KR101300320B1 - 절대 혈소판 응집률을 측정하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

단일 혈액 샘플을 이용하여 항혈소판제로부터 야기되는 혈소판 응집률 또는 혈소판 억제율을 입수하는 방법이 달성된다. 분석 장치가 제공된다. 분석 장치는 여러 개의 채널들을 가지며, 이들 각각은 공통의 도입 포트에 커플링되어 있다. 제1 혈소판 활성물질은 항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응한다. 제2 혈소판 활성물질은 항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응하지 않는다. 항응고된 샘플은 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입된다. 혈소판 응집 수준은 양 채널에서 동시에 측정된다.
혈소판 응집률, 혈소판 억제율, 항혈소판 약물

Description

절대 혈소판 응집률을 측정하기 위한 방법 및 시스템 {METHOD AND SYSTEM FOR ABSOLUTE PLATELET PERCENT AGGREGATION DETERMINATION}
본 발명은 일반적으로, 혈소판 억제율을 측정하기 위한 방법 및 장치, 보다 특히는, 다양한 혈소판 활성화 경로를 억제하는 약물로 처리하였을 때의 혈소판 억제율을 측정하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
포유동물 생리학에 있어서 혈소판의 역할은 엄청나게 다양하지만, 그의 주된 역할은 지혈을 촉진하는 것에 있다. 많은 경우들에 있어서, 혈액이 응고하는 능력을 평가하는 것이 필요하며, 이는 흔히 혈소판이 부착하고/하거나 응집하는 능력에 의해 조절되는 파라미터이다. 그러므로, 혈소판의 부착 기능을 평가하는 것은 관심있는 부분이다. 예를 들어, 관심있는 문제에는 응고물 형성을 차단하는 약물을 투여할지 촉진하는 약물을 투여할지, 또는 수술 절차 전에 혈소판 기능 결핍을 탐지할지가 포함된다. 신약으로서 시험되고 있거나 환자에게 승인된 임상적 치료제로서 사용되고 있는 혈소판 억제제의 효능을 평가하는 것 또한 관심있는 부분이다.
혈소판은 정상적인 지혈을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다. 손상된 혈관에 노출되는 경우, 혈소판은 노출된 내피하 매트릭스에 부착할 것이다. 초기 부착 후, 손상 부위에서 방출되거나 생성되는 다양한 인자들, 예를 들어 트롬빈, ADP 및 콜라겐이 혈소판을 활성화시킨다. 혈소판이 활성화되면, 혈소판 당당백질인 GPIIb/IIIa 수용체가 형태 변화를 일으켜, 피브리노겐 및/또는 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자와 결합할 수 있게 된다. 인접 혈소판 상에서의 GPII/IIIa 수용체에 의한 다가의 피브리노겐 및/또는 폰 빌레브란트 인자 분자의 이러한 결합은 손상 부위로 추가의 혈소판들을 불러모으고, 이들의 응집을 야기하여 지혈 플러그 또는 혈전을 형성하게 한다.
혈소판 응집은 혈소판들이 서로 결합하는 것을 표현하기 위해 사용되는 용어이다. 시험관 내 혈소판 응집측정은 혈소판이 체내에서 응집체를 형성하여 일차 지혈 플러그를 만드는 능력을 측정하기 위해 실험실에서 사용되는 방법이다. 이 기법에서는 항응고된 전혈 샘플을 다중 조건 하에서 원심분리하여, 다혈소판 혈장(PRP)와 빈혈소판 혈장(PPP) 샘플을 형성한다. 그리고 나서, ADP 또는 콜라겐과 같은 응집 물질을 PRP에 첨가하고, 혈소판의 응집을 광학적으로 모니터링하면서, 이와 평행하게 PPP 샘플을 이용하여 별도의 광학 측정을 수행한다. 그 후, PPP 채널을 PRP채널에 비해 100% 기준 응집 수준으로 사용하여 응집률을 측정한다. 혈액을 원심분리하면 적혈구 세포의 용혈을 야기할 수 있기 때문에, 수득과정의 가변성에 기인한 PPP의 광학 밀도의 변화는 응집률을 계산하는데 사용되는 기준 광학 수준에 있어서 오차를 야기할 수 있다.
