CN101171519A - 测量全血中的凝血酶活性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外检测样品中凝血酶活性的方法，其中所述样品为血液样品且凝血酶生成通过以下步骤测量：－将所述样品层与凝血酶的荧光底物接触，其中所述层具有0.05至5mm的厚度和10至500mm²的表面；－允许凝血酶在所述样品中产生；－测量从所述层的表面由荧光底物释放的荧光基团发出的荧光，该荧光是生成的凝血酶对所述荧光底物的酶促作用的结果。

Description

测量全血中的凝血酶活性

[0001]本发明涉及测量方法，尤其是体外测量凝血酶活性的时程，即测量样品中的活性凝血酶，特别是当其在由全血组成的凝血样品中发展时。凝血酶活性的测量结果可由图1中描述的所谓“凝血酶生成曲线”表示。

[0002]本发明还涉及能够实现体外测量样品中随时产生的活性凝血酶的方法。还涉及使用所述测量方法对患者情况进行检测或监控，包括对与血液凝结缺乏相关的病理状态进行检测或监控。

[0003]本发明还涉及使用测量方法筛选物质，包括筛选那些能与凝血过程，尤其是凝血酶活性，相互作用的药物。

[0004]血栓形成性疾病，如心肌梗死、中风、肺栓塞以及一些其它疾病在西方社会是造成约一半的所有死亡和残疾的原因。在发展中国家，它们随着发展程度增加。出血性疾病，虽然在数字上重要性较低，也是死亡的重要原因。因此，止血系统的功能过强或不足是极其重要的发病机制。因而，令人惊讶的是缺乏可用的良好临床功能试验。凝血酶在止血和血栓形成性疾病中的作用：

[0005]在止血和血栓形成中凝血酶起着关键作用。在静脉血栓形成性疾病中这一点早已被认识到(1)并且令人信服地被以下事实所证明，即静脉血栓形成的预防和治疗最好通过降低凝血酶活性，或者通过直接抑制(水蛭素，melagastran)或通过减少合成(维生素K拮抗剂)或通过增加衰减(肝素)。在最近十年间，逐渐了解到凝血酶在动脉疾病中与在静脉疾病中一样重要。临床试验已表明维生素K拮抗剂(2)以及肝素(3)降低心肌梗塞的复发率。凝血酶在出血中的作用通过在严重超剂量口服抗凝血药(4)或肝素(5)使凝血酶生成受到严重影响时观察到的出血时间延长说明。同样，血友病也是凝血酶形成系统的疾病(6)。

所有血液成分均参与凝血酶形成：

[0006]现代研究已认识到凝血酶是通过血液和血浆的既有成分的共同作用形成的。红细胞(RBCs)在这方面活性最小，尽管在它们的一小部分中外膜表现出促凝血活性(7)。更重要的是，白细胞具有组织因子活性。正常情况下该活性被加密，但在损伤时通过与血小板相互作用显示出来(8，9)。起主要作用的无疑是血小板和血浆凝血系统。在教科书中仍发现血小板是初期止血和动脉血栓形成的原因，而血浆的凝结用于加固止血栓，并且是静脉血栓的形成机制。该观点源于将血浆和血小板互相分离进行研究这一事实。事实上，血小板与血浆及血液的其它细胞之间的协作在初期和二期止血，以及在动脉和静脉血栓形成中都是必要的。血小板栓的形成在凝血酶生成中起作用，因为血小板聚集体中的间隙形成不受干扰的微环境，凝血酶可在其中形成而不被血流清除。这就是在凝结全血中测量凝血酶生成与生理实际非常相近的原因。

[0007]除形成凝血酶可在其中形成的“海绵”之外，血小板也活跃地促进凝血酶的生成。它们释放因子V并提供凝血酶原转变所必需的前凝血质磷脂表面，也参与导致凝血酶原酶形成的凝血机制中的不同步骤(10)。因而，凝血酶生成的速度和形成的数量依赖于血小板活性涉及的血浆蛋白。特别有趣的是聚合纤维蛋白的作用。血管性血友病因子(vWf)与聚合纤维蛋白相互作用，经历构象变化，该变化使其可与血小板受体GPIb作用，并通过该结合使血小板变成前凝血质(11，12)。这表明形成纤维蛋白凝块不是止血的终末行为，并且栓(或血栓，或血块)中的凝血酶形成是此过程中的关键事件。的确，正如我们将在下面看到的那样，形成的所有凝血酶中＞95％的在凝血已发生后形成，并且这些凝血酶在止血和血栓形成(H&T)过程中是必要的。也许血小板与血浆凝血系统之间密切关系的最好证据是所有“聚集抑制剂”和其它抗血小板因子也抑制富含血小板的血浆(或全血)中凝血酶生成这一事实。这已被阿司匹林(13)、阿昔单抗(14)、MK383(15)和氯吡格雷(16)证明。相反，特别好的抗血小板药物阿司匹林预防静脉血栓形成的事实(17)进一步表明了血小板功能与凝血之间的紧密联系。

[0008]因此，概言之，血块中形成的凝血酶数量是止血和血栓形成过程中的本质特征，并且所有血液成分都参与其形成。

凝血酶生成(TG)作为血栓形成和出血风险的指示：

[0009]TG增加总是表明血栓形成风险，或是由于抗凝血酶缺乏或是由于凝血酶原过剩。此外，在蛋白C途径发生障碍(缺乏蛋白S和C，因子V_Leiden)时，凝血酶生成高于正常情况。血浆凝血也是如此，但如果蛋白C途径被凝血调节蛋白活化就变得特别明显(图1)。由口服避孕药诱导的血栓形成倾向可归因于对活化的蛋白C获得抗性，该抗性引起凝血酶生成增加10％，当加入TM或APC时变得更加明显(18，19)。

