RU2422835C2 - Измерение активности тромбина в цельной крови - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу in vitro измерения активности тромбина в образце крови. Для измерения выработки тромбина слой указанного образца приводят в контакт с флюорогенным субстратом тромбина, где толщина указанного слоя составляет от 0,05 до 5 мм, а площадь поверхности составляет от 10 до 500 мм2. Далее обеспечивают условия для выработки тромбина в указанном образце. Затем измеряют флуоресценцию, испускаемую с поверхности слоя флуоресцентной группой, высвобождаемой флуоресцентным субстратом в результате ферментативного действия вырабатываемого тромбина на указанный флюорогенный субстрат. Изобретение также обеспечивает набор для осуществления определения активности тромбина в образце. 2 н. и 27 з.п. ф-лы, 12 ил.

Description

[0001] Настоящее изобретение относится к способу определения, в частности, измерения динамики активности тромбина in vitro, т.е. к измерению количества активного тромбина в образце, в частности, к тому, как оно изменяется в образце цельной крови при образовании сгустка. Результат измерения активности тромбина можно представить в виде так называемой «кривой выработки тромбина», показанной на Фигуре 1.

[0002] Настоящее изобретение также относится к средствам, позволяющим измерять количество активного тромбина после его выработки в образце in vitro. Настоящее изобретение также направлено на применение указанного способа измерения для обнаружения или мониторинга заболевания у пациента, в том числе к обнаружению или мониторингу патологического состояния, связанного с нарушением свертываемости крови.

[0003] Настоящее изобретение также относится к применению указанного способа измерения для отбора веществ, в том числе скрининга с целью поиска препаратов, которые могут воздействовать на процесс коагуляции, в частности, на активность тромбина.

[0004] Тромботические заболевания, такие как инфаркт миокарда, инсульт, эмболия легких и некоторые другие, являются причиной приблизительно половины всех смертей и случаев инвалидности в западном обществе. В развивающихся странах количество этих заболеваний растет по мере развития. Гемофилия, хотя она не так широко распространена, также является значимой причиной смерти. Таким образом, избыточная или недостаточная функция системы гемостаза является крайне важным механизмом патогенеза. Это делает еще более удивительным факт отсутствия надежного клинического функционального теста.

Роль тромбина в заболевании системы гемостаза и тромбообразования.

[0005] Тромбин играет центральную роль в гемостазе и при тромбозе. Это давно известно для тромботического заболевания вен (1) и было убедительно продемонстрировано тем фактом, что профилактику и лечение тромбоза вен лучше всего обеспечивает снижение активности тромбина, либо путем прямого ингибирования (гирудин, мелагастран), либо путем снижения синтеза (антагонисты витамина К), либо путем усиления распада (гепарины). В последние десятилетия становится все яснее, что в заболеваниях артерий тромбин играет такую же важную роль, как и при заболеваниях вен. Клинические испытания показали, что антагонисты витамина К (2), а также гепарин (3) снижают частоту повторных инфарктов миокарда. На роль тромбина при кровотечении указывает увеличенное время кровотечения, которое наблюдают при таких сильных нарушениях образования тромбина, как вызываемые серьезной передозировкой оральных антикоагулянтов (4) или гепарина (5). Гемофилии также являются заболеваниями системы образования тромбина (6).

В образовании тромбина участвуют все элементы крови.

[0006] Современные исследования обеспечили понимание того, что образование тромбина является результатом совместного действия элементов, формирующих кровь и плазму. Красные клетки крови (эритроциты) наименее активны в этом отношении, хотя мембрана небольшого процента эритроцитов демонстрирует прокоагулирующую активность (7). Намного более важно то, что белые клетки крови обладают активностью тканевого фактора. Эта активность в норме скрыта, но при повреждениях проявляется во взаимодействии с тромбоцитами крови (8, 9). Основными участниками являются, без сомнения, тромбоциты и плазматическая система свертывания. В учебниках до сих пор можно прочитать, что тромбоциты обеспечивают первичный гемостаз и тромбоз артерий, в то время как свертывание плазмы отвечает за уплотнение гемостатической пробки и является механизмом тромбоза вен. Эта точка зрения основана на том факте, что плазму и тромбоциты изучали по отдельности. В реальности, взаимодействие между тромбоцитами и плазмой, а также другими клетками крови, необходимо как для первичного и вторичного гемостаза, так и для тромбоза артерий и вен. Образование тромбоцитарной пробки играет роль в образовании тромбина, поскольку полости в агрегатах тромбоцитов образуют непремешиваемую нишу, где может происходить образование тромбина, при котором его не будет уносить током крови. Поэтому измерение выработки тромбина при свертывании цельной крови так близко физиологической реальности.

[0007] Помимо образования "губки", в которой может образовываться тромбин, тромбоциты сами также вносят существенный вклад в выработку тромбина. Они содержат фактор V и обеспечивают способствующую коагуляции фосфолипидную поверхность, необходимую для преобразования протромбина, а также для различных этапов механизма коагуляции, который приводит к образованию протромбиназы (10). Скорость выработки тромбина и образовавшееся количество тромбина зависит, таким образом, от активности тромбоцитов, а также от вовлеченных в процесс белков плазмы. Особенно интересна роль полимеризующегося фибрина. Фактор фон Виллебранда (vWf) взаимодействует с полимеризующимся фибрином и претерпевает конформационное изменение, которое делает его способным реагировать с рецептором тромбоцитов GPIb, и посредством этого связывания взаимодействовать с тромбоцитами и становиться прокоагулянтом (11, 12). Это показывает, что образование фибринового сгустка не является завершающим актом гемостаза и что ключевым событием всего процесса является образование тромбина в пробке (тромбе или сгустке). В самом деле, как мы увидим ниже, >95% всего образующегося тромбина образуется после образования тромба, и этот тромбин является необходимым для процессов гемостаза и тромбоза (Н&Т). Возможно, наилучшим подтверждением тесной связи между тромбоцитами и плазматической системой свертывания является тот факт, что все "ингибиторы агрегации" и другие антитромбоцитарные агенты ингибируют также выработку тромбина в богатой тромбоцитами плазме (или в цельной крови). Это было показано для аспирина (13), абциксимаба (14), МК383 (15) и клопидогреля (16). И наоборот, тот факт, что антитромбоцитарные средства, и в особенности аспирин, предотвращают тромбоз вен (17), является дополнительной иллюстрацией тесной связи между функцией тромбоцитов и коагуляцией крови.

[0008] Таким образом, количество тромбина, образующееся в сгустке крови представляет собой существенную особенность гемостаза и тромбоза, и все элементы крови принимают участие в его образовании.

Выработка тромбина (ВТ) как показатель риска тромбоза или кровотечений.

[0009] Повышенная ВТ неизменно указывает на риск тромбоза, вне зависимости от того, является ли она следствием недостатка антитромбина или избытка протромбина. Выработка тромбина превышает норму также при нарушениях цепи реакций белка С (недостаток белков S и С, фактора V_Leiden). Это истинно и в отношении свертывания плазмы в целом, но становится особенно очевидным при активации тромбомодулином цепи реакций белка С (фиг.1). Склонность к тромбообразованию, которую вызывают оральные контрацептивы, можно отнести на счет приобретенной устойчивости к активированному белку С, что вызывает 10% увеличение выработки тромбина и становится более очевидным при добавлении тромбомодулина или концентрата аутологичных тромбоцитов (18, 19).