생체 내 혈소판 응집 능력을 측정하기 위해 실험실에서 사용되는 다른 시험관내 혈소판 응집측정 방법은 희석된 전혈을 사용하여, ADP 또는 콜라겐과 같은 응집 물질을 첨가한 후에 혈소판이 부착하고 응집함에 따라, 2개의 가깝게 위치한 귀 금속 전극 사이의 전기적 임피던스의 변화를 측정하는 것이다. 이 방법을 이용하면, 혈소판 응집률을 측정하는데 단일 측정 수단을 사용할 수 없다. 대신, 2개의 분리된 측정이 수행되어야 하고, 두 측정 사이의 비가 응집률을 결정하는데 고려되어야 한다. 환자가 이미 혈소판 억제 약물을 투여받은 경우, 혈소판 응집 비율을 측정할 방법이 없다. 현재의 혈소판 응집을 측정하는 분석법은 고비용이고, 시간이 많이 들며, 번거롭고, 일반적으로 임상 환경에 적합하지 않다.
고속 혈소판 기능 분석법이 최근에 개발되었으며, 미국 특허 No. 5,763,199에 설명되어 있다. 이 분석법은 비희석된 전혈 중 당단백질 (GP)IIb/IIIa 수용체 차단을 측정한다. GPIIb/IIIa 리간드, 예를 들어 피브리노겐으로 코팅된 작은 중합체 비드들을 차단되지 않은 활성화된 GPIIb/IIIa 수용체를 갖는 혈소판을 함유하는 전혈과 접촉시키면, 상기 비드들의 유착(agglutination)이 야기된다. 유착 실패는 GPIIb/IIIa 수용체가 활성화되지 못했고/거나 GPIIa/IIIa 수용체가 차단된 것을 나타낸다. 바람직한 실시태양에서, ADP 또는 아라키돈산과 같은 혈소판 활성물질을 첨가하면, 활성화 수용체가 차단되지 않을 경우 간편하고 알려진 시간 동안 작은 중합체 비드들의 유착을 야기하는, 병상에서 수행되기에 충분히 빠르고 간편한 분석법을 수행할 수 있다. 상기 분석법은 수집 용기를 개방하지 않고 시험될 혈액을 수집 용기로부터 분석 장치로 옮기는 능력을 포함한다.
혈소판 응집은 혈전증 및 급성 심장 동맥 질환의 발병과정에서 핵심적인 역할을 담당한다. 증거들은, 다양한 항혈소판제에 대한 반응으로 중요한 혈소판 기능의 가변성이 존재한다는 것을 시사한다. 또한, 클로피도그렐과 같은 P2Y12 길항 제가 항응집 효과를 달성하기 위해 환자 치료에 사용되는 경우 혈소판 응집에 있어서 개체간 다양성이 존재한다는 것이 보여졌다. 한 연구 결과는 약물을 받은 환자 중 10% 이상이 기대하는 혈소판 응집 억제를 달성하지 못했다는 것을 보여준다(문헌 [Muller I, Besta F, Schulz C, Massberg S, Schonig A, Gawaz M; Prevalence of clopidogrel non-responders among patients with stable angina pectoris scheduled for elective coronary stent placemen Thromb Haemost. 2003 May, 89(5):783-7]).
심혈관 질환을 갖는 많은 환자들이 지속적으로 티에노피리딘 약제들 중 하나를 섭취하고 있기 때문에, 억제된 샘플의 단일 측정에 기초한 혈소판 억제 수준을 측정하는 방법은 유익할 것이다. 뿐만 아니라, PTCA 절차를 수행하고 있는 환자는 일반적으로 절차 전에 많은 일시 투여량의 티에노피리딘 약제를 투여받는다. 이러한 환자들 중 일부는 그 후, 긴급 수술을 필요로 할 수 있으며, 그들의 절대 혈소판 억제 수준에 관한 정보를 제공하는 분석법은 수술 전에 출혈 관리 위험을 평가하는데 유익할 것이다.
