的标准曲线；横坐标表示5’-单磷酸鸟苷浓度，纵坐标表示5’-单磷酸鸟苷与内标腺苷质谱响应比值。

图6为实施例1中基于商品化标准酶的体外多靶点抗血栓活性物质的筛选结果。

图7为实施例1中基于干血斑的体内多靶点抗血栓活性物质的筛选结果。

具体实施方式

下面将结合附图与具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。只要没有特殊说明，％表示体积百分比。

实施例1

本发明通过以下几个步骤获得了一种基于干血斑样本的多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法：

1.干血斑样本制备以及标准溶液配制：

1.1干血斑样本制备：吸取10-80μL全血滴在Whatman903滤纸卡上，在室温下风干2小时即可得干血斑样本，制得的干血斑样本放入含有干燥剂的密封袋内并于-20℃保存备用。

1.2底物标准溶液的配制：精密称取底物粉末适量，用去离子水将底物S2238、S2765、S2266、S2302和环磷酸腺苷(cAMP)配制成500mg·L^-1浓度的溶液储存。

1.3待筛选化合物溶液的配制：将78个待筛选的化合物用少量DMSO溶解，并在水中制备为100μM的储备溶液。

上述储备溶液均在-20℃避光保存。

1.4阳性对照的配制：将阿加曲班、利伐沙班、苯甲脒、3-乙酰基香豆素和米力农分别溶于50μL的DMSO中，然后加水至终浓度为500μM储存。

当使用DMSO溶解化合物时，可能在质谱分析时诱导离子抑制。因此，DMSO在样品溶液中的浓度必须低于0.2％。

2.构建干血斑多靶点抗血栓活性物质的筛选体系

2.1将干血斑用打孔器取下，得到直径为6mm的干血斑，再将干血斑用100μL去离子水润湿，并放在37℃水浴锅中孵育10分钟，即可得到干血斑再水化溶液。

2.2将上述配制的5种底物S2238、S2765、S2266、S2302、cAMP溶液混合后在37℃孵育，得到底物混合液。其中底物S2238、S2765、S2266、S2302、cAMP所对应的产物为对硝基苯胺和5’-单磷酸腺苷。

底物S2238、S2765、S2266、S2302、cAMP的结构如表1所示。

本发明也可选择其他底物以及其对应的产物，具体如实施例4。

表1.底物相关信息

2.3取100μL上述100μM待筛选化合物溶液，与上述2.1中制备的干血斑再水化溶液混合，加入100μL的上述2.2中制备的底物混合液，混合后，反应50分钟，加入100μL乙腈灭活，12000rmp高速离心20分钟后，取上清液过滤。

2.4将100μL上述经过滤的上清液和100μL的内标混合后，取适量(5μL)注入液相色谱-质谱联用系统进行分析。

该检测过程包括：

色谱条件：色谱柱采用普通C₁₈柱；流动相A为0.1％的甲酸水，B为甲醇；梯度分析：0-0.9分钟为10％B，0.9-1.1分钟为10-60％B，1.1-2.1分钟为60％B，2.1-2.5分钟为60-10％B，2.5-4分钟为10％B，流速为0.4mL·min^-1；分析时间为4分钟。

质谱条件：采用电喷雾质谱(ESI-MS)正离子模式；毛细管出口电压：150V；干燥气温度：350℃；雾化器电压：30psi；毛细管电压：4000V；定量方式为MS2 Scan模式，检测的产物与其内标的质荷比为：对硝基苯胺m/z139.0502，内标N-甲基对硝基苯胺m/z 153.0659，5’-单磷酸腺苷m/z 348.0704、内标腺苷m/z 268.104。其他底物所对应的产物与其内标的质荷比包括：7-氨基-4-甲基香豆素m/z 175.18，内标香豆素m/z 146.14，5’-单磷酸鸟苷m/z283.24，内标腺苷m/z 268.104。