[0010]一个特别有趣的实例是狼疮抗凝血药。该类抗体诱导增加的凝血酶形成的滞后时间，因此增加凝血时间，但也诱导对蛋白C系统活性的重要抗性(20)。这解释了″LE悖论″，即抗凝血药作用伴随血栓形成倾向。

[0011]已发现过量的因子II，VIII和VII与心肌梗塞的发生相关(21-24)。此外，高于正常水平的vWF增加凝血酶生成(12)是动脉血栓形成的危险因子(25，26)。

[0012]在年轻中风患者亚群(约30％)中，已显示富含血小板血浆(PRP)中的凝血酶生成和vWF均显著高于正常情况(27)。在所有先天性凝血因子缺乏中，凝血酶生成减少。这已经为血友病A，B和C(缺乏因子VIII，IX或XI；28-31)以及所有罕见的缺乏症(凝血酶原，因子V，VII，X，XII；32)所证实。一旦TG低于正常的20％就可见出血倾向。在A型血友病中不仅输注因子VIII或给予DDAVP增加血液形成凝血酶的能力，而且使用含有凝血酶原和/或因子VII的产品的抑制剂旁路治疗增加凝血酶生成。

[0013]严重的血小板减少症(＜50000μl-1)引起凝血酶生成减少以及Glanzman和Bemard-Soulier血小板性凝血障碍。在血管性血友病中-目前已知以高切变率诱导血小板黏附的疾病-富含血小板的血浆中的凝血酶生成显著受损(见上)。PRP缺陷比贫血小板血浆(PPP)高得多，表明不能以伴随的-通常轻微的-因子VIII减少来解释。

凝血酶活性图Thrombogram

[0014]当处理本发明所要解决的问题时，关于凝血酶的生成机制应当考虑以下观点。

[0015]凝血酶形成机制的简化方案(图1)甚至也显示其极端复杂，并充满着正反馈和负反馈。实际上如此复杂以至于变成非线性系统，即在反应物浓度与产量之间无简单的关系，且阈值现象可引起该系统发生基本上不可预知的反应。因此不能从相关反应物(甚至可能是未知的)的个别浓度推导出对给定触发事件的整体反应，并且只有测量包含患者血液的整个系统功能的试验才显示患者的止血/血栓形成状态。

[0016]凝血酶生成全过程的结果是暂时凝血酶活性的出现及消失。凝血酶活性对时间的曲线或Thrombogram^TM(TG)的特征为起始期或滞后时间，期间仅形成少量的凝血酶，然后活性突然大增，称为增殖期(图1)。在凝血酶活性刚刚开始大增时血液形成凝块，并且几乎所有的凝血酶都在凝块形成后形成。随后血液中的抗凝血酶使所有形成的凝血酶失活。这些蛋白以慢反应化学计量地结合到凝血酶上。失活速度与凝血酶和抗凝血酶的浓度成比例。只要凝血酶原的转变速率高于凝血酶的失活速率，凝血酶水平就增加。当凝血酶水平增加时，失活速率也增加。在峰值时两种速度相等，此后衰减占优势。获得的凝血酶活性曲线显示不同阶段，尤其显示凝血酶生成的峰值、到达峰值的时间以及内源性凝血酶潜能(ETP)。

现有技术

[0017]自上个世纪以来，医药行业一直注意到需要测量止血和血栓形成系统的功能。直到20世纪90年代，问题的解决方案基本上没有变化，提供的方法要么实用但不充分，要么充分但不切实际。

[0018]实用的解决方法涉及测量凝血时间和出血时间。凝血时间测量凝血酶生成的起始期的长度，因此仅反映功能的一部分(33，仍见上)。临床实验室使用多种检测，每种仅在特定情况下有用，这一事实已显示凝血时间不能反映整体的凝血机制。对于出血时间，可以说它是极其不精确的，变异系数约为40％，这大大地限制了其实际应用(34)。

[0019]自20世纪50年代以来，已经认识到测量凝血中凝血酶的时程最能评价H&T的功能(35-37)。直到1992年，测量TG的唯一方法是从凝血或血浆中取样，并确定其中凝血酶的含量。每条曲线花费一个工时，因此适于研究但不适于现代临床和流行病学应用。

[0020]在1990年，Hemker和Béguin等人(EP-B1-0420332)首次提出向凝血中加入对凝血酶有高度特异性但对凝血酶有低转换速率(低K_cat)和低结合亲和力(高Km)的生色(产生颜色的)底物这一想法。这种底物在整个TG过程中存在，且整段时间内凝血酶活性的总和(即积分)可由形成的产物总量测量。理想地，这测量内源性凝血酶潜能(ETP)，即凝血酶生成曲线下的面积(AUC)。

[0021]后来，Hemker等人进一步发展了该方法以获得完整的TG曲线(38)。基于的原理是，如果底物的动力学常数是有利的，则在整个凝血过程中反应速度就能够以良好的近似保持与凝血酶浓度成比例，以致于产物浓度的一阶导数给出与凝血酶活性成比例的曲线。描述于WO03/093831A1中的该方法是更早公开于EP-B2-0420332中的仅测量产物终末浓度方法的延伸和改进，以此方法获得TG曲线下的面积，即得到ETP。