항혈소판 약물로 인한 혈소판 응집률 또는 억제율을 입수하기 위한 개선된 방법에 대한 필요가 존재한다. 나아가, 단일 혈액 샘플을 사용하여, 항혈소판 약물로 인한 혈소판의 응집률 또는 억제율을 입수하기 위한 방법에 대한 필요가 존재한다. 또한 추가로, 단일 측정으로 항혈소판 약물로 인한 혈소판의 응집률 또는 억제율을 입수하기 위한 방법에 대한 필요가 존재한다.
<발명의 요약>
따라서, 본 발명의 목적은 항혈소판 약물로 인한 혈소판의 응집률 또는 억제율을 측정하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단일 혈액 샘플을 사용하여, 항혈소판 약물로 인한 혈소판의 응집률 또는 억제율을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 단일 측정으로, 항혈소판 약물로 인한 혈소판의 응집률 또는 억제율을 입수하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적들은 단일 혈액 샘플을 이용하여, 항혈소판 약물, 예를 들어(비제한적임) 아스피린, 티에노피리딘, 실로스타졸 등으로부터 야기되는 혈소판의 응집률 또는 억제율을 입수하는 방법을 통해 달성된다. 분석 장치가 제공된다. 분석 장치는 여러개의 채널을 가지며, 이들 각각은 공통의 도입 포트에 커플링되어 있다. 제1 혈소판 활성물질이 분석 장치의 제1 채널로 도입된다. 제1 혈소판 활성물질은 항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응한다. 제2 혈소판 활성물질은 분석 장치의 제2 채널로 도입된다. 제2 혈소판 활성물질은 항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응하지 않는다. 항응고된 샘플은 제1 채널 및 제2 채널로 동시에 도입된다. 혈소판 응집 수준은 양 채널 모두에서 동시에 측정된다. 예를 들어(비제한적임), 혈소판 응집 수준은 광학적 탁도측정법에 의해 결정될 수 있다. 혈소판 응집률(PA) 또는 혈소판 억제율(PI)은 하기와 같이 결정된다:
%PA = (시험 채널/대조군 채널) * 100%
%PI = (1 - (시험 채널/대조군 채널)) * 100% = 100% - %PA
도 1은 다수의 혼합 챔버/검출 웰, 스테이징(staging) 웰, 샘플 웰 및 보호 덮개(sheath)를 갖는, 본 발명에 사용될 수 있는 분석 장치의 도면이다.
본 발명의 한 가지 실시태양에서, 항혈소판 약물로 인한 혈소판의 응집률 또는 억제율은 단일 혈액 샘플을 사용하여 측정된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 일반적으로 (10)으로 표시되는 분석 장치가 제공된다. 분석 장치 (10)은 다수의 혼합 챔버/검출 벽 (12), 스테이징 웰 (14), 샘플 웰 (16) 및 보호 덮개 (18)을 포함한다. 분석 장치는 혈액 샘플을 독립적이고 동시적으로 분석하는데 사용된다. 카트리지가 제공된다.
카트리지는 여러개의 채널들을 가지며, 이들 각각은 공통의 도입 포트에 커플링되어 있다. 제1 혈소판 활성물질이 제1 채널 내로 도입된다. 제1 혈소판 활성물질은 항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응한다. 적합한 제1 혈소판 활성물질에는 아라키돈산, ADP, 콜라겐, 트롬복산 A2, 에피네프린 등이 포함되지만, 이들에 한정되지는 않는다. 제2 혈소판 활성물질은 카트리지의 제2 채널 내로 도입된다. 제2 혈소판 활성물질은 항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응하지 않는다. 적합한 제2 혈소판 활성물질에는 트롬빈, 이소-TRAP 등이 포함되지만, 이들에 한정되지는 않는다.