[0010] Особенно интересен случай антикоагулянта волчанки. Этот тип антител вызывает увеличение времени задержки образования тромбина, и, соответственно, увеличение времени свертывания, но также существенную сопротивляемость активности системы белка С (20). Это объясняет "парадокс LE", т.е. антикоагулирующее действие, которое сопровождается склонностью к тромбозу.

[0011] Было обнаружено, что избыточные количества факторов II, VIII и VII коррелируют с частотой инфаркта миокарда (21-24). Также, повышение фактором Виллебранда выработки тромбина до уровней, выше нормальных (12) представляет собой фактор риска артериального тромбоза (25, 26).

[0012] Было показано, что в суб-популяции молодых пациентов с инсультом (приблизительно 30%) и выработка тромбина в богатой тромбоцитами плазме (PRP), а также под действием фактора Виллебранда находится выше нормы (27). При всех наследственных недостаточностях факторов свертывания крови выработка тромбина снижена. Это продемонстрировали для гемофилии типов А, В и С (отсутствие фактора VIII, IX или XI; 28-31), а также для всех редких видов недостаточностей (отсутствие протромбина, фактора V, VII, X, XII; 32). Склонность к кровотечению наблюдается при снижении ВТ на 20% ниже нормы. При гемофилии типа А не только инфузия фактора VIII или введение десмопрессина (I-диамин-8-D-аргинин-вазопрессин, DDAVP) восполняют способность крови образовывать тромбин, но также параллельная терапия продуктами, содержащими протромбин и/или фактор VII повышают выработку тромбина.

[0013] Тяжелая тромбопения (<50000 мкл-1) вызывает снижение выработки тромбина, а также тромбопатию Гланцмана (Glanzman) и Бернара-Сулье. При болезни фон Виллебранда, которая, как известно, вызывает быстроразвивающееся нарушение адгезии тромбоцитов, происходит существенное нарушение выработки тромбина в богатой тромбоцитами плазме крови (см. выше). Этот дефект в богатой тромбоцитами плазме значительно сильнее выражен, чем в бедной тромбоцитами плазме, что указывает на то, что его нельзя объяснить сопутствующим, обычно умеренным, снижением фактора VIII.

Тромбограмма

[0014] При рассмотрении проблемы, которую предстоит решить согласно настоящему изобретению, следует принять во внимание следующие замечания.

[0015] Даже упрощенная схема механизма образования тромбина (фиг.1) показывает, что это крайне сложный и насыщенный положительными и отрицательными реакциями обратной связи процесс. И в самом деле, он настолько сложен, что представляет собой сложную систему, т.е. в нем нет простых отношений между концентрациями реагентов и результатом (выходом), а пороговый эффект может вызвать фактически непредсказуемое поведение системы. Соответственно, реакцию целой системы на определенный импульс нельзя предсказать на основании знания отдельных концентраций соответствующих реагентов (которые могут быть даже неизвестны), и только тест, в котором измеряют функцию всей системы, содержащейся в крови пациента, может указать гемостатическое/тромбостатическое состояние конкретного пациента.

[0016] Результат всего процесса выработки тромбина - это временное появление и исчезновение активности тромбина. Для кривой активности тромбина в зависимости от времени или Тромобограммы (Thrombogram™, ТГ) характерна фаза инициации или время задержки (лаг), на протяжении которой формируются лишь незначительные количества тромбина; за которой следует всплеск активности, известный как фаза роста (фиг.1). Сгусток в крови образуется в самом начале всплеска, и почти весь тромбин образуется уже после образования сгустка. Весь образовавшийся тромбин впоследствии инактивируется антитромбинами крови. Эти белки в ходе медленной реакции связывают стехиометрические количества тромбина. Скорость инактивации пропорциональна концентрации тромбина и антитромбина. Пока скорость превращения протромбина выше, чем скорость инактивации тромбина, уровень тромбина увеличивается. По мере увеличения уровня тромбина скорость инактивации также увеличивается. На пике обе скорости равны, а после этого начинает преобладать распад. Полученная кривая активности тромбина демонстрирует разные фазы и, в частности, пик выработки тромбина, время достижения пика и потенциал эндогенного тромбина (ПЭТ).

Известный уровень техники

[0017] На протяжении последнего столетия необходимость измерения функции системы гемостаза и тромбоза не ускользнула от внимания медиков. Способы решения этой проблемы не претерпели существенных изменений до 1990-х и предлагали средства, которые были либо практичными, но неадекватными, либо адекватными, но не практичными.

[0018] Практичные решения относятся к измерению времени свертывания и времени кровотечения. Время свертывания является мерой длины фазы инициации выработки тромбина и, следовательно, отражает лишь часть функции (33, см. также выше). Сам по себе факт, что в клинической лабораторной практике применяют много разновидностей указанного теста, каждая из которых пригодна только для конкретной ситуации, уже показывает, что время свертывания не отражает механизм коагуляции в целом. Относительно времени кровотечения можно сказать, что это крайне неточный метод с коэффициентом вариации около 40%, что существенно ограничивает его практическое применение (34).

[0019] Начиная с 1950-х начало возникать понимание того, что измерение времени действия тромбина в свертывающейся крови - это наилучший способ оценки функции системы гемостаза и тромбообразования (35-37). До 1992 г. единственным способом измерить ВТ был отбор образцов из свертывающейся крови или плазмы и определения содержания тромбина в образце. Построение одной кривой занимает около одного человеко-часа, и поэтому подходит для исследовательских целей, но не для применения в современной клинике или эпидемиологии.

[0020] В 1990 г. Hemker, Béguin et al. (EP-B1-0 420 332) выдвинули идею добавления к свертывающейся крови хромогенного (дающего окраску) субстрата, обладающего высокой специфичностью к тромбину, но низкой скоростью превращения (низкая K_cat) и низкой аффинностью связывания тромбина (высокой Km). Такой субстрат будет присутствовать на протяжении всего процесса ВТ, что позволяет измерять суммарную (т.е. интегральную) активность тромбина во времени по общему количеству образовавшегося продукта. В идеале это позволяет измерять потенциал эндогенного тромбина (ПЭТ), т.е. площадь под кривой выработки тромбина (AUC).

[0021] Позднее Hemker et al. дополнительно развили этот способ, чтобы получить кривую ВТ целиком (38). Этот метод основан на принципе, состоящем в том, что при подходящих константах кинетики субстрата скорость реакции может, с хорошим приближением, оставаться пропорциональной концентрации тромбина на протяжении всего процесса коагуляции, и поэтому первая производная концентрации продукта дает кривую, пропорциональную активности тромбина. Этот способ, описанный в WO 03/093831 A1, представляет собой дополнение и усовершенствование процедуры, которая ранее была описана в ЕР-В2-0420332, в которой измеряли только конечный уровень продукта, и, соответственно, получали площадь под кривой ВТ, т.е. ПЭТ.

[0022] Вещества, применяемые в указанном способе, дают желтый продукт, измерение количества которого требует измерения оптической плотности и, следовательно, оптически прозрачной реакционной среды. Следовательно, следует избегать мутности, вызванной образованием сгустка из фибриногена, и необходимо либо удалять фибриноген, либо предотвращать его полимеризацию путем добавления ингибиторов полимеризации. Однако удаление фибриногена имеет недостаток, заключающийся в том, что оно представляет собой удаление важного реагента и его невозможно выполнить без удаления клеточных элементов, таких как важные тромбоциты крови. Кроме того, добавление ингибиторов полимеризации в высоких концентрациях, необходимых для полного предотвращения образования фибрина, ингибирует протромбин, преобразующий фермент, и биохимические реакции, приводящие к его образованию.