3.活性物质筛选结果

将上述1.3中配制的78个待筛选化合物溶液，进行HPLC-MS分析，100μL去离子水替代待筛选化合物溶液加入反应体系作为空白对照，100μL阿加曲班、100μL利伐沙班、100μL苯甲脒、100μL 3-乙酰基香豆素、100μL米力农替待筛选化合物溶液加入反应体系作为阳性对照，色谱条件同上，每个样品重复测定三次，取平均值。

以抑制率为评价标准：抑制率＝1-(待筛选化合物溶液的质谱响应峰面积/空白对照溶液的质谱响应峰面积)，筛选出具有抗血栓作用的活性物质。

结果如图7。图7中，●代表抑制率低于30％的化合物，△和■代表抑制率高于30％的化合物，其中■代表阳性对照抑制剂。

由图7可知，从78个化合物中筛选出有5个具有较好抗血栓活性的化合物。

实施例2

对建立的产物定量方法进行方法验证，考察定量限、检测限、精密度、准确度和基质效应，应符合2015版中国药典四部《分析方法验证指导原则》要求。

(1)定量限和检测限

对硝基苯胺的检测限：5μg·L^-1(S/N＝3.3±1.61；n＝6)；定量下限：10μg·L^-1(S/N＝10.5±1.86；n＝6)；7-氨基-4-甲基香豆素的检测限：4μg·L^-1(S/N＝1.4±2.71；n＝6)；定量下限：10μg·L^-1(S/N＝12.3±1.71；n＝6)；5’-单磷酸腺苷的检测限：5μg·L^-1(S/N＝3.76±1.37；n＝6)；定量下限：10μg·L^-1(S/N＝10.89±1.69；n＝6)；5’-单磷酸鸟苷的检测限：8μg·L^-1(S/N＝6.62±2.39；n＝6)；定量下限：15μg·L^-1(S/N＝13.66±1.52；n＝6)。由该结果可以看出该方法检测灵敏度高。

(2)精密度和准确度考察

配制低浓度(500μg·L^-1)，中间浓度(2500μg·L^-1)，高浓度(10000μg·L^-1)三个浓度水平的产物溶液作为质控样品，进行准确度和精密度的考察。准确度都在85％-115％之间，精密度的相对偏差都在±15％之内，说明该方法精密度和准确度好。

(3)基质效应的考察

制备与空白溶剂(50％乙腈水溶液)相同浓度的基质溶液，以基质中对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷标准品的回收率来评估基质效应。研究了低浓度(500μg·L^-1)，中间浓度(2500μg·L^-1)，高浓度(10000μg·L^-1)三个浓度水平，观察对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷的最小抑制率(<15％)。对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷回收率都在85％-115％之间，说明该方法基本不受基质成分的干扰。

(4)稳定性

配制浓度为1000μg·L^-1的产物溶液标准品，在低温离心的4℃、常温25℃、酶反应进行选用的37℃和以及空气浓缩时所用的85℃条件下放置，每隔30分钟分别进行检测，根据EIC图谱中积分面积的变化，评价48小时内对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷的稳定性，实验结果表明48小时内，对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷在4℃、25℃、37℃和85℃条件下均是稳定的，对定量结果无影响。

(5)线性

精确称取2mg的产物对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷，用去离子水溶液定容在100mL棕色容量瓶中，并作为母液保存在4℃冰箱里。使用时，用去离子水分别配制5μg·L^-1到20000μg·L^-1系列浓度的产物标准溶液，采用内标法定量，内标分别为N-甲基对硝基苯胺、香豆素和腺苷，进入液相色谱-质谱联用分析。以产物与内标质谱响应面积比I/I₀为y轴，以产物浓度为x轴，建立标准曲线：

产物对硝基苯胺的标准曲线如图2所示，线性回归方程为y＝0.4842x±0.02321(R²＝0.9997)，定量范围为10μg·L^-1到25000μg·L^-1；

产物7-氨基-4-甲基香豆素的标准曲线如图3所示，线性回归方程为y＝0.6426x±0.07492(R²＝0.9990)，定量范围为10μg·L^-1到20000μg·L^-1；

产物5’-单磷酸腺苷的标准曲线如图4所示，线性回归方程为y＝0.1750x±0.00398(R²＝0.9992)，定量范围为10μg·L^-1到20000μg·L^-1；