[0022]用于此方法的底物产生黄色产物，该产物的监测需要测量光密度，因此需要光学上清澈的反应介质。因此必须避免由纤维蛋白原凝结引起的浑浊，要么必须去除纤维蛋白原，要么必须通过加入聚合抑制剂阻止其聚合。然而，去除纤维蛋白原有去除重要反应物的缺点，且不能在不去除细胞成分如重要血小板的情况下完成。此外，以完全阻止纤维蛋白形成所需要的高浓度加入聚合抑制剂抑制凝血酶原转化酶及导致其形成的生化反应。

[0023]与光密度相反，荧光可在浑浊介质中测量。不像显色底物那样，产生荧光产物的底物(荧光底物)因此可用在未去除纤维蛋白的血浆和富含血小板血浆(PRP)中(33，39-43)。然而荧光底物的使用产生两个重要缺点：1)因为所谓的内滤效应，荧光强度与荧光团的浓度不成比例；2)根据可用的底物，产物形成的速率不一定与酶浓度成比例。后一缺点可通过使用如生色方法中的不会被显著消耗的底物克服。当时没有这类底物提供。现在这两个问题在实践中均已被解决，通过连续地比较实验信号和恒定的凝血酶样活性的信号，该凝血酶样活性在与测量样品完全相同的条件下作用(WO 03/093831 A1)。

[0024]生色方法显然不能用于全血，因为血液不是透明的。已报道了荧光底物可用于测量全血中的TG(44)。实践中这一公开的方法时常产生不稳定信号，这些不稳定信号不像从已确立的二次取样法得到的凝血酶生成过程(图2)。此外，获得的信号与存在的凝血酶含量之间的数量关系在各个实验间也不同。简言之，所述方法不产生可重复和可计量的结果。

[0025]另一种可能是对血液进行大力稀释(10倍或更多)，使得红细胞RBC有更少的影响(45)。这确实产生优于得自最低程度稀释血液的曲线。然而由于两个原因认为此方法不能表示生理学状况。第一，形成凝块后(即在凝血酶生成的最重要阶段期间)，凝血酶形成反应是扩散限制的，因为它们发生在不溶的界面(血小板和固定在纤维蛋白网络中的其它细胞的表面)。这使得它们比自由溶液中的反应，如凝血酶失活反应，对稀释更敏感。因此在稀释的血液中凝血酶形成与凝血酶失活反应之间的平衡不能代表存在于体内的状态。这在血液中含有病理学抑制剂(例如治疗折射血友病(therapy refractive haemophilia)或红斑狼疮抑制剂)的情况下更加重要。在临床实践中公知，在体外，稀释时凝血抑制剂效果降低。

[0026]由此，剩下的问题是如何获得一种信号，从该信号可确定小于10倍稀释的凝血样品中凝血酶浓度的变化。本发明意在提供该问题的解决方法，该方法至少克服了在现有技术中的一些缺陷。

[0027]发明人发现，在本发明之前获得的不能重现和不稳定的结果至少有两个原因；a：血液凝结前的沉降作用以及b：凝血发生后血块的凝缩(见图4)。因此从其获得荧光的体积在反应期间发生变化，且表面的几何形状发生变化，引起不稳定的聚焦和干扰恢复信号的光反射。发明人意外地发现，当在薄层血液上特别是在提供了栅格和/或微珠的薄层上操作时不发生这些现象。薄层的几何形状，以及具有或不具有所述的栅格和/或微珠，实际上防止沉降作用和凝缩。然而反应体积未知，因此必须在测量期间确定。这在试验开始时通过加入已知浓度的荧光分子来完成。信号小，因此通过使用本领域已知的任何合适设备测量大表面积有利地增加信噪比。此外，由于大的体积-面积比容易蒸发，应当采取合适的预防措施。

[0028]根据本发明，描述了体外及时测量样品中凝血酶活性进程的方法，其中样品为血液样品，通过以下步骤测量凝血酶的生成：

-将所述样品层与凝血酶的荧光底物接触，其中所述层具有0.05至5mm范围的厚度和10至500mm²范围的表面；

-允许在所述样品中产生凝血酶；

-测量从层表面通过荧光底物释放的荧光基团发出的荧光，该释其是生成的凝血酶对所述的荧光底物的酶促作用的结果。

[0029]根据凝血方案，检测凝血酶活性的方法使得能够测量凝血酶浓度的时程，该时程由凝血酶的形成和随后的失活产生。

[0030]本发明的方法可在血液样品，如全血样品或富含血小板血浆(PRP)样品上进行。

[0031]通常在所述样品与适于引发凝血酶生成的成分接触后允许凝血酶在样品中产生。这些成分可包括凝血因子，如组织因子，且可能为钙离子。

[0032]当凝血酶产生并存在于反应混合物中时(活性凝血酶)，其与其荧光底物反应，结果是释放底物的荧光基团。

[0033]反应被设计为在整个反应期间荧光底物以足够高含量存在，以允许测量凝血酶活性。例如，底物浓度约等于或高于凝血酶底物的Km，以致底物的消耗对反应速度没有大的影响。底物被凝血酶转化，使被测样品表面发出的荧光增加。

[0034]本发明中确定的方法使凝血酶生成能在血液样品，特别是在全血样品中发生，此方法中凝血酶生成与体内发生的凝血酶生成基本上相当。因此它为在止血和血栓形成研究中的应用提供了可靠的测量方法。