[0023] Флюоресценцию, в отличие от оптической плотности, можно измерять в мутной среде. Таким образом, в отличие от хромогенных субстратов, субстраты, которые дают флуоресцентный продукт (флюорогенные субстраты), можно применять в плазме, не очищенной от фибрина и, следовательно, также в богатой тромбоцитами плазме (PRP) (33,39-43). Применение флюорогенного субстрата, однако, имеет два важных недостатка: 1) интенсивность флюоресценции не пропорциональна концентрации флуорофора, вследствие так называемого эффекта внутреннего фильтра; 2) с доступными субстратами скорость образования продукта не обязательно пропорциональна концентрации фермента. Последний недостаток можно обойти путем применения субстратов с незначительным расходом, как в способе с применением хромогенного субстрата. На данный момент такие субстраты не доступны. В настоящий момент при практическом применении обе проблемы решают совместно путем непрерывного сравнения экспериментального сигнала с сигналом постоянной тромбиноподобной активности в условиях, полностью идентичных условиям анализируемого образца (WO 03/093831 А1).

[0024] Хромогенный метод, очевидно, нельзя применять для цельной крови, поскольку кровь не прозрачна. Сообщалось, что флюорогенные субстраты можно применять для измерения ВТ в цельной крови (44). При практической реализации описанные в литературе методы в большинстве случаев дает ошибочные сигналы, которые не отражают динамику выработки тромбина, известную из хорошо разработанного метода частичных проб (фиг.2). Кроме того, количественное отношение между полученным сигналом и количеством присутствующего тромбина меняется от эксперимента к эксперименту. Вкратце, описанный способ не дает воспроизводимых количественных результатов.

[0025] Другой возможностью является сильное разбавление крови (в 10 раз или более), с целью уменьшить влияние красных клеток крови (эритроцитов) (45). Это дает кривые, которые лучше получаемых для минимально разбавленной крови. Однако по двум причинам нельзя представить, чтобы этот подход адекватен физиологической ситуации. Во-первых, после образования сгустка (т.е. на протяжении наиболее важной фазы выработки тромбина), реакции образования тромбина ограничены диффузией, поскольку они протекают на нерастворимых поверхностях (поверхности тромбоцитов и других клеток, иммобилизованных в фибриновой сети). Это делает их более чувствительным к разбавлению, чем реакции в свободном растворе, такие как реакции инактивации тромбина. Таким образом, равновесие между образованием тромбина и реакций инактивации тромбина в разбавленной крови не является типичным для ситуации, существующей in vivo. Это даже более важно в случае, когда в крови содержатся патологические ингибиторы (например, при не поддающейся лечению гемофилии или ингибитор красной волчанки). В клинической практике хорошо известно, что ингибиторы коагуляции теряют свой эффект после разбавления in vitro.

[0026] Такие образом, остается проблема, каким образом получить сигнал, по которому можно определить концентрацию тромбина в образце свертывающейся крови, которая разбавлена менее, чем в десять раз. Настоящее изобретение призвано обеспечить решение этой проблемы, что позволит преодолеть по меньшей мере некоторые недостатки существующего уровня техники.

[0027] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что невоспроизводимые и ошибочные результаты, получаемые до настоящего изобретения, имели по меньшей мере две причины: а) седиментация (осаждение), происходящая до образования сгустков крови и b) ретракция (уплотнение) сгустка после того, как произошло его образование (см. фиг.4). Отсюда следует, что объем, от которого получают флюоресценцию, в ходе реакции меняется, как и геометрическая форма поверхности, вызывая неправильное фокусирование и отражение света, которые искажают детектируемый сигнал. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эти явления не возникают при работе с тонким слоем крови, и особенно с тонким слоем на решетке и/или микрогранулах. Геометрическая форма тонкого слоя вместе с указанной решеткой и/или микрогранулами, и в самом деле предотвращает осаждение и уплотнение образца. Тем не менее, реакционный объем остается неизвестным, и, следовательно, его следует определить в ходе измерения. Это делают путем добавления в начале эксперимента известной концентрации флуоресцентной молекулы. Сигнал слабый, и поэтому измерение на большой поверхности при помощи любого известного в данной области устройства успешно увеличивает соотношение сигнал/шум. Кроме того, поскольку при высоком отношении объема к поверхности наблюдают тенденцию испарению образца, предпочтительно принять подходящие меры для предотвращения этого.

[0028] Согласно настоящему изобретению описан способ in vitro определения динамики активности тромбина во времени в образце крови, согласно которому измерение выработки тромбина включает следующие стадии:

- приведение слоя указанного образца в контакт с флюорогенным субстратом тромбина, где толщина указанного слоя составляет от 0.05 до 5 мм, а площадь поверхности составляет от 10 до 500 мм²;

- обеспечение условий для выработки тромбина в указанном образце;

- измерение флюоресценции, испускаемой с поверхности указанного слоя указанной флуоресцентной группой, которую высвобождает флуоресцентный субстрат в результате ферментативного воздействия вырабатываемого тромбина на указанный флюорогенный субстрат.

[0029] Способ определения активности тромбина позволяет измерять изменение концентрации тромбина, которая, согласно схеме коагуляции, зависит от его образования и последующей инактивации.

[0030] Способ согласно настоящему изобретению можно осуществлять на образце крови, таком как образец цельной крови или образец богатой тромбоцитами плазмы.

[0031] Обычно после контакта указанного образца с компонентами, подходящими для инициации выработки тромбина, обеспечивают условия для выработки тромбина в указанном образце. Указанные компоненты могут включать факторы свертывания, такие как тканевой фактор, и, возможно, ионы кальция.

[0032] Пока тромбин вырабатывается и присутствует в реакционной смеси (активный тромбин), он реагирует с флюорогенным субстратом, в результате чего субстрат высвобождает флуоресцентную группу.

[0033] Реакцию организуют таким образом, чтобы флюорогенный субстрат присутствовал на всем протяжении реакции в количествах, достаточно высоких для того, чтобы обеспечить измерение активности тромбина. Например, концентрация субстрата приблизительно равна или выше Km субстрата в отношении тромбина, и благодаря этому расходование субстрата не оказывает существенного влияния на скорость реакции. Преобразование субстрата тромбином приводит к усилению флюоресценции, испускаемой с поверхности исследуемого образца.

[0034] Способ, определенный в настоящем изобретении, обеспечивает выработку тромбина в образце крови, в частности, в образце цельной крови, которая в целом сравнима с выработкой тромбина, которая имеет место в организме. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает надежный способ измерения для применения в исследованиях гемостаза и тромбообразования.

[0035] Измерение увеличения флюоресценции, испускаемой с поверхности исследуемого образца в результате высвобождения флуоресцентной группы субстратом под воздействием тромбина, предпочтительно выполняют при помощи оптического устройства, которое одновременно позволяет освещать большие поверхности, такие как поверхности площадью от 10 до 500 мм², и позволяет детектировать свет, испускаемый такой поверхностью. Длина волны, выбранная для измерения флюоресценции, определяется выбранной флуоресцентной группой. Одну длину волны определяют для возбуждающего света, которым освещают образец для проведения измерений. Другую длину волны определяют для испускаемого света, порождаемого при высвобождении флуоресцентной группы флюорогенные субстратом тромбина. Для измерения флюоресценции подходят оптические устройства, такие как флуоресцентное планшетное считывающее устройство, хорошо известные специалистам в данной области (например, планшетное считывающее устройство Ascent Fluorescent plate reader, Thermolabsystems).