产物5’-单磷酸鸟苷的标准曲线如图5所示，线性回归方程为y＝0.3921x±0.04256(R²＝0.9993)，定量范围为15μg·L^-1到20000μg·L^-1；

实施例3

利用标准酶对多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法进行验证：

1.溶液配制：精密称取凝血酶、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、磷酸二酯酶3粉末适量，使用去离子水分别将其稀释成1000U·L^-1浓度并存放于-20℃以备使用；分别精密称取底物S2238、S2765、S2266、S2302和cAMP粉末适量，用去离子水分别配制成500mg·L^-1浓度的溶液储存；分别取78种待筛选的化合物，用少量DMSO溶解，并在水中制备为100μM的储备溶液。上述储备溶液在-20℃避光保存。将阿加曲班、利伐沙班、苯甲脒、3-乙酰基香豆素和米力农分别溶于50μL的DMSO中，然后加入水至终浓度为500μM储存。当使用DMSO溶解药物时，可能在质谱分析时诱导离子抑制。因此，DMSO在样品溶液中的浓度必须低于0.2％。

2.构建标准靶酶多靶点抗血栓活性物质的筛选体系

将5种酶凝血酶、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、磷酸二酯酶3相互混合，得到酶混合液；将5种底物混合后在37℃孵育，得到底物混合液。

将100μL上述酶混合液与100μL的100μM待筛选化合物混合，加入100μL的底物混合液，混合后，反应50分钟。加入100μL乙腈灭活，12000rmp高速离心20分钟后，取上清液过滤，再将100μL上清液和100μL的内标混合进入液相色谱-质谱联用分析，仪器条件与实施例1中2.4部分相同。分别用100μL去离子水和已知抑制剂(阿加曲班、利伐沙班、苯甲脒、3-乙酰基香豆素、米力农)替代上述待筛选化合物加入反应体系作为空白和阳性对照，每个实验重复测定三次。

3.验证结果

计算实施例3中使用标准酶方法测得的待筛选物质的抑制率，整理绘制成图6。其中●代表抑制率低于30％的化合物，△和■代表抑制率高于30％的化合物，其中■代表阳性抑制剂。

将图6和实施例1的基于干血斑的筛选结果进行比较分析后可以看出，以商品化标准酶组成多靶点的筛选方法(图6)从78个化合物中筛选出有5个具有较好抗血栓活性的化合物；以干血斑为酶源的多靶点筛选方法(图7)从78个化合物中筛选出同样的5个具有较好抗血栓活性的化合物。

两者对比结果显示，本发明构建的基于干血斑样本的多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法在药物筛选领域具有可行性，可以为寻找更具潜力的抗血栓药物提供平台与方法。

实施例4

除了实施例1中使用的底物之外，本发明还可以使用其他的底物，具体地，可以使用的酶和底物以及对应的反应产物如表2。

表2.多靶点抗血栓活性物质筛选体系中可选择的酶和底物

发明人进一步采用Ac-Gly-Gly-Val-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素作为凝血因子XIa的底物，并采用环磷酸鸟苷作为磷酸二酯酶的底物，其余与实施例1相同操作，对78个待筛选化合物进行了HPLC-MS分析，得到与实施例1基本相同的结果。

实施例5筛选出的活性物质的凝血试验测定

凝血试验是常用的一组凝血因子的筛选试验，主要包括凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血时间测定。随着血栓与止血检测在临床上的广泛应用，凝血试验已经成为止血和血栓疾病的常规检测项目，也是内源性、外源性凝血因子缺乏或减少的重要过筛试验。其中，活化部分凝血活酶时间主要可以反应出患者内源性凝血系统的状况，出现增高说明可能存在凝血因子缺乏情况，出现降低说明有促凝成分存在或者凝血因子活性增高。凝血酶原时间可以对患者的外源性凝血系统情况进行反应，时间延长说明存在凝血因子缺乏和纤维蛋白原缺乏，时间缩短说明存在血栓性疾病或者血液处于高凝状态。凝血酶时间反应的是纤维蛋白原转化纤维蛋白的时间长短，时间延长说明存在异常血红蛋白血症和低纤维蛋白原血症，时间缩短则无临床意义。