[0035]尤其使用既允许照明大表面，如具有10至500mm²的表面又允许收集从该表面发出的光的光学设备进行测量从被测样品层表面发出荧光的增加的步骤，该荧光的增加是通过凝血酶作用从底物释放荧光基团的结果。由所选的荧光基团确定所选的测量荧光的波长。为激发光确定一个波长，将激发光传递至样品以进行测量。为发射光确定另一个波长，发射光由凝血酶荧光底物的荧光基团的释放产生。光学设备，如本领域技术人员已知的荧光板读取器(例如the AscentFluorescent plate reader，Thermolabsystems)适于测量荧光。

[0036]根据本发明的实施方案，将被测样品，特别是全血样品装于一个或多个允许有利地同时进行好几个样品测量的容器中。根据确定的厚度和被分析样品层表面的条件设计这些容器，使样品能装入。例如能够使用此分析领域的技术人员已知的含有孔的平底微量培养板或具有另一种合适几何设计的容器或载体。

[0037]如果它们满足以下要求，可用其它设备作为样品的载体，即根据本发明定义能够使所述样品以层状被提供用于分析。因此，参照含有样品的孔(微量培养板的)对进行本发明的方法和方式的描述能够用于含有样品的其它设备(容器或载体)。

[0038]根据本发明的方法，测定中凝血酶的浓度是测量到的由荧光凝血酶底物释放的荧光基团的荧光的函数。特别是，它与荧光出现的增加速率成比例。

[0039]因此，本发明方法能够实现在整个凝血酶活性时间内测量样品中的凝血酶浓度，条件是荧光底物以适当数量存在。

[0040]因此，在凝血前后，在高至凝血酶的峰值顶点以及在达到凝血酶峰值后由于凝血酶失活使凝血酶浓度降低期间，凝血酶活性的进程以时间依赖性的凝血酶浓度曲线的测量表示。在凝血酶活性的不同步骤中，荧光底物与存在的特别是水解的凝血酶反应，引起荧光基团的释放。

[0041]本发明的特殊优点是该方法使得能够在样品中，特别是未稀释的或最低程度稀释的全血样品中测量凝血酶生成，所述稀释在最大10倍，特别是小于或等于4倍的范围内。

[0042]在所述方法的特定实施方案中，被分析样品，特别是全血的层厚度为1至3mm。特别是约2mm或更小。

[0043]在本方法的特定实施方案中，当样品，特别是全血样品，填充于微量培养板的孔中或任何合适容器或支持物中时，样品表面大于20mm²，例如从30mm²至200mm²，特别是大于100mm²，特别是在150至200mm²范围。

[0044]作为实例，将样品填充于微量培养板的孔中，每一孔具有15mm的直径且血液样品的厚度小于2mm，使得能够在约175mm²的表面上测量。

[0045]以能够在每一样品的表面实现多个研究点(lecture point)的方式测量凝血酶活性。

[0046]根据本发明的实施方案，对填充于微量培养板的孔中或任何合适容器或支持物中的样品特别是全血样品进行本方法，其中所述孔还包含有栅格，特别是具有50μm的筛孔。

[0047]除了本发明实施方案中的栅格之外，样品，特别是全血样品填充于培养板的孔中或任何包含微珠的合适容器或支持物中。

[0048]存在所述的栅格和/或微珠有助于将全血分散于孔中，特别是防止凝血中凝块的凝缩。换言之，存在所述栅格和/或微珠能够防止凝血表面的干扰，该干扰使在凝血酶活性中测量的信号变得不清。这些栅格和/或微珠可促进凝缩效果的减弱，其可通过使用大的测量表面获得。还可使用其它可实现该效果的手段。

[0049]在本发明的特定实施方案中，覆盖含有样品，特别是全血样品的孔以避免在测量凝血酶活性期间由于蒸发所致的变干。覆盖可使用常规材料，例如各种类型的薄塑料膜，条件是其不干扰荧光测量。

[0050]测量血液样品中的凝血酶活性从将样品填充到孔中(或其它任何合适的设备中，例如槽中)和将包括组织因子在内的启动凝血酶生成的必需成分加入样品中时起，至凝血酶在凝血过程中消耗完止。

[0051]在本发明方法的特定实施方案中，加至样品中的凝血酶荧光底物的量在50-1000μM范围内。根据所公开的方法，为了能够知道绝对条件下的活性凝血酶浓度(即nM/L)，有必要知道荧光检测中血液样品的体积。为此，可向凝血酶荧光底物中加入已知浓度的荧光团，其中凝血酶底物与荧光团的各自比例为结合在凝血酶底物上的荧光分子数量的1％至10％，特别是1％至5％。

[0052]在本发明的特定实施方案中，所述荧光团与由凝血酶对荧光底物的作用释放的荧光分子具有相同的性质。

[0053]在另一个实施方案中，荧光团与荧光底物的荧光分子的种类不同。此时，荧光测量应该考虑到存在新种类的荧光团；特别是包括测量荧光团的荧光。

[0054]加入已知浓度的这类荧光团为待分析样品提供了内标，使样品的体积能够被评估，其中事实上测量荧光。

[0055]为了在样品，特别是全血样品中进行确定凝血酶生成的方法，使用由与荧光分子偶联的有机化合物组成的凝血酶的合成底物是有利的。

[0056]合成的荧光底物可以是与荧光分子偶联的具有2至30个氨基酸残基序列的寡肽。

[0057]特别有用的是产生荧光的基团与底物中的末端赖氨酸或精氨酸残基结合，因为凝血酶优选切割与这些氨基酸残基结合的基团。

[0058]根据特定实施方案，使用的荧光分子是AMC(7-氨基-4甲基香豆素)或对硝基苯胺。合成底物的描述见Rijkers，D.T.，H.C.Hemker，et al(1996)，lnt J Pept Protein Res 48(2)：182-93；Rijkers，D.T.，S.J.Wielders，et al(1995)，Thromb Res 79(5-6)：491-9；Wielders，S.M.Mukherjee，et al(1997)，Thromb Haemost 77(4)：629-36.

