CN101166832A

CN101166832A - 用于确定绝对血小板凝聚百分比的方法和系统

Info

Publication number: CN101166832A
Application number: CNA2006800145517A
Authority: CN
Inventors: 莉萨·斯威姆; 丹尼斯·德宾
Original assignee: Accumetrics Inc
Current assignee: Accumetrics Inc
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2008-04-23

Abstract

本发明实现了一种方法，其用单个血液样品获得由抗血小板导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。提供了一种测定设备。该测定设备具有多个通道，每一个通道均与一个共用的引入口偶连。第一血小板活化剂对抗血小板药物靶向的活化途径敏感。第二血小板活化剂对抗血小板药物靶向的活化途径不敏感。向第一和第二通道同时引入抗凝样品。在两个通道内同时获得血小板凝聚水平。

Description

用于确定绝对血小板凝聚百分比的方法和系统

发明领域：

本发明大体上涉及用于确定血小板抑制百分比的方法和设备，更具体地，涉及在用抑制血小板各种活化途径的药物进行处理时用于测定血小板抑制百分比的方法和设备。

背景技术：

血小板在哺乳动物生理上的作用是非常多样的，但是它们的主要作用是止血。在许多情况下，希望评估血液凝结的能力，这是一个经常受血小板粘附和/或凝聚的能力控制的参数。因此，人们关心的是评估血小板的粘附功能。例如，感兴趣的问题包括是否施用阻止或促进凝块形成的药物，或者是否在外科手术进行之前检测血小板的功能缺陷。同样感兴趣的是评估被作为新药测试或者批准在患者中临床治疗使用的血小板抑制剂的有效性。

血小板在保持正常止血中发挥关键作用。当暴露于受损的血管时，血小板会粘附到暴露的皮下基质。在初始粘附之后，在受伤位置释放或产生各种因子，例如凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)和胶原，活化血小板。一旦血小板被活化，血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受体将发生构象变化，允许它与纤维蛋白原和/或von Willebrand因子结合。正是由于相邻血小板上的GPIIb/IIIa受体与多价纤维蛋白原和/或von Willebrand因子分子的结合，导致额外的血小板补充到受损位置并且凝聚，从而形成止血栓或血栓。

血小板凝聚是用于描述血小板彼此结合的术语。体外血小板凝聚测定是用于评估血小板在体内形成产生初级止血栓的凝聚体的能力的实验室方法。在这一技术中，抗凝全血样品在多重条件下离心，同时产生富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)样品。然后，向PRP添加凝集剂，如ADP或胶原，与此同时，光学监视血小板的凝聚，用PPP样品进行单独的光学测量。然后，使用PPP通道作为100％凝聚参照水平，与PRP通道进行比较，确定凝聚百分比。因为血液离心会导致红血细胞溶血，所以由于制备差异导致的PPP光密度变化会使用于计算凝聚百分比的光学参照水平产生误差。

在实验室中用于评估体内血小板凝聚能力的另一种体外血小板凝聚测定方法，使用稀释的全血测量在添加了凝集剂，如ADP或胶原，后血小板粘附和凝聚时，两个紧密间隔贵金属电极之间的电阻抗变化。利用这种方法，不能用单个测定装置确定血小板凝聚百分比。相反，必须执行两个单独的测定，获取两个测量结果的比率以确定凝聚百分比。对于患者已经应用血小板抑制药物的情况，无法确定其血小板凝聚百分比。目前测量血小板凝聚的测定方法价格昂贵、费时、笨拙，且一般不适合于临床环境。

最近，美国专利号5,763,199开发并描述了一种快速血小板功能测定方法。该测定方法确定非稀释全血中的糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体阻断(blockade)。当球珠与含有血小板的全血接触时，导致涂布有GPIIb/IIIa配体如纤维蛋白原的小聚合体球珠凝集，所述血小板上带有已活化的未阻断GPIIb/IIIa受体。凝集失败表明GPIIb/IIIa受体激活失败和/或GPIIb/IIIa受体阻断失败。在优选实施方案中，添加血小板活化剂，如ADP或花生四烯酸，使测定能够足够快速和方便地在床边执行，并且若激活受体没有被阻断时，使小聚合体球珠在一个方便的、已知的时期内凝集。该测定方法包括能够将待测试血液从收集容器转移到测定设备，而无需打开收集容器。