[0036] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, образец, который предстоит анализировать, в частности, образец цельной крови помещают в один или более контейнеров, что позволяет одновременно проводить анализ нескольких образцов. Конструкция таких контейнеров позволяет помещать в них образцы, с учетом определенных условий толщины и поверхности слоя образца, который предстоит анализировать. Например, плоскодонные микропланшеты, содержащие лунки, или контейнер, или подложку, имеющие другую подходящую геометрическую конструкцию, известную специалистам в области, где применяют схожие способы анализа.

[0037] В качестве подложки для образцов можно применять другие устройства, если они удовлетворяют требованию придавать образцам для анализа форму слоя, соответствующего определениям настоящего изобретения. Следовательно, описание способов и средств осуществления настоящего изобретения, сделанное путем ссылки на лунки (микропланшета), содержащие образцы, можно применить к другим устройствам (контейнеру или подложке), содержащим образцы.

[0038] Согласно способам в соответствии с настоящим изобретением, концентрация тромбина на протяжении анализа представляет собой функцию измеренной флюоресценции флуоресцентной группы, высвобождаемой флюорогенным субстратом тромбина. Концентрация тромбина, в частности, пропорциональна увеличению интенсивности появления флюоресценции.

[0039] Соответственно, способ согласно настоящему изобретению позволяет измерять концентрацию тромбина на протяжении всего периода активности тромбина в образце, при условии присутствия соответствующих количеств флюорогенного субстрата.

[0040] Следовательно, динамика активности тромбина, до и после образования сгустка крови, вплоть до пиковых значений концентрации тромбина и также на протяжении снижения концентрации тромбина после достижения пиковых значений в результате инактивации тромбина, представлена посредством измерения кривой зависимости концентрации тромбина от времени. На протяжении различных этапов активности тромбина флюорогенный субстрат реагирует с присутствующим тромбином, в результате чего происходит гидролиз субстрата и высвобождение флюорогенной группы.

[0041] Особенное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что способ позволяет измерять выработку тромбина в образце, в частности в образце цельной крови, которая не разбавлена или разбавлена в минимальной степени, не более, чем в 10 раз, в частности, в 4 раза или менее, чем в 4 раза.

[0042] В конкретном варианте реализации описанного способа толщина слоя образца для анализа, в частности образца цельной крови, составляет от 1 до 3 мм, в частности приблизительно 2 мм или менее.

[0043] В конкретном варианте реализации способа, поверхность образца, в частности образца цельной крови, когда его помещают в лунки микропланшета или любого другого подходящего контейнера или подложки, больше 20 мм², например, от 30 мм² до 200 мм², в частности, больше 100 мм², в особенности, в пределах от 150 до 200 мм².

[0044] В качестве примера, образец переносят в лунки микропланшета, каждая из которых имеет диаметр 15 мм, при толщине слоя образца меньше 2 мм, что позволяет проводить анализ на поверхности приблизительно 175 мм².

[0045] Измерение активности тромбина выполняют способом, который обеспечивает множество точек считывания флюоресценции с поверхности для каждого образца.

[0046] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, в указанном способе используют образец, в частности образец цельной крови, который переносят в лунки планшета, которые также содержат специальную сетку с размером отверстий 50 мкм.

[0047] В качестве альтернативы или дополнения к такой сетке в одном способе реализации настоящего изобретения образец, в частности образец цельной крови, переносят в лунку планшета или другого контейнера или подложки, которая содержит микрогранулы.

[0048] Присутствие указанной решетки и/или микрогранул полезно для распределения крови по лунке и, в частности, для предотвращения уплотнения сгустка при сворачивании крови. Другими словами, присутствие сетки или микрогранул может предотвратить нарушение поверхности сворачивающейся крови, которое приведет к ослаблению сигнала, измеряемого в ходе анализа активности тромбина. Указанная решетка и/или микрогранулы может улучшить подавление эффектов сокращения, которое достигают при помощи большой поверхности измерения. Можно также применять другие средства, дающие указанный эффект.

[0049] В конкретном варианте реализации настоящего изобретения лунки, содержащие образец, в частности образец цельной крови, накрывают, чтобы избежать высыхания крови на протяжении измерения активности тромбина в результате испарения. Накрывать лунки можно обычными материалами, например различными типами тонкой пластиковой пленки, при условии, что они не мешают измерению флюоресценции.

[0050] Измерение активности тромбина в образце крови проводят, начиная с того момента, когда образец переносят в лунки (или любое другое подходящее приспособление, такое как паз) и к указанному образцу добавляют компоненты, необходимые для инициации выработки тромбина, включая тканевый фактор, и до момента исчезновения тромбина в процессе коагуляции.

[0051] В конкретном варианте реализации способа согласно настоящему изобретению, количество флюорогенного субстрата тромбина, которое добавляют к образцу, находится в пределах 50-1000 мкМ. Согласно описанному способу, чтобы узнать концентрацию активного тромбина в абсолютных величинах (т.е. в нМ/л), необходимо знать объем образца крови, в котором осуществляют измерение флюоресценции. Для этого к флюорогенному субстрату тромбина можно добавлять флюорофор в известной концентрации, причем соответствующие соотношения содержания субстрата тромбина к флюорофору лежат в диапазоне от 1% до 10% количества флуоресцентной молекулы, связанной с субстратом тромбина, в частности, в диапазоне от 1% до 5%.

[0052] В конкретном варианте реализации настоящего изобретения указанный флюорофор имеет ту же природу, что и флуоресцентная молекула, которую под действием тромбина высвобождает флюорогенный субстрат.

[0053] В другом варианте реализации указанный флюорофор принадлежит к другому виду молекул, чем флуоресцентная молекула флюорогенного субстрата. В это случае, при измерение флюоресценции учитывают присутствие этого нового вида флюорофора; в частности, измеряют флюоресценцию указанного флюорофора.

[0054] Добавление известной концентрации такого флюорофора обеспечивает внутренний стандарт в анализируемом образце и позволяет оценить объем образца, в котором фактически происходит измерение флюоресценции.

[0055] Для осуществления способа определения выработки тромбина в образце, и, в частности в образце цельной крови, успешно применяют синтетический субстрат тромбина, который состоит из органического реагента, соединенного с флуоресцентной молекулой.

[0056] Синтетический флюорогенный субстрат может представлять собой олигопептид, последовательность которого состоит из 2-30 остатков аминокислот, соединенный с флуоресцентной молекулой.

[0057] Может быть особенно полезно, чтобы флюорогенная группа была связана с концевым остатком лизина или аргинина субстрата, поскольку тромбин преимущественно расщепляет группы, связанные с остатками этих аминокислот.

[0058] Согласно конкретному варианте реализации, применяемая флуоресцентная молекула представляет собой АМС (7-амино-4 метилкумарин) или р-нитроанилид. Синтетические субстраты описаны у Rijkers, D.T., Н.С.Hemker, et al. (1996), Int J Pept Protein Res 48(2): 182-93; Rijkers, D.T., S.J.Wielders, et al. (1995), Thromb Res 79(5-6): 491-9; Wielders, S.M.Mukherjee, et al. (1997), Thromb Haemost 77(4): 629-36.

[0059] Конкретный синтетический флюорогенный субстрат тромбина, подходящий для осуществления настоящего изобретения - Z-Gly-Gly-Arg-AMC (можно приобрести в ВАСНЕМ).