[0059]适合进行本发明的一个特定的合成的产生荧光的凝血酶底物是Z-Gly-Gly-Arg-AMC(可得自BACHEM)。

[0060]在本发明的特定实施方案中，含有样品的孔(或其它任何合适的设备)还可包含凝胶，可能是包含钙离子的凝胶，制备所述凝胶使得其不稀释样品中全血。凝胶，如Sefadex或琼脂糖凝胶的使用程度是其不能干燥至允许血浆中的液体进入至凝胶中。

[0061]当使用凝胶时，其可在使用全血样品前或在与全血样品一起填充至孔中。

[0062]为使凝血酶生成，可加入至样品中的化合物包括组织因子及钙离子，加入化合物的量使凝血能够开始。

[0063]当使用加有柠檬酸盐的血液时，该量的范围可以是组织因子为0.05pm/L至15nm/L，Ca⁺⁺离子约10mM。本发明还明确地包括下述情况，其中使用天然的非抗凝血时，不需加入Ca⁺⁺。或者，在某些应用中，为了研究血液的同时凝血性，不加入组织因子是有利的。当需要时，在开始检测前加入组织因子。

[0064]钙离子和/或荧光底物可直接与血样一起加入，特别是当在溶液中使用钙及荧光底物时。或者也可将组织因子加入至血样中。

[0065]当样品及各种化合物被填充至孔中时，立即开始检测。

[0066]在本发明的特定实施方案中，检测的全血是柠檬酸盐血。

[0067]全血样品中凝血酶活性的测量方法可有利地用于检测或监测止血疾病或血栓形成性疾病，或用于检测或监测该疾病出现在患者身上的可能性。

[0068]该方法还能检测或监测全血样品中已确定物质对凝血酶活性的相互作用，其中将所述已确定物质加至被测样品或在凝血酶生成期间加入。

[0069]根据所述方法可被测试的物质，例如为药物制剂或对血液有凝血作用的其它化合物，如凝血因子或药物或抗凝血药因子或药物。特别是，凝血酶抑制剂可根据本发明方法进行测试。

[0070]另一方面，可将本发明方法用于筛选物质以确定它们与凝血酶活性相互作用的能力。

[0071]根据本发明，上述以及即将描述于实例中的方法特别可用于测量全血样品的内源性凝血酶潜能(ETP)。

[0072]它还可用于测量达到凝血酶峰值的时间或测量凝固时间。

[0073]它还可用于测量测定中生成的凝血酶的峰值水平。

[0074]本发明方法实际上允许测量所称的凝血酶曲线，该曲线为测量的荧光的一阶导数，该荧光由凝血酶与荧光底物反应产生。

[0075]在本发明的特定方法中，进行校准步骤，如专利申请WO03/093831中描述的校准。

[0076]已经涉及生物样品描述了本发明方法，该生物样品为全血样品。它还可用于测定富含血小板血浆(PRP)或甚至是贫血小板血浆(PPP)的样品。

[0077]本发明还涉及用于进行以上以及在后面的实例中公开的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括

-凝血酶的荧光底物，

-能使凝血酶生成的组织因子及钙离子，

-任选地，防止血块凝缩和帮助全血分散的网格或微珠，

-任选地，可能包含钙离子的凝胶。

[0078]任选地，试剂盒还包括使用说明书以提供进行本发明方法的具体指导。本发明的其它特征及其优点将公开于随后的实例及附图中。

附图说明

图1：由二次取样法实验获得的凝血酶活性图。主要特征是：滞后时间(＝凝固时间)，峰高及曲线下面积(＝内源性凝血酶潜能，ETP)。

图2：通过校准的自动化凝血酶活性测量仪在贫血小板血浆中获得的凝血酶生成曲线的实例。

AVK：抗维生素K处理；TM：凝血调节蛋白。

图3：凝血酶形成的简化方案：具有明显的正反馈和负反馈。

图4：沉降作用及血块凝缩对凝结全血中荧光信号影响的图示。

图例：大椭圆：红细胞

带星的圆圈：被激发的荧光分子

正方形：未被激发的荧光分子

顶端水平线(c.q.曲线-)：流体表面

底端水平线：测量孔的透明底部

阶段A：刚加入孔的流体血液，(图1t＝0)

阶段B：刚要凝结之前的流体血液，(图1t＝B)

阶段C：刚凝结之后的血液，(图1t＝C)

阶段D：凝缩开始后的血液，(图1t＝D)

图5：惠更斯目镜及聚光镜。

图6：标准微量滴定板孔中的血液薄层(3mm)。7个相同的实验。

图7：大表面微量滴定板孔中的血液薄层。

每孔32个研究点的相同试验。

图8：具有筛孔和盖的大表面微量滴定板孔中的血液薄层。通过集光设备(惠更斯目镜)的一个研究点(1)实验曲线，(2)对α2M-凝血酶校正后。

图9：从任意单位到凝血酶。

图10A：样品芯(cartridge)设计显示双区室测量芯的可能设计。将可能用生物相容性涂层包被的薄片(优选硬质的，例如玻璃)材料(称为“载玻片”)以合适的间隔物分成多个区室。该间隔物还起电极作用，以通过电阻的下降和/或电流的增加检测样品注入。每一区室可用例如校准物的物质和/或底物(或任何其它需要的物质，如抑制剂及组织因子)包被。将第二载玻片连在另一载玻片之上。两片载玻片之间的距离为5-1000μm，优选50μm。