血小板凝聚在血栓症和急性冠状动脉疾病病理中发挥关键作用。有证据表明，在响应各种抗血小板药剂时，血小板功能存在显著的变异性。还已经证实，当使用P2Y12拮抗药如氯吡格雷(clopidogrel)治疗患者以获得抗凝聚效果时，血小板凝聚存在个体差异。一项研究的结果证实，至少有10％的接受药物的患者不会获得预期的血小板凝聚抑制(Muller I，Besta F，SchulzC，Massberg S，Schonig A，Gawaz M；Prevalence of clopidogrel non-respondersamong patients with stable angina pectoris scheduled for elective coronary stentplacemen Thromb Haemost.2003 May，89(5)：783-7)。

由于许多患有心血管疾病的患者长期服用某一种噻吩并吡啶制剂，因此用于基于对被抑制样品进行单次测量确定血小板抑制水平的方法是有利的。此外，正在进行PTCA治疗的患者在治疗之前一般会给予大剂量的噻吩并吡啶制剂。这些患者中的一部分之后可能需要急诊手术，且能够提供有关其血小板抑制绝对水平信息的测定对于在手术之前评估出血处理风险是有利的。

需要有一种改进的方法，用于获得由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。进一步需要一种方法，其使用单个血液样品获得由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。还进一步需要一种方法，其在单次测量中获得由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种改进的方法，用于确定由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。

本发明的另一个目的是提供一种方法，用于使用单个血液样品获得由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。

本发明的再一个目的是提供一种方法，用于在单次测量中获得由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。

本发明的这些和其他的目的在使用单个血液样品用于获得由于抗血小板药物造成的血小板凝聚百分比或抑制百分比的方法中实现，抗血小板药物包括但不仅限于阿司匹林噻吩并吡啶、西洛他唑等。提供了一种测定设备。该测定设备具有多个通道，每一个通道均与一个共用的引入口偶连。将第一血小板活化剂引入到测定设备的第一通道。该第一血小板活化剂对抗血小板药物靶向的活化途径敏感。将第二血小板活化剂引入到测定设备的第二通道，该第二血小板活化剂对抗血小板药物靶向的活化途径不敏感。将抗凝样品同时引入第一和第二通道。在两个通道中同时获得血小板凝聚水平作为举例，而无限制意义，血小板的凝聚水平能够通过光学比浊方法确定。血小板凝聚(PA)或抑制(PI)的百分比的确定如下：

％PA＝(测试通道/对照通道)*100％

％PI＝(1-(测试通道/对照通道))*100％＝100％-％PA

附图简述

图1是能够用于本发明的测定设备的图示，具有多个混合室/检测槽，一个集结槽(staging well)，一个样品槽和一个保护外壳。

优选实施方案说明

在本发明的一个实施方案中，使用单个血液样品确定由于抗血小板药物导致的血小板凝聚百分比或抑制百分比。如图1所示，提供了一个测定设备，一般用10表示。该测定设备10包括多个混合室/检测槽12、一个集结槽14、一个样品槽16和一个保护外壳18。测定设备用于独立地同时测定血液样品。提供一个药筒(cartridge)。

药筒具有多个通道，每个通道均与一个共用的引入口偶连。将第一血小板活化剂引入到第一通道。该第一血小板活化剂对抗血小板药物靶向的活化途径敏感。合适的第一血小板活化剂包括，但不仅限于，花生四烯酸、ADP、胶原、凝血烷A2、肾上腺素等。将第二血小板活化剂引入到药筒的第二通道，该第二血小板活化剂对于抗血小板药物靶向的活化途径不敏感。合适的第二血小板活化剂包括但不仅限于，凝血酶、异凝血酶受体激活肽(iso-TRAP)等。

向第一和第二通道同时引入抗凝样品。在两个通道内同时获得血小板凝集的水平。作为举例，而无限制意义，血小板的凝聚水平能够通过光学比浊方法确定。

血小板凝聚(PA)或抑制(PI)的百分比如下：

％PA＝(测试通道/对照通道)*100％

％PI＝(1-(测试通道/对照通道))*100％＝100％-％PA

该比较在测定设备10内进行。

在一个具体的实施方案中，测定设备10是一种测量由于凝聚导致的光学信号改变的设备。作为举例而无限制意义，合适的仪器包括，动力学分光光度计、Ultegra System仪器(可以从Accumetrics，San Diego，CA商业获得)，并用于对正常样品进行快速血小板功能活力测量等。

Ultegra System设备是一种基于浊度测定的光学检测系统，其利用光透射率的增加测量血小板诱发的凝聚。该系统包括分析仪、一次性药筒和控制器。药筒含有基于微粒凝集技术的试剂。质量控制系统包括电子控制器、两种程度的测定“湿”控制器(WQC)、药筒内湿度传感器、封装内温度指示器、和用于使两个测定通道同时作用的测试器(test)。分析仪控制测定的先后顺序，建立测定温度，控制试剂-样品混合所需的持续时间，确定血小板功能程度，显示结果，和执行自我诊断。