[0060] В конкретном варианте реализации настоящего изобретения лунки (или любое другое подходящее устройство), содержащие образец, могут дополнительно содержать гель, возможно, гель, содержащий ионы кальция, причем указанный гель готовят таким образом, что он не вызывает разбавления указанного образца цельной крови. Можно применять такие гели, как Sefadex или агарозные гели, при условии что они не высушены до такой степени, чтобы позволить жидкости или плазме проникнуть в гель.

[0061] В случае применения геля его можно помещать в лунки до образца цельной крови или вместе с ним.

[0062] Соединения, которые можно добавлять к образцу, чтобы обеспечить выработку тромбина, включают тканевой фактор и ионы кальция, которые добавляют в количествах, обеспечивающих начало коагуляции.

[0063] Указанные количества могут лежать в диапазоне от 0.05 пикоМоль/л до 15 наноМоль/л для тканевого фактора и составлять примерно 10 мМ ионов Са⁺⁺ в случае применения цитратной крови. Очевидно также, что настоящее изобретение также охватывает случай применения нативной крови без антикоагулянтов, в которую необходимо добавлять Са⁺⁺. В качестве альтернативы в некоторых приложениях полезно не добавлять тканевой фактор, чтобы исследовать способность крови к спонтанной коагуляции. Тканевой фактор, если он необходим, добавляют непосредственно перед началом измерения.

[0064] Ионы кальция и/или флюорогенный субстрат можно добавлять либо непосредственно с образцом крови, в частности, в случае применения кальция и флюорогенного субстрата в форме раствора. Тканевой фактор можно также добавлять отдельно от образца крови.

[0065] Измерение проводят сразу после помещения в лунку образца крови и различных соединений.

[0066] В конкретном примере реализации способа согласно настоящему изобретению анализируемая цельная кровь представляет собой цитратную кровь.

[0067] Способ измерения активности тромбина в цельной крови можно с пользой применять для обнаружения или мониторинга гемостатического заболевания или тромботического заболевания, либо для обнаружения или мониторинга возможности появления такого заболевания у пациента.

[0068] Данный способ также обеспечивает обнаружение или мониторинг воздействия определенного вещества (веществ) на активность тромбина в образце цельной крови, причем указанное вещество (вещества) добавляют или в образец, который предстоит анализировать, или в процессе выработке тромбина.

[0069] Вещества, которые можно тестировать способом согласно настоящему изобретению, представляют собой, например, фармацевтические или другие соединения, оказывающие свертывающее действие на кровь, такие как факторы свертывания или препараты-коагулянты, либо факторы - или препараты-антикоагулянты. В частности, способом согласно настоящему изобретению, можно тестировать ингибиторы тромбина.

[0070] В другом аспекте способ согласно настоящему изобретению можно применять для скрининга веществ с целью определения их способности воздействовать на активность тромбина.

[0071] Согласно настоящему изобретению, способ, который был описан выше, и который будет проиллюстрирован при помощи примеров, можно, в частности, применять для измерения потенциала эндогенного тромбина (ПЭТ) образца цельной крови.

[0072] Указанный способ можно также применять для измерения времени достижения пиковой концентрации тромбина или для измерения времени свертывания.

[0073] Указанный способ также полезен для измерения пикового уровня тромбина, вырабатываемого на протяжении анализа.

[0074] Способ согласно настоящему изобретению позволяет измерять так называемую кривую тромбина, которая представляет собой первую производную измеренной флюоресценции, которая является результатом реакции между тромбином и флюорогенным субстратом.

[0075] В конкретном варианте способа согласно настоящему изобретению выполняют этап калибровки такой, как калибровка, описанная в заявке на патент WO 03/093831.

[0076] Способ согласно настоящему изобретению был описан по отношению к биологическому образцу, который представляет собой образец цельной крови. Его можно также применять для анализа образца, представляющего собой богатую тромбоцитами плазму (PRP) или даже бедную тромбоцитами плазму (РРР).

[0077] Настоящее изобретение относится также к набору для осуществления описанного выше способа и приведенных ниже примеров, причем указанный набор содержит

- флюорогенный субстрат тромбина,

- тканевой фактор и ионы кальция для обеспечения выработки тромбина,

- возможно, решетку или микрогранулы, которые предотвращают уплотнение сгустка крови и способствуют распределению цельной крови,

- возможно, гель, возможно, содержащий ионы кальция.

[0078] Набор также может содержать инструкции по применению, чтобы обеспечить конкретное руководство по осуществлению способа согласно настоящему изобретению. Другие свойства настоящего изобретения и его преимущества будут описаны в приведенных ниже примерах и чертежах.

Описание фигур

Фиг.1: Тромбограмма, полученная в эксперименте с частичными пробами. Основные характеристики: Время задержки (=время образования сгустка), высота пика и площадь под кривой (=Потенциал эндогенного тромбина, ПЭТ).

Фиг.2: Пример кривых выработки тромбина, полученный в бедной тромбоцитами плазме путем автоматизированной тромбинографии с калибровкой.

AVK: обработка, удаляющая витамин К; ТМ: тромбомодулин.

Фиг.3: Упрощенная схема образования тромбина. Показаны положительные и отрицательные обратные связи.

Фиг.4: Схематическое изображение влияния осаждения и уплотнения сгустка на флуоресцентный сигнал сворачивающийся цельной крови.

Описание: Большие овалы: Красные клетки крови

Звездчатые кружки: Возбужденные флуоресцентные молекулы

Квадратики: Невозбужденные флуоресцентные молекулы

Верхняя горизонтальная линия (изогнутая на некоторых рисунках): поверхность жидкости

Нижняя горизонтальная линия: прозрачное дно измерительной лунки

Стадия А: Жидкая кровь непосредственно после помещения в лунку. (Фиг.1 t=0)

Стадия В: Жидкая кровь непосредственно перед образованием сгустка. (Фиг.1 t=B)

Стадия С: Кровь непосредственно после образования сгустка. (Фиг.1 t=С)

Стадия D: кровь после начала уплотнение. (Фиг.1 t=D)

Фиг.5: Окуляр Гюйгенса и конденсатор.

Фиг.6: Тонкий слой (3 мм) крови в лунках обычного микротитрационного планшета. Семь идентичных экспериментов.

Фиг.7: Тонкий слой крови в лунках микротитрационного планшета с большой поверхностью. Идентичные эксперименты с 32 точками считывания на лунку.

Фиг.8: Тонкий слой крови в лунках микротитрационного планшета с большой поверхностью с сеткой и крышкой. Одна точка считывания через светособирающее устройство (объектив Гюйгенса) (1) экспериментальная кривая, (2) после коррекции на α2М-тромбин.

Фиг.9: От условных единиц к тромбину.

Фиг.10А: Устройство кассеты с образцом. Показано возможное устройство измерительной кассеты с двумя отделениями. Одну тонкую полоску материала (предпочтительно жесткого, например, стекла) (называемый «слайд»), возможно, покрытую биосовместимым покрытием, разделяют подходящей перегородкой на отделения. Тонкая перегородка может также выполнять функцию электрода для регистрации нанесения образца по падению сопротивления и/или возрастанию электрического тока. Каждое отделение можно покрыть такими веществами, как калибровочный стандарт и/или субстрат (или любым другим необходимым веществом, таким как ингибиторы и тканевой фактор). Второй слайд присоединяют поверх первого слайда. Расстояние между двумя слайдами составляет 5-1000 мкм, предпочтительно 50 мкм.