可在样品芯的一侧或多侧装上合适的分色镜覆盖层使得光学放大成为可能。这允许激发光进入芯内，而发射光在芯内反射(见图10B)并被集中到芯的未覆盖的一侧。

图11：另一种芯设计显示将一片固体基质，例如多孔聚合物或纤维素，放在两片载玻片之间。该基质可包含底物和/或钙(或任何其它物质，如组织因子，抑制剂)。这些物质可以干燥或冻干的形式与溶剂一起存在。

图12显示在滤纸孔中的薄层血液中测量的TG曲线，通过葡萄球菌凝固酶校准物换算为nM凝血酶。

实施例

I测量全血中的TG：测量TG时观察到的现象及技术困难。

[0079]当使用荧光底物时，仅在光不被红细胞遮挡时荧光可被激发和测量，即激发光在血浆中可到达的空间，也是可观察到发射光的空间。为简化起见，我们假定这两种类型的光均完全不能穿过红细胞。然而如果到RBC能被穿透的程度，那么推理基本上不需要改变。

[0080]在起始期结束时，即在开始产生大量凝血酶时全血形成凝块。图4中描述了四个阶段的血液上表面和下表面的情况，在存在荧光底物的情况下血液在荧光计板的孔中凝结，并从顶部或底部被照射。

[0081]在阶段A，搅动的血液刚到达平静，且红细胞均匀地分散于流动性血浆中(图4A)。在凝结前的滞后时间内(通常，3-12分钟)，发生红细胞沉降；在上部更多光能进入血浆，底部则更少(图4B)。血液一凝固(图4C)，B中产生的状态就被出现的纤维蛋白凝块“冻结”。因为凝血酶对血液血小板的作用，血块一形成，血块凝缩就开始。沉降和血块凝缩是肉眼能观察到的现象，每小时达毫米级。每分钟则在微米范围，即落在TG实验的时间数值范围内。凝缩引起RBC的不规则分布和表面的变化，以致其不再平坦而变成弯曲的。这种弯曲引起血浆和血块在表面的不规则再分配，并引起不可预知的光效应。表面不规则在mm范围内且肉眼可见。因此在标准荧光计中它们与激发光点在同一数量级。

[0082]沉降和凝缩引起流体体积的变化，其中激发光可到达荧光分子。由于这种变化，在其中进行测量的实际体积是可变和未知的。因此，即使沉降和凝缩效应可忽略不计，在这些条件下从获得的信号产生对凝血酶含量进行可重现的定量也是不可能的。

[0083]通过使用普通微量滴定板孔进行的实验以及将这些孔填充至达到正常高度(6mm)的体积，仅在一小部分孔中获得满意的结果。这可以解释为，在普通荧光计中仅在被测表面的点(约4mm²)与因为有足够的可用血浆而能获得足够信号的面积吻合的情况下才能获得足够的信号；其不在凝缩的血块团上面，而是在表面的“凹陷”中(见图4D)。测量文献中的阳性报告必然来自对所得数据的小心选择。在得到正确信号的情况下，凝血酶的定量测量是不可能的，因为测量体积是未知和可变的。通过透明薄片从底部测量可解决表面不规则问题，但由于RBC的沉降，信号变得如此之小以致其被背景噪音淹没。

[0084]已观察到的是，正常填充现今可用的96孔板的孔，10孔中有1或2孔可获得可解释的信号。如果将孔填充至低于正常使用的2mm高度，在几乎所有测量中均获得信号。然而，在普通荧光计中以此方式获得的信号可变性很大，而且很小，即相当于从血浆获得的信号的1-5％，且显示出大的信噪比(图6)。我们推断，使用普通荧光计的光学装备尚无可行的方法来确定全血中的TG。

II本发明方法的设计

1.发明原理

[0085]意外的是，发现(a)沉降和凝缩效应随凝血层厚度逐渐减小，以及，(b)从大于约10mm²的表面测量荧光倾向于平衡由凝缩引起的表面不规则。同样意外的是，将血液包含在曲径或间隙，如滤网(具有开放的口为50-500μm的筛孔)或填充堆叠的球(直径50-500μm)中可将沉降和凝缩效应进一步减少。因此，发明者人通过使得能够在展开在大于约10mm²表面上的血液薄层(特别是小于2mm)中进行测量，提供条件从凝血酶活性产物获得不受干扰的荧光信号。

[0086]为解决测量反应体积未知的问题，发明人进一步决定不使用纯的底物而使用含有已知且易于测量的固定低浓度的荧光产物的底物。

2.测量的光学设备

[0087]对于大于正常表面上的测量，需要可以照射大表面和从该表面收集发射光的光学设备。一种这样的设备如惠更斯目镜，另一种如显微镜集光器(图5)。为增加荧光信号，可将血液分散在反射面上，该表面可为下述完整设备的一部分。

3.包含血液样品的设备

[0088]使用在其结构间隙中包含血液的设备可以模拟伤口中血流的状况，可含有组织因子、凝血调节蛋白和或已知存在于正常血管壁中的影响TG过程的其它成分(例如胶原)。为比较起见，可以在惰性材料中选择制作设备的材料，例如尼龙或聚丙烯。