在本发明的一个特定实施方案中，药筒包括冻干的制剂(其包括具有共价结合的GPIIb/IIIa受体配体的颗粒)、AA和抗坏血酸的组合物和缓冲液。患者样品可以是柠檬酸化的全血，其通过分析仪自动地从血液收集管分配到药筒内，无需用户进行血液处理。通过颗粒的红外吸光度特性监视相互作用。随着颗粒与血小板相互作用，通过Ultegra^TM分析仪的光学系统测量颗粒的凝集。凝集的检测是利用红外线透过样品的增加。分析反应动力学，并转换为“阿司匹林响应单元”，ARU内。

分离的试剂在药筒的单独通道内。然而，样品共同地引入到两个通道内。测定设备10控制血液样品的引入，试剂与血液样品的混合，为每个活化通道的凝聚进行独立的光学测量，并根据单独通道的结果确定％PI。

本发明提供了一种单一的测定方法，即使在测量具有药物诱发的血小板抑制的患者时，也可以确定相对于患者未抑制水平的血小板抑制水平。

实施例1

用于确定血小板受体阻断的血液测定

通过注射器从患者吸取血液，并置于含有柠檬酸钠(1体积3.8％的柠檬酸钠)的标准蓝盖试管内。或者，血液可以通过真空采血管直接吸入到蓝盖试管内。

然后，颠倒试管，使抗凝血剂与全血混合。随后将50.mu.l这种混合物添加到50.mu.l缓冲液(0.15M NaCl，5mM CaCl₂，0.05M HEPES，pH7.4)和5.mu.l缓冲液中。将抗凝样品同时引入到药筒的第一和第二通道。

如果GPIIb/IIIa受体被阻断，则球珠保持悬浮。如果GPIIb/IIIa受体没有被阻断，则血小板与结合在球珠表面的纤维蛋白原相互作用，导致球珠聚集。通过测定设备10在两个通道内同时获得血小板凝聚水平。

实施例2

用于确定血小板受体阻断的血液测定

血液样品同时引入到药筒的第一和第二通道内。测定设备10控制血液样品的引入，试剂与血液样品的混合，为每个活化通道进行独立的凝聚光学测量，和根据单独通道的结果确定％PI。

第一血小板活化剂，花生四烯酸，位于第一通道内。将第二血小板活化剂，凝血酶，引入药筒的第二通道内。通过测定设备10在两个通道内同时获得血小板凝聚水平。

实施例3

用于确定血小板受体阻断的血液测定

第一血小板活化剂，ADP，位于第一通道内。第二血小板活化剂，异凝血酶受体激活肽，位于第二通道内。通过测定设备10在两个通道内同时获得血小板凝聚水平。

实施例4

用于确定血小板受体阻断的血液测定

第一血小板活化剂，凝血烷A2，位于第一通道内。第二血小板活化剂，凝血酶，位于第二通道内。通过测定设备10在两个通道内同时获得血小板凝聚水平。

实施例5

用于确定血小板受体阻断的血液测定

第一血小板活化剂，肾上腺素，位于第一通道内。第二血小板活化剂，异凝血酶受体激活肽，位于第二通道内。通过测定设备10在两个通道内同时获得血小板凝聚水平。

本文出于举例和说明的目的提供了前述本发明实施方案的说明。这并不意味着是详尽的或者将本发明限制于确切的公开形式。显然，本领域的技术人员可以显见各种修饰和改变。我们的意图是，本发明的范围由随后的权利要求及其等价物限定。

Claims

1.用于获得血小板凝聚百分比或抑制百分比的方法，包括：

提供测定设备；

向测定设备的第一通道引入第一血小板活化剂，该血小板活化剂对于抗血小板药物靶向的活化途径敏感；

向测定设备的第二通道引入第二血小板活化剂，该第二血小板活化剂对于抗血小板药物靶向的活化途径不敏感；

向测定设备引入抗凝样品；

在两个通道内同时测量血小板的凝聚水平；

如下确定血小板凝聚百分比(PA)或抑制百分比(PI)：

％PA＝(测试通道/对照通道)*100％

％PI＝(1-(测试通道/对照通道))*100％＝100％-％PA

2.权利要求1的方法，其中第一血小板活化剂选自：花生四烯酸、二磷酸腺苷、胶原、凝血烷A2和肾上腺素。

3.权利要求1的方法，其中第二血小板活化剂选自：凝血酶和异凝血酶受体激活肽。

4.权利要求1的方法，其中抗凝样品选自：未稀释的全血、血浆和稀释的全血。