На кассету можно с одной или двух сторон нанести покрытие, выполняющее функцию дихроического зеркала, усиливающего свет. Это позволяет возбуждающему свету проникать в кассету, одновременно обеспечивая отражение испускаемого света внутри кассеты (см. Фиг.10В), благодаря чему он концентрируется на непокрытой стороне кассеты.

Фиг.11: Альтернативное устройство кассеты. Показан кусок твердой подложки, например, пористого полимера или целлюлозы, помещенный между двумя слайдами. Эта основа может содержать субстрат и/или кальций (или любое другое вещество, такое как тканевой фактор, ингибитор). Эти вещества могут присутствовать вместе с растворителем, в сухой или лиофилизованной форме.

Фиг.12: Показана кривая ВТ, измеренная в тонком слое крови в ячейке из фильтровальной бумаги. Концентрация тромбина переведена в нМ при помощи стандарта калибровки - стафилокоагулазы.

ПРИМЕРЫ

I ИЗМЕРЕНИЕ ВТ В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ: НАБЛЮДАЕМЫЕ ЯВЛЕНИЯ И ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРУДНОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ ВТ.

[0079] В случае применения флюорогенного субстрата, флюоресценцию можно вызывать и измерять только на таком расстоянии, где луч света не пересекает красные клетки крови, т.е. в пространстве плазмы, доступном для возбуждающего света, которое является также пространством, в котором можно наблюдать испускаемый свет. Для простоты мы предполагаем, что красные клетки крови полностью непроницаемы для обоих типов света. Однако, если даже эритроциты до некоторой степени проницаемы, нет необходимости в принципиальном изменении логических рассуждений.

[0080] Сгусток в цельной крови образуется в конце фазы инициации, т.е. в начале быстрого роста выработки тромбина. На Фиг.4 изображены четыре стадии указанного процесса под и над поверхностью крови, образование сгустка в лунке планшета флюориметра в присутствии флюорогенного субстрата и при освещении сверху или, в качестве альтернативы, снизу.

[0081] На стадии А перемешивание крови только что закончилось и красные клетки крови равномерно распределены в жидкой плазме (Фиг.4А). На протяжении времени задержки перед образованием сгустка (обычно 3-12 минут) происходит оседание (седиментация) красных клеток крови; в верхней части для света становится доступным большее количество плазмы, а снизу - меньшее (Фиг.4В). Как только кровь сворачивается (Фиг.4С), появление фибринового сгустка приводит к фиксации status quo, возникшего на стадии В. Благодаря воздействию тромбина на тромбоциты крови, уплотнение начинается, как только образуется сгусток. Осаждение и уплотнение сгустка - явления, происходящие в масштабе мм в час, которые можно наблюдать невооруженным глазом. В масштабах микрометров они происходят на протяжении минут, т.е. в пределах времени, которое занимают эксперименты по ВТ. Уплотнение приводит к неравномерному распределению эритроцитов, а также изменяет поверхность таким образом, что она перестает быть плоской и становится неровной. Эта неровность приводит к неравномерному перераспределению плазмы и образованию сгустка на поверхности и вызывает непредсказуемые оптические эффекты. Неровности поверхности имеют размеры порядка миллиметра и их можно увидеть невооруженным глазом. Таким образом, они имеют тот же порядок величины, что и размер пятна возбуждающего света в обычной флюориметрии.

[0082] Осаждение и уплотнение вызывают изменение объема жидкости, в котором возбуждающий свет может достичь флуоресцентных молекул. Вследствие описанного изменения фактический объем, в котором происходит измерение, является переменным и неизвестным. Следовательно, воспроизводимое измерение количества тромбина по получаемой интенсивности сигнала в таких условиях невозможно, даже если бы можно было пренебречь влиянием осаждения и уплотнение.

[0083] Эксперименты, которые проводили с применением лунок обычного микротитрационного планшета и объема, заполняющего эти лунки до нормальной высоты (6 мм) позволяли получать удовлетворительные результаты только в небольшом проценте лунок. Это объясняется тем фактом, что в обычной флюориметрии достаточный сигнал получают только если освещенное пятно на поверхности (около 4 мм²) совпадает с площадью, на которой можно получить достаточный сигнал благодаря достаточному количеству доступной плазмы, которая находится не над плотным сгустком, а во «впадине» поверхности (см. Фиг.4D). Положительные литературные данные об измерениях, вероятно, являются результатом осторожного выбора полученных данных. В тех случаях, когда получают сигнал правильной формы, количественное измерение тромбина невозможно из-за того, что объем, в котором проводят измерения, неизвестен и меняется. Измерение со стороны дна через прозрачную фольгу решило бы проблему неровностей поверхности, но из-за осаждения эритроцитов сигнал становится настолько низким, что падает ниже уровня шума.

[0084] Было замечено, что при нормальном заполнении лунок 96-луночного планшета современного типа, можно получить поддающийся интерпретации сигнал в 1 или 2 из 10 лунок. Если лунки заполнять до высоты меньше 2 мм, т.е. ниже обычно применяемой высоты, сигнал получают при практически всех измерениях. Тем не менее, сигнал, полученный таким образом на обычном флюориметре очень вариабелен и слаб, т.е. соответствует 1-5% сигнала, получаемого для плазмы, и демонстрирует большое отношение сигнал/шум (Фиг.6). Мы пришли к заключению, что не существует практического способа измерения ВТ в цельной крови с применением оптической системы на основе обычного флюориметра.

II СХЕМА СПОСОБА СОГЛАСНО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

1. Принцип изобретения

[0085] Неожиданно было обнаружено, что (а) влияние осаждения и уплотнения постепенно уменьшается с толщиной слоя свертывающейся крови и, (b) измерение флуоресценции от поверхности, большей чем приблизительно 10 мм², приводит к нивелированию сигнала от оставшихся неровностей поверхности, вызванных уплотнением. Также неожиданным оказалось, что эффекты, вызванные осаждением и уплотнением можно далее снизить путем помещения крови в сложные поверхности или пустоты, такие как решетка фильтра (с отверстиями 50-500 мкм) или компактные сферы (диаметр 50-500 мкм). Соответственно, авторы настоящего изобретения обеспечили условия для получения неискаженного сигнала флюоресценции от продукта активности тромбина путем обеспечения возможности проведения измерения в тонком слое (в частности, меньше 2 мм), распределенного по поверхности, большей, чем приблизительно 10 мм².

[0086] Чтобы решить проблему неизвестного объема, в котором измеряют реакцию, авторы настоящего изобретения дополнительно решили применять не чистый субстрат, а субстрат, который уже содержит фиксированную низкую, но известную и легко поддающуюся измерению концентрацию флуоресцентного продукта.

2. Оптический прибор для измерения

[0087] Проведение измерения на поверхности, превышающей обычную, требует использования оптических устройств, которые позволяют освещать большие поверхности и собирать испускаемый свет с больших поверхностей. Один такой прибор напоминает окуляр Гюйгенса, а другой похож на конденсор микроскопа (Фиг.5). Чтобы усилить сигнал флюоресценции, кровь можно распределить по отражающей поверхности, а такая поверхность может представлять собой составную часть устройства, описанного ниже.

3. Устройство, содержащее образец крови

[0088] Применение устройства, в полостях которого содержится кровь, позволяет симулировать ситуацию, когда кровь наполняет рану, дополнительно можно сделать так, чтобы устройство содержало тканевый фактор, тромбомодулин и/или другие элементы, о которых известно, что они присутствуют в стенке нормального сосуда и влияют на процесс ВТ (например, коллаген). Для сравнения, материал, из которого выполнено устройство, можно выбрать из инертных материалов таких, как, например, нейлон или полипропилен.