为进一步验证本发明所筛选出的抗血栓活性物质的抗血栓活性的准确性，依托凝血试验所反映的时间与标准时间范围比较来判断化合物是否具有抗血栓活性。

测定筛选出的5个抗血栓活性物质的活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)以及凝血酶时间(TT)，与标准时间参考范围进行比较，进一步确定其抗血栓活性的准确性。

本发明使用SL-318型血凝仪，通过以下几个步骤，测定筛选出的5个抗血栓活性物质的活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)以及凝血酶时间(TT)：

(1)活化部分凝血活酶时间(aPTT)测定：将50μL的血浆与50μL的aPTT试剂混合均匀加入测试杯，预温5分钟，预温完成后加入50μLCaCl₂试剂，记录测量值时间，重复测定3次，取平均值。实验结果见表2。

(2)凝血酶原时间(PT)测定：将50μL的血浆加入测试杯，预温3分钟，预温完成后加入100μL PT试剂，记录测量值时间，重复测定3次，取平均值。实验结果见表3。

(3)凝血酶时间(TT)测定：将100μL的血浆加入测试杯，预温3分钟，预温完成后加入100μL TT试剂，记录测量值时间，重复测定3次，取平均值。实验结果见表3。

凝血试验内容正常值参考范围以及判断标准如下。

(1)活化部分凝血活酶时间(aPTT)正常值参考范围：25-37s，与正常对照比较超过10s以上为异常。

(2)凝血酶原时间(PT)正常值参考范围：11-14s，与正常对照比较超过3s以上为异常。

(3)凝血酶时间(TT)正常值参考范围：12-16s，与正常对照比较超过3s以上为异常。

表3筛选出的抗血栓活性物质凝血试验检测结果

抗血栓活性物质进行活化部分凝血活酶时间(aPTT)与凝血酶原时间(PT)测试，以测试这些抑制剂是否影响内在和外在的凝血途径。从实验结果看到活化部分凝血活酶时间(aPTT)与凝血酶原时间(PT)均延长，且延长时间至少为原来的2倍。延长时间是抑制剂通过凝血级联的外在途径阻止凝血的能力的量度，表明筛选出的5个抗血栓活性物质均参与了血液凝固途径的丝氨酸蛋白酶相互作用，对血栓形成过程中的关键靶点起到了抑制作用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种多靶点抗血栓物质的筛选方法，其特征在于，所述方法以干血斑作为抗血栓相关靶酶的酶源，采用液相色谱-质谱分析进行筛选，所述的筛选方法包括如下步骤：

（1）再水化干血斑样本：溶解干血斑样本并进行孵育，离心，吸取上清，获得干血斑样本溶液；

（2）配制血栓形成过程涉及的关键靶酶所对应底物的标准溶液，将干血斑样本溶液与上述底物的标准溶液以及待筛选化合物混合后，使其反应完全，得到待筛选溶液；除了不添加待筛选化合物之外，同样地配制空白对照溶液；

（3）对待筛选溶液进行除蛋白处理；

（4）除蛋白处理后的待筛选溶液加入内标溶液后进行液相色谱-质谱分析，测得所述靶酶酶反应产物的峰面积，以抑制率为评价标准：抑制率=1-（待筛选化合物溶液的质谱响应峰面积/空白对照溶液的质谱响应峰面积），筛选出具有抗血栓作用的活性物质；

所述抗血栓相关靶酶为凝血酶、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、磷酸二酯酶3和磷酸二酯酶5的两种以上。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，抗血栓靶酶为3~7个。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，制备干血斑使用滤纸。

4.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，用于制备干血斑的全血用量为10-80μL。

5.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，再水化干血斑样本的溶剂为水。

6.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（4）中，根据所用靶酶反应底物的不同，靶酶酶反应产物选自对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、5’-单磷酸腺苷和5’-单磷酸鸟苷。