항응고된 샘플은 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입된다. 혈소판 응집 수준은 양 채널 모두에서 동시에 측정된다. 예를 들어(비제한적임), 혈소판 응집 수준은 광학적 탁도측정법에 의해 측정될 수 있다.
혈소판 응집률(PA) 또는 억제율(PI)는 하기와 같다:
% PA = (시험 채널/대조군 채널) * 100%
%PI = (1 - (시험 채널/대조군 채널)) * 100% = 100% - %PA
비교는 분석 장치 (10)에서 이루어진다.
한 가지 구체적인 실시태양에서, 분석 장치 (10)은 유착에 의한 광학 신호의 변화를 측정하는 기기이다. 적합한 기기에는, 예를 들어 키네틱 분광광도계인 울테그라 시스템(Ultegra System)® 기기(캘리포니아주 샌디에고에 소재한 아큐메트릭스(Accumetrics)로부터 상업적으로 입수가능함, 정상 샘플에 대한 고속 혈소판 기능 활성 측정에 사용됨) 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
울테그라? 시스템 기기는 광 투과율이 증가함에 따라 혈소판 유도된 응집을 측정하는, 탁도측정에 기초한 광학 탐지 시스템이다. 이 시스템은 분석기, 일회용 카트리지 및 컨트롤로 이루어져 있다. 카트리지는 미세입자 유착 기술에 기초한 시약들을 함유한다. 품질 관리 시스템은 전자적 컨트롤, 두 수준의 분석된 "웨트(wet)" 컨트롤(WQC), 카트리지 내의 습도 센서, 패키징되어 있는 온도 표시계, 및 2개의 분석 채널의 동시 작용 시험을 포함한다. 분석기는 분석 순서를 제어하고, 분석 온도를 정하고, 요구되는 기간 동안 시약-샘플 혼합을 제어하고, 혈소판 기능의 정도를 측정하고, 결과를 보여주고, 자가 진단을 수행한다.
본 발명의 한 가지 구체적인 실시태양에서, 카트리지는 공유적으로 결합된 GPIIa/IIIa 수용체 리간드, AA와 아스코르브산의 조성물, 및 완충액이 있는 입자들을 포함하는 동결건조된 제제를 포함한다. 환자의 샘플은 시트레이트화된 전혈일 수 있으며, 이는 혈액 수집 튜브로부터 카트리지 내로 분석기에 의해 자동적으로 분배되며, 사용자는 혈액을 조작할 필요가 없다. 입자의 적외선 흡광 특성에 의해 상호작용이 모니터링된다. 입자들이 혈소판과 상호작용함에 따라, 입자들의 유착이 울테그라™ 분석기의 광학 시스템을 통해 측정된다. 유착은 샘플을 통해 적외광의 투과가 증가함에 따라 탐지된다. 반응 속도론이 분석되고, "아스피린 반응 유닛(Aspirin Response Units)"인 ARU로 변환된다.
단리된 시약들은 카트리지의 개별 채널 내에 존재한다. 하지만, 양 채널 내로의 샘플의 공통 도입부가 존재한다. 분석 장치 (10)은 혈액 샘플의 도입, 시약과 혈액 샘플의 혼합, 각 활성 채널에 있어서 응집의 독립적인 광학적 측정, 및 개개의 채널 결과들에 기초한 %PI의 측정을 제어한다.
본 발명은 약물에 의해 유도되어 혈소판이 억제된 환자를 측정할 때에도 환자의 비억제된 수준에 비해 혈소판 억제 수준을 측정하는 단일 분석법을 제공한다.