[0089] Чтобы предотвратить высыхание поверхности, тонкий слой крови можно накрыть тонкой пленкой твердого или жидкого материала. В качестве альтернативы кровь можно поместить в паз в прозрачном материале, например, под действием капиллярных сил.

4. Измерение

[0090] Преимуществом измерения в тонком слое является то, что флуоресцентный сигнал пропорционален концентрации флуоресцентных молекул, другими словами, отсутствует влияние эффекта внутреннего фильтра. Однако расходование субстрата все же оказывает влияние. Его можно компенсировать тремя путями: (а) Как в хромогенном способе (38), т.е. путем обеспечения субстратов с такими константами кинетики, при которых влиянием расхода субстрата можно пренебречь; (b) путем проведения математической коррекции на расход субстрата, т.е. применения интегрального уравнения скорости; и (с) путем применения стандарта калибровки, как описано в патенте WO 03/093831.

[0091] Динамику концентрации тромбина в сворачивающейся цельной крови определяют по ферментативному действию тромбина на флюорогенный субстрат, добавленный в кровь. Стабильный и достаточный по величине сигнал получили путем измерения в тонком слое (представленный слоем толщиной 2 мм), распределенном по большой поверхности (представленной поверхностью с площадью более 10 мм²). Чтобы измерить фактический объем, в котором происходила реакция, к субстрату добавляли небольшое количество флюорофора. Для освещения всей поверхности необходим специальный оптический прибор, и еще один прибор необходим для детектирования испускаемого света со всей поверхности.

[0092] Можно стабилизировать тонкий слой и предотвратить его высыхание при помощи ряда механических средств, включая инертную решетку и материал, выбранный таким образом, чтобы он имитировал определенные свойства стенки сосудов. В качестве альтернативы можно применять небольшой паз.

[0093] Эту схему можно применять для измерения выработки тромбина в бедной тромбоцитами и богатой тромбоцитами плазме.

5. Реакционная смесь

Реагенты

[0094] Рекомбинантный релипидированный тканевой фактор (rTF), не содержащие полибрена и Са⁺⁺ получали от Dade Behring (Marburg, Germany (Марбург, Германия)). Флюорогенный субстрат, Z-Gly-Gly-Arg-AMC получен из Bachem (Швейцария). После расщепления тромбином он высвобождает флуоресцентный 7-амино-4-метилкумарин (АМС), который измеряют при помощи набора фильтров 390 нм для возбуждения и 460 нм для испускания.

[0095] Свежую смесь флюорогенного субстрата и CaCl₂ (FluCa) для каждого эксперимента готовят следующим образом: к 875 мкл буфера (Hepes 20 мМ, рН 7.35), содержащего 60 г/л БСА (Sigma, A-7030) добавляли 100 мкл 1 М CaCl₂. При 37°С тонкой струйкой вливали 25 мкл 100 мМ раствора флюорогенного субстрата в ДМСО и сразу энергично перемешивали. Полученный в результате прозрачный раствор, который обозначили как FluCa, представляет собой, таким образом, 2.5 мМ раствор флюорогенного субстрата и 100 мМ раствор CaCl₂.

Буфер А содержит 20 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 5 мг/мл БСА, рН=7.35. Буфер В содержит 20 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 60 мг/мл, рН=7.35.

Кровь и плазма

[0096] Кровь получают путем венопункции (1 объем три-натрий цитрата 0.13 М к 9 объемам крови). Следует применять метод свободного потока или минимальную аспирацию, следует избегать вакуумных контейнеров.

[0097] Измерения осуществляют на планшетном флюориметре (Ascent reader, Thermolabsystems OY, Helsinki Finland (Хельсинки, Финляндия)), оборудованным набором фильтров 390/460 (возбуждение/испускание). Вместо обычно 96-луночного планшета, применяют планшет с 24 круглыми лунками диаметром 15 мм и, соответственно, площадью поверхности 175 мм². Лунки подготавливали путем нескольких промывок буфером А и сушки.

[0098] Затем добавляют смесь крови и субстрата, в которой происходит выработка тромбина. Эта смесь содержит 80 мкл цитратной крови на каждую лунку, которую предстоит заполнить.

[0099] 20 мкл Innovin® разбавленного в отношении 1:1000 буфером А, 20 мкл FluCa или, сообразно обстоятельствам, кратное число этих объемов.

[00100] Сразу после добавления FluCa смесь перемешивают на мешалке Vortex и добавляют в лунки. Планшет вставляют во флюориметр, встряхивают в течение 10 с при 1200 об/мин и затем проводят измерения каждые 2 минуты в течение часа на длине волны 390/460 на при 37°С.

[00101] В каждую лунку добавляют 120 мкл смеси.

Пример 1

Множественные точки считывания, добавление сетки и крышки.

[00102] Выработку тромбина запускали, как указано выше, в трех лунках. В каждой лунке одно за другим освещали и измеряли 24 пятна. Результаты показаны на Фиг.7. Видно, что добавление решетки, в данном случае нейлонового фильтра с размером отверстий 600 мкм, с 51% открытой площади и толщиной 445 мкм (Spectrum Laboratories Inc. Rancho Dominguez California, USA (Калифорния, США)), усиливает и стабилизирует сигнал. Однако имеет место кажущееся возрастание сигнала из-за выпаривания и концентрирования верхнего слоя. Это предотвращают путем накрывания пластиковой пленкой (Thermosprint optical clean sealing tape for QPCR (Bilatec AG, Mannheim, Germany).

Пример 2.

Множественные точки считывания, добавление геля и крышки.

[00103] Выработку тромбина запускали, как указано выше, в трех лунках. В каждой лунке одно за другим освещали и измеряли 24 пятна. Складывали сигналы от 24 точек при каждом считывании. В две лунки добавляли 700 мкл 50% (об./об.) Spehadex-25 в 150 мМ растворе NaCl и в течение 5 минут позволяют порошку осесть. Пипеткой удаляют надосадочную жидкость (300-400 мкл) из лунок.

[00104] Затем добавляют 120 мкл смеси свертывающейся крови. Поверх одной из этих двух лунок наносили пластиковую пленку (Thermosprint оптически прозрачная самоклеющаяся лента для количественной ПЦР (Bilatec AG, Mannheim, Germany (Манхайм, Германия)). Результаты сравнимы с показанными на Фиг.7.

Пример 3

Сбор света оптически прибором

[00105] Для этого эксперимента измерение в одной лунке, с решеткой и крышкой, как описано в примере 1, проводили с помощью флюориметра Fluostar optima (BMG Labtech, Offenburg, Germany (Оффенбург, Германия)). Свет от образца собирали в окуляр Гюйгенса (10х увеличение) и регистрировали после прохождения через оптическое устройство. Результаты показаны на Фиг.8.

Пример 4

От относительных единиц к тромбину

[00106] Этот эксперимент проводили практически так же, как описанный в примере 1 с сеткой и крышкой, но с добавлением известного количества (10 нМ) АМС к субстрату Z-Gly-Gly-Arg-AMC. Вследствие оседания эритроцитов имеет место увеличение объема, в котором проводят измерение, поэтому сигнал от присутствующего АМС растет. В момент коагуляции происходит «фиксация» ситуации и оседание прекращается. В этот момент, который определяют по неожиданному возрастанию сигнала, мы измеряем количество флюоресценции, порожденной после добавления 10 нМ АМС. Это позволило перевести единицы флюоресценции (F) в концентрацию АМС. Таким образом, измеренную dF/dt можно перевести в d[AMC]/dt. Из независимого эксперимента известно, какая d[AMC]/dt соответствует какой концентрации. Таким образом, скорость изменения флюоресценции (Фиг.9, черная линия) можно перевести в концентрацию тромбина в образце.