[0089]为预防表面干涸，可在血液薄层上覆盖一薄层固体或流体材料薄膜。或者，可将血液引入透明材料内部的缝隙中，例如通过毛细管的力量。

4.测量

[0090]在荧光信号与荧光分子浓度成比例的薄层中测量是有利的；换言之，内滤效应不起作用。然而底物消耗起作用。可以三种方法补偿：(a)当采用生色方法时(38)，即通过提供具有底物消耗可忽略不计的动力学常数的底物，(b)通过数学校正底物消耗，即通过运用积分速率方程以及(c)通过使用专利WO03/093831中描述的校正器。

[0091]从凝血酶对加入到血液中的荧光底物的酶促作用确定凝固全血中凝血酶浓度的进程。通过在大表面(具有大于10mm²的表面)上厚度不足2mm的薄层中的测量来获得稳定和足够的信号。为测量在其中发生反应的实际体积，将少量荧光团加入底物。需要专门的光学设备来照射整个表面，且需要另一个来收集从表面发出的光。

[0092]可通过一系列机械方法将薄层固定并防止其干涸，在这些方法中有惰性栅格或为模拟血管壁的某些特性所选择材料的栅格。或者，可使用小缝隙。

[0093]还可将此设备用于测量富含血小板和贫血小板血浆中凝血酶的生成。

5.反应混合物

化学试剂

[0094]不含聚凝胺(polybrene)或Ca⁺⁺的重组再酯化(relipidated)组织因子(rTF)来自Dade Behring(Marburg，Germany)。荧光底物，Z-Gly-Gly-Arg-AMC得自Bachem(Switzerland)。一旦被凝血酶分解，它就释放出荧光的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)，其通过390nm激发和460nm发射过滤设备进行测量。

[0095]按下述为每一实验制备荧光底物和CaCl₂(FluCa)的新鲜混合物：向含有60g/L BSA(Sigma，A-7030)的875μL缓冲液(Hepes 20mM，pH7.35)中加入100μL的1M CaCl₂。在37℃，将25μL荧光底物的100mM DMSO溶液注入，立即剧烈混和。产生的澄清溶液称之为FluCa，因此荧光底物为2.5mM，CaCl₂为100mM。

缓冲液A包含20mM hepes，140mM NaCl，5mg/ml BSA，pH＝7.35.

缓冲液B包含20mM hepes，140mM NaCl，60mg/ml，pH＝7.35血液和血浆

[0096]血液通过静脉穿刺获得(1体积0.13M的柠檬酸三钠加入至9体积血液)。应当采用自由流动或最低限度的抽吸；避免使用真空容器。

[0097]在装有390/460过滤设备(激发/发射)的荧光计(Ascentreader，Thermolab systems OY，Helsinki Finland)的板中进行测量。使用24圆孔板，其孔的直径为15mm，因而表面为175mm²，代替96孔板。以缓冲液A将孔洗涤几次再干燥准备好。

[0098]然后加入血液和底物的混合物，其中发生凝血酶生成。填充至每孔中的该混合物包含：80μL含柠檬酸盐的全血，

[0099]20μL以缓冲液A 1∶1000稀释的Innovin，20μL FluCa，如果情况需要，这些体积的倍数。

[00100]加入FluCa后，立即将混合物于涡旋搅拌器上搅拌并加入孔中。将板插入荧光计并在10s内以1200rpm频率振荡，然后在37℃下在390/460nm处在1小时内每两分钟测量一次。

[00101]向每孔加入120μL混合物。

实施例1

加上栅格和盖的多个研究点.

[00102]如上所述，在三个孔中引发凝血酶生成。每孔24个点被照射，并相继测量。每次读数时来自24个点的信号被相加。结果如图7所示。可见信号增强并通过加上栅格稳定，此处采用尼龙滤器，具有600μM的筛孔开口，51％的开放面积和445μM的厚度(SpectrumLaboratories Inc.Rancho Dominguez California，USA)。然而，假信号随时间增加，由于蒸发和顶层的浓缩。这通过覆盖塑料薄膜来防止。(用于QPCR的Thermosprint透光密封带(Bilatec AG，Mannheim，Germany).

实施例2

加上凝胶和盖的多个研究点.

[00103]如上所述，在三个孔中引发凝血酶生成。每孔24个点被照射，并相继测量。每次读数时来自24个点的信号被相加。向两孔中加入700μL的50％(v/v)Spehadex-25的150mM NaCl溶液，允许粉末沉降5分钟。用移液管从孔中移出上清夜(300-400μL)。

[00104]然后加入120μL的凝血混合物。在这两孔之一的上方使用塑料薄膜(用于QPCR的Thermosprint透光密封带(Bilatec AG，Mannheim，Germany)。结果与图7中的结果相当。

实施例3

使用光学设备集光

[00105]对于这个实验，如实施例1具有栅格和盖，用Fluostaroptima fluorimeter(BMG Labtech，Offenburg，Germany)测量一个孔。来自样品的光被收集到惠更斯目镜(10x放大倍数)中，然后在通过此光学设备后读数。结果显示于图8中。

实施例4

从任意单位到凝血酶

[00106]这个实验基本按照实施例1中具有筛孔和盖的实验进行，但将已知量(10nM)的AMC加入至底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC中。由于红细胞的沉降，进行测量的体积增加，所以来自AMC存在的信号增加。在凝血时，状况“冻结”不发生进一步沉降。在这一时刻，我们测量由于加入了10nM AMC产生的荧光量，可根据信号的突然增加判断这一时刻。以此方法我们知道如何以AMC浓度来换算荧光的单位(F)。因此，可将测量的dF/dt换算成d[AMC]/dt。从独立的实验我们知道什么样的d[AMC]/dt与什么样的凝血酶浓度相对应。因此，可将荧光的变化速度(图9，黑线)换算成样品中凝血酶的浓度。