실시예 1
혈소판 수용체 차단을 측정하기 위한 혈액 분석
혈액을 주사기로 환자로부터 채혈하고, 시트르산나트륨을 함유하는(3.8% 시트르산나트륨 1 부피) 표준 청색 뚜껑 튜브에 위치시켰다. 다르게는, 혈액을 진공채혈관(vacutainer)에 의해 청색 뚜껑 튜브 내로 직접 채혈할 수 있다.
그 후, 튜브를 뒤집어 항응고제와 전혈을 혼합시켰다. 그 후, 50 ㎕의 이 혼합물을 50 ㎕의 완충액(0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.05 M HEPES, pH 7.4)에 첨가하여 5 ㎕로 만들었다. 항응고된 샘플을 카트리지의 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입시켰다.
GPIIb/IIIa 수용체가 차단된다면, 비드는 현탁된 채로 남아있는다. GPIIb/IIIa 수용체가 차단되지 않는다면, 혈소판은 비드의 표면에 결합된 피브리노겐과 상호작용하여, 비드들을 덩어리지게 한다. 혈소판 응집 수준을 분석 장치 (10)에 의해 양 채널 모두에서 동시에 측정하였다.
실시예 2
혈소판 수용체 차단을 측정하기 위한 혈액 분석
혈액을 주사기로 환자로부터 채혈하고, 시트르산나트륨을 함유하는(3.8% 시트르산나트륨 1 부피) 표준 청색 뚜껑 튜브에 위치시켰다. 다르게는, 혈액을 진공채혈관에 의해 청색 뚜껑 튜브 내로 직접 채혈할 수 있다.
혈액 샘플을 카트리지의 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입시켰다. 분석 장치 (10)은 혈액 샘플의 도입, 시약과 혈액 샘플의 혼합, 각 활성 채널에 있어서 응집의 독립적인 광학적 측정, 및 개개의 채널 결과들에 기초한 %PI의 측정을 제어하였다.
제1 혈소판 활성물질인 아라키돈산을 제1 채널에 두었다. 제2 혈소판 활성물질인 트롬빈을 카트리지의 제2 채널 내로 도입시켰다. 혈소판 응집 수준을 분석 장치 (10)에 의해 양 채널 모두에서 동시에 측정하였다.
실시예 3
혈소판 수용체 차단을 측정하기 위한 혈액 분석
혈액을 주사기로 환자로부터 채혈하고, 시트르산나트륨을 함유하는(3.8% 시트르산나트륨 1 부피) 표준 청색 뚜껑 튜브에 위치시켰다. 다르게는, 혈액을 진공채혈관에 의해 청색 뚜껑 튜브 내로 직접 채혈할 수 있다.
혈액 샘플을 카트리지의 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입시켰다. 분석 장치 (10)은 혈액 샘플의 도입, 시약과 혈액 샘플의 혼합, 각 활성 채널에 있어서 응집의 독립적인 광학적 측정, 및 개개의 채널 결과들에 기초한 %PI의 측정을 제어하였다.
제1 혈소판 활성물질인 ADP를 제1 채널에 두었다. 제2 혈소판 활성물질인 이소-TRAP를 카트리지의 제2 채널에 두었다. 혈소판 응집 수준을 분석 장치 (10)에 의해 양 채널 모두에서 동시에 측정하였다.
실시예 4
혈소판 수용체 차단을 측정하기 위한 혈액 분석
혈액을 주사기로 환자로부터 채혈하고, 시트르산나트륨을 함유하는(3.8% 시트르산나트륨 1 부피) 표준 청색 뚜껑 튜브에 위치시켰다. 다르게는, 혈액을 진공채혈관에 의해 청색 뚜껑 튜브 내로 직접 채혈할 수 있다.
혈액 샘플을 카트리지의 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입시켰다. 분석 장치 (10)은 혈액 샘플의 도입, 시약과 혈액 샘플의 혼합, 각 활성 채널에 있어서 응집의 독립적인 광학적 측정, 및 개개의 채널 결과들에 기초한 %PI의 측정을 제어하였다.