Пример 5

Устройство, содержащее образец крови

Ячейку из фильтровальной бумаги, содержащую субстрат и ионы Са²⁺, подготавливали путем добавления 50 мкл 100 мМ раствора флюорогенного субстрата в ДМСО и 100 мкл 1 М раствора CaCl₂ к 5850 мкл этанола. 11 мкл этого раствора распределяют по полосе твердой основы (1 мм бумага для хроматографии Whatman 1MM) размером 7×9 мм и сушат в атмосфере азота. Затем ее кладут на кусочек пластика и покрывают другим кусочком пластика (оптически прозрачная самоклеющаяся пленка для количественной ПЦР Thermosprint, Bilatec AG, Mannheim, Germany (Маннхайм, Германия)), как показано на Фиг.11.

Аналогичную процедуру применяли для подготовки ячейки из фильтровальной бумаги, только содержащей субстрат. В этом случае 50 мкл 100 мМ раствора флюорогенного субстрата в ДМСО добавляли к 5950 мкл этанола, распределяли 11 мкл этого раствора по кусочку твердой подложки и сушили в атмосфере азота.

Множественные точки считывания, применение ячейки из фильтровальной бумаги.

Незадолго до проведения эксперимента готовили две ячейки из фильтровальной бумаги: одну, содержащую флюорогенный субстрат и ионы кальция (А) и одну, содержащую только субстрат (В), как описано выше.

Готовили смесь 4:1:1 цитратной крови, буфера В и Innovin® (разбавленный 1:1000 в буфере А). В качестве калибровочного стандарта путем смешивания крови и ингибитора полимеризации готовили смесь 4:1:1 цитратной крови, ингибитора полимеризации (H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH·AcOH) (Bachem feinchemikalien AG, Bubendorf, Switserland (Бубундорф, Швейцария)) в буфере В (1.0 mM) и 20 мкМ стафилокоагулазы. Непосредственно перед началом эксперимента добавляли стафилокоагулазу и хорошо перемешивали образец.

Сразу после добавления стафилокоагулазы начинали эксперимент путем добавления 11 мкл образца ТВ в ячейку А и 11 мкл калибровочного стандарта в ячейку В. Для этого пипеткой наносят капли вблизи твердой подложки таким образом, чтобы капли касались подложки (см. Фиг.11) и всасывались внутрь под действием капиллярных сил. В каждой ячейке поочередно освещали и измеряли 4 пятна.

Сигнал от калибровочного стандарта представляет собой прямую линию, наклон которой используют для перевода величины сигнала от ячейки с образцом в наноМоли тромбина. Этот стандартный способ калибровки сигнала известен в данной области как «не непрерывная калибровка», согласно заявке на патент РСТ/ЕР 03/04705. Результаты показаны 12.

Claims (29)

1. Способ in vitro определения активности тромбина в образце, причем образец представляет собой образец крови, а измерение выработки тромбина включает следующие стадии:
- приведение слоя указанного образца в контакт с флюорогенным субстратом тромбина, при этом толщина указанного слоя составляет от 0,05 до 5 мм, а площадь поверхности составляет от 10 до 500 мм²;
- обеспечение условий для выработки тромбина в указанном образце;
- измерение флюоресценции, испускаемой с поверхности указанного слоя флюоресцентной группой, которую высвобождает флюорогенный субстрат в результате ферментативного воздействия вырабатываемого тромбина на указанный флюорогенный субстрат.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию тромбина, выработанного в ходе анализа, определяют как функцию измеренной флюоресценции от высвобождаемой флуоресцентной группы.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный образец цельной крови разбавляют в пределах до максимум 10 раз.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что толщина слоя указанного образца составляет примерно 2 мм или меньше.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное приведение образца крови в контакт с флюорогенным субстратом тромбина и/или измерение флюоресценции осуществляют в лунке планшета, которая содержит решетку с размером отверстий от 50 до 500 мкм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное приведение образца крови в контакт с флюорогенным субстратом тромбина и/или измерение флюоресценции осуществляют в лунке планшета, которая содержит микрогранулы.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что при определении активности тромбина лунку, содержащую образец крови, накрывают сверху.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что к флюорогенному субстрату тромбина добавляют флуорофор, причем относительная доля добавленного флюорофора составляет от 1 до 10% количества флуоресцентной молекулы, связанной с субстратом тромбина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что количество субстрата тромбина, добавляемого к образцу, составляет от 50 до 1000 мкМ.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что флюорогенный субстрат представляет собой синтетический субстрат тромбина, соединенный с флуоресцентной молекулой.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный субстрат тромбина селективно гидролизуется тромбином и обладает умеренной аффинностью связывания с тромбином и низкой кинетической константой.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что флюорогенный субстрат представляет собой олигопептид, последовательность которого содержит из 2-30 остатков аминокислот, и который соединен с флуоресцентной молекулой.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный олигопептид на своем конце содержит лизин или аргинин для соединения с флуоресцентной молекулой.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная флуоресцентная молекула представляет собой АМС (7-амино-4-метилкумарин).

15. Способ согласно любому из пп.1 2, 4-14, отличающийся тем, что указанная лунка дополнительно содержит гель, возможно, содержащий ионы кальция, причем указанный гель не вызывает разбавления крови образца.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что тканевой фактор и ионы кальция добавляют образцу крови в количествах, обеспечивающих возможность выработки тромбина.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный образец крови представляет собой образец цельной крови.

18. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный образец крови представляет собой образец плазмы, в частности, богатой тромбоцитами плазмы (PRP).

19. Способ согласно п.17, отличающийся тем, что указанный образец цельной крови представляет собой кровь, обработанную цитратом.

20. Способ по любому из пп.1-2, 4-14, 16-19, согласно которому по определяемой активности тромбина в образце судят о наличии или проводят мониторинг гомеостатического или тромботического заболевания.

21. Способ согласно п.20, согласно которому добавляют в анализируемый образец или в образец на стадии выработки тромбина некоторое вещество (вещества), при этом по определяемой активности тромбина судят о наличии воздействия или проводят мониторинг воздействия указанного вещества (веществ) активность тромбина в образце цельной крови.

22. Способ по п.20, согласно которому по определяемой активности тромбина в образце проводят мониторинг воздействия факторов свертывания крови или препаратов-коагулянтов.

23. Способ по п.20, согласно которому на основании определяемой активности тромбина в образце проводят скрининг веществ с целью определить их способность воздействовать на выработку тромбина.

24. Способ по п.20, который применяют для измерения Потенциала Эндогенного Тромбина (ПЭТ) в образце цельной крови.

25. Способ по п.21, который применяют для измерения времени достижения пиковой концентрации тромбина.

26. Способ по п.22, который применяют для измерения времени образования сгустка крови.

27. Способ по п.23, который применяют для измерения уровня пиковой концентрации выработанного тромбина.

28. Способ по п.24, который включает стадию калибровки.

29. Набор для осуществления способа согласно любому из пп.1-28, который содержит:
- флуорогенный субстрат тромбина,
- тканевой фактор и ионы кальция для обеспечения выработки тромбина,
- возможно, решетку или микрогранулы, которые предотвращают уплотнение сгустка крови и способствуют диспергированию цельной крови,
- возможно, гель, возможно, содержащий ионы кальция.

Images