实施例5

含有血液样品的设备

可通过将50μL的100mM荧光底物的DMSO溶液和100μL 1MCaCl₂溶液加至5850μL乙醇中制备含有底物及Ca²⁺离子的滤纸孔。将11μL该溶液分散于7×9mm的固体基质(Whatman 1MM层析纸)上，再在氮气下干燥。然后如图11所示将其夹在塑料膜(用于QPCR的Thermosprint透光密封带，Bilatec AG，Mannheim，Germany)之间。

用相同的方法制备仅含有底物的滤纸孔，在这个实例中，将50μL的100mM荧光底物的DMSO溶液加至5950μL乙醇中，将其中的11μL分散于固体基质上，再在氮气下干燥。

使用滤纸孔的多个研究点

按上述新鲜制备两个滤纸孔，一个包含荧光底物及钙离子(A)，一个仅包含底物(B)。

制备4：1∶1的含柠檬酸盐的全血、缓冲液B及Innovin(以缓冲液A 1∶1000稀释)的混合物。作为校准物，通过混和全血和聚合抑制剂制备4：1∶1的含柠檬酸盐的全血、缓冲液B(1.0mM)中的聚合抑制剂(H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH·AcOH)(Bachem feinchemikalien AG，Bubendorf，Switserland)及20μM葡萄球菌凝固酶的混合物。在实验马上开始之前，加入葡萄球菌凝固酶并充分混和样品。

加入葡萄球菌凝固酶后，立即开始实验，加11μL的TG样品至A孔，11μL的校准物至B孔。这通过用移液管将液滴靠近固体基质使得液滴接触基质并通过毛细作被吸入其中(参见图11)。每孔4个点被照射，并相继地被测量。

来自校准物的信号是直线，斜率被用来将来自样品孔的信号换算为nM凝血酶。这是本领域已知的常规信号校准，而非根据专利申请PCT/EP03/04705的持续校准。结果如图12所示。

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Claims (29)

1.体外检测样品中凝血酶活性的方法，其中所述样品为血液样品，且通过以下步骤测量凝血酶的生成：

-将所述样品层与凝血酶的荧光底物接触，其中所述层具有0.05至5mm范围的厚度和10至500mm²范围的表面；

-使得在所述样品中产生凝血酶；

-测量从所述层的表面由荧光底物释放的荧光团所发出的荧光，该释放是生成的凝血酶对所述的荧光底物的酶促作用的结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其中测定中生成的凝血酶浓度被确定为测量到的释放的荧光基团荧光的函数。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中全血样品最大被稀释10倍。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中样品层的厚度约2mm或更小。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中，将血液样品填充于板的孔中用于测定，所述孔中还含有筛孔大小为50-500μm的栅格。

6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中，将血液样品填充于还含有微珠的板孔中用于测定。

7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中含有血液样品的孔被覆盖以测定凝血酶活性。

8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中向凝血酶荧光底物中加入荧光团，其中加入的荧光团的各自比例为结合在凝血酶底物上荧光分子数量的1％至10％。

9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中加入样品中的凝血酶荧光底物的量在50-1000μM的范围内。

10.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述荧光底物为与荧光分子偶联的凝血酶的合成底物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中凝血酶底物被凝血酶选择性水解，与凝血酶有中等结合亲和力和低动力学常数。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述荧光底物是与荧光分子偶联的具有2至30个氨基酸残基序列的寡肽。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述寡肽具有末端赖氨酸或精氨酸残基用于与荧光分子偶联。

14.根据权利要求10至13中任一权利要求所述的方法，其中所述荧光分子为AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)。

15.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的方法，其中所述孔还含有凝胶，可能含有钙离子，其中所述凝胶不稀释血液样品。

16.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其中将组织因子及钙离子以使得凝血酶生成能够发生的量加入至血液样品中。

17.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其中所述血液样品为全血。

18.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其中所述血液样品为血浆样品，特别是富含血小板的血浆(PRP)。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述全血样品含柠檬酸盐。

20.根据权利要求1至19中任一权利要求所述的方法，其用于检测或监测止血性疾病或血栓形成性疾病。

21.根据权利要求20所述的方法，其用于检测或监测已确定物质对全血样品中凝血酶活性的相互作用，其中向待测定样品中加入所述的已确定物质或在凝血酶生成期间加入所述的已确定物质。

22.根据权利要求20所述的方法，其用于监测凝血因子或药物的相互作用。

23.根据权利要求20所述的方法，其用于筛选物质以确定其与凝血酶生成的相互作用能力。

24.根据权利要求1至20中任一权利要求所述的方法，其用于测量全血样品的内源性凝血酶潜能(ETP)。

25.根据权利要求1至21中任一权利要求所述的方法，其用于测量凝血酶达到峰值的时间。

26.根据权利要求1至22中任一权利要求所述的方法，其用于测量凝结时间。

27.根据权利要求1至23中任一权利要求所述的方法，其用于测量生成的凝血酶的峰值水平。

28.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其包括校正步骤。

29.用于进行权利要求1至21中任一权利要求所述方法的试剂盒，其包括：

-凝血酶的荧光底物，

-能使凝血酶生成的组织因子及钙离子，

-任选地，预防血块凝缩和帮助全血分散的栅格或微珠，

-任选地，可能含有钙离子的凝胶。

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