제1 혈소판 활성물질인 트롬복산 A2를 제1 채널에 두었다. 제2 혈소판 활성물질인 트롬빈을 제2 채널에 두었다. 혈소판 응집 수준을 분석 장치 (10)에 의해 양 채널 모두에서 동시에 측정하였다.
실시예 5
혈소판 수용체 차단을 측정하기 위한 혈액 분석
혈액을 주사기로 환자로부터 채혈하고, 시트르산나트륨을 함유하는(3.8% 시트르산나트륨 1 부피) 표준 청색 뚜껑 튜브에 위치시켰다. 다르게는, 혈액을 진공채혈관에 의해 청색 뚜껑 튜브 내로 직접 채혈할 수 있다.
혈액 샘플을 카트리지의 제1 채널 및 제2 채널에 동시에 도입시켰다. 분석 장치 (10)은 혈액 샘플의 도입, 시약과 혈액 샘플의 혼합, 각 활성 채널에 있어서 응집의 독립적인 광학적 측정, 및 개개의 채널 결과들에 기초한 %PI의 측정을 제어하였다.
제1 혈소판 활성물질인 에피네프린을 제1 채널에 두었다. 제2 혈소판 활성물질인 이소-TRAP을 제2 채널 내에 두었다. 혈소판 응집 수준을 분석 장치 (10)에 의해 양 채널 모두에서 동시에 측정하였다.
본 발명의 실시태양들의 상기 설명은 예시적이고 설명적인 목적으로 제시되었다. 본 발명을 개시된 정확한 형태들로 소진시키거나 제한하고자 의도된 것이 아니다. 분명하게, 많은 변경법 및 변형법들이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 범위는 하기 청구항 및 그의 동등물들에 의해 정의되는 것으로 의도된 것이다.

Claims (8)

  1. 항혈소판 약물로 치료되는 개체로부터 얻어진 항응고된 혈액 샘플을 제공하는 단계;
    제1 채널 (시험 채널) 및 제2 채널 (대조군 채널)을 갖는 분석 장치를 제공하는 단계;
    항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응하는 제1 혈소판 활성물질을 분석 장치의 제1 채널 (시험 채널)로 도입시키는 단계;
    항혈소판 약물에 의해 표적화된 활성화 경로에 반응하지 않는 제2 혈소판 활성물질을 분석 장치의 제2 채널 (대조군 채널)로 도입시키는 단계;
    상기 항응고된 샘플을 분석 장치로 도입시키는 단계;
    양 채널 모두에서 혈소판 응집 수준을 동시에 측정하는 단계; 및
    혈소판 응집률(PA) 또는 혈소판 억제율(PI)을 하기와 같이 측정하는 단계
    를 포함하는, 혈소판 응집률 또는 억제율의 입수 방법.
    %PA = (시험 채널/대조군 채널) * 100%
    %PI = (1 - (시험 채널/대조군 채널)) * 100% = 100% - %PA
  2. 제1항에 있어서, 제1 혈소판 활성물질이 아라키돈산, ADP, 콜라겐, 트롬복산 A2 및 에피네프린으로부터 선택되는 것인 입수 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제2 혈소판 활성물질이 트롬빈 및 이소-트롬빈 수용체 활성화 펩티드 (iso-TRAP)으로부터 선택되는 것인 입수 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항응고된 혈액 샘플이 비희석된 전혈 및 희석된 전혈로부터 선택되는 것인 입수 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항응고된 혈액 샘플, 제1 혈소판 활성물질 및 제2 혈소판 활성물질을 공통의 도입 포트를 통해 분석 장치에 도입하는 것인 입수 방법.
  6. 제1항에 있어서, 항혈소판 약물이 티에노피리딘인 입수 방법.
  7. 제1항에 있어서, 항혈소판 약물이 아스피린 또는 실로스타졸인 입수 방법.
  8. 제6항에 있어서, 제1 혈소판 활성물질이 ADP이고, 제2 혈소판 활성물질이 iso-TRAP인 입수 방법.
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